Summary
실험실 분석은 연령 관련 황반변성(AMD)의 종방향 광간섭 단층촬영(OCT) 기반 다중 모드 영상의 예후 가치를 활용할 수 있습니다. AMD가 있거나 없는 인간 기증자의 눈은 조직 절편 전에 OCT, 색상, 근적외선 반사율 스캐닝 레이저 검안경 및 자가형광을 사용하여 이미지화됩니다.
Abstract
광간섭 단층촬영(OCT) 기반 멀티모달(MMI) 임상 영상에서 학습한 연령 관련 황반변성(AMD)의 진행 순서는 실험실 소견에 예후 가치를 더할 수 있습니다. 이 작업에서는 망막 조직 절편 전에 생체 외 OCT와 MMI를 인간 기증자의 눈에 적용했습니다. 눈은 ≥80세의 비당뇨병 백인 기증자로부터 회복되었으며 사망 후 보존 시간(DtoP)은 ≤6시간이었습니다. 글로브는 현장에서 회수되어 각막 제거를 용이하게 하기 위해 18mm 트레핀으로 점수를 매기고 완충된 4% 파라포름알데히드에 담갔습니다. 컬러 안저 이미지는 해부 스코프와 SLR 카메라로 전방 분절 제거 후 3배율에서 트랜스, 에피 및 플래시 조명을 사용하여 획득했습니다. 글로브는 60 디옵터 렌즈가 있는 맞춤형으로 설계된 챔버 내의 버퍼에 배치되었습니다. 스펙트럼 도메인 OCT(30° 황반 큐브, 30μm 간격, 평균 = 25), 근적외선 반사율, 488nm 자가형광 및 787nm 자가형광으로 이미지화되었습니다. AMD 눈은 신생혈관 형성 유무에 관계없이 다른 원인의 증거 없이 드루젠 또는 망막하 드루세노이드 침착물(SDD)이 있는 망막 색소 상피(RPE)의 변화를 보여주었습니다. 2016 년 6 월과 2017 년 9 월 사이에 94 개의 오른쪽 눈과 90 개의 왼쪽 눈이 회복되었습니다 (DtoP : 3.9 ± 1.0 h). 184개의 눈 중 40.2%가 초기 중등도(22.8%), 위축성(7.6%), 신생혈관성(9.8%) AMD를 포함하여 AMD를 가지고 있었고 39.7%는 눈에 띄지 않는 황반을 가지고 있었습니다. Drusen, SDD, 과반사 병소, 위축 및 섬유혈관 흉터는 OCT를 사용하여 확인되었습니다. 인공물에는 조직 혼탁, 박리(간균, 망막, RPE, 맥락막), 중심와 낭성 변화, 기복이 있는 RPE 및 기계적 손상이 포함되었습니다. 냉동 절편을 안내하기 위해 OCT 부피를 사용하여 중심와 및 시신경두 랜드마크와 특정 병리를 찾았습니다. 생체 외 부피는 시선 추적을 위한 기준 기능을 선택하여 생체 내 부피에 등록되었습니다. 생체 내에서 볼 수 있는 병리학의 생체 외 가시성은 보존 품질에 따라 다릅니다. 16개월 이내에 AMD의 모든 단계에서 75개의 신속한 DtoP 기증자 안구를 회복하고 임상 MMI 방법을 사용하여 병기를 결정했습니다.
Introduction
광간섭 단층촬영(OCT)의 지도 하에 항-VEGF 요법으로 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD)을 관리한 15년은 시력 상실의 만연한 원인의 진행 순서와 미세 구조에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다. 주요 인식은 AMD가 신경 감각 망막, 망막 색소 상피(RPE) 및 맥락막과 관련된 3차원 질환이라는 것입니다. 시험 환자와 치료받은 클리닉 환자의 동료 눈에 대한 OCT 영상의 결과, 수십 년 동안 임상 표준이었던 컬러 안저 사진에서 볼 수 있는 것 이상의 병리학적 특징이 이제 인식되고 있습니다. 여기에는 망막내 혈관신생(제3형 황반혈관신생1, 이전의 혈관종성 증식), 망막하 드루세노이드 침착물(SDD, 망상 슈도드루젠이라고도 함)2, RPE 운명의 다중 경로3,4, 위축의 강렬한 신경교 뮐러 세포 5,6.
황반(세포 및 동물)이 결여된 모델 시스템은 이 복잡한 질병의 일부 조각을 재현한다 7,8,9. AMD의 부담을 개선하는 데 있어 더 큰 성공은 인간의 눈에서 원발성 병리를 발견하고 탐구하고, 황반의 독특한 세포 구성을 이해한 다음, 모델 시스템으로의 번역에서 비롯될 수 있습니다. 이 보고서는 학술 연구실과 안구 은행 간의 3 년간의 협력을 묘사합니다. 본원에 기술된 조직 특성화 방법의 목표는 두 가지이다: 1) 현미경으로 안저 모양 및 이미징 신호 소스의 기초를 입증함으로써 진화하는 진단 기술을 알리고, 2) 원뿔 전용 중심와 및 간상체가 풍부한 포와를 보존하는 표적(면역조직화학) 및 비표적 분자 발견 기술(이미징 질량 분석법, IMS 및 공간 전사체학)에 대해 AMD 표본을 분류합니다. 이러한 연구는 시선 추적을 통해 진행 순서와 종단 추적이 가능한 임상 OCT로의 번역을 가속화할 수 있습니다. 치료 효과를 모니터링하도록 설계된 이 기술은 망막 혈관을 사용하여 한 클리닉 방문에서 다음 클리닉 방문까지 스캔을 등록합니다. 눈 추적 OCT를 파괴적인 기술로 얻은 실험실 결과와 연결하면 분자 발견에 새로운 수준의 예후 가치를 제공할 수 있습니다.
1993 년 연구소는 필름10에 사후 안저의 컬러 사진을 캡처했습니다. 이러한 노력은 Foos와 동료 11,12,13에 의한 인간 말초 망막의 뛰어난 광현미경 및 조직학과 Sarks et al.14,15에 의한 광범위한 AMD 임상병리학적 상관관계에서 영감을 받았습니다. 2009년부터 스펙트럼 도메인 OCT에 고정된 생체 외 다중 모드 이미징(MMI)이 채택되었습니다. 이러한 전환은 다른 사람들의 유사한 노력에서 영감을 받았습니다.16,17 특히 Sarks가 묘사한 미세 구조의 많은 부분이 시간이 지남에 따라 클리닉18,19에서 3차원으로 이용 가능하다는 사실을 깨달았습니다. 목표는 망막, RPE 및 맥락막의 세포 수준 표현형에 대한 강력한 연구를 위해 합리적인 시간 내에 황반이 부착된 눈을 획득하는 것이었습니다. 그 의도는 "눈당" 통계를 넘어 심혈관 질환20,21의 "취약한 플라크" 개념의 영향을 받는 표준인 "병변 유형별"로 이동하는 것이었습니다.
이 보고서의 프로토콜은 여러 스트림에서 거의 400쌍의 기증자 안구에 대한 경험을 반영합니다. 2011-2014년에 142개의 보관된 표본의 층 두께와 주석을 포함하는 AMD 조직병리학의 Project MACULA 웹사이트가 만들어졌습니다. 이 눈은 1996년부터 2012년까지 고해상도 에폭시 수지 조직학 및 전자 현미경을 위한 글루타르알데히드-파라포름알데히드 고정액으로 보존되었습니다. 모든 fundi는 받았을 때 컬러로 촬영되었으며 조직학 직전에 OCT에 의해 다시 이미지화되었습니다. 원래 시신경 연구(22)를 위해 설계된 아이 홀더는 중심와 중앙에 있는 8mm 직경의 전층 조직 펀치를 수용하는 데 사용되었습니다. 중심와 중심와를 통한 OCT B-스캔과 동일한 수준의 조직학에 해당하는 2mm 상부 부위와 컬러 안저 사진을 웹사이트에 업로드했습니다. OCT 평면의 선택은 fovea 23 하에서 AMD 병리의 두드러짐과 fovea24,25보다 우수한 막대가 풍부한 영역에서 SDD의 두드러짐에 의해 결정되었습니다.
2013년부터 일생 동안 OCT 고정 MMI로 이미지화된 눈은 직접적인 임상병리학적 상관관계에 사용할 수 있었습니다. 대부분(기증자 10명 중 7명)은 망막 의뢰 진료(저자: KBF)에 있는 환자와 관련이 있으며, 연구 목적으로 사망 후 안구 기증에 관심이 있는 환자를 위한 고급 지침 레지스트리를 제공했습니다. 눈은 지역 안구 은행에 의해 회수 및 보존되어 실험실로 옮겨져 Project MACULA 눈과 동일한 방식으로 준비되었습니다. 사전 부검 임상 OCT 볼륨은 실험실에서 원활하게 판독되어 생애 동안 관찰된 병리학적 특징과 현미경에서 관찰된 특징을 일치시켰습니다26.
2014년부터 전향적 안구 채취는 임상 병력이 없지만 정의된 기간(6시간) 동안 보존된 기증자 안구에서 AMD를 선별하는 것으로 시작되었습니다. 이를 위해 아이 홀더는 지구 전체를 수용 할 수 있도록 수정되었습니다. 이렇게 하면 이전에 사용된 8mm 펀치의 절단면 주위에서 분리될 가능성이 줄었습니다. 눈은 면역조직화학을 위해 4% 완충된 파라포름알데히드에 보존되었고 장기 보관을 위해 다음날 1%로 옮겨졌습니다. 2016-2017년(팬데믹 이전)에 90명의 기증자로부터 184개의 안구가 회복되었습니다. 이 보고서의 통계 및 이미지는 이 시리즈에서 생성됩니다. 팬데믹 시대(2020년 봉쇄 및 여파) 동안 전사체학 및 IMS 협업을 위한 전향적 수집은 본질적으로 2014년 방법을 사용하여 감소된 속도로 계속되었습니다.
기증자 눈 평가를 위한 다른 방법을 사용할 수 있습니다. MGS(Minnesota Grading System)27,28는 안저 사진 촬영을 위한 AREDS 임상 시스템을 기반으로 합니다(29). 이 방법의 한계는 위축성 AMD와 신생혈관성 AMD를 "후기 AMD"의 한 단계로 결합하는 것입니다. 또한, MGS는 RPE 맥락막의 광 문서화 전에 신경 감각 망막의 제거를 수반합니다. 이 단계는 SDD를 다양한 각도로 제거하고(30,31) 외부 망막과 그 지지 시스템의 공간적 대응을 제거합니다. 따라서 대사 요구와 망막의 신호 전달을 RPE-맥락막의 병리학으로 연결하려는 노력이 방해받을 수 있습니다. 유타 시스템은 생체 외 컬러 사진과 OCT를 사용하여 MMI를 구현하여 해부 대상 눈을 RNA 및 단백질 추출을 위한 영역으로 분류했습니다32. 전체 아이컵 추출보다 바람직하지만, AMD 진행의 위험이 가장 높은 3mm 직경 영역(33,34)은 6mm 직경의 중심와 중심 펀치의 25%에 불과합니다. 따라서, 면역조직화학을 위한 연속 절편과 같은 중심와와 관련하여 소견을 국소화할 수 있는 기술이 유리하다.
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Protocol
버밍엄에 있는 앨라배마 대학교의 기관 검토 위원회는 Good Laboratory Practices 및 Biosafety Level 2/2+를 준수하는 실험실 연구를 승인했습니다. 모든 미국 안구 은행은 2006년 통일 해부학적 선물법(Uniform Anatomical Gifts Act)과 미국 식품의약국(FDA)을 준수합니다. Advancing Sight Network를 포함한 대부분의 미국 안구 은행은 미국 안구 은행 협회(Eye Bank Association of America)의 의료 표준을 준수합니다.
재료 표에는 소모품과 장비가 나열되어 있습니다. 보충 자료 1은 해부, 안저 사진 및 OCT 기반 MMI에 대한 개요를 제공합니다. 보충 자료 2는 OCT 기반 MMI에 대한 세부 정보를 제공합니다.
1. 조직 채취 기준
- 서류미비 기증자 선별검사에서 AMD 안구의 수율을 최대화하려면 허용 가능한 기증자에 대해 연령 ≥80세, 백인, 비당뇨병 환자, ≤6시간 사망 보존(DtoP) 기준을 설정하십시오.
알림: DtoP는 사망 시점부터 병원이나 실험실에서 제공된 방부제에 눈을 넣는 시점까지의 시간으로 정의됩니다.
2. 보존 배지 및 기타 준비 (실험실)
- 4 % 재고 (구매)에서 20 % 인산염 완충 파라 포름 알데히드를 만듭니다. 200 M Sorenson의 인산염 완충액 800 mL에 20 % 파라 포름 알데히드 (희석 계수 5)의 0.1 mL를 첨가하여 1 L를 준비한다. 필요한 경우 pH가 7.2가 되도록 테스트하고 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 4% 인산염 완충 파라포름알데히드 30mL를 40mL 병에 분배합니다.
- 안구 은행에 방부제 40mL 용기를 표시하여 언제 어디서나 조직을 회수할 수 있습니다.
- 보존 된 눈을 보관하려면 4 % 용액에서 1 % 파라 포름 알데히드를 만드십시오. 1M Sorenson's phosphate buffer의 750mL에 4% 파라포름알데히드(희석 계수 4) 250mL를 첨가하여 0.1L를 준비합니다. 필요한 경우 pH를 테스트하고 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 증류수 500mL와 Sorenson's 완충액 500mL를 혼합하여 Sorenson's phosphate buffer, pH 7.2의 0.2M 용액에서 0.1M 용액 1L를 준비합니다.
- 1 N 염산 또는 1 N 수산화나트륨을 사용하여 pH 강하를 적하합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 해부하는 동안 눈을 안정시키는 홀더를 만듭니다. 액체가 될 때까지 가열 된 치과 용 왁스로 페트리 접시를 채 웁니다. 약간 차가울 때 큰 볼 베어링으로 반구 인상을 준 다음 볼 베어링을 쉽게 제거 할 수 있도록 접시를 얼립니다.
3. 안구 은행 방법
- 연구 조직의 빠른 회복을 보장하려면 이식용 조직을 포함하여 모든 조직을 신속하게 회수하십시오.
- 법에서 요구하는 대로 사망 후 1시간 이내에 사망 의뢰를 받고 조직 뒤에 오는 의뢰 순서 번호로 각 기증자를 추적합니다.
- 잠재적인 임상 문서가 있는 사례를 찾으려면 연구 기증자 위험 평가 인터뷰에서 AMD 및 안과 질환 관련 질문을 하십시오.
- 이동 시간을 최소화하려면 좁은 지역(예: 도시 및 인접 교외 카운티) 내에서 전체 지구본(이식용 각막만 구별됨)을 복구합니다.
- 조직 회복을 위해 방부제 2병(완충된 4% 파라포름알데히드)을 고인의 병실로 가져옵니다(시신이 영안실로 옮겨지기를 기다리는 것과 반대).
- 회복 전과 회복 중에 조사관과 의사 소통하여 전달 및 타이밍을 확인하십시오.
- 병원 현장에서 지구본을 회수하고 일관된 취급 방법으로 개봉한 다음 열린 눈을 방부제에 담그십시오(그림 1).
- 지혈제로 안정화된 거즈 덮개를 사용하여 절제된 기증자의 눈을 제자리에 고정합니다.
- 2mm 너비의 공막 테두리로 각막을 쉽게 제거하려면 직경 18mm의 트레핀을 사용하여 지구본에 점수를 매깁니다.
- 공막 테두리가 있는 각막을 제거하려면 끝이 구부러진 스프링이 장착된 가위를 사용하여 득점된 원을 따라 자르고 지혈제로 잘린 거즈로 지구를 안정화합니다.
- 공막에서 각막을 들어 올려 홍채와 모양체를 노출시킵니다.
- 방부제가 유리체 챔버로 침투하는 것을 용이하게하기 위해, 홍채에 2mm 길이의 슬릿을 동공 가장자리에 수직으로 만듭니다. 4°C에서 방부제 30mL가 든 검체 용기에 눈을 넣고 젖은 얼음 위의 실험실로 옮깁니다.
- 안구 은행에서 연구실 데이터베이스로 비식별화된 기증자 정보를 전자적으로 전송합니다.
참고: 데이터베이스는 의뢰 번호, 안구 은행 조직 번호, 추적을 위한 실험실 ID 번호 및 기타 관련 정보를 유지합니다.
4. 생체 외 색소 안저 촬영을 위한 조직 준비
- 두 개의 실체 현미경을 사용하는데, 하나는 해부용이고 다른 하나는 안저 사진용입니다.
참고: 투과조명으로 색소 변화를 시각화하려면 암시야 현미경용 베이스를 사용하십시오. - 앞쪽 세그먼트 잔여 (홍채 및 수정체)를 제거하십시오. 해부하는 동안 눈을 안정시키려면 왁스로 채워진 페트리 접시에 넣으십시오(보충 자료 1, 슬라이드 7-8). 모양체와 부착된 망막이 유리체 내로 붕괴되는 것을 방지하기 위해, 모양체에 부착된 두꺼운 유리체의 고리(유리체 기저부)의 섭동을 최소화한다.
- 방향을 위해 상위 극을 표시하십시오. 접시에 지구본을 앞쪽이 아래로 향하게 놓습니다. 상직근과 상사근의 삽입힘줄을 찾습니다. 나무 어플리케이터를 사용하여 앞쪽에서 뒤쪽 방향(즉, 상직근의 힘줄 삽입에 수직)으로 10mm 선으로 마킹 잉크를 조금씩 도포합니다.
- 사진을 찍기 전에 차가운 Sorensen의 인산염 완충액으로 안저를 채 웁니다.
- 1 mm 루비 비드를 내부 스케일 바로서 안저에 삽입하여 각 이미지(27)에 나타나게 한다.
- 링 플래시가 장착된 실체 현미경에 장착된 일안 반사식 카메라로 컬러 이미지를 획득합니다. 세 가지 표준 배율 각각에서 트랜스, 에피 및 플래시 조명을 사용하여 특정 영역을 강조하기 위한 이미지를 캡처합니다(보충 자료 1, 슬라이드 11): 1) 적도의 안저, 2) 후극(혈관 아케이드, 시신경두, 중심와), 3) 황반 내의 중심와(노란색 반점).
5. 생체 외 색소 안저 사진 촬영 준비
- 카메라와 모니터를 켭니다. 리모트 셔터를 꽂고 HDMI(High-Definition Multimedia Interface) 카메라/TV(TV) 모니터 및 디스플레이 케이블에서 액추에이터를 분리합니다.
- 카메라 설정을 수동 ISO 기능으로 설정하고 미러 잠금 위치(진동을 줄이기 위해 제자리에 고정됨)로 설정합니다.
참고: 사용하는 카메라의 설정에 대해서는 제조업체의 사용 설명서를 참조하십시오. 카메라 디스플레이에서 히스토그램 및 노출 판독값을 기준으로 노출 과다/노출 부족 설정을 학습합니다. - 현미경 스테이지의 4개 기본 방향으로 조명을 비추기 위해 각각 서로 수직으로 배치된 두 개의 유연한 광 가이드가 있는 두 개의 광원을 배열합니다(보충 자료 1, 10페이지).
- 에피 조명 광원을 최대 전력으로 켭니다.
알림: 사진 작가의 빛/플래시 산란을 제한하기 위해 무대 주위에 검은색 펠트 덮개가 있는 것이 도움이 되지만 반드시 필요한 것은 아닙니다. - 해부 현미경에서 집게를 사용하여 버퍼로 채워진 30mL 석영 도가니에 후극을 삽입합니다. 조직이 바닥으로 가라앉도록 합니다. 움직임을 방지하기 위해 눈과 도가니 벽 사이에 티슈 스폰지와 같은 버팀대를 삽입합니다. 1mm 루비 비드를 뒤쪽 기둥에 삽입합니다.
알림: 구슬이 시신경 컵에 떨어질 수 있습니다. - 도가니에 있는 지구본을 조심스럽게 실체 현미경 무대에 놓고 현미경 접안렌즈를 통해 내부 안저 안저를 관찰합니다. 가장 낮은 배율을 사용하여 12시 위치의 조직 표시, 시신경두(ONH) 및 ONH 아래 5°의 중심와를 식별하여 눈의 방향을 지정합니다. 중심와가 ONH를 통과하는 선 아래로 5° 떨어지도록 눈을 회전시킵니다.
참고: 오른쪽 눈인 경우 ONH는 현미경의 접안렌즈를 통해 볼 수 있듯이 중심와 오른쪽에 있습니다. 왼쪽 눈이라면 ONH는 중심와의 왼쪽에 있습니다. - 카메라에서 보는 리모트 모니터를 켭니다. 현미경 빔 스플리터 슬라이더가 접안렌즈용 포트가 아닌 포토 포트를 통해 관찰하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 빛과 거울의 경로에 따라 적절한 방향을 위해 무대에서 티슈를 180° 회전할 준비를 하십시오.
6. 생체 외 컬러 안저 사진을 이용한 이미지 획득
- 에피 조명이 켜진 상태에서 전체 18mm 트레핀 절개가 전체 시야를 차지하도록 배율을 설정합니다. 중심와 구덩이의 바닥에 초점을 맞출 수 있도록 배율을 높입니다. 배율을 이전 설정으로 줄입니다.
- 노출 시간이 카메라 미터의 중앙 범위에 있도록 ISO 설정을 1,600-3,000 범위로 조정합니다.
- 원격 셔터 트리거를 누릅니다. 거울이 위쪽 위치에 고정되도록 귀를 기울이십시오. 노출을 위해 방아쇠를 다시 누르십시오.
- 올바른 노출을 위해 사전 설정된 메타데이터에 빨강, 녹색, 파랑(RGB) 및 색상 히스토그램을 표시하여 모니터에서 이미지를 관찰합니다. 노출이 허용되면 계속 진행하십시오. 그렇지 않은 경우 매개 변수를 삭제하고 다시 평가한 다음 이미지를 다시 지정합니다.
- 에피 조명용 구즈넥 램프를 끄고 1/4초 노출, 1/250초의 카메라 셔터 속도, 100-320의 ISO로 플래시를 켭니다. 플래시 속도를 기본값으로 설정하거나 카메라 초기 설정 중에 수정하십시오. 이미지를 획득하고 히스토그램에서 적절한 노출을 확인합니다.
- 플래시를 끄고 트랜스 일루미네이션 광원을 켭니다. ISO를 5,000 이상으로 재설정하고 사진 시스템의 잠재적인 진동으로 인해 노출 시간이 1/30초 미만으로 떨어지지 않도록 합니다. 이미지를 획득하고 히스토그램에서 적절한 노출을 확인합니다.
- 배율을 높여 시야에서 ONH와 중심와를 모두 볼 수 있습니다. 에피 조명 램프를 켭니다. ISO 범위를 1,600-3,000으로 설정합니다. 노출 시간이 카메라의 중앙 범위에 있는지 확인하십시오.
- 에피 일루미네이션 램프를 끄고 플래시를 켜서 노출을 1/4초, 카메라 셔터 속도를 1/250초로 설정하고 ISO를 400-800으로 설정합니다. 이미지를 획득하고 히스토그램에서 적절한 노출을 확인합니다.
- 플래시를 끄고 암시야 베이스를 사용하여 트랜스 조명을 켭니다. ISO를 5,000 이상으로 재설정합니다. 노출 시간이 사진 시스템의 잠재적인 진동으로 인해 1/30초보다 느리지 않은지 확인하십시오. 이미지를 획득하고 적절한 히스토그램을 확인합니다.
- 투과조명을 끄고 에피 일루미네이션 램프를 다시 켭니다.
- 6.7단계에서 사용한 배율로 확대합니다. 필요한 경우 초점을 다시 맞춥니다.
- ISO를 3,000-6,000 범위 내에서 높이고 카메라의 적절한 노출 범위 내에 있도록 노출 시간을 조정합니다. 이미지를 획득합니다.
알림: 루비 비드가 더 이상 필드에 나타나지 않을 수 있습니다. 그렇다면 참조를 위해 이 배율에서 비드의 개별 이미지를 캡처합니다. - 에피 일루미네이션 램프를 끕니다. 노출을 1/4초로 설정하고 카메라 셔터 속도를 1/250초로 설정하여 플래시를 켭니다. 플래시 속도를 기본값으로 설정하거나 카메라 초기 설정 중에 변경하고 ISO를 500-1,000으로 설정합니다. 이미지를 획득합니다. 적절한 노출을 위해 히스토그램을 확인하십시오.
- 플래시를 끄고 트랜스 일루미네이션 램프를 켭니다. ISO를 8,000 이상으로 재설정하면 더 민감한 이미지 센서로 더 빠른 노출 시간을 얻을 수 있습니다. 사진 시스템의 잠재적인 진동으로 인해 노출 시간이 1/30초 미만으로 떨어지지 않도록 하십시오. 이미지를 획득합니다.
- 카메라에서 컴퓨터로 이미지를 내보냅니다. 일부를 다시 캡처해야 하는 경우를 대비하여 현미경 단계에서 표본을 제거하기 전에 이미지를 검토하십시오.
7. 생체 외 OCT 및 스캐닝 레이저 검안경(SLO)에 대한 이미지 획득 개요
- 스펙트럼 도메인 OCT의 경우, 60 디옵터 렌즈(35)를 갖는 챔버를 갖는 맞춤형 아이 홀더 내의 포스페이트 완충액에 글로브를 놓는다. 아이홀더를 임상 OCT 영상 장치의 브래킷에 장착하고 환자가 이마를 쉴 수 있는 위치에 부착합니다. OCT 장치는 각 이미지에 배율 막대를 자동으로 삽입합니다.
- 동시에 동일한 장치를 사용하고 눈을 홀더에 고정한 상태에서 근적외선 반사율(NIR, 유치 소프트웨어에서 로케이터 이미지로 사용), 488nm 여기 안저 자가형광(FAF) 및 적색 없는(RF) 반사율을 사용하여 스캐닝 레이저 검안경(SLO)으로 글로브를 이미지화합니다.
알림: 이 장치의 787nm 여기 FAF는 빔 스플리터가 SLO로의 광선 투과율을 감소시키기 때문에 가끔씩만 적합합니다. 이러한 이유로 787nm FAF 이미지를 위한 두 번째 장치(다음 항목 참조)가 사용됩니다. - 개별적으로, 그러나 눈이 여전히 아이 홀더에 있는 상태에서, 이 양식을 잘 표시하는 별도의 장치를 사용하여 RPE 교란(36)을 검출하기 위해 787nm FAF로 글로브를 이미지화한다.
8. 생체 외 OCT/SLO에 대한 이미지 획득 프로토콜(보충 자료 2의 슬라이드 참조)
- 조직 마킹 염료로 상직근을 나타냅니다. 레이저를 켭니다(파란색 화살표, 보충 자료 2, 1페이지).
- 보충 자료 2의 2페이지를 참조하여 전체 장치를 베이스(녹색 화살표)에 대해 두 축으로 이동한 다음 조이스틱을 시계 방향/반시계 방향(cw/ccw, 파란색 화살표)으로 돌려 높이(y)를 올려 OCT 헤드를 배치합니다. 검은색 레버를 R(*) 위치에 놓고 노브(주황색 화살표)를 돌려 이미지의 초점을 맞춥니다. 나비 나사(보라색 화살표)를 고정하여 장치를 잠급니다.
- 아이를 홀더에 삽입하고 스페이서로 뒤쪽에서 안정화합니다(보충 자료 1, 13페이지). 공막이 찌그러지지 않도록 가능한 한 적은 압력을 가하십시오. 상직근의 조직 표시가 위를 향하도록 합니다.
알림: 아이홀더 전면에서 OCT 장치까지의 대략적인 거리는 25mm입니다. - OCT 장치에 대한 독점 시각화 및 분석 소프트웨어를 엽니다. 왼쪽 열에 환자 목록이 나타납니다. 내부 코드 번호로 색인 된 안구 기증자는 "환자"입니다. 제조업체의 사용 설명서를 참조하십시오.
- 새 환자 아이콘을 선택합니다. 필요에 따라 환자 데이터 정보를 작성합니다. 확인을 선택합니다. YYYYNNNL,R_agesex과 같이 개별 눈에 논리적으로 정렬된 번호 매기기 시스템을 사용합니다. 예를 들어 2017016R_97F일 수 있습니다.
- 다음 창에서 데이터 입력을 계속한 후 OK를 누릅니다. 드롭다운 메뉴에서 연산자와 연구를 선택합니다.
참고: 입력한 정보는 내보낼 수 있는 메타데이터에 나타납니다. - 빈 화면을 본 후 노란색 버튼을 터치하여 이미지 획득을 시작합니다.
- IR + OCT(근적외선 반사율 + OCT)를 누릅니다. 레이저가 안저의 실시간 SLO 이미지와 OCT B-스캔을 획득할 수 있도록 합니다.
- ONH와 중심와를 기준으로 올바른 해부학적 위치를 확정하고 나무 어플리케이터를 사용하여 홀더의 눈 위치를 조정합니다. 제어판에서 검은색 원형 버튼을 돌려 강도를 조정합니다.
- 동일한 버튼을 눌러 평균 9-100 프레임을 만듭니다 (빨간색 화살표, 9이면 충분하고 100은 크림색으로 보입니다). 장치의 방향이 올바르면 안저에 초점이 맞춰져야 하고 OCT B-스캔이 디스플레이의 상단 1/3에 나타나야 합니다(보충 자료 2, 9페이지, 이중 빨간색 화살표).
- 안저 이미지에서 커서를 사용하여 파란색 선을 중심와 중앙으로 이동합니다(보충 자료 2, 9페이지, 흰색 화살표). 획득을 누릅니다.
참고: 다른 기본 버튼은 Retina, EDI(꺼짐) 및 Line Scan입니다.
- 다음 획득을 위해 RF + OCT 를 누릅니다. 위치를 다시 확인하여 이미지가 움직이거나 품질이 저하되지 않았는지 확인합니다. 평균을 구하려면 검은색 버튼을 누릅니다. 획득을 누릅니다.
- 자가형광 이미징을 위한 내부 큐브를 488nm 및 787nm 여기 파장으로 전환합니다(보충 자료 2, 10페이지).
알림: 스위치 뒤의 큐브 위치가 표시됩니다. - Autofluorescence mode(자동 형광 모드)를 선택합니다. 선형을 다시 확인합니다. 획득을 누릅니다.
- RPE 중단 및 위축이 의심되는 경우 787nm 자가형광에 대해 ICGA (인도시아닌 그린 혈관조영술)를 선택합니다. 눈 위치를 다시 확인한 다음 Acquire를 누릅니다.
참고: 안저 이미지는 내부 큐브가 빔을 감쇠시키기 때문에 이 양식에 나타나지 않는 경우가 많습니다. - 내부 큐브를 IR의 경우 R 로 다시 전환하고 볼륨 수집을 위해 적색 없는 이미징으로 전환합니다.
알림: 스위치 후의 큐브 위치는 보충 자료 13의 2페이지에 나와 있습니다. - OCT 볼륨을 가져오려면 IR 및 볼륨 설정을 선택합니다. 제어 모듈(14° 황반 큐브, 30μm 간격, 실험 요구 사항에 따라 평균화)에서 적절한 버튼을 전환하여 보충 자료 2 페이지의 모든 설정을 일치시킵니다.
- 근적외선 반사 안저 보기는 파란색 B-스캔 선으로 덮여 있습니다. 오른쪽 창의 위쪽 1/3에 있는 OCT 위치를 다시 확인합니다. 제어 모듈에서 Acquire를 누르고 볼륨 스캔이 완료될 때까지 5분 동안 기다립니다. 이미징 수집이 완료되면 EXIT를 선택합니다. 이미지가 저장됩니다(빨간색 화살표).
알림: 파란색 선은 이전 보기에 표시된 거리를 마이크로미터 단위로 구분합니다. 스캔은 아래쪽(아래쪽)에서 번호 매기기를 시작하여 위쪽으로 진행합니다. 빨간색 선 진행에 유의하십시오. - 컴퓨터가 화면에 나타날 획득 한 이미지를 처리하도록 허용합니다 (보충 자료 2, 16 페이지).
- 한 기증자의 반대쪽 눈을 촬영할 때 눈 사이의 장착 브래킷 위치를 변경하지 마십시오. 왼쪽 눈이 먼저 이미지화되면 결과가 OD(오른쪽 눈) 열에 표시됩니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 모든 이미지를 선택한 다음 교환 OS/OD를 선택합니다. 이미지가 OS 열로 이동합니다.
- Window > Database> 선택을 누릅니다. 화면은 기본적으로 패널 6으로 설정되며 오른쪽 열에 기증자 눈이 추가됩니다(보충 자료 2, 18페이지). 드롭다운 메뉴에서 환자를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 배치를 선택한 다음 E2E 파일을 내보냅니다.
- 파일 전송을 위해 바탕 화면에 생성된 미리 결정된 폴더를 찾습니다. 확인을 선택합니다. 이 폴더에는 외장 하드 드라이브에 복사하고 보관할 E2E 파일이 포함되어 있습니다.
- 홀더의 눈을 787nm 자가형광에 주로 사용되는 스캐닝 레이저 검안경으로 가져옵니다.
참고: 이미지 획득 및 보관에 대해서는 제조업체의 사용 설명서를 참조하십시오. - 컴퓨터와 레이저를 켭니다.
- 새 환자 아이콘을 선택합니다. 필요에 따라 환자 데이터를 작성합니다.
- 눈 데이터시트를 동일하게 유지하려면 OK를 누릅니다. C-커브가 동일하게 유지되면 계속을 누릅니다.
- 스터디 모드를 선택하고 필요한 경우 암호를 입력합니다. C-커브를 7.7mm로 유지하고 확인을 누릅니다.
- 계속을 선택하여 C-커브를 확인합니다. 노란색 표시등을 선택하여 카메라를 시작합니다.
- R 위치를 선택합니다. 지구본을 정렬하고 방향을 지정합니다. 위와 같이 초점을 맞추고 방향을 지정할 IR 모드를 선택합니다.
- 베이스를 기준으로 전체 장치를 두 축으로 움직인 다음(보충 자료 2, 28페이지, 녹색 화살표) 장치의 높이(y)를 올림(파란색 화살표)하여 카메라 헤드의 방향을 지정합니다. 노브(주황색 화살표)를 돌려 이미지의 초점을 맞춥니다. 검은색 레버는 R(*) 위치에 있습니다. 이 헤드가 제자리에 놓이면 나비 나사(보라색 화살표)를 돌려 장치를 잠급니다.
- 보충 자료 29의 2페이지와 같이 화면이 나타납니다.
- 선택기 노브를 R 에서 A로 이동합니다. 파란색, 100% 강도, 30° 시야 및 단상 이미징에서 ICGA (787nm 자가형광 달성)를 선택합니다.
참고: 염료 인도시아닌 그린과 마찬가지로 멜라닌은 787nm 파장의 빛에 의해 여기됩니다. - 보충 자료 31의 2페이지와 같이 화면이 나타납니다. 평균을 구하려면 검은색 디스크를 누른 다음 Acquire를 선택합니다.
- Window > Database를 선택합니다. SLO 장치에서 E2E 파일 가져오기를 선택합니다. 이러한 파일은 외장 하드 드라이브에 저장되고 바탕 화면에 업로드됩니다.
- 열기를 선택합니다. 표시가 기본값인지 확인하고 확인을 선택합니다.
- 환자는 이제 SLO에서 획득한 이미지(파란색 화살표)를 보여주는 탭과 OCT 장치에서 획득한 이미지(빨간색 화살표)를 보여주는 다른 탭의 두 개의 탭을 가지고 있습니다(보충 자료 2페이지, 34페이지).
- 786nm(ICGA) 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 바탕 화면의 SLO 786 파일로 사진을 내보냅니다.
- 786nm 자가형광 SLO 이미지를 저장하려면 환자를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 이미지를 RAW 파일(.vol 파일의 경우)로 바탕 화면의 폴더에 내보냅니다.
- 아카이브 컴퓨터로 전송하기 위해 OCT 장치에서 이미지를 내보내려면 RAWEXPORT 에서 RAW라는 폴더에 복사/붙여넣기를 합니다.
9. 이미징 검토
- 각 기증자에 대한 폴더에 이미지(색상, .vol 파일, SLO 이미지)를 조합하고 각 눈에 대한 하위 폴더가 있는 경우 실험실 ID별로 폴더를 연속적으로 색인화합니다.
- 표준화된 보고서를 위해 데이터베이스에 조직 인상(품질, 병리)을 기록합니다.
- 내보낸 OCT 볼륨을 사내 ImageJ 플러그인을 사용하여 검토합니다.
- 중심와 딥의 중심, 바깥쪽 망막 밴드의 안쪽 상승 또는 가장 얇은 지점으로 인식할 수 있는 중심와 중심을 찾으십시오. 대부분의 경우, 이들은 일치하지만 항상 그런 것은 아니며, 이는 중심와 보존, 개인의 다양성 및 병리학의 존재에 달려 있기 때문입니다.
- 상부 중심와에서 표준 스캔을 찾습니다(상부 방향으로 2mm/67 B-스캔, 즉, 스캔 횟수 증가).
- 나중에 빠르게 참조할 수 있도록 전체 볼륨의 .tif 스택을 저장합니다.
- OCT 볼륨 전체를 스크롤하여 스캔 1(하위)부터 시작하면서 피처가 인식되는 스캔 번호를 기록합니다.
- 황반 외에 유두 주위 부위를 확인하십시오.
참고: 노령 눈의 유두주위 맥락망막 위축에는 독특한 기저층 침착 및 신생혈관이 포함됩니다. 이것은 근시성 눈과 녹내장뿐만 아니라 노화 및 AMD37에서 색소 변화의 일반적인 영역입니다.
- 컬러 사진을 검사하고 가능하면 OCT에서 본 결과와 연결합니다.
참고: 일반적으로 OCT를 통해 대부분의 결과를 먼저 보는 것이 더 쉽습니다. 컬러 사진은 SLO의 영역 외부 영역, 모반을 포함한 맥락막 색소 침착, 헴 및 단단한 삼출물의 존재, 신생혈관 AMD의 검은색 색소에 대한 넓은 시야를 제공합니다. 중심와에 있는 어두운 안료는 앞쪽 부분의 느슨한 멜라노솜을 나타낼 수 있으며 피펫을 사용하여 완충액으로 부드럽게 씻어내야 합니다. - SLO 이미지를 검사하고 가능한 경우 결과를 OCT에서 볼 수 있는 이미지와 연결합니다.
- 중심와 및 중심와에 표준 B-스캔을 저장하고, 주목할 만한 병리학 또는 기타 특징이 있는 추가 B-스캔을 저장하고, 병리학 보고서에 SLO 이미지를 저장합니다.
- 눈을 다음과 같이 분류하십시오: 눈에 띄지 않음, 의심스러움, 중급 AMD, 위축성 AMD, 신생혈관성 AMD, 기타, 알 수 없음, 등급을 매길 수 없음, 기록되지 않음. "의심스러운"은 변경 사항이 다른 분류에 충분히 심각한지 명확하지 않은 경우에 사용됩니다. "등급이 매겨지지 않음"은 망막이 심하게 박리된 눈과 같이 유용한 OCT 스캔이 부족한 눈을 위해 예약되어 있습니다. "기록되지 않음"은 사진 촬영 없이 수령 즉시 처리되는 눈을 위해 예약되어 있습니다.
- AMD에 대해 다음 기준을 사용하십시오: 드루젠 또는 망막하 드루세노이드 침착물이 있는 심각한 RPE 변화, 체액 또는 섬유증과 같은 신생혈관 형성의 징후가 있거나 없고 다른 원인의 증거가 없음(SDD를 수용하기 위해 Curcio et al.10에서 업데이트됨).
참고: 최종 진단은 조직학적 분석으로 확인됩니다.
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Representative Results
표 1은 2016-2017년 동안 80세>94명의 백인 비당뇨병 기증자로부터 184개의 눈이 회복되었음을 보여줍니다. 평균 사망 후 보존 시간은 3.9시간(범위: 2.0-6.4시간)이었습니다. 검토된 184명의 눈 중 75명(40.2%)이 특정 AMD를 가지고 있었습니다. 다음 범주가 확인되었습니다: 눈에 띄지 않음(39.7%), 의심스러움(11.4%), 중급 초중급 AMD(22.8%), 위축성(7.6%), 신생혈관성(9.8%), 기타(8.7%), 알 수 없음/기록되지 않음/등급 매김 불가능(<1%). 그림 2, 그림 3, 그림 4 및 그림 5는 이 시리즈의 매우 잘 보존된 눈의 다중 스케일, 다중 모드 생체 외 이미징을 보여줍니다. 망막 질환(J.A.K.) 전문 안과 의사와 협력하여 눈을 검토했습니다. 일부 눈은 다른 눈보다 개별적인 특징을 더 잘 보여주었지만 이러한 케이스는 만능 고품질을 위해 선택되었습니다.
도 38에 기술된 바와 같이, 생체 외 컬러 사진은 대응하는 생체 내 사진과 상이하다. 망막 부종 및/또는 박리는 후방 색소 조직의 가시성을 감소시킬 수 있습니다. 신선한 눈으로 관찰한 결과 이러한 변화는 사후에 발생하며 즉각적인 고정으로 현저하게 악화되지 않습니다. 또한, 맥락막 혈관은 사망 후 비어 있습니다. 창백한 혈관과 어두운 간질 조직의 물결 모양의 배경으로 인해 RPE 평면의 색소 변화 평가는 색상 이외의 양식에 의해 지원되어야 합니다. 생체 외 OCT에서는 컬러 사진보다 더 많은 정보를 사용할 수 있습니다. 생체 외 OCT는 생체 내 OCT와도 크게 다릅니다. 주요 차이점은 특히 내부 망막에서 조직의 전반적인 반사율 증가, 일부 밴드(신경 섬유층, 내부 및 외부 망상층, RPE)의 일관된 반사율, 특히 부종성 망막 아래의 맥락막 세부 사항의 낮은 가시성 및 조직층 박리의 가시성(아래 참조). 광수용체와 RPE(타원체 영역, EZ; interdigitation zone, IZ)를 포함하는 외부 망막 과반사 밴드는 생체 외에서 일관되게 볼 수 없으며 이러한 맥락에서 랜드마크로 사용되지 않습니다. 스펙트럼 도메인 OCT에 대한 임상적 합의는 RPE-Bruch의 막(BrM) 밴드라는 용어를 사용합니다. 그러나, 용어 RPE-기저층(BL)-BrM 밴드는 AMD24에서 기저층층 퇴적물의 출현을 수용하기 때문에 선호된다.
그림 2 는 눈에 띄지 않는 황반과 저반사성 큰 맥락막 혈관을 보여주며, 둘 사이에 반사 RPE-BL-BrM 밴드가 있습니다. 내부 망막의 큰 혈관은 후층에 그림자를 드리 웁니다. IPL 및 OPL은 적당히 반사됩니다. NIR SLO에서는 망막 및 맥락막 혈관을 모두 볼 수 있습니다. 적색 없는 반사율 SLO는 NFL의 아치형 섬유 및 유두황반 다발과 같은 내부 망막 및 유리체 망막 인터페이스의 기능에 가장 적합합니다. 정상적인 눈에서 488nm 자가형광 SLO는 두꺼워진 중심와로 인해 중심 황반에서 전반적으로 감소된 신호 영역을 보여주며, 경우에 따라 노란색 크산토필 색소에 의한 흡수뿐만 아니라 결합 조직 외피를 암시하는 큰 망막 혈관을 감싸는 과자가형광을 보여줍니다. 787nm에서의 자가형광은 RPE에서 중심 황반의 증가된 신호의 작은 영역, 맥락막 기질의 신호 및 맥락막 혈관에 해당하는 저자가 형광 줄무늬를 보여줍니다.
그림 3 은 초기 중간 AMD가 있는 황반을 보여줍니다. 눈에 보이는 특징으로는 부드러운 드루젠(중심와 근처의 돔 모양의 RPE 거상), SDD(RPE-BL-BrM 밴드 내부의 치아 모양이 있는 간헐적 반사율), 과반사 초점(HRF, 망막에 위치한 층내 RPE와 동일한 반사율을 갖는 반사 물질) 및 유리체 형태 변화(세포 내 및 세포 외 모두에서 RPE 소기관의 내부 확장, 기저 층류 퇴적물과 함께39). 컬러 사진은 색소 침착이 감소하여 유리체 병변에 해당하는 강한 색소 침착을 보여줍니다. 드루젠이나 SDD는 색상으로 명확하게 볼 수 없습니다. NIR 반사율은 중심와(fovea)의 반사율을 나타냅니다. 488nm 여기에서의 자가형광은 중심와에서 얼룩덜룩한 신호를 보여줍니다. SDD는 SLO 양식에 가끔 나타납니다. SDD가 풍부하고 SDD가 규칙적인 간격의 점액 패턴으로 가장 쉽게 볼 수 있는 경우 더 가능성이 높습니다(Spaide 및 Curcio19, 그림 6 참조). 그림 3I 에서 중심와보다 우월하고 시간적인 패턴은 SDD가 아닌데, 이는 불규칙하고 표면 초점면에 국한되기 때문입니다. 모든 안면 양식은 중심와에서 방사되는 미세한 주름을 보여줍니다. 잘 보존되지 않은 눈에서는 유사한 주름이 가장 낮은 시야 배율에서 볼 수 있을 만큼 충분히 클 수 있습니다.
도 4 는 위축성 AMD를 갖는 황반을 나타낸다. 안저 사진은 Henle 섬유층-외부 핵층(HFL-ONL) 수준에서 OCT에서 HRF에 해당하는 원형 위축 영역, 중심 과색소침착 및 중심와에 작은 과색소침착 점을 보여줍니다. 또한 OCT에서 낮은 평평한 RPE 상승은 기저 층류 침착, 비삼출성 1형 혈관신생 또는 둘 다를 나타낼 수 있습니다. 중심와 B-스캔의 위축은 HFL-ONL의 침강, 과투과 영역(맥락막으로 빛이 비치는 것), 중심와 중심에 그림자가 증가한 유리체 형태 변화 및 그림자를 드리우는 HRF로 인식할 수 있습니다. 이 눈에서 NIR 반사율은 중심와에 과반사 반점을 보여줍니다. 787nm 여기에서의 자가형광은 중심와 과색소침착에 해당하는 신호와 원형 위축 영역에서 신호의 부재를 효과적으로 보여줍니다. 적색이 없는 488nm 자가형광은 내부 망막 특징을 보여줍니다.
도 5 는 신생혈관성 AMD에 이차적인 황반 위축을 갖는 황반을 보여준다. 안저 사진은 위축 부위 내의 검은 색소 침착을 보여줍니다. OCT는 HFL-ONL의 처짐(침강)과 증가된 과투과에 의한 위축을 보여줍니다. 중심와 B-스캔은 중심와하 과반사 물질과 망막내 낭종의 더미를 보여줍니다. 근적외선 반사율은 RPE 및 맥락막 혈관의 손실로 인한 위축 영역의 반사율을 나타냅니다. fovea의 작고 강렬하게 반사되는 영역은 색상에서 볼 수 없습니다. 적색이 없는 반사율은 망막 혈관을 나타내며 환형 영역 내에서 맥락막 혈관을 나타냅니다. 자가 형광 (488 nm)은 대략 원형의 위축성 경계와 초기 위축의 섬을 명확하게 보여줍니다. 신호가없는 중앙 영역은 적당한 신호와 눈에 보이는 맥락막 혈관의 고리로 둘러싸여 있습니다.
그림 6은 생체 외 OCT 이미징에서 일반적인 아티팩트를 보여줍니다. 부종은 망막 안쪽에서 두드러져 중심와를 통해 돌출과 주름을 만들 수 있습니다(그림 6A, I). 기계적 손상은 유리체의 견인 또는 망막과 해부 도구의 직접적인 접촉으로 발생할 수 있으며, 이로 인해 재료가 탈구되고 때로는 해당 재료가 손실됩니다(그림 6F,G). 박리는 여러 조직 평면을 따라 발생할 수 있으며 생체 내에서도 발생하는 층 사이의 상대적인 인장력을 나타낼 수 있습니다. 모든 분리는 후속 처리시 더 넓어 질 수 있습니다. 가장 흔한 박리는 망막(즉, 광수용체 외부 세그먼트와 RPE의 정점 과정 사이)입니다(그림 6B-D,F-I). 정점 과정은 조직학에 의해 결정된 바와 같이 외부 세그먼트에서 분리되거나 RPE 세포체와 함께 남아있을 수 있습니다. 망막 박리는 크고 부풀어 오르거나(그림 6 B,D,I) 좁고 거의 식별할 수 없습니다(그림 6C,F,G). 세균 층 박리(BALAD40)는 실험실에서 처음 발견된 후 나중에 임상 OCT에서 발견되었습니다. BALAD는 광수용체 내부 세그먼트의 myoid 부분을 통한 분할에 기인하며, 이는 내부 세그먼트의 타원형 부분과 RPE에 부착된 외부 세그먼트를 남깁니다(그림 6A,D,I). BALAD는 생체 외 OCT에서 SDD로 오인되어서는 안 됩니다. 세 번째 박리면은 내부 제한막(ILM)이며 ILM과 나머지 망막층 사이에는 종종 반사액이 잔류합니다(그림 6A,B,I). 가장 흔하지 않은 박리는 맥락막과 공막 사이입니다(그림 6C). 중심와(fovea)는 종종 신생혈관 형성의 징후와 같은 증거를 뒷받침하는 증거 없이는 병리학적으로 간주되어서는 안 되는 낭포질 공간을 나타냅니다(그림 6H). 단일 B-스캔에서 RPE의 기복은 드루젠의 인상을 줄 수 있습니다. OCT 볼륨의 3D 보기는 이들이 맥락막 혈관을 따라 이동한다는 것을 명확히 합니다(그림 6E,J). 기복은 혈관과 사망 후 및 고정 중 중간 기질 사이의 차등 부피 변화로 인해 발생할 수 있습니다.
품질에 대한 기대치를 보정하고 생체 외 OCT의 한계를 살펴보기 위해 그림 7은 임상적으로 기록된 3개의 눈의 생체 내 이미징, 생체 외 이미징 및 조직학을 AMD와 비교합니다. 이 세 눈은 그림 2, 그림 3, 그림 4 및 그림 5의 눈과 다르게 보존되었습니다. 세포 하위인 구조적 OCT 반사율 소스를 확인하기 위해41, 그림 7의 눈을 2.5% 글루타르알데히드 및 1% 글루타르알데히드에 보존하여 고해상도 에폭시 수지 조직학 및 상관 전자 현미경을 허용했습니다. 글루타르알데히드는 그림 2, 그림 3, 그림 4 및 그림 5에 있는 것과 비교하여 이러한 표본에 불투명도를 추가합니다. 더 짧은 DtoP와 더 긴 DtoP의 효과가 분명합니다(그림 7A-F, 2.1시간 대 그림 7G-I, 8.9시간). DtoP가 더 긴 눈에서 사후 부종이 망막 윤곽을 바꾸고 ILM이 분리되었습니다. 관심의 병리학(외부 망막 세뇨관)은 생체 외 영상에서 미묘했습니다. 눈 추적 생체 내 OCT가 관련 B-스캔을 정확히 찾아내고 맥락막 혈관을 일치시킬 수 있기 때문에 발견되었습니다. DtoP가 더 짧은 두 눈에서 일부 주요 병리(제3형 황반 혈관신생)가 즉시 나타났습니다(그림 7A-C). 다른 것들은 아이트래킹의 도움으로 발견되었습니다(그림 7D-F).
그림 1: 망막의 침지 고정을 위한 인간 기증자 눈의 각막 절제. 왼쪽 상단, 절제된 기증자의 눈은 지혈제로 안정화된 거즈 덮개로 제자리에 고정됩니다. 오른쪽 상단, 18mm 트레핀은 각막과 2mm 너비의 공막 테두리를 포함한 원형 점수를 만드는 데 사용됩니다. 가운데, 득점된 원은 스프링이 장착된 곡선 팁 가위로 절단하여 마무리되고 지구본은 안정화됩니다. 왼쪽 하단, 각막과 공막 테두리가 들어 올려져 홍채 (파란색)와 모양체 (황갈색)가 노출됩니다. 하단 중앙, 림이있는 각막이 완전히 들어 올려집니다. 오른쪽 하단, 홍채는 방부제가 유리체 챔버로 침투하는 것을 용이하게하기 위해 동공 가장자리에 수직으로 절단됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 눈에 띄지 않는 황반의 다중 모드 생체 외 이미징. 사망-보존 간격이 1.97시간인 82세 여성 기증자의 황반. (A) 전안부를 제거한 상태에서 본 오른쪽 눈의 안저(에피 조명). (B) 황반의 클로즈업(에피 조명). (C) 중심와(epi-illumination)의 클로즈업 보기. 녹색 선은 패널 D와 E에서 OCT B-스캔의 위치를 나타냅니다. (D,E) OCT B-(D) 상부 중심와(E) 및 중심와를 통해 스캔합니다. 망막(R), 저반사성 큰 혈관이 있는 맥락막(C) 및 중간에 있는 과반사 RPE-BL-BrM 밴드를 볼 수 있습니다. 이 매우 잘 보존된 눈에는 중간 반사 IPL과 OPL도 볼 수 있습니다. (D) 내부 망막의 큰 혈관은 후층에 그림자를 드리 웁니다. (E) 패널 E(노란색 화살촉)에서 망막과 RPE 사이의 분리는 인공적입니다. (F) 근적외선 반사율은 망막 및 맥락막 혈관 구조의 세부 사항을 보여줍니다. (G) 적색 없는 반사율은 신경 섬유층의 아치형 섬유(왼쪽 녹색 곡선 화살표)와 유두황반 다발(녹색 화살표)을 보여줍니다. (H) 488nm 파장의 자가형광은 두꺼워진 부종성 중심와로 인해 중심 황반에서 전반적으로 감소된 신호 영역과 중심와 중심와 중심과 큰 망막 혈관을 감싸는 과자가형광 지점으로 인해 중심 황반에서 전반적으로 감소된 신호 영역을 보여주며, 이는 결합 조직 외피를 암시합니다. (I) 787nm에서의 자가형광은 RPE에서 중심 황반의 증가된 신호의 작은 영역, 맥락막 기질의 신호 및 맥락막 혈관에 해당하는 저자가 형광 줄무늬를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 초기 중간 AMD를 사용한 기증자 눈의 다중 모드 생체 외 이미징. 사망-보존 간격이 3.1시간인 97세 여성 기증자의 기증자 눈. (A) 전안부를 제거한 상태에서 본 오른쪽 눈의 안저(에피 조명). (B) 황반의 클로즈업(에피 조명). 녹색 선은 패널 D, E 및 F에서 OCT B-스캔의 위치를 나타냅니다. (C) 과다색소침착을 보여주는 중심와의 클로즈업 보기(화살표, 플래시 조명). (D) 상부 중심와(주황색 화살표)의 SDD가 OCT에 표시됩니다. I 중심와 아래 RPE의 Vitelliform 변화(흰색 화살표). (F) 중심와보다 열등한 것은 밑면에 저반사선(노란색 화살표)이 있고 위쪽에 과반사 초점(연한 파란색 화살표)이 있는 부드러운 드루젠입니다. (지-아이) 스캐닝 레이저 검안경 이미지는 중심와에 매우 미세한 별 모양의 주름을 보여줍니다( C에서도 볼 수 있음). (G) 근적외선 반사율은 부분적으로 vitelliform 재료에 해당하는 중심와에서 반사율 재료를 나타냅니다. (H) 적색 없는 반사율은 망막 표면을 나타낸다. (I) 488nm 파장 자가형광은 약간 두꺼워진 중심와로 인해 중심 황반에서 전반적으로 감소된 신호 영역을 보여줍니다. SDD가 명확하게 보이지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 연령 관련 황반변성에서 완전한 RPE 및 망막 위축의 다중 모드 생체 외 이미징. 사망-보존 간격이 2.33시간인 97세 여성의 기증자 눈. (A) 트랜스 조명으로 본 왼쪽 눈의 안저. (B) 황반의 클로즈업(에피 조명). 녹색 선은 패널 D와 E에서 OCT B-스캔의 위치를 나타냅니다. (C) 중심와(epi-illumination)의 클로즈업은 중심 과색소침착(녹색 화살촉)과 작은 과색소침착 점(노란색 화살촉)을 보여줍니다. 중앙 점은 위에 놓인 망막이 매우 얇기 때문에 강렬한 갈색입니다. 점들은 위에 놓인 망막이 두껍기 때문에 채도가 낮아진 것처럼 보입니다. 원형 위축 영역이 표시됩니다 (흰색 화살촉). (D,E) OCT B-(D) 중심와(E) 및 중심와를 통해 스캔합니다. 망막(R)과 얇은 맥락막(C)이 보입니다. (D) HFL-ONL 수준의 과반사 초점(노란색 화살촉)은 C의 과색소침착 점에 해당합니다. 그 아래의 낮은 평평한 RPE 상승은 기저 층류 침전물, 비삼출성 1형 혈관신생 또는 둘 다를 나타낼 수 있습니다. (E) 중심와를 통한 B-스캔은 HFL-ONL(빨간색 화살촉)의 침강, 과투과 영역, 중심와 중심의 그림자가 증가한 유리체 형태 변화(녹색 별표) 및 그림자가 있는 과반사 초점(청록색 화살촉). 망막과 RPE 밴드 사이의 저반사 공간은 망막하액을 나타낼 수 있습니다. (F) 근적외선 반사율은 중심와에 과반사 반점을 나타낸다. (G) 빨간색이 없는 이미지는 NFL의 아치형 섬유와 망막 표면의 반사 블룸을 보여줍니다. (H) 망막에 초점을 맞춘 488nm 자가형광은 망막 혈관과 관련된 신호, RPE와 관련된 신호 없음, 중심 황반 영역의 희미한 자가형광 반점을 보여줍니다. (I) 787nm 자가형광은 C에서 색소침착에 해당하는 신호를 나타낸다. 원형 위축 영역이 분명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 연령 관련 황반변성에서 제1형 혈관신생 및 황반 위축의 다중 모드 생체 외 영상. 사망-보존 간격이 3.5시간인 86세 여성 기증자의 기증자 눈. (A) 전안부를 제거한 상태에서 본 왼쪽 눈의 안저(트랜스 조명). (B) 위축성 테두리(노란색 화살촉)를 자세히 설명하는 황반의 클로즈업. 녹색 선은 패널 D와 E에서 OCT B-스캔의 위치를 나타냅니다. (C) 중심와의 클로즈업은 위축 부위 내에서 검은색 색소침착(녹색 화살촉)을 보여줍니다. (D,E) OCT B-(D), 중심와(E) 및 중심와를 통해 스캔합니다. 망막 I과 얇은 맥락막(C)이 보입니다. 이 매우 잘 보존된 눈에는 중간 반사 IPL과 OPL도 볼 수 있습니다. (D) 중심와주위 B-스캔은 위축 부위의 위쪽 가장자리를 방목합니다. 위축은 HFL-ONL의 처짐과 과투과 증가 (빨간색 화살촉)에 의해 입증됩니다. 가능한 망막 하 드루세노이드 침전물이 표시됩니다 (자홍색 화살촉). (E) 중심와 B-스캔은 중심와하 과반사 물질과 망막내 낭종(별표)의 더미를 보여줍니다. O = 시신경두. (F) 근적외선 반사율은 컬러 이미징으로 볼 수 없는 중앙 황반의 작은 강렬한 영역(주황색 화살촉)을 포함하여 위축 및 맥락막 혈관(청록색 화살촉)의 반사 영역을 보여줍니다. (G) 적색이 없는 반사율은 망막 혈관과 환형 영역 내에서 맥락막 혈관을 보여줍니다. (H) 488nm 자가형광은 대략 원형의 위축 경계(노란색 화살촉)와 초기 위축의 섬을 나타냅니다. 자가 형광이없는 중앙 영역은 중등도의자가 형광의 고리와 눈에 보이는 맥락막 혈관 (흰색 화살촉)으로 둘러싸여 있습니다. 이 눈에서는 787nm 자가형광이 불가능했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 기증자 눈의 생체 외 OCT 영상에서 볼 수 있는 일반적인 인공물. 이 눈은 2016-2017 시리즈 눈에서 나옵니다. 대부분의 망막은 생체 내에서 이미지화된 망막에 비해 과반사성이며 내부 망막층은 외부 망막층보다 반사율이 더 높습니다. 세균 박리(패널 A, D, G 및 I의 황색 화살촉)는 독특한 망막내 공동(40)을 생성하는 광수용체 내부 분절 myoid의 수준에서 분할되는 것으로 정의된다. 망막 박리(패널 B, C, D, F, G 및 I의 녹색 화살촉)는 하부 RPE(42)로부터 전체 신경감각 망막의 분리를 설명한다. 내부 제한막(ILM)의 분리는 ILM과 신경 섬유층을 분리합니다(패널 A, B 및 I의 빨간색 화살촉). 맥락막 박리(패널 C의 파란색 화살촉)는 맥락막 내 또는 맥락막과 공막 사이의 분리입니다. 기계적 손상(패널 F 및 G의 자주색 화살표)은 누락된 재료(패널 G의 녹색 화살표) 및 탈구된 재료(패널 G의 노란색 화살표)에 적용되는 것처럼 모든 수준 및 치수에서 나타날 수 있습니다. 망막 부종(패널 A 및 I의 보라색 별)은 별도의 망막 층 사이에 경계가 잘 정의되지 않은 망막 조직이 두꺼워지는 것으로 나타납니다. 물결 모양의 RPE(패널 E와 J의 파란색 화살표)는 고르지 않은 물결 모양의 RPE 레이어로 나타납니다. 낭포성 병변(패널 H의 빨간색 사각형)은 일반적으로 중심와에서 망막 조직 내의 저반사 챔버와 같은 변화와 관련이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 생체 외에서 보이는 병리의 가시성은 보존 품질에 따라 다릅니다.(A-나는) 패널 A, B그리고 C패널 D, E그리고 F, 및 패널 G, H그리고 나는 두 명의 기증자로부터 임상적으로 문서화된 3개의 눈을 나타내며, 각각은 시선 추적으로 볼 수 있습니다. in vivo (A1-A2,D1-D2,G1-G2) 및 ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2) 이미징, 조직학(C,F,나는). 근적외선 반사율(NIR, A1,B1,D1,E1,G1,H1)는 광간섭 단층촬영(OCT) B-스캔 및 파노라마 조직학의 수준을 나타냅니다. 패널 A, B그리고 C 및 패널 D, E그리고 F, 90대 여성 기증자 한 명의 오른쪽 눈과 왼쪽 눈을 각각 제시합니다. 패널 G, H그리고 나는 역시 90대인 두 번째 여성 기증자의 오른쪽 눈을 보여준다.A-C) 잘 보존된 안구 조직(DtoP: 2.1시간)은 주요 병리를 잘 볼 수 있게 합니다. (A) 과반사성 망막내 황반혈관신생(3형 MNV, 녹색 화살촉)은 사망 17개월 전에 망막내액으로 둘러싸여 있습니다(A2). RPE/Bruch의 멤브레인 복합체는 저반사 물질로 분할되어 "이중층" 기호(A2). 왼쪽에는 맥락막(주황색 화살촉)에 바코드 과투과가 있는 또 다른 이중층 기호가 있습니다. 에 ex vivo 10월(B2), 유형 3 MNV 및 바코드 과전송이 명확하게 표시되고 묘사됩니다. 망막은 흰색 화살촉에서 볼 수 있듯이 인공적으로 분리되어 있습니다. 파노라마 조직학은 수직 방향의 3형 MNV 병변(녹색 화살촉, C1). 이전 연구 보기43,44 원래 케이스에 대한 자세한 내용은. (D-F) 잘 보존된 안구 조직(DtoP: 2.1h)은 감소된 투명도를 초래할 수 있지만 여전히 주요 병리를 감지하기에 충분합니다. OCT (D2)는 삼출성 유형 3 MNV에 대해 추적된 눈의 망막내 과반사 초점(HRF, 자홍색 화살촉) 스택을 보여줍니다. 사망 11개월 전에는 망막내 낭종이 보이지 않습니다. 에 ex vivo 10월(E2), HRF의 스택은 수직으로 압축되지만(자홍색 화살촉) 명확하게 묘사됩니다. 파노라마 조직학(F1), 망막 색소 상피 타워 (자홍색 화살촉)가 부드러운 드루즈에서 위로 올라갑니다. (G-나는) 덜 잘 보존된 안구 조직(DtoP: 8.9시간)은 주요 병리의 가시성을 감소시킵니다. OCT는 사망 48개월 전의 외부 망막 세뇨관(ORT, 노란색 화살촉)을 나타냅니다(G2). 에 ex vivo OCT, ORT는 미묘한 교란으로 나타나며 사전 지식 없이는 식별하기 어려웠을 것입니다(H2). 내부 제한막은 인공적으로 분리됩니다(흰색 화살촉). 부종은 망막 윤곽을 왜곡했습니다. 조직학적 분석은 외부 제한막에 의해 구분된 ORT 루멘과 그 안으로 돌출된 광수용체(나는1). 이전 연구 보기26,45 원래 케이스에 대한 자세한 내용은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 숫자 | 비율 | |||||
| 진단 범주 | 오른쪽 눈 | 왼쪽 눈 | 합계 | 오른쪽 눈 | 왼쪽 눈 | 합계 |
| 눈에 띄지 않는 | 39 | 34 | 73 | 41.50% | 37.80% | 39.70% |
| 의심스러운 AMD | 10 | 11 | 21 | 10.60% | 12.20% | 11.40% |
| 초기 AMD | 20 | 22 | 42 | 21.30% | 24.40% | 22.80% |
| 위축성 AMD | 6 | 8 | 14 | 6.40% | 8.90% | 7.60% |
| 신생혈관성 AMD | 11 | 7 | 18 | 11.70% | 7.80% | 9.80% |
| 다른 | 7 | 8 | 15 | 7.40% | 8.90% | 8.20% |
| 알려지지 않은 | 0 | 0 | 0 | 0.00% | 0.00% | 0.00% |
| 기록되지 않음 | 1 | 0 | 1 | 1.10% | 0.00% | 0.50% |
| 합계 | 94 | 90 | 184 | 100.00% | 100.00% | 100.00% |
| 특정 AMD | 37 | 37 | 75 | 39.40% | 41.10% | 40.20% |
| 가능한 AMD | 47 | 48 | 95 | 50.00% | 53.30% | 51.60% |
| 눈은 6/17/16 - 9/14/17 기간 동안 가입되었습니다. 기준: ≥ 80세, 백인, 비당뇨병, ≤6시간 사망 보존. 대상: 184안(90명의 기증자 중 180안, 보존, 4명의 기증자 4안, 보존) 사망-보존 시간(평균, 최대, 최소): 3.9시간, 6.4시간, 2.0시간 | ||||||
표 1: 2016-2017년 기증자 안구 회복.
보충 자료 1: 해부, 컬러 안저 사진 및 OCT 기반 다중 모드 이미징 개요. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 자료 2: 섹션 5-8의 단계를 설명하기 위한 OCT 기반 다중 모드 이미징의 세부 정보. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
COVID 이전 시대의 16개월 동안 인구 기반 스크리닝 접근 방식을 사용하여 AMD로 75명의 기증자 안구를 조달할 수 있었습니다. 모두 짧은 DtoP로 회수되었고 OCT 고정 MMI를 사용하여 병기되었습니다. 연령 기준(>80세)은 이식 가능한 각막을 위한 조직 회복의 일반적인 연령 범위를 벗어납니다. 고령에도 불구하고 우리의 기준은 AMD의 모든 단계에서 눈을 떴습니다. 많은 RPE 표현형은 모든 AMD 단계에 공통적이며 일부는 신생혈관성 AMD 3,46에만 독점적입니다. 생체 외 및 생체 내 이미징(그림 7)의 직접적인 비교는 짧은 DtoP가 전문가 처리(그림 1)와 함께 최고 수준의 진단 분류에 충분한 외부 망막의 생체 외 이미지를 생성하는 데 중요한 요소임을 확인했으며 이러한 샘플 중 일부는 이미징과 조직학 간의 직접적인 상관 관계에 적합했습니다 4,35, 47. 모든 병리가 생체 외에서 볼 수 있는 것은 아닙니다. 그러나, OCT를 사용할 때, 컬러 사진에 기초한 방법10, 특히 RPE/맥락막(27)으로부터 망막을 분리하는 방법과 비교했을 때 훨씬 더 많은 것을 볼 수 있다. 또한 임상 OCT의 시선 추적은 초점 및 때로는 작은 특징에 주의를 집중시킵니다(그림 7).
이 보존 시스템에는 각막 제거를 위한 일반적인 안구 은행 절차 및 도구가 포함되며, 그 다음에는 미리 제공된 방부제에 눈을 뜨고 담그는 것이 포함됩니다. 이러한 방식으로 안구 은행 직원은 연구 조직을 지속적으로 회수할 수 있습니다(24/7). 후자의 특성은 매우 중요한데, 즉각적인 복합 해부로 예정된 조직27,32은 조사자, 안구 은행 또는 둘 다에 의한 상시 인력 배치가 필요하기 때문입니다. PAXgene Tissue System 및 Hibernate-A와 같이 근무 시간 동안 특수 해부 및 추출이 가능한 다른 안정제는 OCT 이미징과 호환되는 경우 향후 도움이 될 수 있습니다.
이 접근 방식은 RPE에 크게 부착된 상태로 유지되는 망막을 생성하므로 OCT 이미징으로 변환 가능한 데이터를 생성할 수 있습니다. 황반이 작기 때문에(망막 면적의 <3%) 정확한 위치 파악이 필수적입니다. 또한, 침전물 중심의 AMD 진행은 원뿔 및 간상체(48)의 지형과 일치하며, 가장 초기의 발병 및 가장 지속적인 시각적 결함은 특정 장소(즉, 올-원뿔 중심와 옆의 간상체-함유 중심와)49에서 발생한다. OCT와 비교하자면, 비색 염료를 사용한 면역조직화학은 포괄적인 현미경(예: 명시야)과 호환되어 표지된 조직과 표지되지 않은 조직 요소를 모두 설명할 수 있다4. 샘플링 어레이를 기반으로 하는 비표적 분자 분석은 수직으로 구획화된 광수용체와 RPE의 수평 정렬을 활용하여 분해능을 효과적으로 높일 수 있습니다. 직경 8 μm 및 10-15 μm 거리의 이온화 레이저 펄스를 이용한 이미징 질량 분광법은 수십 개의 지질을 외부 망막 세포의 세포하 구획에 국한시킬 수 있다(50). 공간적으로 분해된 전사체학(Spatially Resolved transcriptomics)은 유리 슬라이드 상에 미리 배열된 바코드화된 역전사 프라이머 세트를 사용하며, 여기에 조직 절편이 적용된다(51). 이 기술은 현재 55μm 직경 캡처 및 100μm 간격으로 제한됩니다. 이 기술을 AMD 연구에 적합하게 만드는 해상도의 개선이 예상됩니다.
이 프로토콜에는 제한이 있습니다. 회복 기준은 두 질병 모두에서 맥락막의 중요성으로 인해 당뇨병 진단(앨라배마의 메디케어 수혜자 중 30%)52을 생략합니다. 이러한 제외는 전체 기증자 풀을 줄이고 연구를 위해 충분한 눈을 수집하는 데 필요한 시간을 연장합니다. 역사적인 이유로 2016-2017 기준은 현재 주 전체 안구 기증자의 14 %를 차지하는 흑인 기증자를 생략했으며 흑인 기증자는 현재 예상 프로젝트에 포함됩니다. 안구 기증자가 되고자 하는 사람을 위한 사전 지시서 등록은 광범위하지만 AMD 환자를 돌보는 지역 망막 전문 진료소에 대한 편리한 등록은 아직 포함되어 있지 않습니다. 이 프로젝트는 현재 개발 중입니다. 이와 같은 인구 기반 선별 검사에서는 AMD와 표현형이 겹치는 상태를 가진 눈이 나타나며 진화하는 임상 문헌 및 망막 질환 전문 안과 의사와 상의하여 인식해야 합니다. 예를 들어, 이 일련의 눈에는 드루젠(drusen)이 있는 모반(nevi)이 포함되었습니다.53 및 후피혈관(내부 맥락막의 두꺼운 혈관)54에 대한 RPE 교란 라인이 포함되었습니다. 마지막으로, AMD에 대한 OCT 기반 등급 시스템이 없기 때문에 초기 및 중급 AMD가 결합되었으며, 이는 위축 분류 회의 그룹55에서 개발 중입니다. 그럼에도 불구하고, 조직 회복 및 OCT 기반 특성화의 최적화를 통해 AMD 연구는 시선 추적 OCT 고정 MMI의 시간 요소를 활용하는 데 중점을 두고 자금 지원 응용 분야에서 계획, 전력, 일정 및 예산을 책정할 수 있습니다.
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Disclosures
C.A.C.는 하이델베르그 엔지니어링(Heidelberg Engineering)으로부터 연구 지원을 받고 있으며, 아펠리스(Apellis), 아스텔라스(Astellas), 베링거인겔하임(Boehringer Ingelheim), 캐릭터 바이오사이언스(Character Bioscience), 오산니(Osanni)에 자문을 제공하고 있습니다. TA는 Novartis로부터 연구 지원을 받고 Roche, Novartis, Bayer, Nidek 및 Apellis에 자문을 제공합니다. K.B.F.는 제넨테크(Genentech), 자이스(Zeiss), 하이델베르크 엔지니어링(Heidelberg Engineering), 앨러간(Allergan), 바이엘(Bayer), 노바티스(Novartis)의 컨설턴트입니다.
Acknowledgments
오리지널 아이 홀더의 계측 및 설계에 대해 Heidelberg Engineering, OCT 기반 다중 모드 이미징을 소개한 Richard F. Spaide MD, 임상 이미징 장치에 대한 액세스를 용이하게 해준 Christopher Girkin MD, Figure 1에 대한 David Fisher에게 감사드립니다. 연구를 위한 인간 기증자 눈의 회복은 미국 국립보건원(NIH) 보조금 R01EY06019(C.A.C.), P30 EY003039(Pittler), R01EY015520(Smith), R01EY027948(C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) 및 U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, TA), 앨라배마의 EyeSight Foundation, 국제 망막 연구 재단 (C.A.C.), 황반 연구를위한 Arnold and Mabel Beckman 이니셔티브 (C.A.C.) 및 실명 방지 연구 AMD Catalyst (Schey).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beakers, 250 mL | Fisher | # 02-540K | |
| Bottles, 1 L, Pyrex | Fisher | # 10-462-719 | storage for preservative |
| Bunsen burner or heat source | Eisco | # 17-12-818 | To melt wax |
| Camera, digital | Nikon D7200 | D7200 | |
| Computer and storage | Apple | iMac Pro; 14 TB external hard drive | Image storage |
| Container, insulated | Fisher | # 02-591-45 | For wet ice |
| Containers, 2 per donor, 40 mL | Fisher | Sameco Bio-Tite 40 mL # 13-711-86 | For preservative |
| Crucible, quartz 30 mL | Fisher | # 08-072D | Hold globe for photography |
| Cylinder, graduate, 250 mL | Fisher | # 08-549G | |
| Disinfectant cleaning supplies | https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html | ||
| Eye holder with lens and mounting bracket | contact J. Messinger | jeffreymessinger@uabmc.edu | custom modification of Heidelberg Engineering original design |
| Face Protection Masks | Fisher | # 19-910-667 | |
| Forceps, Harmon Fix | Roboz | # RS-8247 | |
| Forceps, Micro Adson | Roboz | # RS-5232 | |
| Forceps, Tissue | Roboz | # RS-5172 | |
| Glass petri dish, Kimax | Fisher | # 23064 | |
| Gloves Diamond Grip | Fisher | # MF-300 | |
| Gowns GenPro | Fisher | # 19-166-116 | |
| Image editing software | Adobe | Photoshop 2021, Creative Suite | |
| KimWipes | Fisher | # 06-666 | |
| Lamps, 3 goosenecks | Schott Imaging | # A20800 | |
| Microscope, stereo | Nikon | SMZ 1000 | for dissection |
| Microscope, stereo | Olympus | SZX9 | color fundus photography |
| Paraformaldehyde, 20% | EMS | # 15713-S | for preservative; dilute for storage |
| pH meter | Fisher | # 01-913-806 | |
| Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2 | EMS | # 11600-10 | |
| Ring flash | B & H Photo Video | Sigma EM-140 DG | |
| Ruby bead, 1 mm diameter | Meller Optics | # MRB10MD | |
| Safety Glasses 3M | Fisher | # 19-070-940 | |
| Scanning laser ophthalmoscope | Heidelberg Engineering | HRA2 | |
| Scissors, curved spring | Roboz | # RS-5681 | |
| Sharps container | Fisher | # 1482763 | |
| Shutter cord, remote | Nikon | MC-DC2 | |
| Spectral Domain OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA&OCT | https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf |
| Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter | McMaster-Carr | # 9529K31 | |
| Tissue marking dye, black | Cancer Diagnostics Inc | # 0727-1 | |
| Tissue slicer blades | Thomas Scientific | # 6767C18 | |
| Trephine, 18-mm diameter | Stratis Healthcare | # 6718L | |
| TV monitor (HDMI) and cord for digital camera | B&H Photo Video | BH # COHD18G6PROB | for live viewing and remote camera display features |
| Wax, pink dental | EMS | # 72670 | |
| Wooden applicators | Puritan | # 807-12 |
References
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