Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ex Vivo Мультимодальная визуализация донорских глаз человека на основе ОКТ для исследования возрастной макулярной дегенерации

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65240
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4, 5, *6, *1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn
* These authors contributed equally

Summary

Лабораторные анализы могут использовать прогностическую ценность мультимодальной визуализации возрастной макулярной дегенерации (ВМД) на основе продольной оптической когерентной томографии (ОКТ). Донорские глаза человека с ВМД и без нее визуализируются с помощью ОКТ, цветной, сканирующей лазерной офтальмоскопии ближнего инфракрасного диапазона с отражением и аутофлуоресценции на двух длинах волн возбуждения перед разделением ткани.

Abstract

Последовательность прогрессирования возрастной макулярной дегенерации (ВМД), полученная с помощью мультимодальной (MMI) клинической визуализации на основе оптической когерентной томографии (ОКТ), может повысить прогностическую ценность лабораторных результатов. В этой работе ex vivo OCT и MMI применялись к человеческим донорским глазам перед рассечением ткани сетчатки. Глаза были извлечены у белых доноров в возрасте ≥80 лет, не страдающих диабетом, со временем от смерти до сохранения (DtoP) ≤6 ч. Глобусы были извлечены на месте, забиты 18-миллиметровым трепаном для облегчения удаления роговицы и погружены в буферный 4% параформальдегид. Цветные изображения глазного дна были получены после удаления переднего сегмента с помощью препарирующего прицела и зеркальной камеры с использованием транс-, эпи- и вспышки освещения при трех увеличениях. Глобусы были помещены в буфер в специально разработанной камере с линзой 60 диоптрий. Они были изображены с помощью ОКТ в спектральной области (куб макулы 30°, расстояние 30 мкм, среднее значение = 25), коэффициент отражения в ближнем инфракрасном диапазоне, автофлуоресценцию 488 нм и автофлуоресценцию 787 нм. Глаза ВМД показали изменение пигментного эпителия сетчатки (RPE) с друзами или субретинальными друзеноидными отложениями (SDD), с неоваскуляризацией или без нее и без признаков других причин. В период с июня 2016 г. по сентябрь 2017 г. было восстановлено 94 правых глаза и 90 левых глаз (DtoP: 3,9 ± 1,0 ч). Из 184 глаз у 40,2% была ВМД, в том числе ранняя промежуточная (22,8%), атрофическая (7,6%) и неоваскулярная (9,8%) ВМД, а у 39,7% были ничем не примечательные макулы. Друзены, SDD, гиперрефлективные очаги, атрофия и фиброваскулярные рубцы были идентифицированы с помощью ОКТ. Артефакты включали помутнение тканей, отслоения (бациллярные, ретинальные, RPE, хориоидальные), фовеальные кистозные изменения, волнообразный RPE и механические повреждения. Для проведения криосекций использовались объемы ОКТ для определения ориентиров головки ямки и зрительного нерва и специфических патологий. Объемы ex vivo регистрировались вместе с объемами in vivo путем выбора эталонной функции для отслеживания взгляда. Видимость патологии , наблюдаемой in vivo , зависит от качества сохранности. В течение 16 месяцев было восстановлено и поставлено 75 быстрых донорских глаз DtoP на всех стадиях ВМД с использованием клинических методов MMI.

Introduction

Пятнадцать лет лечения неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации (ВМД) с помощью анти-VEGF-терапии под руководством оптической когерентной томографии (ОКТ) позволили по-новому взглянуть на последовательность прогрессирования и микроархитектуру этой распространенной причины потери зрения. Ключевым признанием является то, что ВМД является трехмерным заболеванием, поражающим нейросенсорную сетчатку, пигментный эпителий сетчатки (RPE) и сосудистую оболочку. В результате ОКТ-визуализации исследуемых пациентов и других глаз пациентов клиники, прошедших лечение, в настоящее время признаны особенности патологии, выходящие за рамки тех, которые видны при цветной фотографии глазного дна, являющейся клиническим стандартом на протяжении десятилетий. К ним относятся интраретинальная неоваскуляризация (макулярная неоваскуляризация1 типа 3, ранее ангиоматозная пролиферация), субретинальные друзеноидные отложения (SDD, также называемые ретикулярными псевдодрузами)2, множественные пути судьбы RPE3,4 и интенсивно глиотические клетки Мюллера при атрофии 5,6.

Модельные системы, в которых отсутствуют макулы (клетки и животные), воссоздают некоторые срезы этого сложного заболевания 7,8,9. Дальнейший успех в облегчении бремени ВМД может быть достигнут благодаря открытию и исследованию первичной патологии в глазах человека, пониманию уникального клеточного состава макулы с последующей трансляцией в модельные системы. В этом отчете рассказывается о тридцатилетнем сотрудничестве между академической исследовательской лабораторией и глазным банком. Описанные здесь методы характеризации тканей преследуют две цели: 1) информировать развивающуюся диагностическую технологию, демонстрируя основы внешнего вида глазного дна и источников сигнала визуализации с помощью микроскопии, и 2) классифицировать образцы ВМД для целевых (иммуногистохимия) и нецелевых методов молекулярного обнаружения (масс-спектрометрия визуализации, IMS и пространственная транскриптомика), которые сохраняют только колбочку и богатые палочками пара- и перифовеи. Такие исследования могут ускорить переход к клинической ОКТ, для которой последовательность прогрессирования и продольное наблюдение возможны с помощью отслеживания взгляда. Эта технология, предназначенная для мониторинга эффектов лечения, регистрирует сканирование от одного посещения клиники до другого с использованием сосудов сетчатки. Связь ОКТ с отслеживанием глаз с лабораторными результатами, полученными с помощью деструктивных методов, может обеспечить новый уровень прогностической ценности молекулярных результатов.

В 1993 году исследовательская лаборатория сделала цветные фотографии посмертного глазного дна напленку 10. Эти усилия были вдохновлены превосходной фотомикроскопией и гистологией периферической сетчатки человека Foos и его коллегами 11,12,13 и обширными клинико-патологическими корреляциями AMD Sarks et al.14,15. Начиная с 2009 года, была принята мультимодальная визуализация ex vivo (MMI), основанная на ОКТ в спектральной области. Этот переход был вдохновлен аналогичными усилиями других 16,17 и особенно осознанием того, что большая часть ультраструктуры, описанной Сарками, со временем была доступна в трех измерениях в клинике 18,19. Цель состояла в том, чтобы получить глаза с прикрепленными макулами в разумные сроки для мощных исследований фенотипов клеточного уровня в сетчатке, RPE и сосудистой оболочке. Цель состояла в том, чтобы выйти за рамки статистики «на глаз» к «типу поражения», стандарту, на который повлияли концепции «уязвимого налета» от сердечно-сосудистых заболеваний20,21.

Протокол, приведенный в этом отчете, отражает опыт присоединения почти 400 пар донорских глаз в нескольких потоках. В 2011-2014 гг. был создан веб-сайт проекта MACULA по гистопатологии ВМД, который включает толщину слоев и аннотации из 142 архивных образцов. Эти глаза были сохранены с 1996 по 2012 год в глутаральдегидно-параформальдегидном фиксаторе для гистологии эпоксидной смолы высокого разрешения и электронной микроскопии. Все фундусы были сфотографированы в цвете при получении и были повторно сфотографированы с помощью ОКТ непосредственно перед гистологией. Держатель для глаз, первоначально разработанный для исследованийзрительного нерва 22, использовался для размещения пуансона ткани на всю толщину диаметром 8 мм, сосредоточенного на ямке. На сайт были загружены ОКТ-сканирование через фовеальный центр и участок на 2 мм выше, соответствующий гистологии на тех же уровнях, а также цветная фотография глазного дна. Выбор плоскостей ОКТ был продиктован выпуклостью патологии ВМД под ямкой23 и выпуклостью SDD в богатых палочками участках, превосходящих ямку24,25.

Начиная с 2013 года, глаза, визуализированные с помощью ОКТ-анкордированной MMI в течение жизни, были доступны для прямых клинико-патологических корреляций. Большинство (7 из 10 доноров) включали пациентов в реферальную практику сетчатки (автор: K.B.F.), которая предлагала расширенный директивный реестр для пациентов, заинтересованных в пожертвовании своих глаз после смерти для исследовательских целей. Глаза были извлечены и сохранены местным глазным банком, переданы в лабораторию и подготовлены так же, как глаза проекта MACULA. Предсмертные клинические тома ОКТ были легко счищены в лаборатории, что позволило согласовать признаки патологии, наблюдаемые в течение жизни, с особенностями, наблюдаемыми под микроскопом26.

Начиная с 2014 года, проспективный сбор глаз начинался с скрининга на ВМД в донорских глазах без клинического анамнеза, но сохраненных в течение определенного периода времени (6 часов). Для этого держатель для глаз был модифицирован для размещения целого глобуса. Это уменьшило вероятность отрыва по срезанным кромкам ранее использовавшегося 8-мм пуансона. Глаза консервировали в 4% буферном параформальдегиде для иммуногистохимии и переводили на 1% на следующий день для длительного хранения. В 2016-2017 гг. (до пандемии) было восстановлено 184 глаза от 90 доноров. Статистика и изображения в этом отчете взяты из этой серии. В эпоху пандемии (блокировки и последствия 2020 года) перспективные коллекции для транскриптомики и сотрудничества IMS продолжались более медленными темпами, в основном с использованием методов 2014 года.

Существуют и другие методы оценки донорского глаза. Миннесотская система оценок (MGS)27,28 основана на клинической системе AREDS для цветной фотографии глазного дна 29. К ограничениям этого метода относится объединение атрофической и неоваскулярной ВМД в одну стадию «поздней ВМД». Кроме того, MGS влечет за собой удаление нейросенсорной сетчатки перед фотодокументацией сосудистой оболочки RPE. Этот шаг в разной степени смещает SDD 30,31 и удаляет пространственное соответствие наружной сетчатки и ее поддерживающей системы. Таким образом, усилия по установлению связи метаболического спроса и передачи сигналов от сетчатки к патологии в РПЭ-сосудистой оболочке могут быть затруднены. Система штата Юта внедрила MMI с использованием цветной фотографии ex vivo и ОКТ для категоризации глаз, предназначенных для вскрытия, на области для экстракции РНК и белка32. Несмотря на то, что это предпочтительнее удаления целого наглазника, площадь диаметром 3 мм с наибольшим риском прогрессирования ВМД33,34 составляет только 25% от пуансона диаметром 6 мм, ориентированного на ямку. Таким образом, методы, которые могут локализовать результаты в отношении ямки, такие как серийное сечение для иммуногистохимии, являются преимущественными.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Институциональный наблюдательный совет Университета Алабамы в Бирмингеме одобрил лабораторные исследования, которые соответствовали надлежащей лабораторной практике и уровню биобезопасности 2/2+. Все офтальмологические банки США соответствуют Единому закону об анатомических подарках 2006 года и Управлению по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Большинство офтальмологических банков США, в том числе Advancing Sight Network, соответствуют медицинским стандартам Американской ассоциации глазных банков.

В таблице материалов перечислены расходные материалы и оборудование. В дополнительном материале 1 представлен обзор вскрытия, цветной фотографии глазного дна и MMI на основе ОКТ. В дополнительном материале 2 содержатся подробные сведения о MMI на основе OCT.

1. Критерии забора тканей

  1. Чтобы максимизировать выход глаз ВМД при скрининге недокументированных доноров, установите следующие критерии для приемлемых доноров: возраст ≥80 лет, белый, без диабета и ≤6 ч от смерти до сохранения (DtoP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: DtoP определяется как время между смертью и помещением глаза в предоставленный консервант либо в больнице, либо в лаборатории.

2. Консервационная среда и другая подготовка (лаборатория)

  1. Сделайте 4% фосфатно-буферный параформальдегид из 20% запаса (покупной). Приготовьте 1 л, добавив 200 мл 20% параформальдегида (коэффициент разбавления 5) к 800 мл 0,1 М фосфатного буфера Соренсона. При необходимости проверьте и отрегулируйте, чтобы убедиться, что pH составляет 7,2. Хранить при температуре 4 °C.
  2. Распределите 30 мл 4% фосфатно-буферного параформальдегида в банки по 40 мл.
  3. Храните маркированные контейнеры с консервантом объемом 40 мл в глазном банке, чтобы ткань можно было восстановить в любое время и в любой день.
  4. Для хранения законсервированных глаз из 1% раствора делают 4% параформальдегид. Приготовьте 1 л, добавив 250 мл 4% параформальдегида (коэффициент разбавления 4) к 750 мл 0,1 М фосфатного буфера Соренсона. При необходимости проверьте и отрегулируйте pH. Хранить при температуре 4 °C.
    1. Приготовьте 1 л 0,1 М раствора из 0,2 М раствора фосфатного буфера Соренсона, рН 7,2, комбинируя 500 мл дистиллированной воды и 500 мл буфера Соренсона.
    2. Отрегулируйте рН по каплям, используя 1 Н соляной кислоты или 1 Н гидроксида натрия. Хранить при температуре 4 °C.
  5. Создайте держатель для стабилизации глаз во время рассечения. Наполните чашку Петри зубным воском, нагретым до состояния жидкости. Когда он немного остынет, сделайте в нем полусферический оттиск с помощью большого шарикоподшипника, а затем заморозьте блюдо, чтобы облегчить снятие шарикоподшипника.

3. Методы глазного банка

  1. Чтобы обеспечить быстрое восстановление исследуемых тканей, быстро восстанавливают все ткани, в том числе и предназначенные для трансплантации.
  2. Получайте направления на смерть, как того требует закон, в течение 1 часа после смерти и отслеживайте каждого донора с помощью порядкового номера направления, который следует за тканью.
  3. Чтобы найти случаи с потенциальной клинической документацией, задайте вопросы, связанные с ВМД и заболеваниями глаз, в интервью по оценке риска доноров.
  4. Чтобы свести к минимуму время в пути, восстанавливайте целые глобусы (а не только роговицы для трансплантации) на компактной территории (т.е. в городе и прилегающем пригородном округе).
  5. Принесите две банки консерванта (буферизованного 4% параформальдегида) в больничную палату умершего для восстановления тканей (в отличие от ожидания, пока тело перевезут в морг).
  6. До и во время выздоровления общайтесь со следователями, чтобы подтвердить доставку и сроки.
  7. Извлеките глобусы на месте в больнице, откройте их с помощью последовательных методов обработки и погрузите открытый глаз в консервант (рис. 1).
    1. Удерживайте иссеченный донорский глаз на месте, используя оболочку из марли, стабилизированную гемостатом.
    2. Чтобы облегчить удаление роговицы с ободком склеры шириной 2 мм, используйте трепан диаметром 18 мм для забивания глобуса.
    3. Чтобы освободить роговицу с сопутствующим ободком склеры, разрежьте вдоль забитого круга с помощью подпружиненных ножниц с изогнутыми кончиками, стабилизируя глобус с помощью марли, обрезанной гемостатом.
    4. Поднимите роговицу со склеры, обнажив радужную оболочку и цилиарное тело.
    5. Для облегчения проникновения консерванта в стекловидную камеру делают щель длиной 2 мм в радужной оболочке перпендикулярно зрачковому краю. Поместите глаза в банки с образцами с 30 мл консерванта при температуре 4 ° C и перенесите в лабораторию на влажном льду.
  8. Передача обезличенной информации о донорах в электронном виде из банка глаз в базу данных исследовательской лаборатории.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В базе данных хранится реферальный номер, номер ткани глазного банка и идентификационный номер лаборатории для отслеживания, а также другая соответствующая информация.

4. Подготовка тканей к цветной фотосъемке глазного дна ex vivo

  1. Используйте два стереомикроскопа, один для вскрытия и один для цветной фотографии глазного дна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансиллюминации для визуализации пигментных изменений используйте основу для темнопольной микроскопии.
  2. Удалите остатки переднего сегмента (радужную оболочку и хрусталик). Чтобы стабилизировать глаз во время вскрытия, поместите его в чашку Петри, наполненную воском (дополнительный материал 1, слайды 7-8). Чтобы цилиарное тело и прикрепленная сетчатка не схлопывались в полость стекловидного тела, минимизируйте возмущение кольца толстого стекловидного тела, прикрепленного к цилиарному телу (основанию стекловидного тела).
  3. Отметьте верхний полюс для ориентации. Положите глобус передней стороной вниз в блюдо. Найдите вставные сухожилия верхней прямой мышцы и верхней косой мышцы. Используя деревянный аппликатор, осторожно нанесите маркировочные чернила по линии 10 мм в направлении от переднего к заднему (т. е. перпендикулярно сухожильному введению верхней прямой мышцы).
  4. Перед фотосъемкой заполните глазное ное дно холодным фосфатным буфером Соренсена.
  5. Вставьте рубиновую бусину диаметром 1 мм в глазное дно в виде внутренней шкалы, которая будет отображаться на каждом изображении27.
  6. Получайте цветные изображения с помощью однообъективной зеркальной камеры, установленной на стереомикроскопе с кольцевой вспышкой. Используйте транс-, эпи- и вспышку при каждом из трех стандартных увеличений для получения изображений, предназначенных для выделения определенных областей (дополнительный материал 1, слайд 11): 1) глазное дно до экватора, 2) задний полюс (сосудистые аркады, головка зрительного нерва, ямка) и 3) ямка в желтой пятне (желтое пятно).

5. Подготовка к цветной фотосъемке глазного дна ex vivo

  1. Включите камеру и монитор. Подключите дистанционный затвор и отпустите привод в мониторе камеры/телевизора (ТВ) мультимедийного интерфейса высокой четкости (HDMI) и кабеле дисплея.
  2. Установите в настройках камеры ручную функцию ISO и положение блокировки зеркала (зафиксировано на месте для уменьшения вибрации).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству пользователя производителя для получения информации о настройках используемой камеры. Узнайте на дисплее камеры настройки передержки/недодержки относительно гистограммы и показаний экспозиции.
  3. Расположите два источника света, каждый с двумя гибкими световодами, расположенными перпендикулярно друг другу, для освещения в четырех основных направлениях на предметном столике микроскопа (Дополнительный материал 1, стр. 10).
  4. Включите источники света с эпиподсветкой на полную мощность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно, но не обязательно иметь черный войлочный кожух вокруг сцены, чтобы ограничить рассеяние света / вспышки для фотографа.
  5. На препарирующем микроскопе используйте щипцы, чтобы вставить задний полюс в кварцевый тигель объемом 30 мл, заполненный буфером. Дайте ткани опуститься на дно. Вставьте связку, например, тканевую губку, между глазом и стенкой тигля, чтобы предотвратить движение. Вставьте рубиновую бусину диаметром 1 мм в задний полюс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шарик может попасть в чашечку зрительного нерва.
  6. Осторожно поместите глобус в тигель на столик стереомикроскопа и осмотрите внутреннее глазное дно через окуляры микроскопа. Используя наименьшее увеличение, сориентируйте глаз, определив тканевую метку в положении «12 часов», головку зрительного нерва (ONH) и ямку на 5° ниже ONH. Поверните глаз так, чтобы ямка опустилась ниже линии, проходящей через ONH, на 5°.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если это правый глаз, ONH находится справа от ямки, как видно из глаз микроскопа. Если это левый глаз, ONH находится слева от ямки.
  7. Включите удаленный просмотр монитора с камеры. Убедитесь, что ползунок светоделителя микроскопа настроен на наблюдение через фотопорт, а не через порт для окуляров. В зависимости от световой и зеркальной траектории будьте готовы повернуть ткань на сцене на 180° для правильной ориентации.

6. Получение изображения с использованием цветной фотографии глазного дна ex vivo

  1. При включенной эпиподсветке установите увеличение так, чтобы весь 18-миллиметровый трепан-разрез занимал все поле зрения. Увеличьте увеличение, чтобы можно было сфокусироваться на дне фовеальной ямки. Уменьшите масштаб до предыдущего значения.
  2. Отрегулируйте настройки ISO в диапазоне 1,600-3,000 так, чтобы время экспозиции попадало в центральный диапазон измерителя на камере.
  3. Нажмите на спусковой крючок дистанционного затвора. Прислушайтесь, пока зеркало не зафиксируется в верхнем положении. Нажмите на спусковой крючок еще раз для экспозиции.
  4. Наблюдайте за изображением на мониторе с предустановленными метаданными, показывающими красный, зеленый, синий (RGB) и цветную гистограмму для правильной экспозиции. Если воздействие приемлемо, продолжайте; Если нет, то удалите, переоцените параметры и повторно создайте образ.
  5. Выключите лампы на гусиной шее для эпи-подсветки, чтобы выделить друзы, и включите вспышку с экспозицией 1/4 с, выдержкой камеры 1/250 с и ISO 100-320. Установите скорость вспышки по умолчанию или измените ее во время первоначальной настройки камеры. Получите изображение и проверьте гистограмму на правильность экспозиции.
  6. Выключите вспышку и включите источник света с транссветом. Сбросьте ISO до уровня выше 5,000 и убедитесь, что время экспозиции не опускается ниже 1/30 с из-за потенциальной вибрации в фотосистеме. Получите изображение и проверьте гистограмму на правильность экспозиции.
  7. Увеличьте увеличение, чтобы увидеть как ONH, так и fovea в поле зрения. Включите лампы эпи-подсветки. Установите диапазон ISO на 1,600-3,000. Убедитесь, что время экспозиции находится в центральном диапазоне камеры.
  8. Выключите лампы эпи-подсветки и включите вспышку с экспозицией 1/4 с, предустановленной выдержкой камеры на 1/250 с и ISO на 400-800. Получите изображение и проверьте гистограмму на правильность экспозиции.
  9. Выключите вспышку и включите транс-подсветку с помощью базы темного поля. Сбросьте ISO до уровня выше 5,000. Убедитесь, что время экспозиции не медленнее 1/30 с из-за потенциальной вибрации в фотографической системе. Получите изображение и проверьте правильность гистограммы.
  10. Выключите трансиллюминацию и снова включите лампы эпи-подсветки.
  11. Увеличьте увеличение до того, которое использовалось на шаге 6.7. При необходимости переориентируйтесь.
  12. Увеличьте ISO в диапазоне 3,000-6,000 и отрегулируйте время экспозиции, чтобы оно соответствовало правильному диапазону экспозиции камеры. Приобретите изображение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рубиновая бусина может больше не отображаться в поле зрения. Если это так, сделайте отдельные изображения бусины с этим увеличением для справки.
  13. Выключите лампы эпи-подсветки. Включите вспышку с выдержкой 1/4 с и с выдержкой фотоаппарата до 1/250 с. Установите скорость вспышки по умолчанию или измените ее во время первоначальной настройки камеры и установите ISO на 500-1,000. Приобретите изображение. Проверьте гистограмму на правильность экспозиции.
  14. Выключите вспышку и включите лампы пересветки. Сбросьте ISO до уровня выше 8,000, чтобы обеспечить более быстрое время экспозиции с более чувствительным датчиком изображения. Следите за тем, чтобы время экспозиции не опускалось ниже 1/30 с из-за потенциальной вибрации в фотосистеме. Приобретите изображение.
  15. Экспортируйте изображения с камеры на компьютер. Просмотрите изображения, прежде чем извлекать образец из столика микроскопа, на случай, если некоторые из них необходимо захватить снова.

7. Обзор получения изображений для ОКТ ex vivo и сканирующей лазерной офтальмоскопии (SLO)

  1. Для ОКТ в спектральной области поместите глобусы в фосфатный буфер в специальный держатель для глаз с камерой с линзой 60 диоптрий35. Установите держатель для глаз на кронштейн на клиническом устройстве ОКТ-визуализации и прикрепите его к тому месту, где пациент будет опираться лбом. Устройство центра развертывания Office автоматически вставляет масштабную линейку в каждое изображение.
  2. В то же время, используя то же устройство и с глазом, все еще находящимся в держателе, снимите глобусы с помощью сканирующего лазерного офтальмоскопа (SLO) с использованием ближнего инфракрасного отражения (NIR, используемого в качестве локаторного изображения внутренним программным обеспечением), автофлуоресценции возбуждения глазного дна 488 нм (FAF) и отражения без красного (RF).
    ПРИМЕЧАНИЕ: FAF возбуждения 787 нм в этом устройстве подходит только изредка, потому что светоделитель снижает коэффициент пропускания света в SLO. По этой причине используется второе устройство для изображений FAF с длиной волны 787 нм (см. следующий пункт).
  3. Отдельно, но с глазом, все еще находящимся в держателе глаза, получите изображение глобусов с FAF 787 нм для обнаружения возмущенияRPE 36 с помощью отдельного устройства, которое хорошо отображает эту модальность.

8. Протокол получения изображений для ex vivo OCT/SLO (см. слайды в Дополнительном материале 2)

  1. Обозначьте верхнюю прямую мышцу тканевым маркировочным красителем. Включите лазер (синяя стрелка, Дополнительный материал 2, стр. 1).
  2. Ссылаясь на стр. 2 Дополнительного материала 2, расположите головку ОКТ, переместив весь блок по двум осям относительно основания (зеленая стрелка), а затем увеличив высоту (y), повернув джойстик по часовой стрелке/против часовой стрелки (cw/ccw, синие стрелки). Сфокусируйте изображение, повернув ручку (оранжевая стрелка) с черным рычагом в положении R (*). Зафиксируйте устройство, закрепив винт с накатанной головкой (фиолетовая стрелка).
  3. Вставьте глаз в держатель и стабилизируйте его сзади с помощью прокладок (Дополнительный материал 1, стр. 13). Оказывайте как можно меньшее давление, чтобы избежать вмятин на склерах. Ориентируйтесь так, чтобы тканевая метка для верхней прямой мышцы была обращена вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительное расстояние от передней части держателя глаза до устройства OCT составляет 25 мм.
  4. Откройте проприетарное программное обеспечение для визуализации и анализа для устройства OCT. В левом столбце появится список пациентов. Доноры глаз, индексируемые внутренним кодовым номером, являются «пациентами». Обратитесь к руководству пользователя от производителя.
  5. Выберите значок «Новый пациент ». При необходимости заполните данные о пациенте. Нажмите кнопку ОК. Используйте логически упорядоченную систему нумерации для отдельных глаз, например YYYYNNNL,R_agesex. Например, это может быть 2017016R_97F.
  6. Продолжив ввод данных в следующем окне, нажмите OK. Выберите оператора и изучите из выпадающего меню.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Введенная информация появится в экспортируемых метаданных.
  7. После просмотра пустого экрана нажмите желтую кнопку, чтобы начать получение изображения.
  8. Нажмите ИК + OCT (ближний инфракрасный коэффициент отражения + OCT). Позвольте лазеру получить живое SLO-изображение глазного дна и ОКТ B-сканирование.
    1. Определите правильное анатомическое положение на основе ONH и ямки и используйте деревянный аппликатор для регулировки положения глаз в держателе. На панели управления поверните черную круглую кнопку, чтобы отрегулировать интенсивность.
    2. Нажмите ту же кнопку, чтобы усреднить 9-100 кадров (красные стрелки; 9 достаточно, 100 выглядит кремовым). Если аппарат ориентирован правильно, глазное дно должно быть в фокусе, а ОКТ B-скан должен появиться в верхней трети дисплея (Дополнительный материал 2, стр. 9, двойная красная стрелка).
    3. На изображении глазного дна с помощью курсора переместите синюю линию, чтобы отцентрировать ямку (Дополнительный материал 2, стр. 9, белая стрелка). Нажмите Приобрести.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другими кнопками по умолчанию являются Retina, EDI (выкл.) и Line Scan.
  9. Нажмите RF + OCT для следующего приобретения. Еще раз проверьте положение, чтобы убедиться, что изображение не сдвинулось и не ухудшилось. Нажмите черную кнопку для усреднения. Нажмите Приобрести.
  10. Переключите внутренний куб для автофлуоресцентной визуализации на длины волн возбуждения 488 нм и 787 нм (дополнительный материал 2, стр. 10).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Показано положение куба после переключателя.
  11. Выберите режим автофлуоресценции . Еще раз проверьте выравнивание. Нажмите Приобрести.
  12. При подозрении на нарушение и атрофию RPE выберите ICGA (индоцианиновую зеленую ангиографию) для автофлуоресценции 787 нм. Еще раз проверьте положение глаз и нажмите кнопку Приобрести.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение глазного дна часто не появляется в этой модальности, потому что внутренний куб ослабляет луч.
  13. Переключите внутренний куб обратно в положение R для ИК-изображения и изображения без красного для получения объема.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положение куба после переключателя показано на стр. 13 Дополнительного материала 2.
  14. Чтобы получить тома центра развертывания Office, выберите IR и настройку тома. Сопоставьте все настройки, указанные на стр. 14 Дополнительного материала 2 , переключив соответствующие кнопки на модуле управления (куб макулы 30°, расстояние 30 мкм, усреднение в зависимости от требований эксперимента).
  15. Обратите внимание, что вид глазного дна с отражением в ближнем инфракрасном диапазоне покрыт синими линиями B-скана. Еще раз проверьте положение центра развертывания Office в верхней трети правого окна. Нажмите «Получить » на модуле управления и подождите 5 минут, пока не завершится сканирование тома. Когда получение изображения будет завершено, выберите EXIT. Изображения будут сохранены (красная стрелка).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Синие линии разграничивают расстояния, показанные на предыдущем представлении, в микрометрах. Сканирование начинается с нумерации снизу (снизу) и продолжается вверх. Обратите внимание на прогрессию красной линии.
  16. Позвольте компьютеру обработать полученные изображения, которые появятся на экране (Дополнительный материал 2, стр. 16).
  17. При визуализации других глаз одного донора не изменяйте положение монтажного кронштейна между глазами. Если сначала будет изображен левый глаз, результаты будут отображаться в столбце OD (правый глаз). Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать все образы, а затем выберите Exchange OS/OD. Образы перейдут в столбец ОС.
  18. Нажмите кнопку Выбрать > окне > базы данных. По умолчанию на экране отображается панель 6 с добавлением донорского глаза, изображенного в правом столбце (Дополнительный материал 2, стр. 18). Щелкните правой кнопкой мыши пациента в раскрывающемся меню, выберите «Пакетная обработка» и экспортируйте файл E2E.
  19. Перейдите в заранее определенную папку, созданную на рабочем столе для передачи файлов. Нажмите кнопку ОК. Папка содержит файлы E2E, которые необходимо скопировать на внешний жесткий диск и заархивировать.
  20. Поднесите глаз в держателе к сканирующему лазерному офтальмоскопу, который в основном используется для автофлуоресценции 787 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: обратитесь к руководству пользователя производителя для получения и архивирования изображений.
  21. Включите компьютер и лазер.
  22. Выберите значок «Новый пациент ». При необходимости заполните данные о пациенте.
  23. Чтобы сохранить таблицу глаз прежней, нажмите кнопку ОК. Поскольку С-образная кривая остается прежней, нажмите «Продолжить».
  24. Выберите «Режим обучения» и при необходимости введите пароль. Держите С-образную кривую на расстоянии 7,7 мм. Нажмите ОК.
  25. Нажмите кнопку Продолжить, чтобы проверить С-образную кривую. Выберите желтый индикатор, чтобы запустить камеру.
  26. Выберите позицию R . Выровняйте и сориентируйте земной шар. Выберите ИК-режим , чтобы сфокусироваться и сориентироваться, как указано выше.
  27. Сориентируйте головку камеры, переместив весь блок по двум осям относительно основания (дополнительный материал 2, стр. 28, зеленая стрелка), а затем подняв высоту (y) устройства (синие стрелки). Сфокусируйте изображение, вращая ручку (оранжевая стрелка). Черный рычаг находится в положении R (*). После того, как эта головка встанет на место, зафиксируйте устройство, повернув винт с накатанной головкой (фиолетовая стрелка).
  28. Обратите внимание, что экран выглядит так, как показано на стр. 29 Дополнительного материала 2.
  29. Переместите ручку селектора из положения R в положение A. Выберите ICGA (для достижения автофлуоресценции 787 нм) синего цвета, 100% интенсивности, поля зрения 30° и однофазной визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как и краситель индоцианин зеленый, меланин возбуждается светом с длиной волны 787 нм.
  30. Обратите внимание, что экран выглядит так, как показано на стр. 31 Дополнительных материалов 2. Нажмите черный диск для усреднения, а затем выберите Приобрести.
  31. Выберите «Окно» > «База данных». Выберите «Импортировать файлы E2E с устройства SLO»; Эти файлы хранятся на внешнем жестком диске и загружаются на рабочий стол.
  32. Выберите Открыть. Убедитесь, что отметки установлены по умолчанию, и нажмите кнопку ОК.
  33. Обратите внимание, что у пациента теперь есть две вкладки: одна показывает изображения, полученные с помощью SLO (синяя стрелка), а другая вкладка показывает изображения, полученные с помощью устройства OCT (красная стрелка) (Дополнительный материал 2, стр. 34).
  34. Щелкните правой кнопкой мыши изображение с длиной волны 786 нм (ICGA) и экспортируйте изображение в файл с надписью SLO 786 на рабочем столе.
  35. Чтобы сохранить изображение SLO с автофлуоресценцией 786 нм, выберите пациента и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы экспортировать изображения в виде файлов RAW (для файлов .vol) в папку на рабочем столе.
  36. Чтобы экспортировать изображения с устройства развертывания Office для передачи на архивный компьютер, скопируйте или вставьте из RAWEXPORT в папку с меткой RAW.

9. Обзор изображений

  1. Соберите изображения (цветные, файлы .vol, изображения SLO) в папки для каждого донора с подпапками для каждого глаза и последовательно проиндексируйте папки по идентификатору лаборатории.
  2. Запишите отпечатки тканей (качество, патология) в базу данных для стандартизированного отчета.
  3. Просмотрите экспортированные тома центра развертывания Office с помощью собственного подключаемого модуля ImageJ.
    1. Найдите центр ямки, который можно узнать по центру фовеального провала, внутреннему подъему наружных полос сетчатки или самой тонкой точке. В большинстве случаев они будут совпадать, но не всегда, так как это зависит от фовеальной сохранности, индивидуальной изменчивости и наличия патологии.
    2. Найдите стандартное сканирование в верхней перифове (2 мм/67 B-сканов в верхнем направлении; т. е. увеличивая количество сканов).
    3. Сохраните .tif стек всего тома для быстрого использования в будущем.
    4. Прокрутите том центра развертывания Office полностью, начиная со сканирования 1 (ниже), записывая при этом номера сканов, в которых распознаются объекты.
    5. Проверьте перипапиллярную область в дополнение к макуле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перипапиллярная хориоретинальная атрофия в старых глазах включает характерный базальный ламинарный отложение и неоваскуляризацию. Это распространенная область пигментных изменений при близорукости глаз и глаукоме, а также при старении иВМД 37.
  4. Осмотрите цветные фотографии и свяжите любые результаты с теми, которые были замечены ОКТ, если это возможно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, большинство результатов легче увидеть с помощью ОКТ. Цветные фотографии дают большой обзор области за пределами области на SLO, хориоидальную пигментацию, включая невусы, наличие гемовых и твердых экссудатов, а также черный пигмент при неоваскулярной ВМД. Темный пигмент в ямке может представлять собой рыхлые меланосомы из переднего сегмента и должен быть аккуратно смыт буфером с помощью пипетки.
  5. Проверьте изображения SLO и, если возможно, свяжите все результаты с теми, которые были видны с помощью OCT.
  6. Сохраняйте стандартные B-сканы в ямке и перифове, дополнительные B-сканы с заметной патологией или другими признаками, а также изображения SLO в отчете о патологии.
  7. Классифицируйте глаза следующим образом: ничем не примечательная, сомнительная, ранняя-средняя ВМД, атрофическая ВМД, неоваскулярная ВМД, другая, неизвестная, не поддающаяся градации, не зарегистрированная. «Сомнительный» используется, если неясно, являются ли изменения достаточно серьезными для другой категоризации. «Не градуируется» зарезервировано для глаз, в которых отсутствуют полезные ОКТ-сканирования, например, с сильно отслоившейся сетчаткой. «Не записано» зарезервировано для глаз, которые обрабатываются сразу после получения без фотографии.
  8. Используйте следующие критерии для ВМД: тяжелое изменение РПЭ с друзами или субретинальными друзеноидными отложениями, с признаками неоваскуляризации или без них, такими как жидкость или фиброз, и без признаков других причин (обновлено из Curcio et al.10 для учета SDD).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный диагноз подтверждается гистологическим анализом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Из таблицы 1 видно, что в течение 2016-2017 гг. было восстановлено 184 глаза от 94 белых доноров, не страдающих диабетом, > возрасте 80 лет. Среднее время от смерти до сохранения составило 3,9 ч (диапазон: 2,0-6,4 ч). Из 184 обследованных глаз у 75 (40,2%) была определенная ВМД. Были выявлены следующие категории: непримечательные (39,7%), сомнительные (11,4%), ранние-средние ВМД (22,8%), атрофические (7,6%), неоваскулярные (9,8%), другие (8,7%) и неизвестные/не регистрируемые/не поддающиеся градации (<1%). На рисунке 2, рисунке 3, рисунке 4 и рисунке 5 показана многомасштабная мультимодальная визуализация ex vivo исключительно хорошо сохранившихся глаз из этой серии. Глаза были рассмотрены в сотрудничестве с офтальмологом, специализирующимся на заболеваниях сетчатки (J.A.K.). В то время как некоторые глаза показывали индивидуальные черты лучше, чем другие, эти чехлы были выбраны за всестороннее высокое качество.

Как описано38, цветная фотография ex vivo отличается от соответствующей фотографии in vivo . Отек и/или отслоение сетчатки может снизить видимость задних пигментированных тканей. Наблюдения свежим взглядом показывают, что эти изменения происходят посмертно и не ухудшаются заметно при быстрой фиксации. Кроме того, сосуды хориоидеи опорожняются после смерти. Из-за волнистого фона бледных сосудов и темной интерстициальной ткани оценка пигментных вариаций в плоскости RPE должна поддерживаться модальностями, отличными от цвета. В ex vivo OCT доступно больше информации, чем в цветной фотографии. Ex vivo ОКТ также существенно отличается от ОКТ in vivo . Основные различия включают общую повышенную отражательную способность ткани, особенно во внутренней сетчатке, постоянную отражательную способность некоторых полос (слой нервных волокон, внутренний и внешний плексиформный слой, RPE), меньшую видимость деталей сосудистой оболочки, особенно под отечной сетчаткой, и видимость отслоений слоя ткани (см. Ниже). Наружные гиперрефлективные полосы сетчатки, включающие фоторецепторы и RPE (эллипсоидная зона, EZ; межпальцевая зона, IZ), непоследовательно видны ex vivo и не используются в качестве ориентиров в этом контексте. Клинический консенсус для ОКТ в спектральной области использует термин RPE-Bruch's membrane (BrM). Тем не менее, термин RPE-базальная пластинка (BL)-полоса BrM является предпочтительным, поскольку он учитывает появление базальных ламинарных отложений при ВМД24.

На рисунке 2 показана ничем не примечательная макула и гипорефлективные крупные сосуды хориоидеи с отражающей полосой RPE-BL-BrM между ними. Крупный сосуд во внутренней части сетчатки отбрасывает тень на задние слои. IPL и OPL умеренно отражающие. В NIR SLO видны сосудистые сети сетчатки и хориоидеи. SLO без красного отражения лучше всего подходит для особенностей внутренней сетчатки и витреоретинальных интерфейсов, таких как дугообразные волокна и папилломакулярный пучок НФЛ. В нормальных глазах автофлуоресцентный SLO с длиной волны 488 нм показывает область общего сниженного сигнала в центральной макуле из-за утолщенной парафовеи и, в некоторых случаях, поглощения желтым пигментом ксантофилла, а также гипераутаутофлуоресценции, выстилающей крупные сосуды сетчатки, что наводит на мысль о соединительнотканных оболочках. Автофлуоресценция на длине волны 787 нм показывает небольшую область повышенного сигнала в центральной макуле от RPE, сигнал в строме хориоидеи и гипоавтофлуоресцентные полосы, соответствующие сосудам хориоидеи.

На рисунке 3 показана макула с ранней-промежуточной ВМД. Видимые признаки включают мягкую друзу (куполообразное возвышение РПЭ возле ямки), SDD (прерывистую отражательную способность с зубчатым внешним видом, внутренним по отношению к полосе RPE-BL-BrM), гиперрефлективные очаги (HRF, отражающий материал с той же отражательной способностью, что и внутрислойный RPE, расположенный в сетчатке) и вителлиформное изменение (расширение органелл RPE внутрь, как внутриклеточных, так и внеклеточных, в сочетании с базальными ламинарными отложениями39). Цветная фотография показывает сильную пигментацию, соответствующую вителлиформному поражению, окруженную уменьшенной пигментацией. Ни друзы, ни SDD четко не видны по цвету. Коэффициент отражения в ближнем ИК-диапазоне показывает отражательную способность в ямке. Автофлуоресценция при возбуждении 488 нм показывает пятнистый сигнал в ямке. SDD иногда появляются в модальностях SLO; это более вероятно, если SDD в изобилии, а SDD легче всего рассматривать как регулярно расположенный точечный узор (см. Spaide and Curcio19, рис. 6). Рисунок, верхний и временный по отношению к ямке на рисунке 3I , не является SDD, потому что он нерегулярен и локализован в поверхностной фокальной плоскости. На всех лицевых модальностях видны тонкие складки, расходящиеся от ямки. В менее хорошо сохранившихся глазах подобные складки могут быть достаточно большими, чтобы их можно было увидеть при наименьшем увеличении зрения.

На рисунке 4 показана макула с атрофической ВМД. На цветной фотографии глазного дна видны круглые атрофические участки, центральная гиперпигментация и небольшие гиперпигментированные точки в парафовее, которые соответствуют в ОКТ HRF на уровне слоя волокна Генле — внешнего ядерного слоя (HFL-ONL). Кроме того, при ОКТ низкое плоское возвышение RPE может представлять собой базальное ламинарное отложение, неэкссудативную неоваскуляризацию 1-го типа или и то, и другое. Атрофия при фовеальном В-сканировании распознается по оседанию HFL-ONL, области гипертрансмиссии (свет, проникающий через сосудистую оболочку), вителлиформному изменению с усиленным затенением в фовеальном центре и HRF, отбрасывающему тени. В этом глазу отражательная способность NIR показывает гиперотражающие пятна в ямке. Автофлуоресценция при возбуждении 787 нм эффективно показывает сигнал, соответствующий фовеальной гиперпигментации и отсутствию сигнала в круговых атрофических участках. Автофлуоресценция без красного цвета и длиной волны 488 нм показывает внутренние особенности сетчатки.

На рисунке 5 показана макула с макулярной атрофией, вторичной по отношению к неоваскулярной ВМД. Цветная фотография глазного дна показывает черную пигментацию в атрофической области. ОКТ показывает атрофию из-за провисания (оседания) HFL-ONL и повышенной гипертрансмиссии. Фовеальное В-сканирование показывает насыпь субфовеального гиперрефлективного материала и интраретинальных кист. Ближний инфракрасный коэффициент отражения показывает отражательную способность в атрофической области из-за потери RPE и сосудов хориоидеи. Небольшая, интенсивно отражающая область в ямке не видна на цвете. Красная рефлекторная способность показывает сосуды сетчатки и, в кольцевой зоне, сосуды хориоидеи. Автофлуоресценция (488 нм) ясно показывает примерно круговую атрофическую границу и островки начинающейся атрофии. Центральная область, лишенная сигнала, окружена кольцевым кольцом из умеренных сигнальных и видимых сосудистых сосудов хориоидеи.

На рисунке 6 показаны распространенные артефакты в ОКТ-визуализации ex vivo. Отек может быть заметен во внутренней части сетчатки, создавая выпуклости и складки через ямку (рис. 6A, I). Механические повреждения могут возникать при вытяжении стекловидного тела или при непосредственном контакте сетчатки с рассекающими инструментами, что приводит к вывиху материала, а иногда и к потере этого материала (рис. 6F, G). Отслоения могут возникать вдоль нескольких плоскостей ткани и могут представлять собой относительные растягивающие силы между слоями, которые также возникают in vivo. Любое отслоение может еще больше расшириться при последующей обработке. Наиболее распространенной является отслойка сетчатки (т.е. между наружными сегментами фоторецептора и апикальными отростками RPE) (рис. 6B-D,F-I). Апикальные отростки могут либо отделяться от наружных сегментов, либо оставаться с телами клеток RPE, что определяется гистологией. Отслоения сетчатки могут быть большими и вздымающимися (рис. 6B, D, I) или узкими и едва различимыми (рис. 6C, F, G). Отслоение бациллярного слоя (BALAD40) было впервые обнаружено в лаборатории, а затем обнаружено в клинической ОКТ. BALAD приписывается расщеплению через миоидную часть внутренних сегментов фоторецепторов, которая оставляет эллипсоидную часть внутреннего сегмента и внешний сегмент, прикрепленный к RPE (рис. 6A, D, I). BALAD не следует путать с SDD in ex vivo OCT. Третьей плоскостью отслоения является внутренняя ограничивающая мембрана (ILM), и между ILM и оставшимися слоями сетчатки часто остается остаточная отражающая жидкость (рис. 6A, B, I). Наименее распространенная отслойка наблюдается между сосудистой оболочкой и склерой (рис. 6В). Ямка часто имеет кистозные пространства, которые не следует считать патологическими без подтверждающих доказательств, таких как признаки неоваскуляризации (рис. 6H). При одиночных B-сканах волнообразные колебания RPE могут создавать впечатление друзы. 3D-вид объема ОКТ проясняет, что они перемещаются по сосудам хориоидеи (рис. 6E, J). Волнообразные колебания могут быть вызваны дифференциальными изменениями объема между сосудами и промежуточными стромами после смерти и во время фиксации.

Чтобы откалибровать ожидания в отношении качества и изучить ограничения ОКТ ex vivo, на рисунке 7 сравниваются визуализация in vivo, визуализация ex vivo и гистология трех клинически документированных глаз с ВМД. Эти три глаза сохранились иначе, чем на рисунке 2, рисунке 3, рисунке 4 и рисунке 5. Для подтверждения структурных источников отражательной способности ОКТ, которые являются субклеточными41, глаза на рисунке 7 были сохранены в 2,5% глутарового альдегида и 1% глутарового альдегида, что позволило провести гистологию эпоксидной смолы с высоким разрешением и корреляционную электронную микроскопию. Глутаровый альдегид добавляет непрозрачность этим образцам по сравнению с теми, которые показаны на рисунке 2, рисунке 3, рисунке 4 и рисунке 5. Эффект более короткого по сравнению с более длинным DtoP очевиден (рис. 7A-F, 2,1 ч против рис. 7G-I, 8,9 ч). В глазу с более длительным DtoP посмертный отек изменил контур сетчатки, и ILM был отслоен. Интересующая патология (наружная тубуляция сетчатки) была незначительной при визуализации ex vivo. Это было обнаружено потому, что ОКТ с отслеживанием глаз in vivo точно определила соответствующее B-сканирование, и сосуды хориоидеи могли быть сопоставлены. В обоих глазах с более коротким DtoP сразу же проявились некоторые основные патологии (макулярная неоваскуляризация 3-го типа) (рис. 7A-C). Другие были обнаружены с помощью отслеживания глаз (рис. 7D-F).

Figure 1
Рисунок 1: Иссечение роговицы из донорского глаза человека для иммерсионной фиксации сетчатки. Вверху слева иссеченный донорский глаз удерживается на месте оболочкой из марли, стабилизированной гемостатом; вверху справа трепан диаметром 18 мм используется для создания круговой шкалы, включающей роговицу и ободок склеры шириной 2 мм; посередине, забитый круг завершается разрезом подпружиненными ножницами с изогнутыми наконечниками, а глобус стабилизируется; внизу слева роговица и склеральный край приподняты, обнажая радужную оболочку (синюю) и цилиарное тело (коричнево-коричневый); снизу посередине, роговица с ободком отрывается полностью; Внизу справа радужная оболочка обрезается перпендикулярно зрачковому краю, чтобы облегчить проникновение консерванта в стекловидную камеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Мультимодальная визуализация ex vivo ничем не примечательной макулы. Макула от 82-летней женщины-донора с интервалом от смерти до сохранения 1,97 часа. (A) Глазное дно правого глаза с удаленным передним сегментом (эпи-освещение). (B) Крупный план макулы (эпи-иллюминация). (C) Крупный план ямки (эпи-иллюминация). Зелеными линиями обозначены места расположения В-сканов ОКТ на панелях D и E. (Д,Е) ОКТ В-сканирование через (D) верхнюю перифовею (Е) и ямку. Видны сетчатка (R), сосудистая оболочка (C) с гипорефлективными крупными сосудами и промежуточная гиперрефлективная полоса RPE-BL-BrM. В этом исключительно хорошо сохранившемся глазу также видны умеренно отражающие IPL и OPL. (D) Большой сосуд во внутренней сетчатке отбрасывает тень на задние слои. (E) Разделение между сетчаткой и RPE на панели E (желтая стрелка) является искусственным. (F) Коэффициент отражения в ближнем инфракрасном диапазоне показывает детализацию сосудов как сетчатки, так и хориоидеи. (G) Коэффициент отражения без красного цвета показывает дугообразные волокна (левая зеленая изогнутая стрелка) и папилломакулярный пучок (зеленая стрелка) слоя нервных волокон. (H) Автофлуоресценция с длиной волны 488 нм показывает область общего сниженного сигнала в центральной макуле из-за утолщенной отечной парафовеи, а также кольца и точку низкого сигнала в фовеальном центре и гиперавтофлуоресценцию, выстилающую крупные сосуды сетчатки, что наводит на мысль о соединительнотканных оболочках. (I) Автофлуоресценция на длине волны 787 нм показывает небольшую область повышенного сигнала в центральной макуле от RPE, сигнал в строме хориоидеи и гипоавтофлуоресцентные полосы, соответствующие сосудам хориоидеи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Мультимодальная визуализация ex vivo донорского глаза с ранней промежуточной ВМД. Донорский глаз от 97-летней женщины-донора с интервалом от смерти до сохранения 3,1 часа. (A) Глазное дно правого глаза с удаленным передним сегментом (эпи-освещение). (B) Крупный план макулы (эпи-иллюминация). Зелеными линиями обозначены места расположения B-сканов OCT на панелях D, E и F. (C) Крупный план ямки с гиперпигментацией (стрелка, вспышка). (D) SDD в верхней перифове (оранжевые стрелки) виден на OCT. I Вителлиформная смена в РПЭ под ямкой (белые стрелки). (F) Ниже ямки находится мягкая друза с гипоотражающей линией у основания (желтая стрелка) и гиперотражающим фокусом выше (светло-голубая стрелка). (Г-И) Изображения сканирующего лазерного офтальмоскопа показывают очень тонкие звездчатые складки в ямке (также видны на C). (G) Коэффициент отражения в ближнем инфракрасном диапазоне показывает отражательную способность материала в ямке, частично соответствующую вителлиформному материалу. (H) Коэффициент отражения без красного цвета показывает поверхность сетчатки. (I) Автофлуоресценция с длиной волны 488 нм показывает область общего сниженного сигнала в центральной макуле из-за слегка утолщенной парафовеи. SDD не видны четко. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Мультимодальная визуализация ex vivo полного РПЭ и атрофии сетчатки при возрастной макулярной дегенерации. Донорский глаз от 97-летней женщины с интервалом от смерти до сохранения 2,33 ч. (A) Глазное дно левого глаза, осмотренное с транс-освещением. (B) Крупный план макулы (эпи-иллюминация). Зелеными линиями обозначены места расположения В-сканов ОКТ на панелях D и E. (C) Крупный план ямки (эпи-иллюминация), показывающий центральную гиперпигментацию (зеленый наконечник стрелки) и небольшие гиперпигментированные точки (желтые наконечники стрелок). Центральная точка интенсивно коричневая, потому что вышележащая сетчатка очень тонкая. Точки кажутся ненасыщенными, потому что вышележащая сетчатка толстая. Обозначены круглые атрофические участки (белые наконечники стрелок). (Д,Е) ОКТ В-сканирование через (D), перифовею (Е) и ямку. Видна сетчатка (R) и тонкая сосудистая оболочка (C). (D) Гиперотражающие очаги (желтые наконечники стрелок) на уровне HFL-ONL соответствуют гиперпигментированным точкам в C. Низкое плоское возвышение RPE под ними может представлять собой базальное ламинарное отложение, неэкссудативную неоваскуляризацию 1-го типа или и то, и другое. (E) В-сканирование через ямку показывает атрофию, распознаваемую по оседанию HFL-ONL (красный наконечник стрелки), области гиперпередачи, вителлиформному изменению с усиленным затенением в фовеальном центре (зеленая звездочка) и гиперотражающим очагам (бирюзовый наконечник стрелки) с затенением. Гипорефлективное пространство между сетчаткой и полосой RPE может представлять собой субретинальную жидкость. (F) Коэффициент отражения в ближнем инфракрасном диапазоне показывает гиперотражающие пятна в ямке. (G) На красном изображении показаны дугообразные волокна НФЛ и отражающие цветы на поверхности сетчатки. (H) Автофлуоресценция 488 нм, сфокусированная на сетчатке, показывает сигнал, связанный с сосудами сетчатки, отсутствие сигнала, связанного с RPE, и слабые автофлуоресцентные пятна в центральной макулярной области. (I) Автофлуоресценция 787 нм показывает сигнал, соответствующий пигментации в C. Видны круговые атрофические участки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Мультимодальная визуализация ex vivo неоваскуляризации 1 типа и макулярной атрофии при возрастной макулярной дегенерации. Донорский глаз от 86-летней женщины-донора с интервалом от смерти до сохранения 3,5 часа. (A) Глазное дно левого глаза с удаленным передним сегментом (транс-освещение). (B) Крупный план макулы с подробным описанием атрофических границ (желтые наконечники стрелок). Зелеными линиями обозначены места расположения В-сканов ОКТ на панелях D и E. (C) Крупный план ямки показывает черную пигментацию (зеленые наконечники стрелок) в атрофической области. (Д,Е) ОКТ В-сканирование через (D) перифовеа (E) и ямку. Видны сетчатка I и тонкая сосудистая оболочка (С). В этом исключительно хорошо сохранившемся глазу также видны умеренно отражающие IPL и OPL. (D) Перифовеальное В-сканирование охватывает верхний край атрофической области. Об атрофии свидетельствует провисание HFL-ONL и повышенная гипертрансмиссия (красные наконечники стрелок). Указываются возможные субретинальные отложения друзеноидов (наконечники стрел фуксии). (E) Фовеальное В-сканирование показывает насыпь субфовеального гиперотражающего материала и интраретинальные кисты (звездочка). O = головка зрительного нерва. (F) Коэффициент отражения в ближнем инфракрасном диапазоне показывает отражающую область атрофии и сосуды хориоидеи (бирюзовые наконечники стрел), включая небольшую интенсивную область в центральной макуле (оранжевый наконечник стрелы), не видимую при цветном изображении. (G) Коэффициент отражения без красного цвета показывает сосуды сетчатки и, в пределах кольцевой зоны, сосуды хориоидеи. (H) Автофлуоресценция с длиной волны 488 нм изображает примерно круглую атрофическую границу (желтые наконечники стрелок) и островки начинающейся атрофии. Центральная область, лишенная автофлуоресценции, окружена кольцевым кольцом умеренной автофлуоресценции и видимыми сосудами хориоидеи (белые наконечники стрелок). Автофлуоресценция 787 нм была невозможна в этом глазу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Общие артефакты, наблюдаемые при ОКТ-визуализации донорских глаз ex vivo. Эти глаза взяты из серии глаз 2016-2017 годов. Большинство сетчаток являются гиперотражающими по сравнению с сетчатками, изображенными in vivo, а внутренние слои сетчатки более отражающие, чем внешние слои сетчатки. Бациллярная отслойка (желтые наконечники стрелок на панелях A, D, G и I) определяется как расщепление на уровне миоида внутреннего сегмента фоторецептора, которое создает характерную интраретинальную полость40. Отслоение сетчатки (зеленые стрелки на панелях B, C, D, F, G и I) описывает отделение всей нейросенсорной сетчатки от лежащего в основе RPE42. Отслоения внутренней ограничивающей мембраны (ILM) разделяют слой ILM и нервных волокон (красные наконечники стрелок на панелях A, B и I). Отслойка хориоидеи (синий наконечник стрелки на панели C) представляет собой разделение внутри сосудистой оболочки или между сосудистой оболочкой и склерой. Механические повреждения (фиолетовая стрелка на панелях F и G) могут появиться на любом уровне и с любыми размерами, как это относится к отсутствующему материалу (зеленая стрелка на панели G) и смещенному материалу (желтая стрелка на панели G). Отек сетчатки (фиолетовые звезды на панелях A и I) проявляется как утолщение ткани сетчатки с плохо очерченными границами между отдельными слоями сетчатки. Волнообразный RPE (синие стрелки на панелях E и J) выглядит как неровный волнистый слой RPE. Кистозные поражения (красный квадрат на панели H) коррелируют с гипорефлективными камероподобными изменениями в ткани сетчатки, обычно в ямке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Видимость патологии in vivo ex vivo зависит от качества сохранности. (A-Я) Панели A, Bи CПанели D, Eи F, и панели G, Hи Я представляют собой три клинически задокументированных глаза от двух доноров, каждый из которых виден с помощью слежения за глазами in vivo (A1-A2,D1-D2,G1-G2) и ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2) визуализация с последующей гистологией (C,F,Я). Зеленые линии отражения ближнего инфракрасного диапазона (NIR, A1,B1,D1,E1,G1,H1) представляют собой уровни оптической когерентной томографии (ОКТ), В-сканирования и панорамной гистологии. Панели A, Bи C и панелей D, Eи F, представляют правый и левый глаз, соответственно, одной женщины-донора в возрасте 90 лет. Панели G, Hи Я показать правый глаз второй женщины-донора, также в возрасте 90 лет. (A-CХорошо сохранившаяся глазная ткань (DtoP: 2,1 ч) обеспечивает хорошую видимость основной патологии. (A) Гиперрефлективная интраретинальная макулярная неоваскуляризация (тип 3 MNV, зеленая стрелка) окружена интраретинальной жидкостью за 17 месяцев до смерти (A2). Мембранный комплекс РПЭ/Бруха расщеплен гипоотражающим материалом и выглядит как знак «двойного слоя» (A2). Слева еще один двухслойный знак со штрих-кодом гипертрансмиссии в сосудистую оболочку (оранжевый наконечник стрелки). На ex vivo ОКТ (B2), MNV типа 3 и гипертрансмиссия штрих-кода хорошо видны и очерчены. Сетчатка искусственно отслоена, как показано белым наконечником стрелки. Панорамная гистология показывает вертикально ориентированное поражение MNV типа 3 (зеленый наконечник стрелки, C1). Посмотреть предыдущее исследование43,44 для получения подробной информации об оригинальном деле. (D-FХорошо сохранившаяся глазная ткань (DtoP: 2,1 ч) может привести к снижению прозрачности, но все же достаточной для выявления основной патологии. OCT (D2) показан стек интраретинальных гиперрефлекторных очагов (HRF, фуксия стреловидная стрелка) в глазу, за которым следует экссудативный MNV 3-го типа. Интраретинальные кисты не видны за 11 месяцев до смерти. На ex vivo ОКТ (E2), стопка HRF сжата по вертикали (наконечник стрелы цвета фуксии), но четко очерчена. Об панорамной гистологии (F1), башня пигментного эпителия сетчатки (fuchsia arrowhead) поднимается вверх из мягкой друзы. (G-ЯМенее хорошо сохранившаяся глазная ткань (DtoP: 8,9 ч) приводит к снижению видимости основной патологии. ОКТ указывает на наружную тубуляцию сетчатки (ОРТ, желтый наконечник стрелки) за 48 месяцев до смерти (G2). На странице ex vivo ОКТ, ОРТ проявляется как тонкое возмущение, и это было бы трудно различить без предварительного знания (H2). Внутренняя ограничительная мембрана искусственно отделена (белый наконечник стрелы). Отек исказил контур сетчатки. Гистологический анализ показывает просвет ОРТ, ограниченный наружной ограничительной мембраной и выступающими в нее фоторецепторами (Я1). Посмотреть предыдущее исследование26,45 для получения подробной информации об оригинальном деле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Числа Проценты
Диагностическая категория Правые глаза Левый глаз Итог Правые глаза Левый глаз Итог
Обыкновенный 39 34 73 41.50% 37.80% 39.70%
Сомнительная AMD 10 11 21 10.60% 12.20% 11.40%
Ранняя ВМД 20 22 42 21.30% 24.40% 22.80%
Атрофическая ВМД 6 8 14 6.40% 8.90% 7.60%
Неоваскулярная ВМД 11 7 18 11.70% 7.80% 9.80%
Другой 7 8 15 7.40% 8.90% 8.20%
Неизвестный 0 0 0 0.00% 0.00% 0.00%
Не записано 1 0 1 1.10% 0.00% 0.50%
Итог 94 90 184 100.00% 100.00% 100.00%
Некоторые AMD 37 37 75 39.40% 41.10% 40.20%
Возможная драма 47 48 95 50.00% 53.30% 51.60%
Глаза были присоединены в период с 17.06.16 по 14.09.17. Критерии: ≥ 80 лет, белый, без диабета, ≤6 ч от смерти до сохранения. Цель: 184 глаза (180 глаз 90 доноров, сохранены; 4 глаза 4 донора, сохранены) Время от смерти до сохранения (среднее, максимальное, минимальное): 3,9 ч, 6,4 ч, 2,0 ч

Таблица 1: Восстановление донорских глаз в 2016-2017 гг.

Дополнительный материал 1: Обзор вскрытия, цветной фотографии глазного дна и мультимодальной визуализации на основе ОКТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный материал 2: Подробная информация о мультимодальной визуализации на основе ОКТ, иллюстрирующая шаги, описанные в разделах 5-8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Используя популяционный подход к скринингу в течение 16-месячного периода в доковидную эпоху, удалось получить 75 донорских глаз с ВМД. Все они были восстановлены с помощью короткого DtoP и поставлены с использованием MMI с привязкой к OCT. Возрастной критерий (>80 лет) выходит за рамки типичного возрастного диапазона для восстановления тканей, предназначенных для трансплантируемой роговицы. Несмотря на преклонный возраст, наши критерии привели к появлению глаз на всех стадиях ВМД. Многие фенотипы RPE являются общими для всех стадий ВМД, а некоторые являются эксклюзивными для неоваскулярной ВМД 3,46. Прямое сравнение изображений ex vivo и in vivo (рис. 7) подтвердило, что короткий DtoP является критическим фактором, наряду с экспертной обработкой (рис. 1), в получении изображений наружной сетчатки ex vivo, достаточных для диагностической классификации верхнего уровня, и некоторые из этих образцов были пригодны для прямых корреляций между визуализацией и гистологией 4,35, 47. Не всякая патология видна ex vivo. Тем не менее, при использовании ОКТ видно гораздо больше по сравнению с методами10, основанными на цветной фотографии, особенно теми, которые включают отделение сетчатки от RPE/сосудистой оболочки27. Кроме того, отслеживание взгляда с помощью клинической ОКТ направляет внимание на очаговые, а иногда и на мелкие особенности (рис. 7).

Эта система консервации включает в себя типичные процедуры банкирования глаз и инструменты для удаления роговицы с последующим погружением открытого глаза в заранее предоставленный консервант. Таким образом, персонал глазного банка может непрерывно восстанавливать исследовательские ткани (24/7). Последняя характеристика имеет решающее значение, так как ткани, предназначенные для немедленного сложного вскрытия27,32, требуют круглосуточного персонала либо исследователями, либо глазным банком, либо обоими. Другие стабилизаторы, которые позволят восстанавливать ткани в любое время с последующим специализированным рассечением и экстракцией в рабочее время, такие как тканевая система PAXgene и Hibernate-A, могут быть полезны в будущем, если они совместимы с ОКТ-визуализацией.

Этот подход дает сетчатку, которая остается в значительной степени прикрепленной к RPE и, таким образом, способна генерировать данные, переводимые в ОКТ-визуализацию. Точная локализация имеет важное значение, потому что макула небольшая (<3% площади сетчатки). Кроме того, прогрессирование ВМД, вызванное отложениями, согласуется с топографией колбочек и стержней48, и самые ранние и наиболее стойкие дефекты зрения возникают в определенном месте (т. е. в палочкосодержащей парафовее рядом с цельноконусной ямкой)49. Для сравнения с ОКТ, иммуногистохимия с колориметрическими красителями совместима с комплексной микроскопией (например, светлопольной) для учета всех тканевых элементов, как меченых, так и немеченых4. Нецелевые молекулярные анализы, основанные на выборочных массивах, могут использовать горизонтальное выравнивание вертикально разделенных фоторецепторов и RPE для эффективного увеличения разрешения. Визуализационная масс-спектрометрия с помощью ионизирующих лазерных импульсов диаметром 8 мкм и на расстоянии 10-15 мкм друг от друга может локализовать десятки липидов в субклеточных компартментах наружных клеток сетчатки50. Транскриптомика с пространственным разрешением использует заранее подготовленный набор праймеров обратной транскрипции со штрих-кодом на предметных стеклах, к которым наносятсясрезы ткани 51. В настоящее время эта технология ограничена захватом диаметром 55 мкм и расстоянием 100 мкм; Ожидается улучшение разрешения, которое сделает эту технологию пригодной для исследований AMD.

Этот протокол имеет ограничения. Критерий выздоровления не учитывает диагнозы диабета (30% среди получателей Medicare в Алабаме)52 из-за важности сосудистой оболочки при обоих заболеваниях. Это исключение сокращает общий пул доноров и удлиняет время, необходимое для сбора достаточного количества глаз для исследования. По историческим причинам в критериях 2016-2017 годов не учитывались чернокожие доноры, которые в настоящее время составляют 14% доноров глаз по всему штату, и чернокожие доноры теперь включены в текущие перспективные проекты. Предварительный реестр распоряжений для лиц, желающих стать донорами глаз, обширен, но еще не включает удобную регистрацию в местных специализированных клиниках сетчатки, которые ухаживают за пациентами с ВМД; В настоящее время этот проект находится в разработке. Во время популяционного скрининга, такого как этот, появятся глаза с состояниями, перекрывающимися по фенотипу с ВМД, и их необходимо распознать в консультации с развивающейся клинической литературой и офтальмологом, специализирующимся на заболеваниях сетчатки. Например, эта серия глаз включала невусы с друзами53 и линией нарушения RPE над пахисосудом (толстым сосудом во внутренней сосудистой оболочке)54. Наконец, ранняя и средняя ВМД были объединены из-за отсутствия системы оценки ВМД на основе ОКТ, которая находится в стадии разработки группой55 Классификации атрофии. Тем не менее, оптимизация восстановления тканей и характеристика на основе ОКТ позволяют проводить исследования ВМД, направленные на использование временного элемента MMI с отслеживанием глаз, привязанного к ОКТ, который можно планировать, питать, планировать и бюджетировать в заявках на финансирование.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

C.A.C. получает исследовательскую поддержку от Heidelberg Engineering и консультирует Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience и Osanni. Т.А. получает исследовательскую поддержку от Novartis и консультирует Roche, Novartis, Bayer, Nidek и Apellis. K.B.F. является консультантом Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer и Novartis.

Acknowledgments

Мы благодарим Heidelberg Engineering за приборы и дизайн оригинального держателя для глаз, Ричарда Ф. Спайда, доктора медицины, за введение в мультимодальную визуализацию на основе ОКТ, Кристофера Гиркина, доктора медицины, за облегчение доступа к устройствам клинической визуализации и Дэвида Фишера за рисунок 1. Восстановление человеческих донорских глаз для исследований было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Питтлер), R01EY015520 (Смит), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) и U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), Фонд EyeSight в Алабаме, Международный фонд исследований сетчатки (C.A.C.), Инициатива Арнольда и Мейбл Бекман по исследованиям желтого пятна (C.A.C.) и Исследования по предотвращению слепоты AMD Catalyst (Schey).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers, 250 mL Fisher # 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex  Fisher # 10-462-719 storage for preservative
Bunsen burner or heat source Eisco # 17-12-818 To melt wax
Camera, digital Nikon D7200 D7200
Computer and storage Apple iMac Pro; 14 TB external hard drive Image storage
Container, insulated Fisher # 02-591-45 For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL Fisher Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86 For preservative
Crucible, quartz 30 mL Fisher # 08-072D Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL Fisher # 08-549G
Disinfectant cleaning supplies   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket contact J. Messinger jeffreymessinger@uabmc.edu custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks Fisher # 19-910-667
Forceps, Harmon Fix Roboz  # RS-8247
Forceps, Micro Adson Roboz  # RS-5232
Forceps, Tissue Roboz # RS-5172
Glass petri dish, Kimax Fisher # 23064
Gloves Diamond Grip Fisher # MF-300
Gowns GenPro Fisher # 19-166-116
Image editing software Adobe Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes Fisher # 06-666
Lamps, 3 goosenecks Schott Imaging # A20800
Microscope, stereo Nikon SMZ 1000 for dissection
Microscope, stereo Olympus  SZX9 color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%  EMS # 15713-S for preservative; dilute for storage
pH meter Fisher  # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2  EMS # 11600-10
Ring flash B & H Photo Video Sigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameter Meller Optics # MRB10MD
Safety Glasses 3M Fisher # 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope Heidelberg Engineering HRA2
Scissors, curved spring Roboz # RS-5681
Sharps container Fisher # 1482763
Shutter cord, remote Nikon MC-DC2
Spectral Domain OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA&OCT https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter McMaster-Carr # 9529K31
Tissue marking dye, black Cancer Diagnostics Inc # 0727-1
Tissue slicer blades Thomas Scientific # 6767C18
Trephine, 18-mm diameter Stratis Healthcare # 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera B&H Photo Video BH # COHD18G6PROB for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental EMS  # 72670
Wooden applicators Puritan # 807-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
  2. Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A. Subretinal drusenoid deposits a.k.a. pseudodrusen. Survey of Ophthalmology. 63 (6), 782-815 (2018).
  3. Curcio, C. A., Zanzottera, E. C., Ach, T., Balaratnasingam, C., Freund, K. B. Activated retinal pigment epithelium, an optical coherence tomography biomarker for progression in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (6), 211-226 (2017).
  4. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, OCT progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
  5. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, S12-S25 (2016).
  6. Edwards, M. M., et al. Subretinal glial membranes in eyes with geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1352-1367 (2017).
  7. Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
  8. Jiang, M., et al. Microtubule motors transport phagosomes in the RPE, and lack of KLC1 leads to AMD-like pathogenesis. Journal of Cell Biology. 210 (4), 595-611 (2015).
  9. Collin, G. B., et al. Disruption of murine Adamtsl4 results in zonular fiber detachment from the lens and in retinal pigment epithelium dedifferentiation. Human Molecular Genetics. 24 (24), 6958-6974 (2015).
  10. Curcio, C. A., Medeiros, N. E., Millican, C. L. The Alabama Age-related Macular Degeneration Grading System for donor eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 39 (7), 1085-1096 (1998).
  11. Bastek, J. V., Siegel, E. B., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Pigmentary patterns of the peripheral fundus. Ophthalmology. 89 (12), 1455-1463 (1982).
  12. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y., Lightfoot, D. O. Reticular degeneration of the pigment epithelium. Ophthalmology. 92 (11), 1485-1495 (1985).
  13. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Multiple extramacular drusen. Ophthalmology. 93 (8), 1098-1112 (1986).
  14. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye. 2 (5), 552-577 (1988).
  15. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of soft drusen in age-related macular degeneration. Eye. 8 (3), 269-283 (1994).
  16. Ghazi, N. G., Dibernardo, C., Ying, H. S., Mori, K., Gehlbach, P. L. Optical coherence tomography of enucleated human eye specimens with histological correlation: Origin of the outer "red line". American Journal of Ophthalmology. 141 (4), 719-726 (2006).
  17. Brown, N. H., et al. Developing SDOCT to assess donor human eyes prior to tissue sectioning for research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (8), 1069-1080 (2009).
  18. Helb, H. M., et al. Clinical evaluation of simultaneous confocal scanning laser ophthalmoscopy imaging combined with high-resolution, spectral-domain optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica. 88 (8), 842-849 (2010).
  19. Spaide, R. F., Curcio, C. A. Drusen characterization with multimodal imaging. Retina. 30 (9), 1441-1454 (2010).
  20. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part 1. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  21. Garcia-Garcia, H. M., Gonzalo, N., Regar, E., Serruys, P. W. Virtual histology and optical coherence tomography: from research to a broad clinical application. Heart. 95 (16), 1362-1374 (2009).
  22. Strouthidis, N. G., et al. Comparison of clinical and spectral domain optical coherence tomography optic disc margin anatomy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4709-4718 (2009).
  23. Sarks, S. H. Ageing and degeneration in the macular region: A clinico-pathological study. British Journal of Ophthalmology. 60 (5), 324-341 (1976).
  24. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (13), 19 (2020).
  25. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (1), 33 (2021).
  26. Litts, K. M., et al. Clinicopathological correlation of outer retinal tubulation in age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 133 (5), 609-612 (2015).
  27. Olsen, T. W., Feng, X. The Minnesota grading system of eye bank eyes for age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4484-4490 (2004).
  28. Mano, F., Sprehe, N., Olsen, T. W. Association of drusen phenotype in age-related macular degeneration from human eye-bank eyes to disease stage and cause of death. Ophthalmology Retina. 5 (8), 743-749 (2021).
  29. Age-related eye disease study research group. The Age-Related Eye Disease Study system for classifying age-related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The Age-Related Eye Disease Study Report Number 6. American Journal of Ophthalmology. 132 (5), 668-681 (2001).
  30. Arnold, J. J., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Reticular pseudodrusen. A risk factor in age-related maculopathy. Retina. 15 (3), 183-191 (1995).
  31. Olsen, T. W., Bottini, A. R., Mendoza, P., Grossniklausk, H. E. The age-related macular degeneration complex: linking epidemiology and histopathology using the Minnesota grading system (the inaugural Frederick C. Blodi Lecture). Transactions of the American Ophthalmological Society. 113, (2015).
  32. Owen, L. A., et al. The Utah protocol for postmortem eye phenotyping and molecular biochemical analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1204-1212 (2019).
  33. Wang, J. J., et al. Ten-year incidence and progression of age-related maculopathy: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 114 (1), 92-98 (2007).
  34. Joachim, N., Mitchell, P., Burlutsky, G., Kifley, A., Wang, J. J. The incidence and progression of age-related macular degeneration over 15 years: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 122 (12), 2482-2489 (2015).
  35. Pang, C., Messinger, J. D., Zanzottera, E. C., Freund, K. B., Curcio, C. A. The onion sign in neovascular age-related macular degeneration represents cholesterol crystals. Ophthalmology. 122 (11), 2316-2326 (2015).
  36. Keilhauer, C. N., Delori, F. C. Near-infrared autofluorescence imaging of the fundus: Visualization of ocular melanin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3556-3564 (2006).
  37. Curcio, C. A., Saunders, P. L., Younger, P. W., Malek, G. Peripapillary chorioretinal atrophy: Bruch's membrane changes and photoreceptor loss. Ophthalmology. 107 (2), 334-343 (2000).
  38. Curcio, C. A. Imaging maculopathy in the post-mortem human retina. Vision Research. 45 (28), 3496-3503 (2005).
  39. Brinkmann, M., et al. Histology and clinical lifecycle of acquired vitelliform lesion, a pathway to advanced age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 240, 99-114 (2022).
  40. Ramtohul, P., et al. Bacillary layer detachment: Multimodal imaging and histologic evidence of a novel optical coherence tomography terminology. Literature review and proposed theory. Retina. 41 (11), 2193-2207 (2021).
  41. Wilson, J. D., Foster, T. H. Mie theory interpretations of light scattering from intact cells. Optics Letters. 30 (18), 2442-2444 (2005).
  42. Ghazi, N. G., Green, W. R. Pathology and pathogenesis of retinal detachment. Eye. 16 (4), 411-421 (2002).
  43. Berlin, A., et al. Correlation of optical coherence tomography angiography of type 3 macular neovascularization with corresponding histology. JAMA Ophthalmology. 140 (6), 628-633 (2022).
  44. Berlin, A., et al. Histology of type 3 macular neovascularization and microvascular anomalies in anti-VEGF treated age-related macular degeneration. Ophthalmology Science. 3 (3), 100280 (2023).
  45. Schaal, K. B., et al. Outer retinal tubulation in advanced age-related macular degeneration: optical coherence tomographic findings correspond to histology. Retina. 35 (7), 1339-1350 (2015).
  46. Chen, L., et al. Histology and clinical imaging lifecycle of black pigment in fibrosis secondary to neovascular age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 214, 108882 (2022).
  47. Balaratnasingam, C., et al. Histologic and optical coherence tomographic correlations in drusenoid pigment epithelium detachment in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 124 (1), 644-656 (2017).
  48. Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: Morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
  49. Owsley, C., et al. Biologically guided optimization of test target location for rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration: ALSTAR2 baseline. Ophthalmology Science. 3 (2), 100274 (2023).
  50. Anderson, D. M. G., et al. The molecular landscape of the human retina and supporting tissues by high resolution imaging mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (12), 2426-2436 (2020).
  51. Lee, J., Yoo, M., Choi, J. Recent advances in spatially resolved transcriptomics: challenges and opportunities. BMB Reports. 55 (3), 113-124 (2022).
  52. Diabetes. Alabama Public Health. , Available from: https://www.alabamapublichealth.gov/healthrankings/diabetes.html (2022).
  53. Francis, J. H., et al. Swept-source optical coherence tomography features of choroidal nevi. American Journal of Ophthalmology. 159 (1), 169-176 (2015).
  54. Inoue, M., Dansingani, K. K., Freund, K. B. Progression of age-related macular degeneration overlying a large choroidal vessel. Retina Cases Brief Reports. 10 (1), 22-25 (2016).
  55. Jaffe, G. J., et al. Imaging features associated with progression to geographic atrophy in age-related macular degeneration: CAM Report 5. Ophthalmology Retina. 5 (9), 855-867 (2021).

Tags

Неврология выпуск 195 Глазное банкирование биобанкинг оптическая когерентная томография мультимодальная визуализация возрастная макулярная дегенерация
<em>Ex Vivo</em> Мультимодальная визуализация донорских глаз человека на основе ОКТ для исследования возрастной макулярной дегенерации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messinger, J. D., Brinkmann, M.,… More

Messinger, J. D., Brinkmann, M., Kimble, J. A., Berlin, A., Freund, K. B., Grossman, G. H., Ach, T., Curcio, C. A. Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (195), e65240, doi:10.3791/65240 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter