Her beskriver vi en mikrostasjonsdesign, kirurgisk implantasjonsprosedyre og gjenopprettingsstrategi etter kirurgi som muliggjør kroniske felt- og enkeltenhetsopptak fra flere hjernegrupper samtidig hos unge og unge mus over et kritisk utviklingsvindu fra postnatal dag 20 (p20) til postnatal dag 60 (p60) og utover.
In vivo elektrofysiologi gir enestående innsikt i kretsdynamikken på sub-andre nivå i den intakte hjernen og representerer en metode av særlig betydning for å studere musemodeller av humane nevropsykiatriske lidelser. Imidlertid krever slike metoder ofte store kraniale implantater, som ikke kan brukes til mus på tidlige utviklingstidspunkter. Som sådan har nesten ingen studier av in vivo-fysiologi blitt utført på spedbarn eller unge mus som oppfører seg fritt, til tross for at en bedre forståelse av nevrologisk utvikling i dette kritiske vinduet sannsynligvis vil gi unik innsikt i aldersavhengige utviklingsforstyrrelser som autisme eller schizofreni. Her beskrives en mikrostasjonsdesign, kirurgisk implantasjonsprosedyre og gjenopprettingsstrategi etter kirurgi som muliggjør kroniske felt- og enkeltenhetsopptak fra flere hjernegrupper samtidig hos mus når de eldes fra postnatal dag 20 (p20) til postnatal dag 60 (p60) og utover, et tidsvindu som omtrent tilsvarer menneskets alder på 2 år til voksen alder. Antall opptakselektroder og endelige opptakssteder kan enkelt modifiseres og utvides, og dermed muliggjøre fleksibel eksperimentell kontroll av in vivo-overvåking av atferds- eller sykdomsrelevante hjernegrupper på tvers av utvikling.
Hjernen gjennomgår store endringer i løpet av de kritiske utviklingsvinduene i barndommen og ungdomsårene 1,2,3. Mange nevrologiske og psykiatriske sykdommer, inkludert autisme og schizofreni, manifesterer seg først atferdsmessig og biologisk i denne perioden med ungdoms- og ungdomshjerneutvikling 4,5,6. Mens mye er kjent om cellulære, synaptiske og genetiske endringer som skjer over tidlig utvikling, er relativt lite kjent om hvordan krets- eller nettverksnivåprosesser endres gjennom dette tidsvinduet. Det er viktig at hjernefunksjon på kretsnivå, som til slutt ligger til grunn for kompleks atferd, minne og kognisjon, er en ikke-forutsigbar, fremvoksende egenskap av cellulær og synaptisk funksjon 7,8,9,10. For å forstå hjernefunksjonen på nettverksnivå fullt ut, er det derfor nødvendig å studere nevral aktivitet direkte på nivået av en intakt nevral krets. I tillegg, for å identifisere hvordan hjerneaktiviteten endres gjennom utviklingen av nevropsykiatriske lidelser, er det viktig å undersøke nettverksaktivitet i en gyldig sykdomsmodell under det spesifikke tidsvinduet når sykdommens atferdsfenotyper manifesterer seg og å spore de observerte endringene når de vedvarer i voksen alder.
En av de vanligste og kraftigste vitenskapelige modellorganismene er musen, med et stort antall unike genetiske stammer som modellerer nevrodevelopmental lidelser med aldersavhengig utbrudd av atferdsmessige og / eller mnemoniske fenotyper 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Selv om det er utfordrende å korrelere presise utviklingstidspunkter mellom hjernen til mennesker og mus, indikerer morfologiske og atferdsmessige sammenligninger at p20-p21-mus representerer menneskelige aldre på 2-3 år, og p25-p35-mus representerer menneskelige aldre på 11-14 år, med mus som sannsynligvis når utviklingsekvivalenten til en menneskelig 20 år gammel voksen innen p603, 22. For bedre å forstå hvordan den unge hjernen utvikler seg og for å identifisere hvordan nevrale nettverk i hjernen blir dysfunksjonelle i sykdommer som autisme eller schizofreni, ville det være ideelt å direkte overvåke hjernens aktivitet in vivo hos mus i alderen 20 dager til 60 dager gammel.
En grunnleggende utfordring ved overvåking av hjerneaktivitet på tvers av tidlig utvikling hos mus er imidlertid den lille størrelsen og relative svakheten hos unge mus. Den kroniske implantasjonen av elektroder, som er nødvendig for langsgående studier av hjernens utvikling, krever vanligvis store, klumpete hus for å beskytte de fine elektrodeledningene og grensesnittkortene23,24, og implantatene må være godt festet til museskallen, som er tynnere og mindre stiv hos unge mus på grunn av redusert ossifikasjon. Dermed har nesten alle studier av in vivo gnagerfysiologi blitt utført hos voksne personer på grunn av deres relative størrelse, styrke og skalletykkelse. Til dags dato har de fleste studier som utforsker in vivo juvenil gnagerhjernefysiologi blitt utført i villtype unge rotter, noe som nødvendigvis begrenser evnen til eksperimentelt å overvåke juvenil hjernefunksjon i en fritt oppførende modell av en menneskelig lidelse 25,26,27,28,29,30.
Dette manuskriptet beskriver nytt implantathus, en kirurgisk implantasjonsprosedyre og en gjenopprettingsstrategi etter operasjonen for kronisk å studere den langsiktige (opptil 4 eller flere uker) in vivo hjernefunksjonen til unge mus over et utviklingskritisk tidsvindu (p20 til p60 og utover). Implantasjonsprosedyren tillater pålitelig, permanent festing av elektrodene til hodeskallene til unge mus. Videre er mikrodrivdesignen lett, da denne mikrostasjonen veier ~ 4-6 g når den er fullt montert, og på grunn av den minimale motbalanseringen som kreves for å kompensere for implantatets vekt, påvirker den ikke atferdsytelsen til unge mus under typiske atferdsparadigmer.
Moderne eksperimenter som utforsker in vivo nevrale kretsfunksjoner hos gnagere, bruker ofte ekstracellulær elektrofysiologi via permanent implanterte elektroder for å overvåke aktiviteten til individuelle nevroner (dvs. enkeltenheter) eller lokale populasjoner (via lokale feltpotensialer, LFP), men slike metoder brukes sjelden på unge mus på grunn av tekniske utfordringer. Dette manuskriptet beskriver en metode for å oppnå in vivo elektrofysiologiske opptak hos mus over utviklingskritiske vinduer fra p20 til p60 og utover. Denne metoden innebærer en produksjonsprosess for utskrift og konstruksjon av et mikrodrivimplantat, en kirurgisk implantasjonsprosedyre og en gjenopprettingsstrategi etter operasjonen, som alle er skreddersydd for bruk i unge mus. Flere hensyn var innflytelsesrike i utviklingen av denne protokollen, inkludert den lille størrelsen og relative svakheten til unge mus sammenlignet med deres voksne kolleger, samt den reduserte ossifikasjonen av den unge museskallen som mikrostasjonen måtte festes på.
To primære metoder som vanligvis brukes til å utføre in vivo elektrofysiologi er matriser av elektroder (f.eks. Tetroder) og silisiumprober. Silisiumsonder er lette, kan gi et stort antall opptakssteder per vektenhet, og har tidligere blitt brukt i unge rotter25. Imidlertid er silisiumprober relativt dyre per enhet. I motsetning til dette kan mikrostasjonen beskrevet i dette manuskriptet konstrueres ved å bruke mindre enn $ 50 USD i råvarer, noe som gjør det til et kostnadseffektivt alternativ for in vivo-opptak . I tillegg må silisiumprober ofte implanteres i faste linjer, noe som forbyr opptak av romlig forskjellige hjernegrupper. I motsetning til dette bruker mikrostasjonsdesignet beskrevet i dette manuskriptet uavhengig justerbare tetroder for å imøtekomme samtidige opptak på opptil 16 forskjellige steder med praktisk talt ingen begrensning på det romlige forholdet mellom disse stedene. Denne mikrodrivdesignen kan enkelt modifiseres for å tillate målretting mot forskjellige steder enn de som er beskrevet her ved å flytte kanylehullprofilene til ønsket fremre / bakre og mediale / distale plassering. Når du målretter mot alternative hjerneområder, er det viktig å merke seg at mens tetrodene ofte vil reise rett, er det mulig for disse tynne ledningene å avbøye litt når de går ut av mikrodrivkanylen. Således, jo mindre eller mer ventral en hjernegruppe er, desto mer utfordrende vil det være å lykkes med å målrette området med tetroder.
Mikrodrivimplantatet beskrevet i dette manuskriptet er grunnleggende likt flere tidligere tetrodebaserte mikrodrivdesign 23,32,33,34,35 ved at de enkelte tetrodene er festet til skruer, noe som muliggjør fin kontroll av opptaksdybden til hver tetrode. Mens flere funksjoner i den nåværende mikrostasjonsdesignen er unike, inkludert det enkle å målrette romlig distribuerte hjerneområder, er den primære nyheten i det nåværende manuskriptet beskrivelsen av kirurgisk implantasjon og gjenopprettingsstrategier etter kirurgi, noe som muliggjør kroniske studier av nettverksaktivitet hos fortsatt utviklende unge mus. Faktisk kan operasjons- og gjenopprettingsmetodene som er beskrevet her, tilpasses for å støtte andre implantater i unge mus.
For å opprettholde et konsistent opptak over flere dager, må ledningene eller sondene festes stivt til skallen. Mens den generelle strukturen til museskallen bare gjennomgår mindre endringer etter p20, tykner skallen betydelig mellom alderen p20 og p4536. Faktisk er skallen på p20 utilstrekkelig stiv til å støtte et festet implantat uten å bli skadet. For å overvinne denne biologiske begrensningen, tykner denne protokollen kunstig skallen via cyanoakrylat under implantasjonsoperasjonen. Implantasjon hos mus yngre enn p20 er sannsynligvis mulig ved hjelp av denne strategien, men museskallen gjennomgår betydelige størrelses- og formendringer til omtrent p2036. Dermed anbefales ikke implantasjon i lengre perioder hos mus yngre enn p20, da cyanoakrylat og faste beinskruer i den fortsatt utviklende skallen kan påvirke den naturlige veksten av skallen og den underliggende hjernevevsutviklingen betydelig. Det er viktig at det i denne studien ikke ble observert noen innvirkning på bruttomålingene av skallen eller hjernestørrelsen etter kronisk implantasjon som startet på p20 (figur 5C).
Et kritisk trinn i metoden beskrevet i dette manuskriptet er gjenopprettingsstrategien etter operasjonen; I henhold til denne strategien skal implantatets vekt kontinuerlig balanseres når musen modnes og gjennomgår muskel- og muskel- og skjelettsystemutvikling. Tidlig etter implantasjon klarer ikke mus å bære vekten av implantatet uten motvekten, noe som fører til underernæring og dehydrering da musen ikke tilstrekkelig kan nå mat- og vannkildene i buret. Motvektssystemet er enkelt og billig å konstruere, trivielt å implementere, og lar mus i hvilken som helst implanterbar alder fritt utforske hele hjemmeburet, og dermed sikre tilstrekkelig ernæring og hydrering. Når mus blir eldre, kan mengden motvekt reduseres til den kan fjernes helt hos voksne mus; Det anbefales imidlertid fortsatt bruk av motvektsystemet i løpet av forsøket med minst en nominell motvekt festet til enhver tid. Mens en voksen mus kan være i stand til å bære størrelsen og vekten av mikrostasjonen over tid, produserer fortsatt naturlig bevegelse under fri oppførsel uten forbedrende motvekt dreiemoment og skjærkraft på beinskruene som forankrer mikrostasjonen på skallen, noe som gjør det stadig mer sannsynlig å bli løsrevet, spesielt under lengre kroniske eksperimenter.
To viktige begrensninger er verdt å merke seg for den aktuelle studien. For det første, for å vurdere effekten av implantasjon ved p20 på hodeskalle og hjerneutvikling, ble flere kohorter av mus ofret etter langvarig implantasjon (figur 5C). Selv om disse analysene ikke viste noen signifikant innvirkning av implantasjon på hodeskallehulens størrelse eller hjernemasse (figur 5C), undersøkte den nåværende studien ikke skallestørrelsen eller hjernemassen på flere tidspunkter gjennom den tidlige utviklingsperioden p20-p60. Mens tidligere arbeid viser at utviklingen av hjernehulen er fullført innen p2036, er det mulig at implantasjon i dette tidlige vinduet kan gi uventede endringer som korrigeres eller kompenseres av de voksne aldrene som ble evaluert her. For det andre var eksperimentene som produserte de elektrofysiologiske dataene vist i figur 3 og figur 4 ikke designet for å maksimere celleutbyttet. Selv om dataene som presenteres her, viser stabile, kroniske opptak og godt isolerte enkeltenheter, bør de derfor ikke tas som representative for det maksimale potensielle utbyttet for denne enheten.
Mange menneskelige nevrologiske og psykiatriske lidelser manifesterer seg i perioder med tidlig utvikling eller over ungdomsårene, inkludert autisme og schizofreni. Imidlertid er lite kjent om dysfunksjonen på kretsnivå som kan ligge til grunn for disse sykdommene, til tross for mengden musemodeller som er tilgjengelige. Identifiseringen av disse innledende nettverksendringene er avgjørende for å skape tidlige deteksjonsstrategier og behandlingsparadigmer. Likevel, på grunn av tekniske utfordringer, er det fortsatt uklart hvordan nettverksfunksjonen forstyrres på tvers av utvikling i musemodeller av nevropsykiatriske sykdommer. Mikrostasjonen og gjenopprettingsstrategien som er beskrevet her, er utformet for å støtte undersøkelser av multiregional hjernenettverksutvikling i musehjernen og dermed tillate forskere å måle sunn hjerneutvikling, samt identifisere endringer i utviklingen i musemodeller av sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) og F99NS12053 (L.D.Q.) og UT Southwestern GSO Endowment Award (R.J.P. og L.D.Q.). Forfatterne takker Jenny Scaria (Texas Tech University Health Sciences Center School of Pharmacy) for teknisk assistanse og Dr. Brendon Watson (University of Michigan) for metodologiske forslag.
10 V video tracking LEDs | Neuralynx | HS-LED-Red/Green-omni-10V | For use with headstage pre-amplifiers that contain LED sockets for movement tracking purposes |
16TT EIB Board | Neuralynx | EIB-36-16TT | Electronic interface board- omnetics connector |
16TT headstage pre-amplifier | Neuralynx | HS-36-LED | Omnetics 44 socket signal amplifier between EIB board and tether cable for recording applications; includes connectors for headstage LEDs for movement tracking purposes |
Baby-Mixter hemostat | FST | 13013-14 | Fine curved hemostat |
Bone anchor screw | Stoelting | 51457 | Used to attach EIB board to main drive body |
Burpenorphine | ZooPharm | Lot #BERLAB0.5-221207 | Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL quantity |
Cable tether | Neuralynx | HS-36 Litz Tether | Lightweight shielded wire tether for omnetics headstages; length options of 1 m/2 m/3 m/5 m |
Carprofen/Rimadyl | Bio-Serve | MD150-2 | Post-operative anti-inflammatory agent |
Clear resin v4 | Formlabs | FLGPGR04 | Liquid resin that is photopolymerized by 3D printer during the 3D printing process |
Custom (shuttle) screw | Advanced Machining and Tooling, Inc. | Custom | Machined and threaded custom screws |
Dental acrylic liquid component | Teets denture material | Lot# 329801 | liquid component of denture material (see above) |
Dental acrylic powder component | Teets denture material | Lot# 583987 | "cold cure" denture material, methyl methacrylate; mixed with liquid component for application to secure recording device in place |
DietGel Boost | ClearH2O | 72-04-5022 | High calorie dietary supplement for young/recovering mice |
Digital Lynx 16SX | Neuralynx | DigitalLynx 16SX Base | Main recording apparatus with 16 combo board slots for up to 512 recording channels |
Dissector scissors- heavy blades | FST | 14082-09 | Various |
Dumont #5 ceramic coated forceps | FST | 11252-50 | Tetrode handling/threading/pinning |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose assembly use |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose surgical use |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Various |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Multipurpose surgical use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Plating/assembly use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Stereotactic accessory for lowering drive onto skull during surgery |
Euthasol | Virbac | 710101 | Pentobarbital sodium for euthanasia |
Extra fine Bonn scissors | FST | 14083-38 | Various |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Fine hemostats | FST | 13006-12 | Fine hemostats |
Fine scissors- CeramaCut | FST | 14958-09 | Tetrode cutting |
Fine scissors- ToughCut | FST | 14058-09 | Various |
Form 3+ | Formlabs | PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC | 3D printer for fabrication of all printed parts/materials; low-force stereolithography 3D printer (LFS) |
Gel super glue | Loctite | 1363589 | Various steps |
Graefe forceps | FST | 11049-10 | Small angled serrated forceps |
Ground wire | A-M Systems | Lot# 582335 | Stainless steel bare wire, .005" diameter, annealed, 100 feet |
Hair removal gel | Generic | Commercially available | For pre-op removal of hair from top of mouse head |
Heat gun | Dewalt | D26960K | Tetrode fusion following spinning |
High temperature cautery kit | FST | 18010-00 | For use with bone wax if applicable |
Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | Electrical sterilization apparatus for ad hoc instrument sterilization during surgical procedures |
Isoflurane | Covetrus | 11695067771 | Standard isoflurane liquid anesthsia for use in isoflurane vaporizer to max 5% |
Isopropyl alcohol 91% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
Jewelry screw (bone screws for juvenile mice) | Component supply co. | MX-000120-02SFL | S/S machine screw #000-120 x 1/8'' filister head, slotted drive |
LaGrange scissors | FST | 14173-12 | Various |
Large polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 13564 | Polyimide tubing- inner diameter 0.0071"; outer diameter 0.0115"; length 36" |
Liquid super glue | Loctite | 1365882 | Various steps |
Micro drill | Foredom | K.1070 | K.1070 high speed rotary micromotor kit; with control box, 3/32" collet, variable speed foot control, handpiece cradle; stereotactically fittable; 100–115 V use |
Micro drill burr (0.5 mm+) | FST | 19007-05/07/09 | Craniotomy |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | Various steps |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | For use keeping craniotomy holes open |
Miniature flathead screwdriver | FST | 30051-10 | Insertion/tightening of bone screws |
Neosporin Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 512373700 | Antibiotic ointment |
Omnetics 44 socket nano connector | Neuralynx | Neuralynx part #A70427-801 | NONSTANDARD ITEM- omnetics 44 socket (female) dual row straight leg nano connector with 2 guide pins (male) for use with custom-made counterbalance apparatus |
Platinum 10% iridium wire | California fine wire | MO# M374710 | Fine recording wire spun into tetrodes for use during recording by use of the terode assembly station and spinner 2.0 (see below); HML NATRL VG BOND COAT; SIZE .0007 X 200FT |
Platinum black plating solution | Neuralynx | Platinum black plating solution | Plating |
Polycarbonate cage bottom | Thomas Scientific/Maryland plastics | 1113M35; mfr. No. E0270 | Standard cage bottom; can be fitted with wire mesh apparatus over top that contains chow+water bottle for unimplanted mice |
Polycarbonate cage top with N10 micro filter | Ancare | N/A | Standard cage top to be modified with PVC pipe for counterbalance apparatus |
Povidone iodine 10% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
PVC pipe | Charlotte pipe | N/A | 1/2" x 600 PSI schedule 40 white PVC pipe; for use/assembly into counterbalance apparatus during mouse recovery |
Scalpel blades- #4 | FST | 10060-00 | Incision use |
Scalpel handle- #4 gross anatomy | FST | 10060-13 | Incision use |
Self-holding pin and bone screw forceps | FST | 26100-00 | Holder for bone and ground screws while inserting into skull |
Small EIB pins | Neuralynx | Small EIB pins | Attachment of tetrode wires to EIB board |
Small polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 19102423 | Polyimide tubing- inner diameter 0.004''; outer diameter 0.0044''; length 36" |
SolidWorks | Dassault Systemes | SolidWorks | 3D CAD program for micro-drive design |
Spatula and probe | FST | 1090-13 | Applicator for petroleum jelly/mineral oil + optional use for ad hoc tetrode straightening |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Scissors for cranial tissue incisions |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Initial incisions |
Standard pattern forceps | FST | 11000-12 | Large serrated forceps |
Surgical scissors- sharp-blunt | FST | 14001-12 | Various |
Surgical scissors- ToughCut | FST | 14054-13 | Various |
Tetrode assembly station | Neuralynx | Tetrode assembly station | Tetrode Assembly |
Tetrode spinner 2.0 | Neuralynx | Tetrode spinner 2.0 | Tetrode Assembly |
Two-part epoxy | Gorilla brand | 4200102 | Various steps |