Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ex Vivo OCT-gebaseerde multimodale beeldvorming van menselijke donorogen voor onderzoek naar leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65240
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4, 5, *6, *1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn
* These authors contributed equally

Summary

Laboratoriumtests kunnen gebruikmaken van de prognostische waarde van de longitudinale optische coherentietomografie (OCT) -gebaseerde multimodale beeldvorming van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD). Menselijke donorogen met en zonder AMD worden in beeld gebracht met behulp van OCT, kleur, nabij-infrarood reflectantie scanning laser oftalmoscopie, en autofluorescentie op twee excitatie golflengten voorafgaand aan weefselsectie.

Abstract

Een progressiesequentie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) geleerd van op optische coherentie tomografie (OCT) gebaseerde multimodale (MMI) klinische beeldvorming zou prognostische waarde kunnen toevoegen aan laboratoriumbevindingen. In dit werk werden ex vivo OCT en MMI toegepast op menselijke donorogen voorafgaand aan retinale weefselsectie. De ogen werden hersteld van niet-diabetische witte donoren van ≥80 jaar oud, met een death-to-preservation time (DtoP) van ≤6 uur. De bollen werden ter plaatse teruggevonden, gescoord met een trephine van 18 mm om het verwijderen van het hoornvlies te vergemakkelijken en ondergedompeld in gebufferd 4% paraformaldehyde. Kleurenfundusbeelden werden verkregen na verwijdering van het voorste segment met een ontleedkijker en een spiegelreflexcamera met behulp van trans-, epi- en flitsverlichting bij drie vergrotingen. De bollen werden in een buffer geplaatst in een speciaal ontworpen kamer met een 60 dioptrie lens. Ze werden afgebeeld met spectraaldomein OCT (30° maculakubus, 30 μm afstand, gemiddeld = 25), nabij-infrarode reflectie, 488 nm autofluorescentie en 787 nm autofluorescentie. De AMD-ogen vertoonden een verandering in het retinale pigmentepitheel (RPE), met drusen of subretinale drusenoïde afzettingen (SDD's), met of zonder neovascularisatie en zonder bewijs van andere oorzaken. Tussen juni 2016 en september 2017 werden 94 rechterogen en 90 linkerogen hersteld (DtoP: 3,9 ± 1,0 uur). Van de 184 ogen had 40,2% AMD, inclusief vroege intermediaire (22,8%), atrofische (7,6%) en neovasculaire (9,8%) AMD, en 39,7% had onopvallende macula's. Drusen, SDD's, hyperreflecterende foci, atrofie en fibrovasculaire littekens werden geïdentificeerd met behulp van OCT. Artefacten omvatten weefselopacificatie, loslatingen (bacillair, retinaal, RPE, choroïdaal), foveale cystische verandering, een golvende RPE en mechanische schade. Om de cryo-sectie te begeleiden, werden OCT-volumes gebruikt om de fovea- en oogzenuwkoporiëntatiepunten en specifieke pathologieën te vinden. De ex vivo volumes werden geregistreerd bij de in vivo volumes door de referentiefunctie voor eye tracking te selecteren. De ex vivo zichtbaarheid van de in vivo waargenomen pathologie hangt af van de conserveringskwaliteit. Binnen 16 maanden werden 75 snelle DtoP-donorogen in alle stadia van AMD hersteld en geënsceneerd met behulp van klinische MMI-methoden.

Introduction

Vijftien jaar beheer van neovasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) met anti-VEGF-therapie onder begeleiding van optische coherentietomografie (OCT) heeft nieuwe inzichten geboden in de progressievolgorde en microarchitectuur van deze veel voorkomende oorzaak van verlies van het gezichtsvermogen. Een belangrijke erkenning is dat AMD een driedimensionale ziekte is waarbij het neurosensorische netvlies, retinale pigmentepitheel (RPE) en vaatvlies betrokken zijn. Als gevolg van de OCT-beeldvorming van proefpatiënten en de collega-ogen van behandelde kliniekpatiënten, worden de kenmerken van pathologie die verder gaan dan die van kleurenfundusfotografie, al tientallen jaren een klinische standaard, nu erkend. Deze omvatten intraretinale neovascularisatie (type 3 maculaire neovascularisatie1, voorheen angiomateuze proliferatie), subretinale drusenoïde afzettingen (SDD's, ook wel reticulaire pseudodrusen genoemd)2, meerdere routes van RPE-lot3,4 en intens gliotische Müller-cellen in atrofie 5,6.

Modelsystemen zonder macula's (cellen en dieren) recreëren enkele plakjes van deze complexe ziekte 7,8,9. Verder succes bij het verbeteren van de last van AMD zou kunnen komen van de ontdekking en verkenning van primaire pathologie in menselijke ogen, het begrijpen van de unieke cellulaire samenstelling van de macula, gevolgd door vertaling naar modelsystemen. Dit rapport schetst een drie decennia durende samenwerking tussen een academisch onderzoekslaboratorium en een oogbank. De doelen van de weefselkarakteriseringsmethoden die hierin worden beschreven, zijn tweeledig: 1) om evoluerende diagnostische technologie te informeren door de basis van fundusverschijning en beeldvormingssignaalbronnen met microscopie aan te tonen, en 2) om AMD-monsters te classificeren voor gerichte (immunohistochemie) en ongerichte moleculaire ontdekkingstechnieken (beeldvormende massaspectrometrie, IMS en ruimtelijke transcriptomica) die de kegel-only fovea en staafrijke para- en perifovea behouden. Dergelijke studies zouden de vertaling naar klinische OCT kunnen versnellen, waarvoor een progressiesequentie en longitudinale follow-up mogelijk zijn door middel van eye-tracking. Deze technologie, die is ontworpen om de effecten van de behandeling te controleren, registreert scans van het ene kliniekbezoek naar het volgende met behulp van retinale vaten. Het koppelen van oog-gevolgde OCT aan laboratoriumresultaten verkregen met destructieve technieken zou een nieuw niveau van prognostische waarde kunnen bieden aan moleculaire bevindingen.

In 1993 maakte het onderzoekslaboratorium kleurenfoto's van postmortale fundus op film10. Deze inspanning werd geïnspireerd door de uitstekende fotomicroscopie en histologie van het menselijke perifere netvlies door Foos en collega's 11,12,13 en de uitgebreide AMD clinicopathologische correlaties door Sarks et al.14,15. Vanaf 2009 werd ex vivo multimodale beeldvorming (MMI) verankerd op spectraal domein OCT aangenomen. Deze overgang werd geïnspireerd door de soortgelijke inspanningen van anderen 16,17 en vooral door het besef dat zoveel van de door de Sarken beschreven ultrastructuur in drie dimensies beschikbaar was, in de loop van de tijd, in de kliniek 18,19. Het doel was om ogen te krijgen met aangehechte macula's in een redelijk tijdsbestek voor goed aangedreven studies van fenotypes op cellulair niveau in het netvlies, RPE en vaatvlies. De bedoeling was om verder te gaan dan "per oog" statistieken naar "per laesie type", een standaard beïnvloed door de "kwetsbare plaque" concepten van hart- en vaatziekten20,21.

Het protocol in dit rapport weerspiegelt de ervaring met bijna 400 paar donorogen die in verschillende stromen zijn toegevoegd. In 2011-2014 werd de Project MACULA-website van AMD histopathology gemaakt, die laagdiktes en annotaties van 142 gearchiveerde exemplaren bevat. Deze ogen werden bewaard van 1996-2012 in een glutaaraldehyde-paraformaldehydefixatief voor hoge resolutie epoxyhars histologie en elektronenmicroscopie. Alle fundi waren bij ontvangst in kleur gefotografeerd en werden vlak voor de histologie door OCT opnieuw in beeld gebracht. Een ooghouder die oorspronkelijk was ontworpen voor oogzenuwstudies22 werd gebruikt om plaats te bieden aan een weefselpons van 8 mm met een diameter van volledige dikte gecentreerd op de fovea. OCT B-scans door het foveale centrum en een site 2 mm superieur, overeenkomend met histologie op dezelfde niveaus, werden geüpload naar de website, plus een kleurenfundusfoto. De keuze van de LGO-vliegtuigen werd bepaald door de prominentie van AMD-pathologie onder de fovea23 en de prominentie van SDD's in staafrijke gebieden die superieur zijn aan de fovea24,25.

Vanaf 2013 waren ogen die tijdens het leven met OCT-verankerde MMI in beeld waren gebracht beschikbaar voor directe clinicopathologische correlaties. De meeste (7 van de 10 donoren) betroffen patiënten in een verwijzingspraktijk voor het netvlies (auteur: K.B.F.), die een geavanceerd richtlijnregister aanbood voor patiënten die geïnteresseerd waren in het doneren van hun ogen na de dood voor onderzoeksdoeleinden. De ogen werden hersteld en bewaard door de lokale oogbank, overgebracht naar het laboratorium en op dezelfde manier voorbereid als de Project MACULA-ogen. Premortale klinische OCT-volumes werden naadloos gelezen in het laboratorium, waardoor de pathologiekenmerken die tijdens het leven werden gezien, werden afgestemd op de kenmerken die onder de microscoopwerden gezien 26.

Vanaf 2014 begon prospectieve oogverzameling met screening op AMD in donorogen zonder klinische voorgeschiedenis, maar bewaard gedurende een gedefinieerde tijdslimiet (6 uur). Voor dit doel werd de ooghouder aangepast om plaats te bieden aan een hele wereldbol. Dit verkleinde de kans op loslating rond de snijranden van de eerder gebruikte 8 mm pons. De ogen werden bewaard in 4% gebufferd paraformaldehyde voor immunohistochemie en de volgende dag overgebracht naar 1% voor langdurige opslag. In 2016-2017 (pre-pandemie) werden 184 ogen van 90 donoren hersteld. De statistieken en afbeeldingen in dit rapport zijn gegenereerd uit deze serie. Tijdens het pandemietijdperk (lockdowns en nasleep van 2020) gingen prospectieve collecties voor transcriptomics en IMS-samenwerkingen in een lager tempo door, voornamelijk met behulp van de methoden van 2014.

Er zijn andere methoden voor donoroogbeoordeling beschikbaar. Het Minnesota Grading System (MGS)27,28 is gebaseerd op het AREDS klinische systeem voor kleurenfundusfotografie 29. De beperkingen van deze methode omvatten het combineren van atrofische en neovasculaire AMD in één stadium van "late AMD". Verder omvat de MGS de verwijdering van het neurosensorische netvlies vóór de fotodocumentatie van het RPE-vaatvlies. Deze stap verwijdert SDD's in verschillende mate30,31 en verwijdert de ruimtelijke correspondentie van het buitenste netvlies en het ondersteunende systeem. Pogingen om metabole vraag en signalering van het netvlies te koppelen aan pathologie in het RPE-vatoïde kunnen dus worden belemmerd. Het Utah-systeem implementeerde MMI met behulp van ex vivo kleurenfotografie en OCT om ogen bestemd voor dissectie te categoriseren in regio's voor RNA- en eiwitextracties32. Hoewel het de voorkeur verdient boven extracties met hele oogschelpen, vertegenwoordigt het gebied met een diameter van 3 mm met het hoogste risico op AMD-progressie33,34 slechts 25% van een fovea-gecentreerde pons met een diameter van 6 mm. Technieken die bevindingen kunnen lokaliseren met betrekking tot de fovea, zoals seriële secties voor immunohistochemie, zijn dus voordelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De institutionele beoordelingsraad van de Universiteit van Alabama in Birmingham keurde de laboratoriumstudies goed, die zich hielden aan Good Laboratory Practices en Biosafety Level 2/2+. Alle Amerikaanse oogbanken voldoen aan de Uniform Anatomical Gifts Act van 2006 en de Amerikaanse Food and Drug Administration. De meeste Amerikaanse oogbanken, waaronder Advancing Sight Network, voldoen aan de medische normen van de Eye Bank Association of America.

De Tabel met materialen geeft een overzicht van de benodigdheden en apparatuur. Aanvullend materiaal 1 geeft een overzicht van de dissectie, kleurenfundusfotografie en OCT-gebaseerde MMI. Aanvullend materiaal 2 bevat details over de op de LGO gebaseerde MMI.

1. Criteria voor weefselverzameling

  1. Om de opbrengst van AMD-ogen in een scherm van ongedocumenteerde donoren te maximaliseren, stelt u de volgende criteria in voor acceptabele donoren: leeftijd ≥ 80 jaar, wit, niet-diabetisch en ≤6 uur death-to-preservation (DtoP).
    OPMERKING: DtoP wordt gedefinieerd als de tijd tussen overlijden en wanneer het oog in een verstrekt conserveermiddel wordt geplaatst, hetzij in het ziekenhuis of in het laboratorium.

2. Conserveringsmedium en ander preparaat (laboratorium)

  1. Maak 4% fosfaat-gebufferd paraformaldehyde uit 20% voorraad (gekocht). Bereid 1 L door 200 ml 20% paraformaldehyde (verdunningsfactor van 5) toe te voegen aan 800 ml 0,1 M Sorenson's fosfaatbuffer. Test en pas indien nodig aan om ervoor te zorgen dat de pH 7,2 is. Bewaren bij 4 °C.
  2. Doseer 30 ml 4% fosfaat-gebufferd paraformaldehyde in potten van 40 ml.
  3. Voorraad gelabeld 40 ml containers met conserveermiddel op de oogbank, zodat het weefsel op elk moment en op elke dag kan worden hersteld.
  4. Maak voor de opslag van geconserveerde ogen 1% paraformaldehyde van de 4% -oplossing. Bereid 1 L door 250 ml 4% paraformaldehyde (verdunningsfactor van 4) toe te voegen aan 750 ml 0,1 M Sorenson's fosfaatbuffer. Test en pas de pH indien nodig aan. Bewaren bij 4 °C.
    1. Bereid 1 l van een 0,1 M-oplossing uit de 0,2 M-oplossing van Sorenson's fosfaatbuffer, pH 7,2, door 500 ml gedestilleerd water en 500 ml Sorenson's buffer te combineren.
    2. Pas de pH-daling druppelsgewijs aan met 1 N zoutzuur of 1 N natriumhydroxide. Bewaren bij 4 °C.
  5. Maak een houder om de ogen te stabiliseren tijdens de dissectie. Vul een petrischaaltje met tandwas verwarmd tot het vloeibaar is. Wanneer het enigszins koel is, maak er dan een hemisferische indruk in met een groot kogellager en vries de schaal vervolgens in om het verwijderen van het kogellager te vergemakkelijken.

3. Oogbank methoden

  1. Om een snel herstel van onderzoeksweefsels te garanderen, moet u alle weefsels snel herstellen, inclusief die welke bestemd zijn voor transplantatie.
  2. Ontvang overlijdensverwijzingen, zoals vereist door de wet, binnen 1 uur na overlijden en volg elke donor met een verwijzingsvolgnummer dat het weefsel volgt.
  3. Om gevallen met potentiële klinische documentatie te vinden, stelt u AMD- en oogziektespecifieke vragen in het donorrisicobeoordelingsinterview voor onderzoek.
  4. Om de reistijd te minimaliseren, herstelt u hele bollen (in tegenstelling tot alleen hoornvliezen voor transplantatie) binnen een compact gebied (d.w.z. stad en aangrenzende voorstedelijke provincie).
  5. Breng twee potten conserveermiddel (gebufferd 4% paraformaldehyde) naar de ziekenhuiskamer van de overledene voor weefselherstel (in plaats van te wachten tot het lichaam naar een mortuarium wordt verplaatst).
  6. Communiceer voor en tijdens het herstel met de onderzoekers om de levering en timing te bevestigen.
  7. Herstel de bollen ter plaatse in het ziekenhuis, open ze met consistente hanteringsmethoden en dompel het geopende oog onder in conserveermiddel (figuur 1).
    1. Houd het weggesneden donoroog op zijn plaats met behulp van een gaasmantel gestabiliseerd door een hemostaat.
    2. Om het verwijderen van het hoornvlies met een 2 mm brede rand van sclera te vergemakkelijken, gebruikt u een trephine met een diameter van 18 mm om de bol te scoren.
    3. Om het hoornvlies met een bijbehorende rand van sclera te bevrijden, knipt u langs de gescoorde cirkel met een veerbelaste schaar met gebogen uiteinden terwijl u de bol stabiliseert met het hemostat-geknipte gaas.
    4. Til het hoornvlies van de sclera op en stel de iris en het ciliaire lichaam bloot.
    5. Om de penetratie van het conserveermiddel in de glasachtige kamer te vergemakkelijken, maakt u een 2 mm lange spleet in de iris loodrecht op de pupilrand. Plaats de ogen in monsterpotten met 30 ml conserveermiddel bij 4 °C en breng ze over naar het laboratorium op nat ijs.
  8. Verzend geanonimiseerde donorinformatie elektronisch van de oogbank naar de database van het onderzoekslaboratorium.
    OPMERKING: De database onderhoudt het verwijzingsnummer, het oogbankweefselnummer en het laboratorium-ID-nummer voor tracking, plus andere relevante informatie.

4. Weefselvoorbereiding voor ex vivo kleurenfundusfotografie

  1. Gebruik twee stereomicroscopen, één voor dissectie en één voor kleurenfundusfotografie.
    OPMERKING: Voor transilluminatie om pigmentveranderingen te visualiseren, gebruikt u een basis voor donkerveldmicroscopie.
  2. Verwijder de restanten van het voorste segment (iris en lens). Om het oog tijdens de dissectie te stabiliseren, plaatst u het in de petrischaal gevuld met was (aanvullend materiaal 1, dia's 7-8). Om te voorkomen dat het ciliaire lichaam en het aangehechte netvlies in de glasvochtholte instorten, minimaliseert u de verstoring van de ring van dik glasvocht dat aan het ciliaire lichaam is bevestigd (glasvochtbasis).
  3. Markeer de superieure paal voor oriëntatie. Leg de wereldbol met de voorste kant naar beneden in de schaal. Zoek de inbrengpezen van de superieure rectus en superieure schuine spieren. Breng met behulp van een houten applicator spaarzaam een markeringsinkt aan in een lijn van 10 mm in een voorste naar achterste richting (d.w.z. loodrecht op het tendineuze inbrengen van de superieure rectusspier).
  4. Vul voor het fotograferen de fundus met de fosfaatbuffer van koude Sorensen.
  5. Plaats een robijnrode kraal van 1 mm in de fundus als een interne schaalbalk die in elke afbeelding wordt weergegeven27.
  6. Verkrijg kleurenbeelden met een spiegelreflexcamera met één lens die is gemonteerd op een stereomicroscoop die is uitgerust met een ringflitser. Gebruik trans-, epi- en flitsverlichting bij elk van de drie standaardvergrotingen om beelden vast te leggen die bedoeld zijn om specifieke gebieden te markeren (aanvullend materiaal 1, dia 11): 1) de fundus naar de evenaar, 2) de achterste pool (vasculaire arcades, oogzenuwkop, fovea) en 3) de fovea in de macula lutea (gele vlek).

5. Voorbereiding voor ex vivo kleuren fundus fotografie

  1. Schakel de camera en monitor in. Sluit de externe sluiter aan en laat de actuator los in de HDMI-monitor (high-definition multimedia-interface) van de camera/televisie (tv) en de displaykabel.
  2. Stel de camera-instellingen in op de handmatige ISO-functie en de spiegelvergrendelingspositie (vergrendeld om trillingen te verminderen).
    OPMERKING: Raadpleeg de gebruikershandleiding van de fabrikant voor de instellingen op de gebruikte camera. Leer van de camera om de instellingen voor over-/onderbelichting weer te geven ten opzichte van het histogram en de belichtingsuitlezingen.
  3. Schik twee lichtbronnen, elk met twee flexibele lichtgeleiders die loodrecht op elkaar zijn geplaatst, voor verlichting in de vier windrichtingen op het microscooppodium (Aanvullend materiaal 1, pagina 10).
  4. Schakel de epi-verlichtingslichtbronnen in op vol vermogen.
    OPMERKING: Het is handig maar niet noodzakelijk om een zwarte vilten lijkwade rond het podium te hebben om de licht- / flitsverstrooiing voor de fotograaf te beperken.
  5. Gebruik bij de ontleedmicroscoop een tang om de achterste pool in een kwartskroes van 30 ml gevuld met buffer in te brengen. Laat het weefsel naar de bodem zakken. Plaats een beugel, zoals een weefselspons, tussen het oog en de wand van de kroes om beweging te voorkomen. Steek de 1 mm robijnrode kraal in de achterste pool.
    OPMERKING: De kraal kan in de oogzenuwcup vallen.
  6. Plaats de wereldbol voorzichtig in de smeltkroes op het stereomicroscooppodium en observeer de inwendige oculaire fundus door de microscoopoculairs. Met behulp van de laagste vergroting oriënteert u het oog door het weefselmerkteken op de positie van 12 uur, de oogzenuwkop (ONH) en de fovea 5° onder de ONH te identificeren. Draai het oog zo dat de fovea 5° onder een lijn door de ONH valt.
    OPMERKING: Als het een rechteroog is, bevindt de ONH zich rechts van de fovea, gezien door de oculairen van de microscoop. Als het een linkeroog is, bevindt de ONH zich links van de fovea.
  7. Schakel de weergave van de externe monitor vanaf de camera in. Zorg ervoor dat de schuifregelaar van de microscoopbundelsplitser is ingesteld om waar te nemen via de fotopoort en niet via de poort voor de oculairen. Afhankelijk van het licht- en spiegelpad, moet u voorbereid zijn om het weefsel 180 ° op het podium te draaien voor de juiste oriëntatie.

6. Beeldacquisitie met behulp van ex vivo kleurenfundusfotografie

  1. Terwijl de epi-verlichting is ingeschakeld, stelt u de vergroting zo in dat de volledige 18 mm trephine-incisie het hele gezichtsveld in beslag neemt. Verhoog de vergroting zodat het mogelijk is om scherp te stellen op de bodem van de foveale put. Verklein de vergroting tot de vorige instelling.
  2. Pas de ISO-instellingen aan in het bereik van 1.600-3.000, zodat de belichtingstijden in het middenbereik van de meter op de camera vallen.
  3. Druk op de externe sluitertrigger. Luister naar de spiegel om in de bovenste positie te vergrendelen. Druk nogmaals op de trigger voor belichting.
  4. Bekijk het beeld op de monitor, met de vooraf ingestelde metagegevens met rood, groen, blauw (RGB) en een kleurenhistogram voor de juiste belichting. Als de blootstelling aanvaardbaar is, ga dan verder; Zo niet, verwijder dan, evalueer de parameters opnieuw en maak opnieuw een afbeelding.
  5. Schakel de zwanenhalslampen uit voor epi-verlichting om drusen te markeren en schakel de flitser in, met een belichting van 1/4 s, een sluitertijd van de camera van 1/250 s en een ISO van 100-320. Stel de flitssnelheid in op de standaardinstelling of wijzig deze tijdens de eerste installatie van de camera. Maak een afbeelding en controleer het histogram op de juiste belichting.
  6. Schakel de flitser uit en schakel de transverlichtingslichtbron in. Reset de ISO naar boven de 5.000 en zorg ervoor dat de belichtingstijd niet onder de 1/30 s komt als gevolg van mogelijke trillingen in het fotografische systeem. Maak een afbeelding en controleer het histogram op de juiste belichting.
  7. Verhoog de vergroting om zowel de ONH als de fovea in het gezichtsveld te bekijken. Schakel de epi-verlichtingslampen in. Stel het ISO-bereik in op 1.600-3.000. Zorg ervoor dat de belichtingstijden in het middenbereik van de camera vallen.
  8. Schakel de epi-verlichtingslampen uit en schakel de flitser in, met een belichting van 1/4 s, de vooraf ingestelde sluitertijd van de camera ingesteld op 1/250 s en de ISO ingesteld op 400-800. Maak een afbeelding en controleer het histogram op de juiste belichting.
  9. Schakel de flitser uit en schakel de transverlichting in met behulp van de donkerveldbasis. Reset de ISO naar boven de 5.000. Zorg ervoor dat de belichtingstijd niet langzamer is dan 1/30 s als gevolg van mogelijke trillingen in het fotografische systeem. Verkrijg een afbeelding en controleer op een goed histogram.
  10. Schakel de transilluminatie uit en schakel de epi-verlichtingslampen weer in.
  11. Verhoog de vergroting tot die in stap 6.7. Herfocus indien nodig.
  12. Verhoog de ISO binnen het bereik van 3.000-6.000 en pas de belichtingstijd aan om binnen het juiste belichtingsbereik van de camera te vallen. Een afbeelding verkrijgen.
    OPMERKING: De robijnrode kraal verschijnt mogelijk niet meer in het gezichtsveld. Als dat het geval is, leg dan afzonderlijke afbeeldingen van de kraal vast bij deze vergroting ter referentie.
  13. Schakel de epi-verlichtingslampen uit. Zet de flitser aan met een belichting van 1/4 s en met de sluitertijd van de camera tot 1/250 s. Stel de flitssnelheid in op de standaardinstelling of wijzig deze tijdens de eerste installatie van de camera en stel de ISO in op 500-1.000. Verkrijg de afbeelding. Controleer het histogram voor de juiste belichting.
  14. Schakel de flitser uit en schakel de transverlichtingslampen in. Reset de ISO naar boven de 8.000 om een snellere belichtingstijd mogelijk te maken met een gevoeligere beeldsensor. Zorg ervoor dat de belichtingstijd niet onder de 1/30 s komt als gevolg van mogelijke trillingen in het fotografische systeem. Een afbeelding verkrijgen.
  15. Exporteer de beelden van de camera naar een computer. Bekijk de beelden voordat u het monster uit het microscoopstadium verwijdert voor het geval er opnieuw een aantal moet worden vastgelegd.

7. Beeldacquisitie overzicht voor ex vivo OCT en scanning laser oftalmoscopie (SLO)

  1. Voor spectraal domein OCT plaatst u de bollen in fosfaatbuffer in een aangepaste ooghouder met een kamer met een 60 dioptrielens35. Monteer de ooghouder aan een beugel op een klinisch OCT-beeldvormingsapparaat en bevestig deze op de plaats waar een patiënt zijn voorhoofd zou laten rusten. Het OCT-apparaat voegt automatisch een schaalbalk in elke afbeelding in.
  2. Tegelijkertijd, met hetzelfde apparaat en met het oog nog steeds in de houder, beeldt u de bollen af met een scannende laseroftalmoscoop (SLO) met behulp van nabij-infrarode reflectie (NIR, gebruikt als locatorbeeld door de inwonende software), 488 nm excitatie fundus autofluorescentie (FAF) en roodvrije (RF) reflectie.
    OPMERKING: De 787 nm excitatie FAF in dit apparaat is slechts af en toe geschikt omdat een beam-splitter de lichtdoorlatendheid naar de SLO vermindert. Om deze reden wordt een tweede apparaat voor 787 nm FAF-beelden (zie volgend punt) gebruikt.
  3. Afzonderlijk, maar met het oog nog steeds in de ooghouder, beeld je de bollen met 787 nm FAF voor het detecteren van RPE-storing36 met behulp van een apart apparaat dat deze modaliteit goed weergeeft.

8. Beeldacquisitieprotocol voor ex vivo OCT/SLO (zie dia's in Aanvullend materiaal 2)

  1. Geef de superieure rectusspier aan met weefselmarkeringskleurstof. Zet de laser aan (blauwe pijl, Aanvullend materiaal 2, pagina 1).
  2. Verwijzend naar pagina 2 van aanvullend materiaal 2, positioneert u de OCT-kop door de hele eenheid in twee assen ten opzichte van de basis te bewegen (groene pijl) en vervolgens de hoogte (y) te verhogen door de joystick met de klok mee / tegen de klok in te draaien (cw / ccw, blauwe pijlen). Stel het beeld scherp door aan de knop (oranje pijl) te draaien, met de zwarte hendel in positie R (*). Vergrendel het apparaat door de duimschroef (paarse pijl) vast te zetten.
  3. Steek het oog in de houder en stabiliseer vanaf het achterste aspect met afstandhouders (Aanvullend materiaal 1, pagina 13). Oefen zo min mogelijk druk uit om te voorkomen dat de sclera indeukt. Oriënteer met het weefselmerk voor de superieure rectusspier naar boven gericht.
    OPMERKING: De geschatte afstand van de voorkant van de ooghouder tot het OCT-apparaat is 25 mm.
  4. Open de eigen visualisatie- en analysesoftware voor het OCT-apparaat. In de linkerkolom verschijnt een patiëntenlijst. De oogdonoren geïndexeerd door een intern codenummer zijn de 'patiënten'. Raadpleeg de gebruikershandleiding van de fabrikant.
  5. Selecteer het pictogram Nieuwe patiënt . Vul de patiëntgegevens indien nodig in. Selecteer OK. Gebruik een logisch geordend nummeringssysteem voor individuele ogen, zoals JJYYNNNL, R_agesex. Dit kan bijvoorbeeld 2017016R_97F zijn.
  6. Nadat u bent doorgegaan met de gegevensinvoer in het volgende venster, drukt u op OK. Selecteer de operator en studeer in het vervolgkeuzemenu.
    OPMERKING: De ingevoerde informatie wordt weergegeven in de exporteerbare metagegevens.
  7. Nadat u een leeg scherm hebt bekeken, raakt u de gele knop aan om de beeldacquisitie te starten.
  8. Druk op IR + OCT (nabij-infraroodreflectie + OCT). Laat de laser een live SLO-beeld van de fundus en OCT B-scan verkrijgen.
    1. Voltooi de juiste anatomische positie op basis van de ONH en fovea en gebruik een houten applicator om de oogpositie in de houder aan te passen. Draai op het bedieningspaneel aan de zwarte ronde knop om de intensiteit aan te passen.
    2. Druk op dezelfde knop om gemiddeld 9-100 frames te maken (rode pijlen; 9 is voldoende, 100 ziet er romig uit). Als de eenheid correct is georiënteerd, moet de fundus scherp zijn en moet de OCT B-scan in het bovenste derde deel van het scherm verschijnen (aanvullend materiaal 2, pagina 9, dubbele rode pijl).
    3. Gebruik op de fundusafbeelding de cursor om de blauwe lijn naar het midden van de fovea te verplaatsen (Aanvullend materiaal 2, pagina 9, witte pijl). Druk op Verwerven.
      OPMERKING: Andere standaardknoppen zijn Retina, EDI (uit) en Line Scan.
  9. Druk op RF + OCT voor de volgende acquisitie. Controleer de positie opnieuw om er zeker van te zijn dat de afbeelding niet is verplaatst of verslechterd. Druk op de zwarte knop voor middeling. Druk op Verwerven.
  10. Schakel de interne kubus voor autofluorescentiebeeldvorming naar de excitatiegolflengten van 488 nm en 787 nm (Aanvullend materiaal 2, pagina 10).
    OPMERKING: De kubuspositie na de schakelaar wordt weergegeven.
  11. Selecteer Autofluorescentiemodus . Controleer de uitlijning opnieuw. Druk op Verwerven.
  12. Voor vermoedelijke gevallen van RPE-verstoring en atrofie selecteert u ICGA (indocyaninegroene angiografie) voor 787 nm autofluorescentie. Controleer de oogpositie opnieuw en druk op Verwerven.
    OPMERKING: Een fundusafbeelding verschijnt vaak niet in deze modaliteit omdat de interne kubus de bundel dempt.
  13. Schakel de interne kubus terug naar R voor IR en rode vrije beeldvorming voor volume-acquisitie.
    OPMERKING: De kubuspositie na de schakelaar wordt weergegeven op pagina 13 van aanvullend materiaal 2.
  14. Als u de OCT-volumes wilt verkrijgen, selecteert u IR en de volume-instelling. Pas alle instellingen op pagina 14 van aanvullend materiaal 2 aan door de juiste knoppen op de bedieningsmodule in te schakelen (30° maculakubus, afstand van 30 μm, gemiddeld afhankelijk van de experimentele vereisten).
  15. Merk op dat de nabij-infrarode reflectie fundusweergave is bedekt met blauwe B-scanlijnen. Controleer de OCT-positie in het bovenste derde deel van het rechtervenster opnieuw. Druk op Acquire (Verwerven ) op de besturingsmodule en wacht 5 minuten totdat de volumescan is voltooid. Wanneer de beeldacquisitie is voltooid, selecteert u EXIT. De beelden worden opgeslagen (rode pijl).
    OPMERKING: De blauwe lijnen bakenen de afstanden die in de vorige weergave zijn weergegeven in micrometers. De scans beginnen met nummeren vanaf de onderkant (inferieur) en gaan naar boven. Let op de voortgang van de rode lijn.
  16. Laat de computer de verkregen beelden verwerken, die op het scherm verschijnen (Aanvullend materiaal 2, pagina 16).
  17. Wanneer u de medeogen van één donor in beeld brengt, mag u de positie van de montagebeugel tussen de ogen niet wijzigen. Als het linkeroog eerst wordt afgebeeld, worden de resultaten weergegeven in de kolom OD (rechteroog). Klik met de rechtermuisknop om alle afbeeldingen te selecteren en selecteer vervolgens Exchange OS/OD. De afbeeldingen worden verplaatst naar de kolom OS.
  18. Druk op Selecteer > venster > database. Het scherm is standaard ingesteld op paneel 6 met de toevoeging van het donoroog in de rechterkolom (Aanvullend materiaal 2, pagina 18). Klik met de rechtermuisknop op de patiënt in het vervolgkeuzemenu, kies Batch en exporteer het E2E-bestand.
  19. Blader naar de vooraf bepaalde map die op het bureaublad is gemaakt voor bestandsoverdrachten. Selecteer OK. De map bevat de E2E-bestanden die naar een externe harde schijf moeten worden gekopieerd en gearchiveerd.
  20. Breng het oog in de houder naar de scanlaseroftalmoscoop, die voornamelijk wordt gebruikt voor autofluorescentie van 787 nm.
    OPMERKING: raadpleeg de gebruikershandleiding van de fabrikant voor het verkrijgen en archiveren van de afbeeldingen.
  21. Schakel de computer en de laser in.
  22. Selecteer het pictogram Nieuwe patiënt . Vul de patiëntgegevens indien nodig in.
  23. Als u het ooggegevensblad hetzelfde wilt houden, drukt u op OK. Aangezien de C-curve hetzelfde blijft, drukt u op Doorgaan.
  24. Selecteer Studiemodus en voer indien nodig het wachtwoord in. Houd de C-curve op 7,7 mm. Druk op OK.
  25. Selecteer Doorgaan om de C-curve te controleren. Selecteer de gele indicator om de camera te starten.
  26. Selecteer de R-positie . Lijn de wereld uit en oriënteer ze. Selecteer de IR-modus om scherp te stellen en te oriënteren zoals hierboven.
  27. Oriënteer de camerakop door de hele eenheid in twee assen ten opzichte van de basis te bewegen (aanvullend materiaal 2, pagina 28, groene pijl) en vervolgens de hoogte (y) van de eenheid te verhogen (blauwe pijlen). Stel het beeld scherp door aan de knop te draaien (oranje pijl). De zwarte hendel bevindt zich in stand R (*). Nadat deze kop op zijn plaats is, vergrendelt u het apparaat door aan de duimschroef (paarse pijl) te draaien.
  28. Merk op dat het scherm verschijnt zoals weergegeven op pagina 29 van Aanvullend materiaal 2.
  29. Verplaats de keuzeknop van R naar A. Selecteer ICGA (om 787 nm autofluorescentie te bereiken) in blauw, 100% intensiteit, een gezichtsveld van 30° en eenfasige beeldvorming.
    OPMERKING: Net als de kleurstof indocyaninegroen wordt melanine geëxciteerd door licht met een golflengte van 787 nm.
  30. Merk op dat het scherm verschijnt zoals weergegeven op pagina 31 van Aanvullend materiaal 2. Druk op de zwarte schijf voor middeling en selecteer vervolgens Verwerven.
  31. Kies Venster > Database. Selecteer E2E-bestanden importeren van het SLO-apparaat ; Deze bestanden worden opgeslagen op een externe harde schijf en geüpload naar het bureaublad.
  32. Selecteer Openen. Controleer of de markeringen de standaardmarkeringen zijn en selecteer OK.
  33. Merk op dat de patiënt nu twee tabbladen heeft: een met de beelden verkregen uit de SLO (blauwe pijl) en het andere tabblad met de beelden verkregen van het OCT-apparaat (rode pijl) (Aanvullend materiaal 2, pagina 34).
  34. Klik met de rechtermuisknop op de 786 nm (ICGA) afbeelding en exporteer de afbeelding naar een bestand met het label SLO 786 op het bureaublad.
  35. Als u de 786 nm autofluorescentie SLO-afbeelding wilt opslaan, selecteert u de patiënt en klikt u met de rechtermuisknop om afbeeldingen als RAW-bestanden (voor .vol-bestanden) naar een map op het bureaublad te exporteren.
  36. Als u afbeeldingen van het OCT-apparaat wilt exporteren voor overdracht naar de archiefcomputer, kopieert/plakt u van RAWEXPORT naar een map met het label RAW.

9. Imaging beoordeling

  1. Verzamel de afbeeldingen (kleur, .vol-bestand, SLO-afbeeldingen) in mappen voor elke donor met submappen voor elk oog en indexeer de mappen achtereenvolgens op laboratorium-ID.
  2. Noteer de weefselafdrukken (kwaliteit, pathologie) in een database voor een gestandaardiseerd rapport.
  3. Bekijk de geëxporteerde OCT-volumes met een interne ImageJ-plug-in.
    1. Zoek het fovea-centrum, dat kan worden herkend aan het midden van de foveale dip, de naar binnen stijgende van de buitenste retinale banden of het dunste punt. In de meeste gevallen zullen deze samenvallen, maar niet altijd, omdat dit afhangt van het foveale behoud, individuele variabiliteit en de aanwezigheid van pathologie.
    2. Zoek een standaardscan in de superieure perifovea (2 mm/67 B-scans weg in de superieure richting; d.w.z. toenemende scanaantallen).
    3. Sla een .tif stapel van het hele volume op voor snelle referentie in de toekomst.
    4. Blader door het OCT-volume in zijn geheel, beginnend bij scan 1 (inferieur), terwijl u de scannummers opneemt waarin functies worden herkend.
    5. Controleer naast de macula ook het peripapillaire gebied.
      OPMERKING: Peripapillaire chorioretinale atrofie in oudere ogen omvat een onderscheidende basale laminaire afzetting en neovascularisatie. Dit is een gemeenschappelijk gebied van pigmentaire verandering in bijziende ogen en glaucoom, evenals in veroudering en AMD37.
  4. Inspecteer de kleurenfoto's en koppel eventuele bevindingen indien mogelijk aan die van OCT.
    OPMERKING: Over het algemeen is het gemakkelijker om de meeste bevindingen eerst door OCT te zien. Kleurenfoto's geven wel een groot beeld van het gebied buiten het gebied op de SLO, choroïdale pigmentatie inclusief naevi, de aanwezigheid van heem en harde exsudaten en zwart pigment in neovasculaire AMD. Donker pigment in de fovea kan losse melanosomen uit het voorste segment vertegenwoordigen en moet voorzichtig worden weggespoeld met buffer met behulp van een pipet.
  5. Inspecteer de SLO-beelden en koppel eventuele bevindingen indien mogelijk aan die van OCT.
  6. Bewaar standaard B-scans bij de fovea en perifovea, extra B-scans met opmerkelijke pathologie of andere kenmerken en SLO-beelden in een pathologierapport.
  7. Categoriseer de ogen als volgt: Onopvallend, Twijfelachtig, Vroeg-Intermediaire AMD, Atrofische AMD, Neovasculaire AMD, Overig, Onbekend, Niet gradeerbaar, Niet opgenomen. "Twijfelachtig" wordt gebruikt als het niet duidelijk is of de veranderingen ernstig genoeg zijn voor een andere categorisatie. "Niet gradeerbaar" is gereserveerd voor ogen zonder nuttige OCT-scans, zoals die met ernstig losgemaakte netvliezen. "Not Recorded" is gereserveerd voor ogen die direct na ontvangst zonder fotografie worden verwerkt.
  8. Gebruik deze criteria voor AMD: ernstige RPE-verandering met drusen of subretinale drusenoïde afzettingen, met of zonder tekenen van neovascularisatie, zoals vloeistof of fibrose, en zonder bewijs van andere oorzaken (bijgewerkt van Curcio et al.10 om SDD's te accommoderen).
    OPMERKING: De uiteindelijke diagnose wordt bevestigd door histologische analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tabel 1 laat zien dat in de periode 2016-2017 184 ogen van 94 witte niet-diabetische donoren >80 jaar oud werden hersteld. De gemiddelde sterfte-tot-bewaringstijd was 3,9 uur (bereik: 2,0-6,4 uur). Van de 184 onderzochte ogen hadden 75 (40,2%) bepaalde AMD. De volgende categorieën werden geïdentificeerd: Onopvallend (39,7%), Twijfelachtig (11,4%), Early-Intermediate AMD (22,8%), Atrofisch (7,6%), Neovasculair (9,8%), Overig (8,7%) en Onbekend/Niet Opgenomen/Niet Gradeerbaar (<1%). Figuur 2, figuur 3, figuur 4 en figuur 5 tonen multischaal, multimodale ex vivo beeldvorming van uitzonderlijk goed bewaarde ogen uit deze serie. De ogen werden beoordeeld in samenwerking met een oogarts gespecialiseerd in netvliesaandoeningen (J.A.K.). Hoewel sommige ogen individuele kenmerken beter vertoonden dan andere, werden deze gevallen gekozen voor allround hoge kwaliteit.

Zoals beschreven38, verschilt ex vivo kleurenfotografie van de overeenkomstige in vivo fotografie. Netvliesoedeem en/of loslating kan de zichtbaarheid van de achterste gepigmenteerde weefsels verminderen. Waarnemingen met frisse ogen geven aan dat deze veranderingen postmortaal optreden en niet merkbaar verergeren met snelle fixatie. Bovendien lopen choroïdale vaten leeg na de dood. Vanwege een golvende achtergrond van bleke bloedvaten en donker interstitiële weefsel, moet de beoordeling van pigmentvariaties in het vlak van de RPE worden ondersteund door andere modaliteiten dan kleur. In ex vivo OCT is meer informatie beschikbaar dan in kleurenfotografie. Ex vivo De LGO verschillen ook aanzienlijk van de in vivo LGO. De belangrijkste verschillen zijn de algehele verhoogde reflectiviteit van weefsel, vooral in het binnenste netvlies, de consistente reflectiviteit van sommige banden (zenuwvezellaag, binnenste en buitenste plexiforme laag, RPE), de lagere zichtbaarheid van de vaatvliesdetails, vooral onder het oedemateuze netvlies, en de zichtbaarheid van weefsellaagloslatingen (zie hieronder). De buitenste retinale hyperreflecterende banden, waarbij fotoreceptoren en de RPE (ellipsoïde zone, EZ; interdigitatiezone, IZ) betrokken zijn, zijn ex vivo inconsistent zichtbaar en worden in deze context niet als oriëntatiepunten gebruikt. De klinische consensus voor spectraaldomein OCT gebruikt de term RPE-Bruch's membraan (BrM) band. De term RPE-basale lamina (BL)-BrM-band heeft echter de voorkeur omdat deze geschikt is voor het verschijnen van basale laminaire afzettingen in AMD24.

Figuur 2 toont een onopvallende macula en hyporeflecterende grote choroïdale vaten, met een reflecterende RPE-BL-BrM-band tussen de twee. Een groot vat in het binnenste netvlies werpt een schaduw op de achterste lagen. De IPL en OPL zijn matig reflecterend. In de NIR SLO zijn zowel de retinale als de choroïdale vasculaturen zichtbaar. De roodvrije reflectie SLO werkt het beste voor functies van het binnenste netvlies en vitreoretinale interfaces zoals de boogvormige vezels en de papillomaculaire bundel van de NFL. In normale ogen toont de 488 nm autofluorescentie SLO een gebied van algemeen verminderd signaal in de centrale macula als gevolg van verdikte parafovea en, in sommige gevallen, absorptie door het gele xanthofylpigment, evenals hyperautofluorescentie langs de grote retinale vaten, wat wijst op bindweefselscheden. De autofluorescentie bij 787 nm toont een klein gebied van verhoogd signaal in de centrale macula van de RPE, een signaal in het choroïdale stroma en hypoautofluorescerende strepen die overeenkomen met de choroïdale vaten.

Figuur 3 toont een macula met early-intermediate AMD. De zichtbare kenmerken omvatten een zachte drusen (koepelvormige RPE-verhoging nabij de fovea), SDD's (intermitterende reflectiviteit met een dentate uiterlijk intern in de RPE-BL-BrM-band), hyperreflecterende foci (HRF, reflecterend materiaal met dezelfde reflectiviteit als de in-layer RPE, gelegen in het netvlies), en vitelliforme verandering (een inwaartse expansie van de RPE-organellen, zowel intracellulair als extracellulair, in combinatie met basale laminaire afzettingen39). De kleurenfotografie toont een sterke pigmentatie die overeenkomt met de vitelliforme laesie, omgeven door verminderde pigmentatie. Noch de drusen, noch de SDD's zijn duidelijk zichtbaar door kleur. De NIR-reflectantie toont de reflectiviteit in de fovea. De autofluorescentie bij 488 nm excitatie toont een gevlekt signaal in de fovea. SDD's verschijnen af en toe op SLO-modaliteiten; dit is waarschijnlijker als de SDD's overvloedig aanwezig zijn en SDD's het gemakkelijkst worden gezien als een regelmatig gespreid punctaatpatroon (zie Spaide en Curcio19, figuur 6). Het patroon superieur en temporeel aan de fovea in figuur 3I is geen SDD, omdat het onregelmatig is en gelokaliseerd in een oppervlakkig brandpuntsvlak. Alle en face modaliteiten vertonen fijne plooien die uitstralen vanuit de fovea. In minder goed bewaarde ogen kunnen vergelijkbare plooien groot genoeg zijn om zichtbaar te zijn bij de laagste kijkvergrotingen.

Figuur 4 toont een macula met atrofische AMD. De kleurenfundusfotografie toont cirkelvormige atrofische gebieden, centrale hyperpigmentatie en kleine hypergepigmenteerde stippen in de parafovea die in de OCT overeenkomen met HRF op het niveau van Henle-vezellaag-buitenste nucleaire laag (HFL-ONL). Bovendien kan in OCT een lage vlakke RPE-elevatie een basale laminaire afzetting, niet-exsudatieve type 1 neovascularisatie of beide vertegenwoordigen. Atrofie in de foveale B-scan is herkenbaar aan de verzakking van de HFL-ONL, een gebied van hypertransmissie (licht dat doorschijnt naar het vaatvlies), een vitelliforme verandering met verhoogde schaduwwerking in het foveale centrum en HRF die schaduwen werpt. In dit oog toont de NIR-reflectie hyperreflecterende vlekken in de fovea. De autofluorescentie bij 787 nm excitatie toont effectief een signaal dat overeenkomt met foveale hyperpigmentatie en de afwezigheid van een signaal in de cirkelvormige atrofische gebieden. De roodvrije en 488 nm autofluorescentie tonen de binnenste retinale kenmerken.

Figuur 5 toont een macula met macula-atrofie secundair aan neovasculaire LMD. De kleurenfundusfotografie toont zwarte pigmentatie binnen het atrofische gebied. Het OCT vertoont atrofie door de verzakking (verzakking) van HFL-ONL en verhoogde hypertransmissie. De foveale B-scan toont een berg subfoveaal hyperreflecterend materiaal en intraretinale cysten. De nabij-infrarode reflectie toont reflectiviteit in het atrofische gebied als gevolg van het verlies van RPE en choroïdale vaten. Een klein, intens reflecterend gebied in de fovea is niet zichtbaar op kleur. De roodvrije reflectie toont retinale vaten en, binnen een ringvormige zone, choroïdale vaten. De autofluorescentie (488 nm) toont duidelijk een ruwweg cirkelvormige atrofische grens en eilanden van beginnende atrofie. Een centraal gebied zonder signaal is omgeven door een annulus van matig signaal en zichtbare choroïdale vaten.

Figuur 6 toont gemeenschappelijke artefacten in ex vivo OCT-beeldvorming. Oedeem kan prominent aanwezig zijn in het binnenste netvlies, waardoor uitstulpingen en plooien door de fovea ontstaan (figuur 6A,I). Mechanische schade kan optreden bij tractie op het glasvocht of door direct contact van het netvlies met de ontleedgereedschappen, wat resulteert in de ontwrichting van materiaal en soms verlies van dat materiaal (figuur 6F, G). Loslatingen kunnen langs meerdere weefselvlakken voorkomen en kunnen relatieve trekkrachten tussen de lagen vertegenwoordigen die ook in vivo voorkomen. Eventuele loslatingen kunnen zich bij latere verwerking verder verbreden. De meest voorkomende loslating is retinaal (d.w.z. tussen de buitenste segmenten van de fotoreceptor en de apicale processen van de RPE) (figuur 6B-D,F-I). De apicale processen kunnen zich losmaken van de buitenste segmenten of bij de RPE-cellichamen blijven, zoals bepaald door histologie. Netvliesloslatingen kunnen groot en golvend zijn ( figuur 6 B,D,I) of smal en nauwelijks waarneembaar (figuur 6C,F,G). Bacillaire laagloslating (BALAD40) werd voor het eerst gezien in het laboratorium en later gevonden in klinische OCT. BALAD wordt toegeschreven aan een splitsing door het myoïde deel van de binnenste segmenten van de fotoreceptor, waardoor het ellipsoïde deel van het binnenste segment en het buitenste segment aan de RPE vastzitten (figuur 6A, D, I). BALAD mag niet worden verward met SDD in ex vivo LGO. Een derde loslatingsvlak is het binnenste begrenzingsmembraan (ILM) en er is vaak resterend reflecterend vocht tussen de ILM en de resterende retinale lagen (figuur 6A,B,I). De minst voorkomende loslating is tussen het vaatvlies en de sclera (figuur 6C). De fovea vertoont vaak cystoïde ruimten die niet als pathologisch moeten worden beschouwd zonder ondersteunend bewijs, zoals tekenen van neovascularisatie (figuur 6H). Bij enkele B-scans kunnen golvingen van de RPE de indruk wekken van drusen. De 3D-weergave van een OCT-volume maakt duidelijk dat deze langs de choroïdale vaten reizen (figuur 6E,J). Golvingen kunnen te wijten zijn aan differentiële volumeveranderingen tussen de bloedvaten en tussenliggend stroma na de dood en tijdens fixatie.

Om de verwachtingen voor kwaliteit te kalibreren en de beperkingen van ex vivo OCT te onderzoeken, vergelijkt figuur 7 de in vivo beeldvorming, ex vivo beeldvorming en histologie van drie klinisch gedocumenteerde ogen met AMD. Deze drie ogen zijn anders bewaard gebleven dan die in figuur 2, figuur 3, figuur 4 en figuur 5. Om de structurele OCT-reflectiviteitsbronnen, die subcellulair41 zijn, te bevestigen, werden de ogen in figuur 7 bewaard in 2,5% glutaaraldehyde en 1% glutaaraldehyde om hoge-resolutie epoxyharshistologie en correlatieve elektronenmicroscopie mogelijk te maken. Glutaaraldehyde voegt opaciteit toe aan deze monsters ten opzichte van die in figuur 2, figuur 3, figuur 4 en figuur 5. Het effect van een kortere versus langere DtoP is duidelijk (Figuur 7A-F, 2,1 uur vs. Figuur 7G-I, 8,9 uur). In het oog met een langere DtoP veranderde postmortaal oedeem de retinale contour en werd de ILM losgemaakt. De pathologie van belang (buitenste retinale tubulatie) was subtiel in de ex vivo beeldvorming. Het werd gevonden omdat de in vivo OCT met het oog de relevante B-scan aanwees en de choroïdale vaten konden worden gematcht. In de twee ogen met een kortere DtoP waren enkele belangrijke pathologieën (type 3 maculaire neovascularisatie) onmiddellijk duidelijk (figuur 7A-C). Anderen werden gevonden met behulp van eye tracking (figuur 7D-F).

Figure 1
Figuur 1: Cornea-excisie uit een menselijk donoroog voor onderdompelingsfixatie van het netvlies. Linksboven wordt het weggesneden donoroog op zijn plaats gehouden door een gaasmantel gestabiliseerd door een hemostaat; rechtsboven wordt een trephine van 18 mm gebruikt om een cirkelvormige partituur te maken inclusief het hoornvlies en een 2 mm brede rand van sclera; midden, de gescoorde cirkel wordt afgewerkt door een snede met een veerbelaste gebogen puntschaar, terwijl de bol is gestabiliseerd; linksonder worden het hoornvlies en de sclerale rand opgetild, waardoor de iris (blauw) en het ciliaire lichaam (bruinbruin) worden blootgesteld; in het midden onderaan wordt het hoornvlies met de rand volledig opgeheven; Rechtsonder wordt de iris loodrecht op de pupilrand geknipt om de penetratie van het conserveermiddel in de glasachtige kamer te vergemakkelijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Multimodale ex vivo beeldvorming van een onopvallende macula. Een macula van een 82-jarige vrouwelijke donor met een interval van 1,97 h. (A) De fundus van het rechteroog bekeken met het voorste segment verwijderd (epi-illuminatie). (B) Close-up van de macula (epi-verlichting). (C) Close-up van de fovea (epi-verlichting). De groene lijnen geven de locaties van de OCT B-scans in de panelen D en E aan. (D,E) OCT B-scans via de (D) superieure perifovea (E) en fovea. Het netvlies (R), het vaatvlies (C) met hyporeflecterende grote vaten en de tussenliggende hyperreflecterende RPE-BL-BrM-band zijn zichtbaar. In dit uitzonderlijk goed bewaarde oog zijn ook de matig reflecterende IPL en OPL zichtbaar. (D) Een groot vat in het binnenste netvlies werpt een schaduw op de achterste lagen. (E) De scheiding tussen het netvlies en RPE in paneel E (gele pijlpunt) is artefactueel. (F) De nabij-infrarode reflectantie toont de details van zowel de retinale als de choroïdale vasculaturen. (G) De roodvrije reflectie toont de boogvormige vezels (linker groene gebogen pijl) en de papillomaculaire bundel (groene pijl) van de zenuwvezellaag. (H) De 488 nm golflengte autofluorescentie toont een gebied van algemeen verminderd signaal in de centrale macula als gevolg van een verdikte oedemateuze parafovea, evenals ringen en een punt van laag signaal in het foveale centrum en hyperautofluorescentie langs de grote retinale vaten, wat suggestief is voor bindweefselscheden. (I) De autofluorescentie bij 787 nm toont een klein gebied van verhoogd signaal in de centrale macula van de RPE, een signaal in het choroïdale stroma en hypoautofluorescerende strepen die overeenkomen met choroïdale vaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. Multimodale ex vivo beeldvorming van een donoroog met vroege intermediaire AMD. Donoroog van een 97-jarige vrouwelijke donor met een interval van overlijden tot behoud van 3,1 h. (A) De fundus van het rechteroog bekeken met het voorste segment verwijderd (epi-illuminatie). (B) Close-up van de macula (epi-verlichting). De groene lijnen geven de locaties van de OCT B-scans in de panelen D, E en F aan. (C) Close-up van de fovea met hyperpigmentatie (pijl, flitsverlichting). (D) Een SDD in de superieure perifovea (oranje pijlen) wordt gezien op OCT. I Vitelliforme verandering in de RPE onder de fovea (witte pijlen). (F) Inferieur aan de fovea is een zachte drusen met een hyporeflecterende lijn aan de basis (gele pijl) en een hyperreflecterende focus erboven (lichtblauwe pijl). (G-I) De scanning laser oftalmoscoop beelden tonen zeer fijne stellaat plooien in de fovea (ook te zien in C). (G) De nabij-infrarode reflectantie toont reflectiviteitsmateriaal in de fovea dat gedeeltelijk overeenkomt met vitelliforme materiaal. (H) De roodvrije reflectie toont het netvliesoppervlak. (I) De 488 nm golflengte autofluorescentie toont een gebied van algemeen verminderd signaal in de centrale macula als gevolg van een licht verdikte parafovea. SDD's zijn niet duidelijk zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Multimodale ex vivo beeldvorming van een complete RPE en retinale atrofie bij leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. Donoroog van een 97-jarige vrouw met een interval van 2,33 h. (A) Fundus van het linkeroog bekeken met trans-verlichting. (B) Close-up van de macula (epi-verlichting). De groene lijnen geven de locaties van de OCT B-scans in de panelen D en E aan. (C) Close-up van de fovea (epi-verlichting) met centrale hyperpigmentatie (groene pijlpunt) en kleine hypergepigmenteerde stippen (gele pijlpunten). De centrale stip is intens bruin omdat het bovenliggende netvlies erg dun is. De stippen lijken onverzadigd omdat het bovenliggende netvlies dik is. Cirkelvormige atrofische gebieden worden aangegeven (witte pijlpunten). (D,E) OCT B-scans via de (D) perifovea (E) en fovea. Het netvlies (R) en het dunne vaatvlies (C) zijn zichtbaar. (D) Hyperreflecterende foci (gele pijlpunten) ter hoogte van de HFL-ONL komen overeen met de hypergepigmenteerde stippen in C. De lage vlakke RPE-elevatie eronder kan een basale laminaire afzetting, niet-exsudatieve type 1 neovascularisatie of beide vertegenwoordigen. (E) De B-scan door de fovea toont atrofie herkenbaar aan de verzakking van de HFL-ONL (rode pijlpunt), een gebied van hypertransmissie, een vitelliforme verandering met verhoogde schaduwvorming in het foveale centrum (groen sterretje) en hyperreflecterende foci (groenblauwe pijlpunt) met schaduw. De hyporeflecterende ruimte tussen het netvlies en de RPE-band kan subretinale vloeistof vertegenwoordigen. (F) De nabij-infrarode reflectie toont hyperreflecterende vlekken in de fovea. (G) De roodvrije afbeelding toont de boogvormige vezels van de NFL en reflecterende bloemen op het netvliesoppervlak. (H) De 488 nm autofluorescentie gericht op het netvlies toont een signaal geassocieerd met de retinale vaten, geen signaal geassocieerd met de RPE, en zwakke autofluorescente vlekken in het centrale maculaire gebied. (I) De 787 nm autofluorescentie vertoont een signaal dat overeenkomt met pigmentatie in C. Cirkelvormige atrofische gebieden zijn duidelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Multimodale ex vivo beeldvorming van type 1 neovascularisatie en macula-atrofie bij leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. Een donoroog van een 86-jarige vrouwelijke donor met een interval van dood tot behoud van 3,5 h. (A) De fundus van het linkeroog bekeken met het voorste segment verwijderd (trans-illuminatie). (B) Close-up van de macula met atrofische randen (gele pijlpunten). De groene lijnen geven de locaties van de OCT B-scans in de panelen D en E aan. (C) Close-up van de fovea toont zwarte pigmentatie (groene pijlpunten) binnen het atrofische gebied. (D,E) OCT B-Scans via de (D) perifovea (E) en fovea. Het netvlies I en het dunne vaatvlies (C) zijn zichtbaar. In dit uitzonderlijk goed bewaarde oog zijn ook de matig reflecterende IPL en OPL zichtbaar. (D) De perifoveale B-scan schampt de superieure rand van het atrofische gebied. Atrofie blijkt uit het verslappen van de HFL-ONL en verhoogde hypertransmissie (rode pijlpunten). Mogelijke subretinale drusenoïde afzettingen zijn aangegeven (fuchsia pijlpunten). (E) De foveale B-scan toont een berg subfoveaal hyperreflecterend materiaal en intraretinale cysten (asterisk). O = oogzenuwkop. (F) De nabij-infrarode reflectie toont een reflecterend gebied van atrofie en choroïdale vaten (groenblauwe pijlpunten), inclusief een klein intens gebied in de centrale macula (oranje pijlpunt) dat niet zichtbaar is door kleurenbeeldvorming. (G) De roodvrije reflectie toont retinale vaten en, binnen een ringvormige zone, choroïdale vaten. (H) De 488 nm autofluorescentie toont een ruwweg cirkelvormige atrofische rand (gele pijlpunten) en eilanden van beginnende atrofie. Een centraal gebied zonder autofluorescentie is omgeven door een annulus van matige autofluorescentie en zichtbare choroïdale vaten (witte pijlpunten). De 787 nm autofluorescentie was in dit oog niet mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Gemeenschappelijke artefacten gezien in de ex vivo OCT-beeldvorming van donorogen. Deze ogen komen uit de serie ogen van 2016-2017. De meeste netvliezen zijn hyperreflecterend ten opzichte van de netvliezen die in vivo zijn afgebeeld, en de binnenste retinale lagen zijn meer reflecterend dan de buitenste retinale lagen. Bacillaire loslating (gele pijlpunten in panelen A, D, G en I) wordt gedefinieerd als een splitsing ter hoogte van de fotoreceptor binnenste segment myoid, die een onderscheidende intraretinale holte40 creëert. Netvliesloslating (groene pijlpunten in panelen B, C, D, F, G en I) beschrijft een scheiding van het gehele neurosensorische netvlies van de onderliggende RPE42. Loslatingen van het interne beperkende membraan (ILM) scheiden de ILM- en zenuwvezellaag (rode pijlpunten in panelen A, B en I). Een choroïdale loslating (blauwe pijlpunt in paneel C) is een scheiding binnen het vaatvlies of tussen het vaatvlies en sclera. Mechanische schade (paarse pijl in panelen F en G) kan op elk niveau en met elke dimensie verschijnen, zoals van toepassing is op ontbrekend materiaal (groene pijl in paneel G) en ontwricht materiaal (gele pijl in paneel G). Het netvliesoedeem (paarse sterren in de panelen A en I) verschijnt als een verdikking van het netvliesweefsel met slecht gedefinieerde grenzen tussen de afzonderlijke retinale lagen. Een golvende RPE (blauwe pijlen in panelen E en J) verschijnt als een ongelijke, golvende RPE-laag. Cystoïde laesies (rood vierkant in paneel H) correleren met hyporeflecterende kamerachtige veranderingen in het netvliesweefsel, vaak in de fovea. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Ex vivo zichtbaarheid van de in vivo waargenomen pathologie afhankelijk van de conserveringskwaliteit. (Een-Ik) Panelen Een, Ben CPanelen D, Een Fen panelen G, Hen Ik vertegenwoordigen drie klinisch gedocumenteerde ogen van twee donoren, elk gezien door eye-tracking in vivo (Een1-Een2,D1-D2,G1-G2) en ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2) beeldvorming, gevolgd door histologie (C,F,Ik). De groene lijnen op de nabij-infrarode reflectie (NIR, Een1,B1,D1,E1,G1,H1) vertegenwoordigen de niveaus van optische coherentietomografie (OCT) B-scans en panoramische histologie. Panelen Een, Ben C en panelen D, Een F, presenteren respectievelijk het rechter- en linkeroog van één vrouwelijke donor in haar 90s. Panelen G, Hen Ik tonen het rechteroog van een tweede vrouwelijke donor, ook in haar 90s. (Een-C) Goed bewaard oogweefsel (DtoP: 2,1 uur) zorgt voor een goede zichtbaarheid van de belangrijkste pathologie. (Een) Een hyperreflecterende intraretinale maculaire neovascularisatie (type 3 MNV, groene pijlpunt) wordt 17 maanden voor de dood omgeven door intraretinale vloeistof (Een2). Het membraancomplex van de RPE/Bruch wordt gesplitst door hyporeflecterend materiaal en verschijnt als een "dubbellaags" teken (Een2). Aan de linkerkant is nog een dubbellaags teken met barcode hypertransmissie in het vaatvlies (oranje pijlpunt). Op ex vivo LGO (B2), zijn de type 3 MNV en barcode hypertransmissie duidelijk zichtbaar en afgebakend. Het netvlies is artefactisch losgemaakt, zoals blijkt uit de witte pijlpunt. De panoramische histologie toont een verticaal georiënteerde type 3 MNV-laesie (groene pijlpunt, C1). Zie eerder onderzoek43,44 voor details van de oorspronkelijke zaak. (D-F) Goed geconserveerd oogweefsel (DtoP: 2,1 uur) kan resulteren in een transparantie die verminderd is, maar nog steeds voldoende voor het detecteren van belangrijke pathologie. De LGO (D2) toont een stapel intraretinale hyperreflecterende foci (HRF, fuchsia pijlpunt) in een oog gevolgd voor exsudatief type 3 MNV. Er zijn geen intraretinale cysten zichtbaar 11 maanden voor de dood. Op ex vivo LGO (E2), is de stapel HRF verticaal samengedrukt (fuchsiapijlpunt) maar duidelijk afgebakend. Over panoramische histologie (F1), stijgt een retinale pigmentepitheeltoren (fuchsiapijlpunt) omhoog uit een zachte druze. (G-Ik) Minder goed bewaard gebleven oogweefsel (DtoP: 8,9 uur) resulteert in verminderde zichtbaarheid van belangrijke pathologieën. Het OCT duidt op een buitenste retinale tubulatie (ORT, gele pijlpunt) 48 maanden voor het overlijden (G2). Op de ex vivo OCT, de ORT verschijnt als een subtiele verstoring, en dit zou moeilijk te onderscheiden zijn geweest zonder voorafgaande kennis (H2). Het binnenste begrenzingsmembraan is artefactisch losgemaakt (witte pijlpunt). Oedeem heeft de netvliescontour vervormd. De histologische analyse toont het ORT-lumen begrensd door het externe beperkende membraan en de fotoreceptoren die erin uitsteken (Ik1). Zie eerder onderzoek26,45 voor details van de oorspronkelijke zaak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Cijfers Percentages
Diagnostische categorie Rechterogen Linker ogen Totaal Rechterogen Linker ogen Totaal
Onopvallend 39 34 73 41.50% 37.80% 39.70%
Twijfelachtige AMD 10 11 21 10.60% 12.20% 11.40%
Vroege AMD 20 22 42 21.30% 24.40% 22.80%
Atrofische AMD 6 8 14 6.40% 8.90% 7.60%
Neovasculaire AMD 11 7 18 11.70% 7.80% 9.80%
Ander 7 8 15 7.40% 8.90% 8.20%
Onbekend 0 0 0 0.00% 0.00% 0.00%
Niet opgenomen 1 0 1 1.10% 0.00% 0.50%
Totaal 94 90 184 100.00% 100.00% 100.00%
Bepaalde AMD 37 37 75 39.40% 41.10% 40.20%
Mogelijke AMD 47 48 95 50.00% 53.30% 51.60%
Ogen werden toegetreden in de periode 6/17/16 - 9/14/17. Criteria: ≥ 80 jaar, blank, niet-diabetisch, ≤6 uur dood-tot-behoud. Doel: 184 ogen (180 ogen van 90 donoren, geconserveerd; 4 ogen van 4 donoren, bewaard) Death-to-preservation time (gemiddeld, maximaal, minimaal): 3,9 uur, 6,4 uur, 2,0 uur

Tabel 1: Donoroogherstel van 2016-2017.

Aanvullend materiaal 1: Overzicht van de dissectie, kleurenfundusfotografie en OCT-gebaseerde multimodale beeldvorming. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend materiaal 2: Details van de op LGO gebaseerde multimodale beeldvorming ter illustratie van de stappen in de secties 5-8. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met behulp van een populatie-gebaseerde screeningsaanpak gedurende een periode van 16 maanden in het pre-COVID-tijdperk, was het mogelijk om 75 donorogen met AMD te verkrijgen. Ze werden allemaal teruggevonden met een korte DtoP en geënsceneerd met OCT-verankerde MMI. Het leeftijdscriterium (>80 jaar) valt buiten de typische leeftijdscategorie voor weefselherstel bedoeld voor transplanteerbare hoornvliezen. Ondanks de gevorderde leeftijd resulteerden onze criteria in ogen in alle stadia van AMD. Veel RPE-fenotypen zijn gemeenschappelijk voor alle AMD-stadia en sommige zijn exclusief voor neovasculaire AMD 3,46. De directe vergelijking van ex vivo en in vivo beeldvorming (figuur 7) bevestigde dat korte DtoP een kritische factor is, samen met deskundige behandeling (figuur 1), bij het produceren van ex vivo beelden van het buitenste netvlies die voldoende zijn voor diagnostische classificatie op het hoogste niveau, en sommige van deze monsters waren geschikt voor directe correlaties tussen beeldvorming en histologie4,35, 47. Niet alle pathologie is ex vivo zichtbaar. Er is echter veel meer zichtbaar bij het gebruik van OCT in vergelijking met op kleurenfotografie gebaseerde methoden10, vooral die waarbij het netvlies wordt gescheiden van de RPE / choroid27. Verder richt eye tracking van klinische OCT de aandacht op focale en soms kleine kenmerken (figuur 7).

Dit conserveringssysteem omvat typische oogbankprocedures en hulpmiddelen voor het verwijderen van het hoornvlies, gevolgd door de onderdompeling van een geopend oog in een conserveermiddel dat van tevoren is verstrekt. Op deze manier kan het personeel van de oogbank continu (24/7) onderzoeksweefsels herstellen. Dit laatste kenmerk is van cruciaal belang, omdat weefsels die bestemd zijn voor onmiddellijke complexe dissecties27,32 de klok rond personeel vereisen door de onderzoekers, de oogbank of beide. Andere stabilisatoren die weefselherstel op elk uur mogelijk maken, gevolgd door gespecialiseerde dissectie en extracties tijdens werkuren, zoals het PAXgene Tissue System en Hibernate-A, kunnen in de toekomst nuttig zijn als deze compatibel zijn met OCT-beeldvorming.

Deze aanpak levert netvliezen op die grotendeels aan de RPE blijven hangen en dus in staat zijn om gegevens te genereren die vertaalbaar zijn naar OCT-beeldvorming. Nauwkeurige lokalisatie is essentieel omdat de macula klein is (<3% van het netvliesgebied). Verder komt de afzettingsgestuurde AMD-progressie overeen met de topografie van kegeltjes en staafjes48, en de vroegste aanvang en meest persistente visuele defecten treden op een specifieke plaats op (d.w.z. de staafbevattende parafovea naast de fovea van de kegels)49. Ter vergelijking met OCT is immunohistochemie met colorimetrische kleurstoffen compatibel met uitgebreide microscopie (bijv. Bright-field) om rekening te houden met alle weefselelementen, zowel gelabeld als ongelabeld4. Ongerichte moleculaire assays op basis van sampling arrays kunnen gebruik maken van de horizontale uitlijning van verticaal gecompartimenteerde fotoreceptoren en de RPE om de resolutie effectief te verhogen. Beeldvorming van massaspectrometrie met ioniserende laserpulsen met een diameter van 8 μm en een afstand van 10-15 μm kan tientallen lipiden lokaliseren naar subcellulaire compartimenten van de buitenste retinale cellen50. Ruimtelijk opgeloste transcriptomics maakt gebruik van een vooraf gearrangeerde set barcoded reverse transcriptieprimers op glazen dia's, waarop weefselsecties worden aangebracht51. Deze technologie is momenteel beperkt tot afvang met een diameter van 55 μm en een afstand van 100 μm; verbeteringen in de resolutie die deze technologie geschikt zouden maken voor AMD-onderzoek worden verwacht.

Dit protocol heeft beperkingen. Het herstelcriterium laat diagnoses van diabetes weg (30% onder Medicare-ontvangers in Alabama)52 vanwege het belang van het vaatvlies bij beide ziekten. Deze uitsluiting vermindert de totale donorpool en verlengt de tijd die nodig is om voldoende ogen te verzamelen voor een onderzoek. Om historische redenen hebben de criteria van 2016-2017 zwarte donoren weggelaten, die nu 14% van de oogdonoren in de hele staat vertegenwoordigen, en zwarte donoren zijn nu opgenomen in de huidige toekomstige projecten. Het register van voorafgaande richtlijnen voor personen die oogdonor willen zijn, is uitgebreid, maar omvat nog geen handige registratie bij lokale netvliesspecialistische praktijken die voor AMD-patiënten zorgen; Dit project is momenteel in ontwikkeling. Tijdens een populatie-gebaseerde screening zoals deze, zullen ogen verschijnen met aandoeningen die overlappen in fenotype met AMD en moeten worden herkend in overleg met de evoluerende klinische literatuur en een oogarts die gespecialiseerd is in netvliesaandoeningen. Deze reeks ogen omvatte bijvoorbeeld nevi met drusen53 en een lijn van RPE-verstoring over een pachyvessel (een dik vat in het binnenste vaatvlies)54. Ten slotte werden vroege en intermediaire AMD gecombineerd vanwege het ontbreken van een OCT-gebaseerd beoordelingssysteem voor AMD, dat wordt ontwikkeld door de Classificatie van Atrofie Vergaderingsgroep55. Niettemin maakt de optimalisatie van weefselherstel en OCT-gebaseerde karakterisering amd-onderzoek mogelijk dat zich richt op het benutten van het tijdselement van oog-gevolgde OCT-verankerde MMI om te worden gepland, aangedreven, gepland en gebudgetteerd in financieringsaanvragen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

C.A.C. ontvangt onderzoeksondersteuning van Heidelberg Engineering en adviseert voor Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience en Osanni. T.A. krijgt onderzoeksondersteuning van Novartis en adviseert voor Roche, Novartis, Bayer, Nidek en Apellis. K.B.F. is consultant voor Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer en Novartis.

Acknowledgments

We danken Heidelberg Engineering voor de instrumentatie en het ontwerp van de originele ooghouder, Richard F. Spaide MD voor de introductie tot OCT-gebaseerde multimodale beeldvorming, Christopher Girkin MD voor het vergemakkelijken van de toegang tot klinische beeldvormingsapparatuur en David Fisher voor figuur 1. Het herstel van de menselijke donorogen voor onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) en U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), de EyeSight Foundation of Alabama, de International Retinal Research Foundation (C.A.C.), het Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) en Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers, 250 mL Fisher # 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex  Fisher # 10-462-719 storage for preservative
Bunsen burner or heat source Eisco # 17-12-818 To melt wax
Camera, digital Nikon D7200 D7200
Computer and storage Apple iMac Pro; 14 TB external hard drive Image storage
Container, insulated Fisher # 02-591-45 For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL Fisher Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86 For preservative
Crucible, quartz 30 mL Fisher # 08-072D Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL Fisher # 08-549G
Disinfectant cleaning supplies   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket contact J. Messinger jeffreymessinger@uabmc.edu custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks Fisher # 19-910-667
Forceps, Harmon Fix Roboz  # RS-8247
Forceps, Micro Adson Roboz  # RS-5232
Forceps, Tissue Roboz # RS-5172
Glass petri dish, Kimax Fisher # 23064
Gloves Diamond Grip Fisher # MF-300
Gowns GenPro Fisher # 19-166-116
Image editing software Adobe Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes Fisher # 06-666
Lamps, 3 goosenecks Schott Imaging # A20800
Microscope, stereo Nikon SMZ 1000 for dissection
Microscope, stereo Olympus  SZX9 color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%  EMS # 15713-S for preservative; dilute for storage
pH meter Fisher  # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2  EMS # 11600-10
Ring flash B & H Photo Video Sigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameter Meller Optics # MRB10MD
Safety Glasses 3M Fisher # 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope Heidelberg Engineering HRA2
Scissors, curved spring Roboz # RS-5681
Sharps container Fisher # 1482763
Shutter cord, remote Nikon MC-DC2
Spectral Domain OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA&OCT https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter McMaster-Carr # 9529K31
Tissue marking dye, black Cancer Diagnostics Inc # 0727-1
Tissue slicer blades Thomas Scientific # 6767C18
Trephine, 18-mm diameter Stratis Healthcare # 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera B&H Photo Video BH # COHD18G6PROB for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental EMS  # 72670
Wooden applicators Puritan # 807-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
  2. Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A. Subretinal drusenoid deposits a.k.a. pseudodrusen. Survey of Ophthalmology. 63 (6), 782-815 (2018).
  3. Curcio, C. A., Zanzottera, E. C., Ach, T., Balaratnasingam, C., Freund, K. B. Activated retinal pigment epithelium, an optical coherence tomography biomarker for progression in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (6), 211-226 (2017).
  4. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, OCT progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
  5. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, S12-S25 (2016).
  6. Edwards, M. M., et al. Subretinal glial membranes in eyes with geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1352-1367 (2017).
  7. Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
  8. Jiang, M., et al. Microtubule motors transport phagosomes in the RPE, and lack of KLC1 leads to AMD-like pathogenesis. Journal of Cell Biology. 210 (4), 595-611 (2015).
  9. Collin, G. B., et al. Disruption of murine Adamtsl4 results in zonular fiber detachment from the lens and in retinal pigment epithelium dedifferentiation. Human Molecular Genetics. 24 (24), 6958-6974 (2015).
  10. Curcio, C. A., Medeiros, N. E., Millican, C. L. The Alabama Age-related Macular Degeneration Grading System for donor eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 39 (7), 1085-1096 (1998).
  11. Bastek, J. V., Siegel, E. B., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Pigmentary patterns of the peripheral fundus. Ophthalmology. 89 (12), 1455-1463 (1982).
  12. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y., Lightfoot, D. O. Reticular degeneration of the pigment epithelium. Ophthalmology. 92 (11), 1485-1495 (1985).
  13. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Multiple extramacular drusen. Ophthalmology. 93 (8), 1098-1112 (1986).
  14. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye. 2 (5), 552-577 (1988).
  15. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of soft drusen in age-related macular degeneration. Eye. 8 (3), 269-283 (1994).
  16. Ghazi, N. G., Dibernardo, C., Ying, H. S., Mori, K., Gehlbach, P. L. Optical coherence tomography of enucleated human eye specimens with histological correlation: Origin of the outer "red line". American Journal of Ophthalmology. 141 (4), 719-726 (2006).
  17. Brown, N. H., et al. Developing SDOCT to assess donor human eyes prior to tissue sectioning for research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (8), 1069-1080 (2009).
  18. Helb, H. M., et al. Clinical evaluation of simultaneous confocal scanning laser ophthalmoscopy imaging combined with high-resolution, spectral-domain optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica. 88 (8), 842-849 (2010).
  19. Spaide, R. F., Curcio, C. A. Drusen characterization with multimodal imaging. Retina. 30 (9), 1441-1454 (2010).
  20. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part 1. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  21. Garcia-Garcia, H. M., Gonzalo, N., Regar, E., Serruys, P. W. Virtual histology and optical coherence tomography: from research to a broad clinical application. Heart. 95 (16), 1362-1374 (2009).
  22. Strouthidis, N. G., et al. Comparison of clinical and spectral domain optical coherence tomography optic disc margin anatomy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4709-4718 (2009).
  23. Sarks, S. H. Ageing and degeneration in the macular region: A clinico-pathological study. British Journal of Ophthalmology. 60 (5), 324-341 (1976).
  24. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (13), 19 (2020).
  25. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (1), 33 (2021).
  26. Litts, K. M., et al. Clinicopathological correlation of outer retinal tubulation in age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 133 (5), 609-612 (2015).
  27. Olsen, T. W., Feng, X. The Minnesota grading system of eye bank eyes for age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4484-4490 (2004).
  28. Mano, F., Sprehe, N., Olsen, T. W. Association of drusen phenotype in age-related macular degeneration from human eye-bank eyes to disease stage and cause of death. Ophthalmology Retina. 5 (8), 743-749 (2021).
  29. Age-related eye disease study research group. The Age-Related Eye Disease Study system for classifying age-related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The Age-Related Eye Disease Study Report Number 6. American Journal of Ophthalmology. 132 (5), 668-681 (2001).
  30. Arnold, J. J., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Reticular pseudodrusen. A risk factor in age-related maculopathy. Retina. 15 (3), 183-191 (1995).
  31. Olsen, T. W., Bottini, A. R., Mendoza, P., Grossniklausk, H. E. The age-related macular degeneration complex: linking epidemiology and histopathology using the Minnesota grading system (the inaugural Frederick C. Blodi Lecture). Transactions of the American Ophthalmological Society. 113, (2015).
  32. Owen, L. A., et al. The Utah protocol for postmortem eye phenotyping and molecular biochemical analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1204-1212 (2019).
  33. Wang, J. J., et al. Ten-year incidence and progression of age-related maculopathy: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 114 (1), 92-98 (2007).
  34. Joachim, N., Mitchell, P., Burlutsky, G., Kifley, A., Wang, J. J. The incidence and progression of age-related macular degeneration over 15 years: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 122 (12), 2482-2489 (2015).
  35. Pang, C., Messinger, J. D., Zanzottera, E. C., Freund, K. B., Curcio, C. A. The onion sign in neovascular age-related macular degeneration represents cholesterol crystals. Ophthalmology. 122 (11), 2316-2326 (2015).
  36. Keilhauer, C. N., Delori, F. C. Near-infrared autofluorescence imaging of the fundus: Visualization of ocular melanin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3556-3564 (2006).
  37. Curcio, C. A., Saunders, P. L., Younger, P. W., Malek, G. Peripapillary chorioretinal atrophy: Bruch's membrane changes and photoreceptor loss. Ophthalmology. 107 (2), 334-343 (2000).
  38. Curcio, C. A. Imaging maculopathy in the post-mortem human retina. Vision Research. 45 (28), 3496-3503 (2005).
  39. Brinkmann, M., et al. Histology and clinical lifecycle of acquired vitelliform lesion, a pathway to advanced age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 240, 99-114 (2022).
  40. Ramtohul, P., et al. Bacillary layer detachment: Multimodal imaging and histologic evidence of a novel optical coherence tomography terminology. Literature review and proposed theory. Retina. 41 (11), 2193-2207 (2021).
  41. Wilson, J. D., Foster, T. H. Mie theory interpretations of light scattering from intact cells. Optics Letters. 30 (18), 2442-2444 (2005).
  42. Ghazi, N. G., Green, W. R. Pathology and pathogenesis of retinal detachment. Eye. 16 (4), 411-421 (2002).
  43. Berlin, A., et al. Correlation of optical coherence tomography angiography of type 3 macular neovascularization with corresponding histology. JAMA Ophthalmology. 140 (6), 628-633 (2022).
  44. Berlin, A., et al. Histology of type 3 macular neovascularization and microvascular anomalies in anti-VEGF treated age-related macular degeneration. Ophthalmology Science. 3 (3), 100280 (2023).
  45. Schaal, K. B., et al. Outer retinal tubulation in advanced age-related macular degeneration: optical coherence tomographic findings correspond to histology. Retina. 35 (7), 1339-1350 (2015).
  46. Chen, L., et al. Histology and clinical imaging lifecycle of black pigment in fibrosis secondary to neovascular age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 214, 108882 (2022).
  47. Balaratnasingam, C., et al. Histologic and optical coherence tomographic correlations in drusenoid pigment epithelium detachment in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 124 (1), 644-656 (2017).
  48. Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: Morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
  49. Owsley, C., et al. Biologically guided optimization of test target location for rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration: ALSTAR2 baseline. Ophthalmology Science. 3 (2), 100274 (2023).
  50. Anderson, D. M. G., et al. The molecular landscape of the human retina and supporting tissues by high resolution imaging mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (12), 2426-2436 (2020).
  51. Lee, J., Yoo, M., Choi, J. Recent advances in spatially resolved transcriptomics: challenges and opportunities. BMB Reports. 55 (3), 113-124 (2022).
  52. Diabetes. Alabama Public Health. , Available from: https://www.alabamapublichealth.gov/healthrankings/diabetes.html (2022).
  53. Francis, J. H., et al. Swept-source optical coherence tomography features of choroidal nevi. American Journal of Ophthalmology. 159 (1), 169-176 (2015).
  54. Inoue, M., Dansingani, K. K., Freund, K. B. Progression of age-related macular degeneration overlying a large choroidal vessel. Retina Cases Brief Reports. 10 (1), 22-25 (2016).
  55. Jaffe, G. J., et al. Imaging features associated with progression to geographic atrophy in age-related macular degeneration: CAM Report 5. Ophthalmology Retina. 5 (9), 855-867 (2021).

Tags

Neuroscience Eye banking biobanking optical coherence tomography multimodal imaging age-related macular degeneration
<em>Ex Vivo</em> OCT-gebaseerde multimodale beeldvorming van menselijke donorogen voor onderzoek naar leeftijdsgebonden maculaire degeneratie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messinger, J. D., Brinkmann, M.,… More

Messinger, J. D., Brinkmann, M., Kimble, J. A., Berlin, A., Freund, K. B., Grossman, G. H., Ach, T., Curcio, C. A. Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (195), e65240, doi:10.3791/65240 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter