Här beskriver vi en mikrodrivdesign, kirurgisk implantationsprocedur och återhämtningsstrategi efter operation som möjliggör kroniska fält- och enhetsinspelningar från flera hjärnregioner samtidigt hos unga och unga möss över ett kritiskt utvecklingsfönster från postnatal dag 20 (p20) till postnatal dag 60 (p60) och därefter.
In vivo elektrofysiologi ger oöverträffad inblick i kretsdynamiken under andra nivån i den intakta hjärnan och representerar en metod av särskild betydelse för att studera musmodeller av mänskliga neuropsykiatriska störningar. Sådana metoder kräver emellertid ofta stora kranialimplantat, som inte kan användas hos möss vid tidiga utvecklingstidpunkter. Som sådan har praktiskt taget inga studier av in vivo-fysiologi utförts på fritt betande spädbarn eller unga möss, trots att en bättre förståelse av neurologisk utveckling i detta kritiska fönster sannolikt skulle ge unika insikter i åldersberoende utvecklingsstörningar som autism eller schizofreni. Här beskrivs en mikrodrivdesign, kirurgisk implantationsprocedur och återhämtningsstrategi efter operation som möjliggör kroniska fält- och enhetsinspelningar från flera hjärnregioner samtidigt hos möss när de åldras från postnatal dag 20 (p20) till postnatal dag 60 (p60) och därefter, ett tidsfönster som ungefär motsvarar människans åldrar 2 år till vuxen ålder. Antalet inspelningselektroder och slutliga inspelningsplatser kan enkelt modifieras och utökas, vilket möjliggör flexibel experimentell kontroll av in vivo-övervakning av beteende- eller sjukdomsrelevanta hjärnregioner under utveckling.
Hjärnan genomgår storskaliga förändringar under de kritiska utvecklingsfönstren i barndomen och tonåren 1,2,3. Många neurologiska och psykiatriska sjukdomar, inklusive autism och schizofreni, manifesterar sig först beteendemässigt och biologiskt under denna period av juvenil och ungdoms hjärnutveckling 4,5,6. Medan mycket är känt om de cellulära, synaptiska och genetiska förändringar som sker över tidig utveckling, är relativt lite känt om hur krets- eller nätverksnivåprocesser förändras under hela detta tidsfönster. Det är viktigt att hjärnfunktionen på kretsnivå, som i slutändan ligger till grund för komplexa beteenden, minne och kognition, är en icke-förutsägbar, framväxande egenskap hos cellulär och synaptisk funktion 7,8,9,10. För att fullt ut förstå hjärnfunktionen på nätverksnivå är det således nödvändigt att direkt studera neural aktivitet i nivå med en intakt neural krets. För att identifiera hur hjärnaktiviteten förändras under utvecklingen av neuropsykiatriska störningar är det dessutom viktigt att undersöka nätverksaktivitet i en giltig sjukdomsmodell under det specifika tidsfönstret när sjukdomens beteendefenotyper manifesteras och att spåra de observerade förändringarna när de kvarstår i vuxen ålder.
En av de vanligaste och mest kraftfulla vetenskapliga modellorganismerna är musen, med ett stort antal unika genetiska stammar som modellerar utvecklingsneurologiska störningar med åldersberoende debut av beteendemässiga och/eller mnemoniska fenotyper 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Även om det är utmanande att korrelera exakta utvecklingstidpunkter mellan hjärnorna hos människor och möss, indikerar morfologiska och beteendemässiga jämförelser att p20-p21-möss representerar mänskliga åldrar 2-3 år och p25-p35-möss representerar mänskliga åldrar 11-14 år, med möss som sannolikt når utvecklingsekvivalenten för en mänsklig 20-årig vuxen med p603, 22. Således, för att bättre förstå hur den unga hjärnan utvecklas och för att identifiera hur hjärnans neurala nätverk blir dysfunktionella vid sjukdomar som autism eller schizofreni, skulle det vara idealiskt att direkt övervaka hjärnaktiviteten in vivo hos möss i åldrarna 20 dagar till 60 dagar gamla.
En grundläggande utmaning vid övervakning av hjärnaktivitet över tidig utveckling hos möss är dock den lilla storleken och relativa svagheten hos unga möss. Den kroniska implantationen av elektroder, som är nödvändig för longitudinella studier av hjärnans utveckling, kräver vanligtvis stort, skrymmande hölje för att skydda de fina elektrodtrådarna och gränssnittskorten23,24, och implantaten måste vara ordentligt fästa vid musskallen, som är tunnare och mindre styv hos unga möss på grund av minskad benbildning. Således har praktiskt taget alla studier av in vivo gnagarfysiologi utförts på vuxna försökspersoner på grund av deras relativa storlek, styrka och skalltjocklek. Hittills har de flesta studier som undersöker in vivo juvenil gnagare hjärnfysiologi utförts på unga råttor av vildtyp, vilket nödvändigtvis begränsar förmågan att experimentellt övervaka juvenil hjärnfunktion i en fritt betande modell av en mänsklig störning 25,26,27,28,29,30.
Detta manuskript beskriver nya implantathus, ett kirurgiskt implantationsförfarande och en återhämtningsstrategi efter operationen för att kroniskt studera den långsiktiga (upp till 4 eller fler veckor) in vivo-hjärnfunktionen hos unga möss över ett utvecklingskritiskt tidsfönster (p20 till p60 och därefter). Implantationsproceduren möjliggör tillförlitlig, permanent anbringering av elektroderna på skallarna hos unga möss. Dessutom är mikrodrivdesignen lätt, eftersom denna mikrodrivenhet väger ~ 4-6 g när den är helt monterad, och på grund av den minimala motvikt som krävs för att kompensera implantatets vikt påverkar den inte beteendeprestandan hos unga möss under typiska beteendeparadigmer.
Moderna experiment som utforskar in vivo neural kretsfunktion hos gnagare använder ofta extracellulär elektrofysiologi via permanent implanterade elektroder för att övervaka aktiviteten hos enskilda neuroner (dvs enskilda enheter) eller lokala populationer (via lokala fältpotentialer, LFP), men sådana metoder tillämpas sällan på unga möss på grund av tekniska utmaningar. Detta manuskript beskriver en metod för att erhålla in vivo elektrofysiologiska inspelningar hos möss över de utvecklingskritiska fönstren p20 till p60 och därefter. Denna metod innefattar en tillverkningsprocess för utskrift och konstruktion av ett mikrodrivet implantat, ett kirurgiskt implantationsförfarande och en återhämtningsstrategi efter operationen, som alla är skräddarsydda för användning hos unga möss. Flera överväganden var inflytelserika i utvecklingen av detta protokoll, inklusive den lilla storleken och relativa svagheten hos unga möss jämfört med deras vuxna motsvarigheter, liksom den minskade förbeningen av den unga musskallen på vilken mikroenheten behövde fästas.
Två primära metoder som vanligtvis används för att utföra in vivo elektrofysiologi är matriser av elektroder (t.ex. tetroder) och kiselprober. Kiselsonder är lätta, kan ge ett stort antal inspelningsplatser per viktenhet och har tidigare använts hos unga råttor25. Kiselsonder är dock relativt dyra per enhet. Däremot kan mikroenheten som beskrivs i detta manuskript konstrueras med mindre än $ 50 USD i råvaror, vilket gör det till ett kostnadseffektivt alternativ för in vivo-inspelning . Dessutom måste kiselsonder ofta implanteras i fasta linjer, vilket förbjuder inspelning av rumsligt olika hjärnregioner. Däremot använder mikrodrivdesignen som beskrivs i detta manuskript oberoende justerbara tetroder för att rymma samtidiga inspelningar på upp till 16 olika platser med praktiskt taget ingen begränsning av det rumsliga förhållandet mellan dessa platser. Denna mikrodrivdesign kan enkelt modifieras för att möjliggöra inriktning på andra platser än de som beskrivs här genom att flytta kanylhålsprofilerna till önskad främre/bakre och medial/distal plats. När man riktar in sig på alternativa hjärnområden är det viktigt att notera att medan tetroderna ofta kommer att resa rakt, är det möjligt för dessa tunna trådar att avböjas något när de lämnar mikrodrivkanylen. Således, ju mindre eller mer ventral en hjärnregion är, desto mer utmanande blir det att framgångsrikt rikta området med tetroder.
Mikrodrivimplantatet som beskrivs i detta manuskript liknar i grunden flera tidigare tetrodbaserade mikrodrivkonstruktioner 23,32,33,34,35 genom att de enskilda tetroderna är fästa på skruvar, vilket möjliggör finkontroll av inspelningsdjupet för varje tetrode. Medan flera funktioner i den nuvarande mikrodrivdesignen är unika, inklusive lättheten att rikta in sig på rumsligt fördelade hjärnområden, är den primära nyheten i det aktuella manuskriptet beskrivningen av kirurgiska implantations- och återhämtningsstrategier efter operation, vilket möjliggör kroniska studier av nätverksaktivitet hos unga möss som fortfarande utvecklas. De kirurgiska metoder och återhämtningsmetoder som beskrivs här skulle kunna anpassas för att stödja andra implantat hos unga möss.
För att upprätthålla en konsekvent inspelning över flera dagar måste ledningarna eller sonderna vara fast fästa på skallen. Medan musskallens övergripande struktur endast genomgår mindre förändringar efter p20, tjocknar skallen avsevärt mellan åldrarna p20 och p4536. Faktum är att skallen vid p20 inte är tillräckligt styv för att stödja ett bifogat implantat utan att skadas. För att övervinna denna biologiska begränsning förtjockar detta protokoll artificiellt skallen via cyanoakrylat under implantationsoperationen. Implantation hos möss yngre än p20 är sannolikt möjlig med denna strategi, men musskallen genomgår betydande storleks- och formförändringar tills ungefär p2036. Således rekommenderas inte implantation under längre perioder hos möss yngre än p20 eftersom cyanoakrylatet och fasta benskruvar i den fortfarande utvecklande skallen kan påverka den naturliga tillväxten av skallen och den underliggande hjärnvävnadsutvecklingen. Viktigt är att i denna studie observerades ingen påverkan på bruttomätningarna av skallen eller hjärnstorleken efter kronisk implantation som började vid p20 (figur 5C).
Ett kritiskt steg i metoden som beskrivs i detta manuskript är återhämtningsstrategin efter operationen; Enligt denna strategi bör implantatets vikt kontinuerligt balanseras när musen mognar och genomgår muskulär och muskuloskeletal systemutveckling. Tidigt efter implantationen kan möss inte framgångsrikt bära implantatets vikt utan motvikten, vilket leder till undernäring och uttorkning eftersom musen inte kan nå mat- och vattenkällorna i buren tillräckligt. Motviktssystemet är enkelt och billigt att konstruera, trivialt att implementera och tillåter möss i alla implanterbara åldrar att fritt utforska hela sin hembur, vilket säkerställer tillräcklig näring och hydrering. När möss åldras kan mängden motvikt minskas tills den kan avlägsnas helt hos vuxna möss; Fortsatt användning av motviktssystemet rekommenderas dock under försöket med åtminstone en nominell motvikt kopplad vid alla tidpunkter. Medan en vuxen mus kanske kan bära mikrodrivenhetens storlek och vikt över tiden, ger fortsatt naturlig rörelse under fritt beteende utan förbättrande motvikt vridmoment och skjuvkraft på benskruvarna som förankrar mikroenheten på skallen, vilket gör det alltmer sannolikt att lossna, särskilt under längre kroniska experiment.
Två viktiga begränsningar är att notera för den aktuella studien. För det första, för att bedöma effekten av implantation vid p20 på skalle och hjärnutveckling, offrades flera kohorter av möss efter långvarig implantation (figur 5C). Medan dessa analyser inte avslöjade någon signifikant inverkan av implantation på skallhålans storlek eller hjärnmassa (figur 5C), undersökte den aktuella studien inte skallstorleken eller hjärnmassan vid flera tidpunkter under den tidiga utvecklingsperioden av p20-p60. Medan tidigare arbete visar att utvecklingen av hjärnhålan är klar med p2036, är det möjligt att implantation vid detta tidiga fönster kan ge oväntade förändringar som korrigeras eller kompenseras av de vuxna åldrarna som utvärderades här. För det andra var experimenten som producerade de elektrofysiologiska data som visas i figur 3 och figur 4 inte utformade för att maximera cellutbytet. Således, medan de data som presenteras här visar stabila, kroniska registreringar och välisolerade enskilda enheter, bör de inte tas som representativa för den maximala potentiella avkastningen för denna enhet.
Många mänskliga neurologiska och psykiatriska störningar manifesteras under perioder av tidig utveckling eller över tonåren, inklusive autism och schizofreni. Men lite är känt om dysfunktion på kretsnivå som kan ligga till grund för dessa sjukdomar, trots den uppsjö av musmodeller som finns tillgängliga. Identifieringen av dessa initiala nätverksförändringar är avgörande för att skapa strategier för tidig upptäckt och behandlingsparadigmer. Men på grund av tekniska utmaningar är det fortfarande oklart hur nätverksfunktionen störs över utvecklingen av musmodeller av neuropsykiatriska sjukdomar. Mikrodrivnings- och återhämtningsstrategin som beskrivs här är utformad för att stödja undersökningar av multiregional hjärnnätverksutveckling i mushjärnan och därmed tillåta forskare att mäta hälsosam hjärnutveckling samt identifiera förändringar i den utvecklingen i musmodeller av sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) och F99NS12053 (L.D.Q.) och UT Southwestern GSO Endowment Award (R.J.P. och L.D.Q.). Författarna tackar Jenny Scaria (Texas Tech University Health Sciences Center School of Pharmacy) för teknisk hjälp och Dr. Brendon Watson (University of Michigan) för metodologiska förslag.
10 V video tracking LEDs | Neuralynx | HS-LED-Red/Green-omni-10V | For use with headstage pre-amplifiers that contain LED sockets for movement tracking purposes |
16TT EIB Board | Neuralynx | EIB-36-16TT | Electronic interface board- omnetics connector |
16TT headstage pre-amplifier | Neuralynx | HS-36-LED | Omnetics 44 socket signal amplifier between EIB board and tether cable for recording applications; includes connectors for headstage LEDs for movement tracking purposes |
Baby-Mixter hemostat | FST | 13013-14 | Fine curved hemostat |
Bone anchor screw | Stoelting | 51457 | Used to attach EIB board to main drive body |
Burpenorphine | ZooPharm | Lot #BERLAB0.5-221207 | Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL quantity |
Cable tether | Neuralynx | HS-36 Litz Tether | Lightweight shielded wire tether for omnetics headstages; length options of 1 m/2 m/3 m/5 m |
Carprofen/Rimadyl | Bio-Serve | MD150-2 | Post-operative anti-inflammatory agent |
Clear resin v4 | Formlabs | FLGPGR04 | Liquid resin that is photopolymerized by 3D printer during the 3D printing process |
Custom (shuttle) screw | Advanced Machining and Tooling, Inc. | Custom | Machined and threaded custom screws |
Dental acrylic liquid component | Teets denture material | Lot# 329801 | liquid component of denture material (see above) |
Dental acrylic powder component | Teets denture material | Lot# 583987 | "cold cure" denture material, methyl methacrylate; mixed with liquid component for application to secure recording device in place |
DietGel Boost | ClearH2O | 72-04-5022 | High calorie dietary supplement for young/recovering mice |
Digital Lynx 16SX | Neuralynx | DigitalLynx 16SX Base | Main recording apparatus with 16 combo board slots for up to 512 recording channels |
Dissector scissors- heavy blades | FST | 14082-09 | Various |
Dumont #5 ceramic coated forceps | FST | 11252-50 | Tetrode handling/threading/pinning |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose assembly use |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose surgical use |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Various |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Multipurpose surgical use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Plating/assembly use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Stereotactic accessory for lowering drive onto skull during surgery |
Euthasol | Virbac | 710101 | Pentobarbital sodium for euthanasia |
Extra fine Bonn scissors | FST | 14083-38 | Various |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Fine hemostats | FST | 13006-12 | Fine hemostats |
Fine scissors- CeramaCut | FST | 14958-09 | Tetrode cutting |
Fine scissors- ToughCut | FST | 14058-09 | Various |
Form 3+ | Formlabs | PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC | 3D printer for fabrication of all printed parts/materials; low-force stereolithography 3D printer (LFS) |
Gel super glue | Loctite | 1363589 | Various steps |
Graefe forceps | FST | 11049-10 | Small angled serrated forceps |
Ground wire | A-M Systems | Lot# 582335 | Stainless steel bare wire, .005" diameter, annealed, 100 feet |
Hair removal gel | Generic | Commercially available | For pre-op removal of hair from top of mouse head |
Heat gun | Dewalt | D26960K | Tetrode fusion following spinning |
High temperature cautery kit | FST | 18010-00 | For use with bone wax if applicable |
Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | Electrical sterilization apparatus for ad hoc instrument sterilization during surgical procedures |
Isoflurane | Covetrus | 11695067771 | Standard isoflurane liquid anesthsia for use in isoflurane vaporizer to max 5% |
Isopropyl alcohol 91% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
Jewelry screw (bone screws for juvenile mice) | Component supply co. | MX-000120-02SFL | S/S machine screw #000-120 x 1/8'' filister head, slotted drive |
LaGrange scissors | FST | 14173-12 | Various |
Large polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 13564 | Polyimide tubing- inner diameter 0.0071"; outer diameter 0.0115"; length 36" |
Liquid super glue | Loctite | 1365882 | Various steps |
Micro drill | Foredom | K.1070 | K.1070 high speed rotary micromotor kit; with control box, 3/32" collet, variable speed foot control, handpiece cradle; stereotactically fittable; 100–115 V use |
Micro drill burr (0.5 mm+) | FST | 19007-05/07/09 | Craniotomy |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | Various steps |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | For use keeping craniotomy holes open |
Miniature flathead screwdriver | FST | 30051-10 | Insertion/tightening of bone screws |
Neosporin Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 512373700 | Antibiotic ointment |
Omnetics 44 socket nano connector | Neuralynx | Neuralynx part #A70427-801 | NONSTANDARD ITEM- omnetics 44 socket (female) dual row straight leg nano connector with 2 guide pins (male) for use with custom-made counterbalance apparatus |
Platinum 10% iridium wire | California fine wire | MO# M374710 | Fine recording wire spun into tetrodes for use during recording by use of the terode assembly station and spinner 2.0 (see below); HML NATRL VG BOND COAT; SIZE .0007 X 200FT |
Platinum black plating solution | Neuralynx | Platinum black plating solution | Plating |
Polycarbonate cage bottom | Thomas Scientific/Maryland plastics | 1113M35; mfr. No. E0270 | Standard cage bottom; can be fitted with wire mesh apparatus over top that contains chow+water bottle for unimplanted mice |
Polycarbonate cage top with N10 micro filter | Ancare | N/A | Standard cage top to be modified with PVC pipe for counterbalance apparatus |
Povidone iodine 10% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
PVC pipe | Charlotte pipe | N/A | 1/2" x 600 PSI schedule 40 white PVC pipe; for use/assembly into counterbalance apparatus during mouse recovery |
Scalpel blades- #4 | FST | 10060-00 | Incision use |
Scalpel handle- #4 gross anatomy | FST | 10060-13 | Incision use |
Self-holding pin and bone screw forceps | FST | 26100-00 | Holder for bone and ground screws while inserting into skull |
Small EIB pins | Neuralynx | Small EIB pins | Attachment of tetrode wires to EIB board |
Small polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 19102423 | Polyimide tubing- inner diameter 0.004''; outer diameter 0.0044''; length 36" |
SolidWorks | Dassault Systemes | SolidWorks | 3D CAD program for micro-drive design |
Spatula and probe | FST | 1090-13 | Applicator for petroleum jelly/mineral oil + optional use for ad hoc tetrode straightening |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Scissors for cranial tissue incisions |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Initial incisions |
Standard pattern forceps | FST | 11000-12 | Large serrated forceps |
Surgical scissors- sharp-blunt | FST | 14001-12 | Various |
Surgical scissors- ToughCut | FST | 14054-13 | Various |
Tetrode assembly station | Neuralynx | Tetrode assembly station | Tetrode Assembly |
Tetrode spinner 2.0 | Neuralynx | Tetrode spinner 2.0 | Tetrode Assembly |
Two-part epoxy | Gorilla brand | 4200102 | Various steps |