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Neuroscience

Ein leichtes Antriebsimplantat für chronische Tetrodenableitungen bei juvenilen Mäusen

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65228

Summary

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Mikroantriebsdesign, ein chirurgisches Implantationsverfahren und eine postoperative Erholungsstrategie, die chronische Feld- und Einzelableitungen von mehreren Hirnregionen gleichzeitig bei juvenilen und heranwachsenden Mäusen über ein kritisches Entwicklungsfenster vom 20. postnatalen Tag (p20) bis zum 60. postnatalen Tag (p60) und darüber hinaus ermöglichen.

Abstract

Die In-vivo-Elektrophysiologie bietet einen beispiellosen Einblick in die Schaltkreisdynamik des intakten Gehirns im Subsekundenbereich und stellt eine Methode von besonderer Bedeutung für die Untersuchung von Mausmodellen für neuropsychiatrische Erkrankungen des Menschen dar. Solche Methoden erfordern jedoch oft große Schädelimplantate, die bei Mäusen zu frühen Entwicklungszeitpunkten nicht eingesetzt werden können. Daher wurden praktisch keine Studien zur In-vivo-Physiologie an sich frei verhaltenden Säuglingen oder juvenilen Mäusen durchgeführt, obwohl ein besseres Verständnis der neurologischen Entwicklung in diesem kritischen Zeitfenster wahrscheinlich einzigartige Einblicke in altersabhängige Entwicklungsstörungen wie Autismus oder Schizophrenie liefern würde. In dieser Arbeit werden ein Mikroantriebsdesign, ein chirurgisches Implantationsverfahren und eine postoperative Genesungsstrategie beschrieben, die chronische Feld- und Einzelableitungen von mehreren Gehirnregionen gleichzeitig bei Mäusen ermöglichen, wenn sie vom 20. postnatalen Tag (p20) bis zum 60. postnatalen Tag (p60) und darüber hinaus altern, ein Zeitfenster, das in etwa dem menschlichen Alter von 2 Jahren bis zum Erwachsenenalter entspricht. Die Anzahl der Aufzeichnungselektroden und der endgültigen Aufzeichnungsstellen kann leicht modifiziert und erweitert werden, so dass eine flexible experimentelle Steuerung der In-vivo-Überwachung verhaltens- oder krankheitsrelevanter Hirnregionen über die gesamte Entwicklung hinweg möglich ist.

Introduction

Das Gehirn erfährt während der kritischen Entwicklungsfenster der Kindheit und Jugend großflächige Veränderungen 1,2,3. Viele neurologische und psychiatrische Erkrankungen, darunter Autismus und Schizophrenie, manifestieren sich erstmals verhaltensmäßig und biologisch in dieser Phase der Entwicklung des jugendlichen und jugendlichen Gehirns 4,5,6. Während viel über die zellulären, synaptischen und genetischen Veränderungen bekannt ist, die in der frühen Entwicklung auftreten, ist vergleichsweise wenig darüber bekannt, wie sich Prozesse auf Schaltkreis- oder Netzwerkebene während dieses Zeitfensters verändern. Wichtig ist, dass die Gehirnfunktion auf Schaltkreisebene, die letztendlich komplexen Verhaltensweisen, Gedächtnis und Kognition zugrunde liegt, eine nicht vorhersehbare, emergente Eigenschaft der zellulären und synaptischen Funktionist 7,8,9,10. Um die Gehirnfunktion auf Netzwerkebene vollständig zu verstehen, ist es daher notwendig, die neuronale Aktivität direkt auf der Ebene eines intakten neuronalen Schaltkreises zu untersuchen. Um herauszufinden, wie sich die Gehirnaktivität während des Fortschreitens neuropsychiatrischer Störungen verändert, ist es außerdem von entscheidender Bedeutung, die Netzwerkaktivität in einem validen Krankheitsmodell während des spezifischen Zeitfensters zu untersuchen, in dem sich die Verhaltensphänotypen der Krankheit manifestieren, und die beobachteten Veränderungen zu verfolgen, während sie bis ins Erwachsenenalter anhalten.

Einer der häufigsten und leistungsfähigsten wissenschaftlichen Modellorganismen ist die Maus mit einer großen Anzahl einzigartiger genetischer Stämme, die neurologische Entwicklungsstörungen mit altersabhängigem Beginn der Verhaltens- und/oder Gedächtnisphänotypenmodellieren 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Während es schwierig ist, genaue Entwicklungszeitpunkte zwischen den Gehirnen von Menschen und Mäusen zu korrelieren, deuten morphologische und verhaltensbezogene Vergleiche darauf hin, dass p20-p21-Mäuse das menschliche Alter von 2-3 Jahren und p25-p35-Mäuse das menschliche Alter von 11-14 Jahren repräsentieren, wobei Mäuse wahrscheinlich das Entwicklungsäquivalent eines menschlichen 20-jährigen Erwachsenen um p60erreichen 3, 22. Der Teufel Um besser zu verstehen, wie sich das jugendliche Gehirn entwickelt, und um zu erkennen, wie die neuronalen Netzwerke des Gehirns bei Krankheiten wie Autismus oder Schizophrenie dysfunktional werden, wäre es ideal, die Gehirnaktivität in vivo bei Mäusen im Alter von 20 bis 60 Tagen direkt zu überwachen.

Eine grundlegende Herausforderung bei der Überwachung der Gehirnaktivität in der frühen Entwicklung von Mäusen ist jedoch die geringe Größe und relative Schwäche von juvenilen Mäusen. Die chronische Implantation von Elektroden, die für Längsschnittstudien der Gehirnentwicklung notwendig ist, erfordert in der Regel ein großes, sperriges Gehäuse, um die feinen Elektrodendrähte und Schnittstellenplatinen zu schützen23,24, und die Implantate müssen fest mit dem Mausschädel verbunden sein, der bei jungen Mäusen aufgrund der reduzierten Verknöcherung dünner und weniger steif ist. Daher wurden praktisch alle Studien zur In-vivo-Physiologie von Nagetieren aufgrund ihrer relativen Größe, Stärke und Schädeldicke an erwachsenen Probanden durchgeführt. Bisher wurden die meisten Studien, die die Gehirnphysiologie von juvenilen Nagetieren in vivo untersuchten, an wildtypartigen juvenilen Ratten durchgeführt, was zwangsläufig die Fähigkeit einschränkt, die juvenile Gehirnfunktion in einem sich frei verhaltenden Modell einer menschlichen Störung experimentell zu überwachen 25,26,27,28,29,30.

Dieses Manuskript beschreibt ein neuartiges Implantatgehäuse, ein chirurgisches Implantationsverfahren und eine postoperative Genesungsstrategie, um die langfristige (bis zu 4 oder mehr Wochen) In-vivo-Gehirnfunktion von juvenilen Mäusen über ein entwicklungskritisches Zeitfenster (p20 bis p60 und darüber hinaus) chronisch zu untersuchen. Das Implantationsverfahren ermöglicht die zuverlässige und dauerhafte Befestigung der Elektroden an den Schädeln von Jungmäusen. Darüber hinaus ist das Mikroantriebsdesign leicht, da dieses Mikrolaufwerk im vollständig montierten Zustand ~4-6 g wiegt und aufgrund des minimalen Ausgleichs, das erforderlich ist, um das Gewicht des Implantats auszugleichen, die Verhaltensleistung von juvenilen Mäusen während typischer Verhaltensparadigmen nicht beeinträchtigt.

Protocol

Die vorliegende Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas Southwestern Medical Center genehmigt (Protokoll 2015-100867) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutionen und des National Institute of Health durchgeführt. Die in der vorliegenden Studie verwendeten männlichen und weiblichen C57/Bl6-Mäuse wurden bei p20 (Gewicht 8,3-11,1 g zum Zeitpunkt der Implantation) implantiert.

1. Design und Konstruktion von Mikroantrieben

  1. Digitales Entwerfen und Drucken des Mikroantriebs (Abbildung 1)
    1. Laden Sie die Modellvorlagen für Mikroantriebe herunter (https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive).
    2. Identifizieren Sie die stereotaktischen Positionen der Zielhirnregion(en) in einem geeigneten stereotaktischen Atlas.
    3. Laden Sie mit einer dreidimensionalen Computer-Aided-Design-Software (3D-CAD) die Schablonen-Mikroantriebskanüle (Abbildung 1B).
    4. Ändern Sie bei Bedarf die Ausgangspositionen der Ausgangskanüle auf dem Mikroantriebskanülenmodell, um die gewünschte(n) Gehirnregion(en) anzusprechen.
      Anmerkungen: Jede Kanülenlochextrusion sollte mindestens 2 mm lang sein, um sicherzustellen, dass die Tetrode aus dem Kanülenloch austritt und direkt auf das Ziel zielt. Die Mikroantriebskanülenschablone ist so konzipiert, dass sie bilateral auf den anterioren cingulären Kortex (eine Tetrode pro Hemisphäre), den Hippocampusbereich CA1 (vier Tetroden pro Hemisphäre) und den Hippocampusbereich CA3 (zwei Tetroden pro Hemisphäre) abzielt, wobei eine Referenztetrode pro Hemisphäre in der weißen Substanz über dem Hippocampusbereich CA1 positioniert ist.
    5. Modifizieren Sie bei Bedarf das Mikroantriebsgehäuse (Abbildung 1A), um die Befestigung der elektronischen Schnittstellenplatine (EIB) aufzunehmen.
    6. Drucken Sie den Mikroantriebskörper, die Kanüle, den Konus und den Deckel in hoher Auflösung auf einem 3D-Drucker (idealerweise mit einer Auflösung besser als 25 μm) und bereiten Sie die gedruckten Materialien gemäß den Protokollen des Herstellers vor. Verwenden Sie Druckerharze mit hoher Steifigkeit.
  2. Montage der kundenspezifischen Schrauben und Befestigungen (Abbildung 2A, B)
    1. Laden Sie mit einer 3D-CAD-Software die Schraubbefestigungsmodelle (Abbildung 1E).
    2. Drucken Sie die Schraubbefestigungen hochauflösend auf einem 3D-Drucker (idealerweise mit einer Auflösung von mindestens 25 μm) und bereiten Sie die gedruckten Materialien nach den Protokollen des Herstellers vor. Verwenden Sie Druckerharze mit hoher Steifigkeit.
    3. Befestigen Sie die Schraubenbefestigungen an jeder Tetrodenvorschubschraube (Abbildung 1F) (Tetrodenvorschubschrauben werden vor dem Bau von Mikroantrieben in einer Maschinenwerkstatt kundenspezifisch hergestellt).
      1. Befestigen Sie an jeder Schraube zwei Schraubbefestigungen, eine über und eine unter dem First. Achten Sie darauf, dass die Unterseite jeder Schraubbefestigung den First berührt. Halten Sie die Schraubenbefestigungen mit Gel-Cyanacrylat zusammen.
      2. Achten Sie nach dem Anbringen darauf, dass sich die Schraubbefestigungen nicht in der Längsachse der Schraube bewegen, sondern sich mit minimalem Widerstand frei drehen.
  3. Zusammenbau des Mikroantriebskörpers (Abbildung 2C, D)
    1. Schneiden Sie mit einer feinen, scharfen Schere große Polyimidrohre (Außendurchmesser: 0,2921 mm, Innendurchmesser: 0,1803 mm) in ~6 cm lange Abschnitte.
    2. Führen Sie die großen Polyimidabschnitte durch die Ausgangslöcher an der Mikroantriebskanüle, so dass jeder Schlauch um einige Millimeter über den Boden der Kanüle hinausragt.
    3. Befestigen Sie das Polyimid mit einer sauberen 30-g-Nadel auf der Kanüle, indem Sie kleine Mengen flüssiges Cyanacrylat auftragen. Achten Sie darauf, dass das Cyanacrylat nicht in das Innere der Polyimid-Tube eindringt.
      Anmerkungen: Das Abtropfen von flüssigem Cyanacrylat durch die Oberseite des Antriebskörpers in die Kanüle kann diesen Vorgang beschleunigen, erfordert jedoch später ein erneutes Reinigen der Führungslöcher mit einem Bohrer mit feiner Spitze.
    4. Führen Sie die großen Polyimid-Röhrchen von der Oberseite der Mikroantriebskanüle durch die entsprechenden großen Polyimid-Löcher im Mikroantriebskörper.
    5. Drücken Sie die Mikroantriebskanüle und den Mikroantriebskörper langsam zusammen, bis sie benachbart sind und die Kanülen-/Körperbefestigungslaschen ineinander greifen. Achten Sie darauf, die Polyimidrohre dabei nicht zu knicken oder zu beschädigen.
      Anmerkungen: Jeder Polyimidschlauch sollte sanft von der Unterseite der Kanüle durch die Oberseite des Mikroantriebskörpers geführt werden. Eine leichte Biegung ist normal, aber eine übermäßige Biegung des Polyimidrohrs kann die Tetrode verformen und verhindern, dass sie direkt in das Gehirn gelangt.
    6. Befestigen Sie den Mikroantriebskörper und die Mikroantriebskanüle zusammen mit Cyanacrylat.
    7. Trennen Sie mit einer neuen, scharfen Rasierklinge die großen Polyimid-Röhrchenenden ab, die von der Unterseite der Kanülenausgangslöcher herausragen. Achten Sie darauf, dass sich der Schnitt genau an der Basis der Kanüle befindet, damit die Röhrchen und der Kanülenboden bündig ineinander liegen.
    8. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere den großen Polyimid-Schlauch knapp über der Kante des inneren Randes des Antriebskörpers in einem Winkel von ~45° ab.
  4. Laden der montierten kundenspezifischen Schrauben (Abbildung 2E)
    1. Schrauben Sie jede zusammengebaute kundenspezifische Schraube in die äußeren Löcher des Mikroantriebskörpers. Stellen Sie sicher, dass der Schraubenführungspfosten durch das große Loch in den Schraubenbefestigungen geführt wird. Schieben Sie jede Schraube vollständig vor, bis sie nicht mehr weiter vorgeschoben werden kann. Es wird empfohlen, die Schrauben mit Mineralöl oder Achsfett vorzuschmieren.
    2. Schneiden Sie kleine Polyimid-Schläuche (Außendurchmesser: 0,1397 mm, Innendurchmesser: 0,1016) mit einer extrem scharfen Schere in ~4 cm lange Abschnitte.
    3. Führen Sie die kleinen Polyimidabschnitte durch die großen Polyimidschläuche, die bereits im Mikroantrieb montiert sind. Stellen Sie sicher, dass überschüssige kleine Polyimidschläuche aus der Ober- und Unterseite jedes großen Polyimidschlauchs herausragen.
    4. Befestigen Sie die kleinen Polyimid-Röhrchen mit Cyanacrylat an den Verschraubungen und achten Sie darauf, dass weder in die großen noch in die kleinen Polyimid-Röhrchen Cyanacrylat gelangt.
    5. Trennen Sie mit einer neuen, scharfen Rasierklinge die kleinen Polyimid-Röhrchenenden, die aus dem Boden der Kanülenlöcher herausragen. Stellen Sie sicher, dass sich der Schnitt genau an der Basis der Kanüle befindet und dass der Schnitt sauber ist und nichts das Polyimid-Röhrchenloch blockiert.
    6. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere die Oberseite des kleinen Polyimids einige Millimeter über der Oberseite der Schraubbefestigung in einem Winkel von ~45° ab. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt sauber ist und nichts das Polyimid-Rohrloch blockiert.
  5. Laden der Tetroden
    1. Bereiten Sie die Tetroden (~6 cm Länge) mit den zuvor beschriebenen Methodenvor 31.
    2. Führen Sie mit einer Pinzette mit Keramik- oder Gummispitze vorsichtig eine Tetrode durch eines der kleinen Polyimid-Röhrchen, wobei ~2 cm aus der Oberseite des kleinen Polyimid-Röhrchens herausragen.
    3. Befestigen Sie die Tetrode mit flüssigem Cyanacrylat an der Oberseite des kleinen Polyimid-Röhrchens und achten Sie dabei darauf, dass das kleine und das große Polyimid-Röhrchen nicht miteinander verbunden werden.
    4. Ziehen Sie die Schraube zurück, bis sie sich in der Nähe der Oberseite des Laufwerks befindet.
    5. Fassen Sie den Tetrodendraht, der aus der Unterseite des Laufwerks herausragt, und knicken Sie ihn vorsichtig an der Stelle, an der er aus der Kanüle austritt.
    6. Schieben Sie die Schraube wieder vollständig in das Laufwerk ein.
    7. Schneiden Sie den Tetrodendraht mit einer sehr scharfen Schere knapp über dem Knick ab. Stellen Sie unter dem Mikroskop sicher, dass der Schnitt sauber ist und das Metall aller vier Tetroden freiliegt.
    8. Ziehen Sie die Schraube zurück, bis die Tetrode gerade noch in der Kanüle befestigt ist.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.2-1.5.8 für alle Schrauben.
    10. Befestigen Sie die EIB mit kleinen Schmuckschrauben an der EIB-Stützplattform.
    11. Schließen Sie jede Elektrode jeder Tetrode an den entsprechenden Anschluss des EIB an.
  6. Vorbereitung des Mikroantriebs für die Operation
    1. Die Tetroden werden elektrisch beschichtet, um die elektrische Impedanz unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verfahren31 zu reduzieren.
    2. Stellen Sie nach dem Plattieren sicher, dass jede Tetrode so in der Kanüle untergebracht ist, dass die Spitze der Tetrode bündig mit dem Boden jedes Kanülenlochs abschließt.
    3. Schieben Sie den Mikroantriebskegel um den fertigen Mikroantrieb. Befestigen Sie den Micro-Drive-Deckel am Micro-Drive-Konus, indem Sie die Konusbefestigungsstange in die Deckelöffnung schieben.
    4. Richten Sie den Konus so aus, dass die EIB-Verbinder bei geschlossenem Deckel ungehindert durch die Durchgangslöcher des EIB-Anschlusses geführt werden, und kleben Sie den Konus mit Cyanacrylat, das um die Basis des Konus gelegt wird, und achten Sie darauf, dass kein Cyanacrylat in eine der Kanülenausgangslöcher eindringt. Entfernen Sie den Deckel.
    5. Füllen Sie jedes Kanülenloch sorgfältig mit sterilem Mineralöl auf, um zu verhindern, dass nach der chirurgischen Implantation Körperflüssigkeiten in die Polyimidlöcher gelangen.
    6. Beschichten Sie den Boden der Kanüle vorsichtig mit steriler Vaseline. Dies dient als Barriere, um zu verhindern, dass chemische Wirkstoffe (z. B. Zahnzement) während der Operation in das freiliegende Gehirn gelangen.
    7. Wiegen Sie den vollständig montierten Mikroantrieb, den Deckel und die vier Knochenschrauben, um ein gleichgewichtiges Gegengewicht herzustellen.
    8. Optional können die Tetroden vor der Operation in einem Abstand extrudiert werden, der geeignet ist, die Zielhirnregionen zu erreichen, sobald der Antrieb bündig mit dem Schädel ist.
      HINWEIS: Sterilisieren Sie das Implantat vor der chirurgischen Implantation durch Gassterilisation in Ethylenoxid (500-1200 mg/L, 2-4 Stunden).  Alle Knochenschrauben und chirurgischen Instrumente sollten im Autoklaven (121 °C, 30 Minuten) sterilisiert werden.

2. Chirurgische Implantation

  1. Betäubung der Maus und Einbau in die stereotaktische Apparatur
    1. Legen Sie die Maus in eine kleine Schachtel mit ausreichend Bewegungsfreiheit und betäuben Sie die Maus mit 3%-4% Isofluran.
      Anmerkungen: Es können auch andere Anästhetika verwendet werden, aber aufgrund des Alters, der Größe und des Gewichts der jugendlichen Maus ist Vorsicht geboten.
    2. Sobald die Maus nicht mehr reagiert (keine Reaktion auf das Kneifen des Schwanzes, eine Belüftungsrate von ~60 Atemzügen pro Minute), nehmen Sie sie aus der Verpackung und montieren Sie sie schnell auf dem stereotaktischen Gerät.
    3. Legen Sie die stereotaktische Maske schnell über die Schnauze der Maus und halten Sie die Anästhesie bei 1-3% Isofluran aufrecht. Tragen Sie vor dem ersten chirurgischen Schnitt alle vom Tierarzt zugelassenen Schmerzmittel wie Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung (0,05-0,5 mg/kg subkutan) oder entzündungshemmende Mittel wie Carprofen (5-10 mg/kg subkutan) auf.
    4. Befestigen Sie den Kopf der Maus mit Hilfe von Ohrbügeln vollständig im stereotaktischen Gerät. Stellen Sie sicher, dass der Schädel gerade und unbeweglich ist, ohne unnötigen Druck auf die Gehörgänge der Maus auszuüben. Aufgrund der begrenzten Verknöcherung juveniler Schädelknochen ist es möglich, bei der Kopffixierung bleibende Schäden zu verursachen.
  2. Vorbereitung der Maus auf die Operation und Freilegung des Schädels
    1. Schützen Sie die Augen der Maus, indem Sie eine kleine Menge synthetisches Tränengel auf jedes Auge auftragen und jedes Auge mit einem autoklavierten Folienfleck abdecken.
      HINWEIS: Die synthetischen Tränen halten die Augen feucht, während die Folie verhindert, dass Lichtquellen langfristige Schäden verursachen. Dickere synthetische Tränenlösungen werden bevorzugt, da sie auch als Barriere gegen das versehentliche Einbringen anderer potenziell toxischer chirurgischer Lösungen (Ethanol, Dentalacryl usw.) in die Augen dienen können.
    2. Tragen Sie mit sterilen Wattestäbchen eine Haarentfernungscreme auf den Operationsbereich auf, um die Haare von der Kopfhaut zu entfernen. Achten Sie darauf, die Creme nicht in die Nähe der Augen zu bringen. Nachdem Sie die Haare entfernt haben, legen Sie einen sterilen Vorhang über die Kopfhaut, um den Operationsbereich zu sichern.
    3. Reinigen Sie die Kopfhaut mit sterilen Wattestäbchen durch drei aufeinanderfolgende Waschgänge mit Povidon-Jod-Lösung (10 %), gefolgt von Isopropylalkohol (100 %).
    4. Entfernen Sie die Kopfhaut mit einem sterilen Skalpell oder einer feinen Schere.
    5. Reinigen Sie den Schädel gründlich mit sterilen Wattestäbchen und sterilen Lösungen aus Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) und Wasserstoffperoxid.
    6. Identifizieren Sie Bregma und markieren Sie mit dem stereotaktischen Gerät sorgfältig die Zielableitungsstellen auf dem Schädel mit einem Permanentmarker.
  3. Öffnen des Kanülenlochs und Anbringen der Knochenanker
    1. Entfernen Sie den Schädel, der die Aufnahmestellen überlagert. # Aufgrund der Dünnheit des Schädels in diesem Alter den Schädel mit einer Skalpellklinge schneiden; Dadurch entfällt die Notwendigkeit, einen Bohrer zu verwenden, der die darunter liegende Dura beschädigen kann. Halten Sie die freiliegende Dura mit steriler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) oder sterilem Mineralöl feucht. Entfernen oder punktieren Sie die Dura in diesem Stadium nicht, da sie bei juvenilen Mäusen dünn genug ist, damit die Tetroden in zukünftigen Schritten passieren können.
    2. Bohren Sie vorsichtig Vorbohrungen für vier Knochenschrauben.
      1. Platzieren Sie die Knochenschrauben in den äußersten lateralen und rostralen oder kaudalen Teilen des Schädels, wo der Knochen am dicksten ist und die Knochenschrauben ausreichend weit vom Mikroantriebsimplantat entfernt sind. Verwenden Sie für die Knochenschrauben sterile, feine Schmuckschrauben (z.B. UNM 120 Gewinde, 1,5 mm Kopf).
      2. Wickeln Sie eine Knochenschraube mit einem dünnen, hochleitfähigen Draht fest, der als Erdung dient und in Schritt 2.4.6 an der EIB befestigt wird.
    3. Ritzen Sie den Schädel mit einer Skalpellklinge oder vorsichtig mit einem Bohrer in die Nähe der Knochenschraubenlöcher. Die Riefenbildung ist wichtig, um eine ausreichend raue Oberfläche zu schaffen, damit das flüssige Cyanacrylat in Schritt 2.3.5 binden kann.
    4. Schrauben Sie jede sterile Knochenschraube mit einem sterilen Schraubendreher und einer sterilen Schraubklemme ein und achten Sie darauf, die darunter liegende Dura nicht zu durchbohren.
    5. Geben Sie mit einer sterilen 30-g-Nadel flüssiges Cyanacrylat um jede Knochenschraube. Dadurch wird der Schädel an der Stelle, an der die Knochenschrauben befestigt wurden, effektiv verdickt. Achten Sie darauf, dass kein Cyanacrylat in die freiliegende Dura über den Aufnahmestellen gelangt.
  4. Absenken und Anbringen des Mikroantriebs (Bild 2G)
    1. Montieren Sie den fertigen Mikroantrieb auf die stereotaktische Apparatur, um vorsichtig auf den Mausschädel abgesenkt zu werden. Stellen Sie sicher, dass sich die Mikroantriebskanüle beim Absenken an den richtigen Koordinaten befindet.
    2. Senken Sie den Mikroantrieb langsam ab und bewegen Sie sich nur in dorsaler/ventraler Richtung. Senken Sie den Mikroantrieb mit den bereits aus den Kanülenlöchern vorgeschobenen Tetroden ab (Schritt 1.6.6), um ihren Eintritt in das Gehirn sichtbar zu machen; Jede mediale/laterale oder rostrale/kaudale Bewegung, wenn die Tetroden die Maus berühren, kann die Tetroden verbiegen und dazu führen, dass sie ihr endgültiges Ziel verfehlen.
    3. Sobald der Mikroantrieb vollständig abgesenkt ist, stellen Sie sicher, dass die Basis der Kanüle gerade Kontakt mit dem Schädel/Dura hat. Die Schicht aus Vaseline und/oder Mineralöl dient als Barriere, um die freiliegende Dura zu bedecken. Fügen Sie bei Bedarf sterile Vaseline oder steriles Knochenwachs hinzu, um überschüssige freiliegende Dura abzudecken.
    4. Während Sie den Mikroantrieb mit der stereotaktischen Apparatur an Ort und Stelle halten, beschichten Sie den Schädel mit Zahnzement, um die Mikroantriebsbasis an den implantierten Knochenschrauben zu befestigen.
      HINWEIS: Der Zahnzement sollte alle Knochenschrauben vollständig umhüllen und die Ankerleiste des Zahnzements an der Mikroantriebskanüle bedecken.
    5. Während der Zahnzement aushärtet, formen Sie ihn sorgfältig, um scharfe Ecken oder Kanten zu vermeiden, die die Maus oder das Mikrolaufwerk beschädigen könnten. Stellen Sie sicher, dass genügend Zahnzement vorhanden ist, um den Mikroantrieb zu halten, aber vermeiden Sie überschüssigen Zahnzement, der unnötiges Gewicht verursacht.
    6. Fädeln Sie das Erdungskabel vorsichtig durch das Mikrolaufwerk und befestigen Sie es an dem entsprechenden Steckplatz am EIB.
    7. Sobald der Zahnzement vollständig ausgehärtet ist, lösen Sie den Mikroantrieb vorsichtig vom stereotaktischen Apparat. Setzen Sie den Deckel auf das Mikrolaufwerk.
    8. Reinigen Sie die Maus mit einem sterilen Wattestäbchen und steriler Kochsalzlösung.
    9. Tragen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen eine dünne Schicht antibiotische Salbe auf die freiliegende Kopfhaut in der Nähe der Implantatstelle auf.
    10. Entferne die Folie von den Augen der Maus.
    11. Nehmen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Gerät und achten Sie darauf, das zusätzliche Gewicht des Mikroantriebs zu tragen, während die Maus in einen sauberen Käfig transportiert wird.

3. Genesung nach der Operation

  1. Sofortige Genesung
    1. Bereiten Sie vor der Operation das Gegengewichtssystem vor, indem Sie ein PVC-Rohr mit einem Durchmesser von 0,75 anschließen, wie in Abbildung 2G gezeigt. Ein Arm des Systems wird durch Löcher geführt, die in den Deckel des Käfigs gebohrt wurden, der zweite Arm ruht auf dem Käfigdeckel und der dritte Arm ragt über den Käfig hinaus. Der oberste Arm ist mit einer Kappe versehen.
    2. Befestigen Sie den Mikroantrieb vorsichtig am Gegengewichtssystem (Abbildung 2G-I) und verwenden Sie ein Gegengewicht, das mit dem Gewicht des Mikroantriebs und der Knochenschrauben identisch ist. Führen Sie einen starken Faden oder eine Angelschnur von einem an der EIB befestigten Verbindungsstück über die drei Arme des Gegengewichtssystems zum Gegengewichtsgewicht, das über dem obersten Arm hängt.
    3. Stellen Sie sicher, dass das Gegengewicht fest mit dem EIB-Mikroantrieb verbunden ist und dass genügend Leitung vorhanden ist, um der Maus vollständigen Zugriff auf den gesamten Käfig zu ermöglichen.
    4. Stellen Sie nährstoffreiches Gel im Käfig zusammen mit angefeuchtetem normalem Nagetierfutter bereit, um die Rehydrierung und Erholung zu gewährleisten.
    5. Beobachten Sie die Maus, bis sie sich vollständig von der chirurgischen Anästhesie erholt hat.
  2. Langfristiger Aufschwung
    1. Stellen Sie immer sicher, dass der Mikroantrieb, wenn er nicht an das Aufzeichnungsgerät angeschlossen ist, vom Gegengewichtssystem unterstützt wird. Reduzieren Sie das Gegengewicht im Laufe der Zeit, aber entfernen Sie es niemals vollständig, um unerwartete Belastungen der Maus oder Drehmomente für die Knochenschrauben zu vermeiden.
    2. Um eine Beschädigung des Implantats und des Gegengewichtssystems zu vermeiden, sollten Sie die Maus für die Dauer des Experiments ohne die Möglichkeit einer direkten Interaktion mit anderen Mäusen unterbringen.
    3. Verabreichen Sie nach der Operation mindestens 3 Tage lang nährstoffreiches Gel, danach ist nur feste Nahrung ausreichend.
      1. Stellen Sie aufgrund der Überkopfanforderungen des Gegengewichtssystems keine Lebensmittel und kein Wasser in einem Oberleitungsgeflecht bereit. Legen Sie das Futter auf den Boden des Käfigs und geben Sie Wasser durch die Seite des Käfigs. Um Verderb zu vermeiden, ersetzen Sie die Lebensmittel täglich vollständig.
    4. Stellen Sie täglich sicher, dass die Maus freien Zugriff auf den gesamten Käfig hat und dass das Gegengewicht robust und fest mit dem Mikroantrieb verbunden ist.

Representative Results

Das oben beschriebene Protokoll wurde verwendet, um lokale Feldpotentialsignale und einzelne Einheiten aus mehreren Hirnarealen gleichzeitig in Mäusen aufzuzeichnen, wobei tägliche Aufzeichnungen in denselben Mäusen von p20 bis p60 durchgeführt wurden. Hier wird über repräsentative elektrophysiologische Ableitungen von zwei Mäusen und eine Histologie nach dem Experiment berichtet, die die endgültigen Aufnahmeorte demonstriert.

Chirurgische Implantation des Micro-Antriebs in p20-Mäuse
Ein Mikroantrieb (Abbildung 1) wurde konstruiert (Abbildung 2) und wie oben beschrieben chirurgisch in eine p20-Maus implantiert. Unmittelbar nach der Operation wurde die Maus an das Gegengewichtssystem (Abbildung 2G-I) angeschlossen und konnte sich erholen. Sobald die Maus vollständig mobil war, wurde das Mikrolaufwerk an ein In-vivo-Elektrophysiologie-Aufzeichnungssystem angeschlossen. Die Kabel, die das Mikrolaufwerk mit dem Aufnahmegerät verbinden, waren über der Maus aufgehängt. Elektrophysiologische Ableitungen (32 kHz) wurden über alle Kanäle für 1 h aufgenommen, während sich die Maus in ihrem Heimatkäfig natürlich verhielt. Nach der Aufnahme wurde die Maus vom Aufnahmesystem getrennt, wieder an das Gegengewichtssystem angeschlossen und mit freiem Zugang zu Wasser und Futter in das Vivarium zurückgebracht.

Tägliche Aufzeichnung der neuronalen Aktivität
Elektrophysiologische Ableitungen wurden täglich über mehrere Wochen durchgeführt, um die chronische Überwachung derselben Hirnregion über die kritischen Entwicklungsfenster von p20-p60 hinweg zu ermöglichen. Proben der rohen lokalen Feldpotentiale (LFP) aus den chronischen Aufzeichnungen sind in Abbildung 3A,C dargestellt. Isolierte Einzeleinheiten wurden gleichzeitig aus mehreren Tetroden gewonnen (Abbildung 3B). Einheiten mit ähnlichen Wellenformen wurden über mehrere Tage hinweg identifiziert (Abbildung 3B, Mitte und rechts), aber aufgrund der potenziellen Drift der Aufzeichnungselektrode war es nicht möglich, definitiv zu behaupten, dass dieselbe Einheit über Tage hinweg identifiziert wurde. In einer separaten Maus, die an p20 implantiert und über mehrere Wochen täglich aufgezeichnet wurde, wurde die neuronale Aktivität auf einer Tetrode untersucht, die auf den dorsalen Bereich CA1 abzielt. Welligkeiten mit großer Amplitude und gut isolierte Einzeleinheiten wurden an jedem Tag der Aufzeichnung identifiziert (Abbildung 4). Diese Daten deuten darauf hin, dass stabile, qualitativ hochwertige elektrophysiologische In-vivo-Ableitungen von derselben Maus in der frühen Entwicklung stammen könnten.

Histologische Absicherung der Ableitungsstellen und der Entwicklungseinfluss der chronischen Implantation
Nach dem letzten Aufnahmetag wurde die Maus mittels Isofluran-Anästhesie gründlich betäubt, gefolgt von einer tödlichen Injektion von Pentobarbital-Natrium, und ein Strom wurde durch die Elektrodenspitzen geleitet, um kleine Läsionen an den Aufnahmestellen zu erzeugen. Die histologische Schnittführung des Mäusegehirns nach dem Experiment ermöglichte die Visualisierung der endgültigen Aufnahmestellen (Abbildung 5A,B). In einer separaten Kohorte wurden drei männliche und drei weibliche Mäuse wie oben beschrieben operativ an p20 implantiert. Die gleiche Anzahl von Wurfgeschwistern wurde nicht implantiert und unter identischen Haltungsbedingungen gehalten. Die Mäuse wurden bei p62 (6 Wochen postoperativ für die implantierte Kohorte) geopfert. Die Schädel wurden sorgfältig gereinigt und der Abstand zwischen Bregma und Lambda (Abbildung 5C, oben links) und die äußere maximale Schädelbreite bei Lambda (Abbildung 5C, oben rechts) wurden extern gemessen. Entlang der Mittellinie des Schädels wurde ein Schnitt gemacht, und eine Hälfte des Schädels wurde entfernt, um das Gehirn für die Massenmessung herauszuschneiden (Abbildung 5C, unten rechts). Die Höhe der Schädelhöhle an der Bregma wurde von der intakten Schädelhälfte aus gemessen (Abbildung 5C, unten links). Kein Maß unterschied sich signifikant zwischen den implantierten und nicht implantierten Kohorten (Wilcoxon-Rangsummentest), was darauf hindeutet, dass die Langzeitimplantation ab p20 keinen groben Einfluss auf die natürliche Entwicklung des Schädels oder des Hirnvolumens hat.

Figure 1
Abbildung 1: Komponenten des Mikroantriebs. Dreidimensionale Darstellungen des (A) Mikroantriebskörpers, (B) der Kanüle, (C) des Konus, (D) des Deckels, (E) der Schraubenbefestigungen und (F) der Tetrodenvorschubschraube. Die kritischen Merkmale jeder Komponente werden angezeigt. Messdetails können aus den Modelldateien extrahiert werden, die bei https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/ verfügbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Mikroantriebskonstruktion . (A) Seiten- und (B) Draufsicht auf die Tetrodenvorschubschraube mit angeschlossenen oberen und unteren Schraubbefestigungen. (C) Seiten- und (D) Draufsicht des Mikroantriebs mit dem angebrachten Gehäuse und der Kanüle und dem großen Polyimidschlauch, der durch jedes Kanülenloch verläuft und auf den Boden der Kanüle zugeschnitten ist. (E) Seitenansicht des Mikroantriebs mit den Schrauben und den kleinen Polyimidschläuchen. Die Oberseiten der kleinen Polyimidrohre werden unmittelbar vor der Tetrodenbeladung beschnitten. (F) Fertiger Mikroantrieb, der an die stereotaktische Vorrichtung angeschlossen ist. Der Schutzkegel, der normalerweise das Mikrolaufwerk umgibt, wurde zu Visualisierungszwecken entfernt. Beachten Sie, dass einige der Schraubenbefestigungen für dieses Mikrolaufwerk in einem schwarzen Harz gedruckt wurden. (G) Gegengewichts-Unterstützungssystem. (H) Seiten- und (I) Draufsicht auf einen Mauskäfig mit angebrachtem Gegengewichtsstützsystem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative elektrophysiologische Aufzeichnungen. Eine p20-Maus wurde wie oben beschrieben mit einem Mikroantrieb implantiert. Beginnend auf p21 und danach jeden Tag für 2 Wochen wurde die Maus an das Aufzeichnungsgerät angeschlossen, und die neuronale Aktivität wurde für mindestens 1 h aufgezeichnet. (A) Rohe lokale Feldpotentialableitungen (LFP) von der bilateralen (L = links; R = rechts) anteriorer cingulärer Kortex (ACC), Hippocampusbereich CA3 (CA3) und Hippocampusbereich CA1 (CA1). Die Daten wurden täglich erhoben; Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden nur Daten von ungeraden Tagen angezeigt. Alle Spuren wurden während der Immobilität im Hauskäfig aufgenommen. Maßstabsbalken: 1 mV, 2 s. (B) Repräsentative Einzeleinheiten, isoliert aus dem Hippocampusbereich CA3 (links) und CA1 (rechts) für die Aufnahmen in Panel A. Alle Rohwellenformen auf jeder Elektrode sind schwarz dargestellt. Der Durchschnitt liegt im roten Bereich. Maßstabsbalken: 50 μV, 0,2 ms. (C) Repräsentative LFP-Rohspuren für jeden 10. Tag bis zum letzten Aufnahmetag bei p60 für eine zweite Maus, die bei p20 implantiert wurde. Die Daten wurden täglich erhoben; Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden nur Daten von jedem 10. Tag angezeigt. Alle Spuren wurden während der Immobilität im Hauskäfig aufgenommen. Maßstab: 1 mV, 2 s. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4. Stabilität der chronischen Aufnahmen. Eine p20-Maus wurde, wie oben beschrieben, mit einem Mikroantrieb implantiert. Beginnend auf p21 und danach für 4 Wochen wurde die Maus an die Aufzeichnungsapparatur angeschlossen, und die neuronale Aktivität wurde für mindestens 1 h aufgezeichnet. Gezeigt werden Daten aus den Tetroden, die auf den dorsalen Hippocampus CA1 abzielen. (A) Rohe (oben) und wellengefilterte (unten) LFP für identifizierte Welligkeitsereignisse bei p21, p30 und p40. Um Welligkeitsereignisse zu identifizieren, wurde der rohe LFP zwischen 125 Hz und 300 Hz bandpassgefiltert, und die Welligkeitsereignisse wurden als transiente Anstiege der Rippelbandleistung von mehr als 3 Standardabweichungen über dem Mittelwert identifiziert. Der Beginn und das Ende jeder Welligkeit wurden als der Punkt definiert, an dem die Rippelbandleistung zum Mittelwert zurückkehrte. Die identifizierten Wellen sind rot dargestellt. Maßstabsleiste: 100 ms, von oben nach unten: 1.000 μV, 140 μV, 1.800 μV, 180 μV, 9.000 μV, 1.200 μV, 10.000 μV, 1.000 μV. (B) Eine repräsentative Einzeleinheit aus jedem Tag aus der CA1-gezielten Tetrode für die Aufnahmen in Panel A. Alle Rohwellenformen auf jeder Elektrode sind schwarz dargestellt. Der Durchschnitt liegt im roten Bereich. Maßstabsbalken 0,2 ms, von oben nach unten: 50 μV, 100 μV, 100 μV. (C) Autokorrelogramm aller Spikes für einzelne Einheiten in Panel B. Diese Daten zeigen eine stabile Elektrodenplatzierung innerhalb der Hippocampus-Pyramidenschicht über mehrere Wochen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Histologie und Einfluss auf die Schädelentwicklung. Eine p20-Maus wurde, wie oben beschrieben, mit einem Mikroantrieb implantiert. Nach dem letzten Aufnahmetag auf p60 wurden an den Abtaststellen elektrolytische Läsionen erzeugt und das Gehirn mit 4%igem Paraformaldehyd perfundiert. Zur Identifizierung der Aufnahmestellen wurden 50 μm-Schnitte angefertigt. (A) Läsionen in CA1 und CA3 des Hippocampus. Die Pfeilspitze bezeichnet den CA3-Aufnahmeort; die Doppelpfeilspitze kennzeichnet die CA1-Aufnahmestelle. Maßstab: 0,5 mm. (B) Läsionen im bilateralen ACC. Die Pfeilspitzen bezeichnen die ACC-Aufnahmestellen. Maßstabsbalken: 0,5 mm. (C) Schädelgröße und Hirnmasse von p62-Mäusen, denen ein Mikroantrieb bei p20 (grau) und nicht implantierten Wurfgeschwistern (weiß) implantiert wurde. Der p-Wert des Wilcoxon-Rangsummentests wird für jede Messung angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Moderne Experimente, die die Funktion neuronaler Schaltkreise in vivo bei Nagetieren untersuchen, nutzen oft die extrazelluläre Elektrophysiologie über dauerhaft implantierte Elektroden, um die Aktivität einzelner Neuronen (d. h. einzelner Einheiten) oder lokaler Populationen (über lokale Feldpotentiale, LFP) zu überwachen, aber solche Methoden werden aufgrund technischer Herausforderungen selten auf juvenile Mäuse angewendet. Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Gewinnung elektrophysiologischer In-vivo-Ableitungen in Mäusen über die entwicklungskritischen Fenster von p20 bis p60 und darüber hinaus. Diese Methodik umfasst einen Herstellungsprozess für den Druck und die Konstruktion eines Micro-Drive-Implantats, ein chirurgisches Implantationsverfahren und eine postoperative Genesungsstrategie, die alle speziell auf den Einsatz bei juvenilen Mäusen zugeschnitten sind. Mehrere Überlegungen waren bei der Entwicklung dieses Protokolls von Bedeutung, darunter die geringe Größe und relative Schwäche von juvenilen Mäusen im Vergleich zu ihren erwachsenen Artgenossen sowie die reduzierte Verknöcherung des juvenilen Mausschädels, an dem der Mikroantrieb befestigt werden musste.

Zwei primäre Methoden, die üblicherweise zur Durchführung der In-vivo-Elektrophysiologie verwendet werden, sind Elektrodenarrays (z. B. Tetroden) und Siliziumsonden. Siliziumsonden sind leichtgewichtig, können eine große Anzahl von Aufzeichnungsstellen pro Gewichtseinheit bereitstellen und wurden zuvor bei juvenilen Ratten eingesetzt25. Siliziumsonden sind jedoch relativ teuer pro Einheit. Im Gegensatz dazu kann das in diesem Manuskript beschriebene Mikrolaufwerk mit weniger als 50 US-Dollar an Rohstoffen hergestellt werden, was es zu einer kostengünstigen Option für die In-vivo-Aufzeichnung macht. Hinzu kommt, dass Siliziumsonden oft in feste Leitungen implantiert werden müssen, was die Aufnahme von räumlich unterschiedlichen Hirnregionen verhindert. Im Gegensatz dazu verwendet das in diesem Manuskript beschriebene Mikroantriebsdesign unabhängig einstellbare Tetroden, um gleichzeitige Aufnahmen an bis zu 16 verschiedenen Orten zu ermöglichen, ohne dass die räumliche Beziehung zwischen diesen Orten praktisch eingeschränkt ist. Dieses Mikroantriebsdesign kann leicht modifiziert werden, um eine andere als die hier beschriebene Position zu ermöglichen, indem die Kanülenlochextrusionen an eine beliebige anteriore/posteriore und mediale/distale Stelle verschoben werden. Wenn Sie auf alternative Gehirnbereiche abzielen, ist es wichtig zu beachten, dass die Tetroden zwar oft gerade verlaufen, es jedoch möglich ist, dass diese dünnen Drähte beim Austritt aus der Mikroantriebskanüle leicht abgelenkt werden. Je kleiner oder ventraler eine Hirnregion ist, desto schwieriger wird es, den Bereich erfolgreich mit Tetroden anzusprechen.

Das in diesem Manuskript beschriebene Mikroantriebsimplantat ähnelt im Grunde mehreren früheren Tetroden-basierten Mikroantriebskonstruktionen 23,32,33,34,35 insofern, als die einzelnen Tetroden an Schrauben befestigt sind, die eine Feinsteuerung der Aufnahmetiefe jeder Tetrode ermöglichen. Während mehrere Merkmale des aktuellen Mikroantriebsdesigns einzigartig sind, einschließlich der Leichtigkeit, räumlich verteilte Gehirnareale anzusprechen, ist die primäre Neuheit des aktuellen Manuskripts die Beschreibung von chirurgischen Implantations- und postoperativen Erholungsstrategien, die chronische Studien der Netzwerkaktivität bei sich noch entwickelnden juvenilen Mäusen ermöglichen. In der Tat könnten die hier beschriebenen Operations- und Genesungsmethoden angepasst werden, um andere Implantate bei juvenilen Mäusen zu unterstützen.

Um eine konsistente Aufzeichnung über mehrere Tage hinweg zu gewährleisten, müssen die Drähte oder Sonden starr am Schädel befestigt werden. Während sich die Gesamtstruktur des Mausschädels nach p20 nur geringfügig verändert, verdickt sich der Schädel zwischen p20 und p4536 erheblich. Tatsächlich ist der Schädel bei p20 nicht steif genug, um ein befestigtes Implantat zu tragen, ohne beschädigt zu werden. Um diese biologische Einschränkung zu überwinden, verdickt dieses Protokoll den Schädel während der Implantationsoperation künstlich über Cyanacrylat. Eine Implantation bei Mäusen, die jünger als p20 sind, ist mit dieser Strategie wahrscheinlich möglich, aber der Mausschädel erfährt erhebliche Größen- und Formveränderungen bis etwa p2036. Daher wird eine Implantation über einen längeren Zeitraum bei Mäusen, die jünger als p20 sind, nicht empfohlen, da das Cyanacrylat und die festen Knochenschrauben im sich noch entwickelnden Schädel das natürliche Wachstum des Schädels und die Entwicklung des zugrunde liegenden Hirngewebes erheblich beeinträchtigen können. Wichtig ist, dass in dieser Studie nach chronischer Implantation ab p20 kein Einfluss auf die Bruttomaße des Schädels oder die Gehirngröße beobachtet wurde (Abbildung 5C).

Ein entscheidender Schritt in der in diesem Manuskript beschriebenen Methode ist die postoperative Genesungsstrategie. Nach dieser Strategie sollte das Gewicht des Implantats kontinuierlich ausgeglichen werden, wenn die Maus reift und die Entwicklung des muskulären und muskuloskelettalen Systems durchläuft. Zu Beginn der Implantation sind Mäuse nicht in der Lage, das Gewicht des Implantats ohne Gegengewicht erfolgreich zu tragen, was zu Unterernährung und Dehydrierung führt, da die Maus die Nahrungs- und Wasserquellen in ihrem Käfig nicht ausreichend erreichen kann. Das Gegengewichtssystem ist einfach und kostengünstig zu konstruieren, trivial zu implementieren und ermöglicht es Mäusen jeden implantierbaren Alters, ihren gesamten Heimkäfig frei zu erkunden und so eine ausreichende Ernährung und Flüssigkeitszufuhr zu gewährleisten. Mit zunehmendem Alter der Mäuse kann das Ausmaß des Gegengewichts verringert werden, bis es bei erwachsenen Mäusen vollständig entfernt werden kann. Es wird jedoch empfohlen, das Gegengewichtssystem für die Dauer des Versuchs weiterhin zu verwenden, wobei immer mindestens ein nominales Gegengewicht angebracht ist. Während eine erwachsene Maus im Laufe der Zeit in der Lage sein mag, die Größe und das Gewicht des Mikroantriebs zu tragen, erzeugt eine fortgesetzte natürliche Bewegung während des freien Verhaltens ohne verbesserndes Gegengewicht Drehmoment und Scherkraft auf die Knochenschrauben, die den Mikroantrieb am Schädel verankern, wodurch die Wahrscheinlichkeit steigt, dass er sich löst, insbesondere bei längeren chronischen Experimenten.

Zwei wichtige Einschränkungen sind für die aktuelle Studie von Bedeutung. Um zunächst den Einfluss der Implantation an p20 auf die Schädel- und Gehirnentwicklung zu untersuchen, wurden mehrere Kohorten von Mäusen nach längerer Implantation geopfert (Abbildung 5C). Während diese Analysen keinen signifikanten Einfluss der Implantation auf die Größe der Schädelhöhle oder die Hirnmasse zeigten (Abbildung 5C), wurde in der aktuellen Studie die Schädelgröße oder Hirnmasse zu mehreren Zeitpunkten während der frühen Entwicklungsphase von p20-p60 nicht untersucht. Während frühere Arbeiten zeigen, dass die Entwicklung der Hirnhöhle durch p2036 abgeschlossen ist, ist es möglich, dass die Implantation in diesem frühen Fenster zu unvorhergesehenen Veränderungen führt, die durch das hier untersuchte Erwachsenenalter korrigiert oder kompensiert werden. Zweitens waren die Experimente, die die in Abbildung 3 und Abbildung 4 gezeigten elektrophysiologischen Daten lieferten, nicht darauf ausgelegt, die Zellausbeute zu maximieren. Die hier vorgestellten Daten zeigen zwar stabile, chronische Aufzeichnungen und gut isolierte Einzeleinheiten, sollten aber nicht als repräsentativ für die maximale potenzielle Ausbeute für dieses Gerät angesehen werden.

Viele neurologische und psychiatrische Störungen des Menschen manifestieren sich in Phasen der frühen Entwicklung oder während der Adoleszenz, einschließlich Autismus und Schizophrenie. Es ist jedoch wenig über die Funktionsstörungen auf Schaltkreisebene bekannt, die diesen Krankheiten zugrunde liegen könnten, trotz der Fülle der verfügbaren Mausmodelle. Die Identifizierung dieser anfänglichen Netzwerkveränderungen ist entscheidend für die Entwicklung von Früherkennungsstrategien und Behandlungsparadigmen. Aufgrund technischer Herausforderungen bleibt jedoch unklar, wie die Netzwerkfunktion in der Entwicklung von Mausmodellen neuropsychiatrischer Erkrankungen gestört wird. Die hier beschriebene Mikroantriebs- und Erholungsstrategie soll Untersuchungen zur Entwicklung multiregionaler Hirnnetzwerke im Mäusegehirn unterstützen und es den Forschern ermöglichen, die gesunde Gehirnentwicklung zu messen und Veränderungen dieser Entwicklung in Mausmodellen zu identifizieren.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) und F99NS12053 (L.D.Q.) sowie dem UT Southwestern GSO Endowment Award (R.J.P. und L.D.Q.) unterstützt. Die Autoren danken Jenny Scaria (Texas Tech University, Health Sciences Center, School of Pharmacy) für die technische Unterstützung und Dr. Brendon Watson (University of Michigan) für methodische Vorschläge.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 V video tracking LEDs Neuralynx HS-LED-Red/Green-omni-10V For use with headstage pre-amplifiers that contain LED sockets for movement tracking purposes
16TT EIB Board Neuralynx EIB-36-16TT Electronic interface board- omnetics connector
16TT headstage pre-amplifier Neuralynx HS-36-LED Omnetics 44 socket signal amplifier between EIB board and tether cable for recording applications; includes connectors for headstage LEDs for movement tracking purposes
Baby-Mixter hemostat FST 13013-14 Fine curved hemostat
Bone anchor screw Stoelting 51457 Used to attach EIB board to main drive body
Burpenorphine ZooPharm Lot #BERLAB0.5-221207 Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL quantity
Cable tether Neuralynx HS-36 Litz Tether Lightweight shielded wire tether for omnetics headstages; length options of 1 m/2 m/3 m/5 m
Carprofen/Rimadyl Bio-Serve MD150-2 Post-operative anti-inflammatory agent
Clear resin v4 Formlabs FLGPGR04 Liquid resin that is photopolymerized by 3D printer during the 3D printing process
Custom (shuttle) screw Advanced Machining and Tooling, Inc. Custom Machined and threaded custom screws
Dental acrylic liquid component Teets denture material Lot# 329801 liquid  component of denture material (see above)
Dental acrylic powder component Teets denture material Lot# 583987 "cold cure" denture material, methyl methacrylate; mixed with liquid component for application to secure recording device in place
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 High calorie dietary supplement for young/recovering mice
Digital Lynx 16SX Neuralynx DigitalLynx 16SX Base Main recording apparatus with 16 combo board slots for up to 512 recording channels
Dissector scissors- heavy blades FST 14082-09 Various
Dumont #5 ceramic coated forceps FST 11252-50 Tetrode handling/threading/pinning
Dumont #5SF forceps FST 11252-00 Multipurpose assembly use
Dumont #5SF forceps FST 11252-00 Multipurpose surgical use
Dumont #7 fine forceps (curved) FST 11274-20 Various
Dumont #7 fine forceps (curved) FST 11274-20 Multipurpose surgical use
EIB-36 plating adapter Neuralynx EIB-36 plating adapter Plating/assembly use
EIB-36 plating adapter Neuralynx EIB-36 plating adapter Stereotactic accessory for lowering drive onto skull during surgery
Euthasol Virbac 710101 Pentobarbital sodium for euthanasia
Extra fine Bonn scissors FST 14083-38 Various
Extra fine graefe forceps FST 11150-10 Small straight serrated forceps
Extra fine graefe forceps FST 11150-10 Small straight serrated forceps
Fine hemostats FST 13006-12 Fine hemostats
Fine scissors- CeramaCut FST 14958-09 Tetrode cutting
Fine scissors- ToughCut FST 14058-09 Various
Form 3+ Formlabs PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC 3D printer for fabrication of all printed parts/materials; low-force stereolithography 3D printer (LFS)
Gel super glue Loctite 1363589 Various steps
Graefe forceps FST 11049-10 Small angled serrated forceps
Ground wire A-M Systems Lot# 582335 Stainless steel bare wire, .005" diameter, annealed, 100 feet
Hair removal gel Generic Commercially available For pre-op removal of hair from top of mouse head
Heat gun Dewalt D26960K Tetrode fusion following spinning
High temperature cautery kit FST 18010-00 For use with bone wax if applicable
Hot bead sterilizer FST 18000-45 Electrical sterilization apparatus for ad hoc instrument sterilization during surgical procedures
Isoflurane Covetrus 11695067771 Standard isoflurane liquid anesthsia for use in isoflurane vaporizer to max 5%
Isopropyl alcohol 91% Generic Commercially available For standard pre-operative sterilization procedure
Jewelry screw (bone screws for juvenile mice) Component supply co. MX-000120-02SFL S/S machine screw #000-120 x 1/8'' filister head, slotted drive
LaGrange scissors FST 14173-12 Various
Large polyimide tubing Nordson medical Lot # 13564 Polyimide tubing- inner diameter 0.0071"; outer diameter 0.0115"; length 36"
Liquid super glue Loctite 1365882 Various steps
Micro drill Foredom K.1070 K.1070 high speed rotary micromotor kit; with control box, 3/32" collet, variable speed foot control, handpiece cradle; stereotactically fittable; 100–115 V use
Micro drill burr (0.5 mm+) FST 19007-05/07/09 Craniotomy
Mineral oil Sigma Pcode 1002076577; M5904-500mL Various steps
Mineral oil Sigma Pcode 1002076577; M5904-500mL For use keeping craniotomy holes open
Miniature flathead screwdriver FST 30051-10 Insertion/tightening of bone screws
Neosporin Triple Antibiotic Ointment Johnson & Johnson 512373700 Antibiotic ointment
Omnetics 44 socket nano connector Neuralynx Neuralynx part #A70427-801 NONSTANDARD ITEM- omnetics 44 socket (female) dual row straight leg nano connector with 2 guide pins (male) for use with custom-made counterbalance apparatus
Platinum 10% iridium wire California fine wire MO# M374710 Fine recording wire spun into tetrodes for use during recording by use of the terode assembly station and spinner 2.0 (see below); HML NATRL VG BOND COAT; SIZE .0007 X 200FT
Platinum black plating solution Neuralynx Platinum black plating solution Plating
Polycarbonate cage bottom Thomas Scientific/Maryland plastics 1113M35; mfr. No. E0270 Standard cage bottom; can be fitted with wire mesh apparatus over top that contains chow+water bottle for unimplanted mice
Polycarbonate cage top with N10 micro filter Ancare N/A Standard cage top to be modified with PVC pipe for counterbalance apparatus
Povidone iodine 10% Generic Commercially available For standard pre-operative sterilization procedure
PVC pipe Charlotte pipe N/A 1/2" x 600 PSI schedule 40 white PVC pipe; for use/assembly into counterbalance apparatus during mouse recovery
Scalpel blades- #4 FST 10060-00 Incision use
Scalpel handle- #4 gross anatomy FST 10060-13 Incision use
Self-holding pin and bone screw forceps FST 26100-00 Holder for bone and ground screws while inserting into skull
Small EIB pins Neuralynx Small EIB pins Attachment of tetrode wires to EIB board
Small polyimide tubing Nordson medical Lot # 19102423 Polyimide tubing- inner diameter 0.004''; outer diameter 0.0044''; length 36"
SolidWorks Dassault Systemes SolidWorks 3D CAD program for micro-drive design
Spatula and probe FST 1090-13 Applicator for petroleum jelly/mineral oil + optional use for ad hoc tetrode straightening
Spring scissors- 8 mm FST 15024-10 Scissors for cranial tissue incisions
Spring scissors- 8 mm FST 15024-10 Initial incisions
Standard pattern forceps FST 11000-12 Large serrated forceps
Surgical scissors- sharp-blunt FST 14001-12 Various
Surgical scissors- ToughCut FST 14054-13 Various
Tetrode assembly station Neuralynx Tetrode assembly station Tetrode Assembly
Tetrode spinner 2.0 Neuralynx Tetrode spinner 2.0 Tetrode Assembly
Two-part epoxy Gorilla brand 4200102 Various steps

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Pendry, R. J., Quigley, L. D., Volk, More

Pendry, R. J., Quigley, L. D., Volk, L. J., Pfeiffer, B. E. A Lightweight Drive Implant for Chronic Tetrode Recordings in Juvenile Mice. J. Vis. Exp. (196), e65228, doi:10.3791/65228 (2023).

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