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Neuroscience

Ex Vivo Imagerie multimodale basée sur l’OCT des yeux de donneurs humains pour la recherche sur la dégénérescence maculaire liée à l’âge

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65240
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4, 5, *6, *1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn
* These authors contributed equally

Summary

Les tests de laboratoire peuvent tirer parti de la valeur pronostique de l’imagerie multimodale longitudinale de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) basée sur la tomographie longitudinale par cohérence optique (OCT). Les yeux des donneurs humains avec et sans DMLA sont imagés à l’aide de l’OCT, de la couleur, de l’ophtalmoscopie laser à balayage dans le proche infrarouge et de l’autofluorescence à deux longueurs d’onde d’excitation avant la section des tissus.

Abstract

Une séquence de progression pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) apprise à partir de l’imagerie clinique multimodale (MMI) basée sur la tomographie par cohérence optique (OCT) pourrait ajouter une valeur pronostique aux résultats de laboratoire. Dans ce travail, l’OCT ex vivo et le MMI ont été appliqués aux yeux de donneurs humains avant la section du tissu rétinien. Les yeux ont été récupérés sur des donneurs blancs non diabétiques âgés de ≥80 ans, avec un temps de décès à la préservation (DtoP) de ≤6 h. Les globes ont été récupérés sur place, marqués avec une tréphine de 18 mm pour faciliter l’élimination de la cornée, et immergés dans du paraformaldéhyde tamponné à 4%. Les images du fond d’œil couleur ont été acquises après le retrait du segment antérieur avec une lunette de dissection et un appareil photo reflex utilisant un éclairage trans, épi- et flash à trois grossissements. Les globes ont été placés dans un tampon dans une chambre conçue sur mesure avec une lentille de 60 dioptries. Ils ont été imagés avec le domaine spectral OCT (cube de macula de 30°, espacement de 30 μm, moyenne = 25), la réflectance dans le proche infrarouge, l’autofluorescence de 488 nm et l’autofluorescence de 787 nm. Les yeux de la DMLA ont montré un changement dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), avec des dépôts drusen ou drusenoïdes sous-rétiniens (SDD), avec ou sans néovascularisation, et sans preuve d’autres causes. Entre juin 2016 et septembre 2017, 94 yeux droits et 90 yeux gauches ont été récupérés (DtoP : 3,9 ± 1,0 h). Sur les 184 yeux, 40,2 % avaient une DMLA, y compris une DMLA intermédiaire précoce (22,8 %), atrophique (7,6 %) et néovasculaire (9,8 %), et 39,7 % avaient des macules banales. Drusen, SDD, foyers hyperréfléchissants, atrophie et cicatrices fibrovasculaires ont été identifiés à l’aide de l’OCT. Les artefacts comprenaient une opacification des tissus, des décollements (bacillaires, rétiniens, EPR, choroïdiens), un changement kystique fovéal, un EPR ondulant et des dommages mécaniques. Pour guider la cryosection, des volumes OCT ont été utilisés pour trouver les repères de la fovéa et de la tête du nerf optique et des pathologies spécifiques. Les volumes ex vivo ont été enregistrés avec les volumes in vivo en sélectionnant la fonction de référence pour le suivi oculaire. La visibilité ex vivo de la pathologie observée in vivo dépend de la qualité de conservation. En 16 mois, 75 yeux de donneurs DtoP rapides à tous les stades de la DMLA ont été récupérés et stadifiés à l’aide de méthodes cliniques MMI.

Introduction

Quinze années de prise en charge de la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l’âge (DMLA) avec un traitement anti-VEGF sous la direction de la tomographie par cohérence optique (OCT) ont offert de nouvelles perspectives sur la séquence de progression et la microarchitecture de cette cause répandue de perte de vision. Une reconnaissance clé est que la DMLA est une maladie tridimensionnelle impliquant la rétine neurosensorielle, l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et la choroïde. Grâce à l’imagerie OCT des patients de l’essai et des yeux des patients traités en clinique, les caractéristiques de la pathologie au-delà de celles observées par la photographie couleur du fond d’œil, une norme clinique depuis des décennies, sont maintenant reconnues. Il s’agit notamment de la néovascularisation intrarétinienne (néovascularisation maculaire de type 3 1, anciennement prolifération angiomateuse), des dépôts druzenoïdes sous-rétiniens (SDD, également appelés pseudodruzen réticulaires)2, des voies multiples du destin RPE3,4 et des cellulesde Müller intensément gliotiques dans l’atrophie 5,6.

Les systèmes modèles dépourvus de maculas (cellules et animaux) recréent quelques tranches de cette maladie complexe 7,8,9. Un autre succès dans l’amélioration du fardeau de la DMLA pourrait provenir de la découverte et de l’exploration de la pathologie primaire dans les yeux humains, de la compréhension de la composition cellulaire unique de la macula, suivie de la traduction en systèmes modèles. Ce rapport décrit une collaboration de trois décennies entre un laboratoire de recherche universitaire et une banque d’yeux. Les objectifs des méthodes de caractérisation tissulaire décrites ici sont doubles : 1) éclairer l’évolution de la technologie diagnostique en démontrant la base de l’apparence du fond d’œil et des sources de signaux d’imagerie par microscopie, et 2) classer les échantillons de DMLA pour des techniques de découverte moléculaire ciblées (immunohistochimie) et non ciblées (spectrométrie de masse d’imagerie, IMS et transcriptomique spatiale) qui préservent la fovéa conique et la para- et périfovéa riches en bâtonnets. De telles études pourraient accélérer la traduction en OCT clinique, pour laquelle une séquence de progression et un suivi longitudinal sont possibles grâce au suivi oculaire. Cette technologie, conçue pour surveiller les effets du traitement, enregistre les scans d’une visite clinique à l’autre à l’aide de vaisseaux rétiniens. L’établissement d’un lien entre la TCO suivie oculaire et les résultats de laboratoire obtenus à l’aide de techniques destructrices pourrait fournir un nouveau niveau de valeur pronostique aux résultats moléculaires.

En 1993, le laboratoire de recherche a capturé des photographies couleur de fond d’œil post-mortem sur film10. Cet effort a été inspiré par la superbe photomicroscopie et histologie de la rétine périphérique humaine par Foos et ses collègues 11,12,13 et les corrélations clinicopathologiques étendues de la DMLA par Sarks et al.14,15. À partir de 2009, l’imagerie multimodale ex vivo (MMI) ancrée sur le domaine spectral OCT a été adoptée. Cette transition a été inspirée par les efforts similaires d’autres 16,17 et surtout par la prise de conscience qu’une grande partie de l’ultrastructure décrite par les Sercs était disponible en trois dimensions, au fil du temps, dans la clinique 18,19. L’objectif était d’acquérir des yeux avec des maculas attachées dans un délai raisonnable pour des études bien puissantes des phénotypes au niveau cellulaire dans la rétine, l’EPR et la choroïde. L’intention était d’aller au-delà des statistiques « par œil » pour aller au-delà des statistiques « par type de lésion », une norme influencée par les concepts de « plaque vulnérable » des maladies cardiovasculaires20,21.

Le protocole présenté dans le présent rapport reflète l’expérience acquise avec près de 400 paires d’yeux de donneurs acquises dans plusieurs flux. En 2011-2014, le site Web du projet MACULA sur l’histopathologie de la DMLA a été créé, qui comprend des épaisseurs de couche et des annotations provenant de 142 spécimens archivés. Ces yeux ont été conservés de 1996 à 2012 dans un fixateur glutaraldéhyde-paraformaldéhyde pour l’histologie époxy-résine haute résolution et la microscopie électronique. Tous les fundi avaient été photographiés en couleur lors de leur réception et ont été réimagés par OCT juste avant l’histologie. Un porte-œil conçu à l’origine pour les études du nerf optique22 a été utilisé pour accueillir un poinçon tissulaire de 8 mm de diamètre sur toute l’épaisseur centré sur la fovéa. Des scans OCT B à travers le centre fovéal et un site supérieur de 2 mm, correspondant à l’histologie aux mêmes niveaux, ont été téléchargés sur le site Web, ainsi qu’une photographie du fond d’œil en couleur. Le choix des plans OCT a été dicté par l’importance de la pathologie AMD sous la fovéa23 et l’importance des SDD dans les zones riches en bâtonnets supérieures à la fovéa24,25.

À partir de 2013, les yeux imagés avec un MMI ancré dans les OCT pendant la vie étaient disponibles pour des corrélations clinicopathologiques directes. La plupart (7 donneurs sur 10) impliquaient des patients dans une pratique de référence de la rétine (auteur: K.B.F.), qui offrait un registre de directives avancées pour les patients intéressés à donner leurs yeux après leur décès à des fins de recherche. Les yeux ont été récupérés et préservés par la banque d’yeux locale, transférés au laboratoire et préparés de la même manière que les yeux du projet MACULA. Les volumes cliniques d’OCT pré-mortem ont été lus de manière transparente en laboratoire, alignant ainsi les caractéristiques pathologiques observées au cours de la vie avec les caractéristiques observées au microscope26.

À partir de 2014, le prélèvement prospectif sur les yeux a commencé par le dépistage de la DMLA dans les yeux de donneurs sans antécédents cliniques, mais conservés pendant un délai défini (6 h). À cette fin, le porte-œil a été modifié pour accueillir un globe entier. Cela réduisait le risque de détachement autour des bords coupés du poinçon de 8 mm précédemment utilisé. Les yeux ont été conservés dans du paraformaldéhyde tamponné à 4% pour l’immunohistochimie et transférés à 1% le lendemain pour un stockage à long terme. En 2016-2017 (avant la pandémie), 184 yeux de 90 donneurs ont été récupérés. Les statistiques et les images de ce rapport sont générées à partir de cette série. Pendant la période pandémique (confinements de 2020 et conséquences), les collectes potentielles pour la transcriptomique et les collaborations IMS se sont poursuivies à un rythme réduit, utilisant essentiellement les méthodes de 2014.

D’autres méthodes d’évaluation oculaire du donneur sont disponibles. Le Minnesota Grading System (MGS)27,28 est basé sur le système clinique AREDS pour la photographie couleurdu fond d’œil 29. Les limites de cette méthode comprennent la combinaison de la DMLA atrophique et néovasculaire en un seul stade de « DMLA tardive ». De plus, le MGS implique l’ablation de la rétine neurosensorielle avant la photo-documentation de la choroïde RPE. Cette étape déloge les SDD à des degrés divers30,31 et supprime la correspondance spatiale de la rétine externe et de son système de support. Ainsi, les efforts visant à lier la demande métabolique et la signalisation de la rétine à la pathologie de l’EPR-choroïde peuvent être entravés. Le système de l’Utah a mis en œuvre le MMI en utilisant la photographie couleur ex vivo et l’OCT pour catégoriser les yeux destinés à la dissection en régions pour les extractions d’ARN et de protéines32. Bien que préférable aux extractions d’œillets entiers, la zone de 3 mm de diamètre présentant le risque le plus élevé de progression de la DMLA33,34 ne représente que 25% d’un poinçon centré sur la fovéa de 6 mm de diamètre. Ainsi, les techniques qui permettent de localiser les résultats en référence à la fovéa, telles que la coupe en série pour l’immunohistochimie, sont avantageuses.

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Protocol

Le comité d’examen institutionnel de l’Université de l’Alabama à Birmingham a approuvé les études de laboratoire, qui ont adhéré aux bonnes pratiques de laboratoire et au niveau de biosécurité 2/2+. Toutes les banques ophtalmologiques américaines sont conformes à la loi de 2006 sur les cadeaux anatomiques uniformes et à la Food and Drug Administration des États-Unis. La plupart des banques ophtalmologiques américaines, y compris Advancing Sight Network, sont conformes aux normes médicales de l’Eye Bank Association of America.

Le tableau des matériaux énumère les fournitures et l’équipement. Le matériel supplémentaire 1 donne un aperçu de la dissection, de la photographie du fond d’œil en couleur et du MMI basé sur l’OCT. Le matériel supplémentaire 2 fournit des détails sur l’IMM basé sur l’OCT.

1. Critères de prélèvement de tissus

  1. Pour maximiser le rendement des yeux de DMLA dans un dépistage de donneurs sans papiers, définissez les critères suivants pour les donneurs acceptables : âge ≥80 ans, blanc, non diabétique et décès à ≤6 h jusqu’à la préservation (DtoP).
    REMARQUE : Le DtoP est défini comme le temps écoulé entre le décès et le moment où l’œil est placé dans un agent de conservation fourni, soit à l’hôpital, soit en laboratoire.

2. Milieu de conservation et autre préparation (laboratoire)

  1. Faire 4% de paraformaldéhyde tamponné au phosphate à partir de 20% de stock (acheté). Préparer 1 L en ajoutant 200 mL de paraformaldéhyde à 20 % (facteur de dilution de 5) à 800 mL de tampon phosphate de Sorenson 0,1 M. Testez et ajustez pour vous assurer que le pH est de 7,2, si nécessaire. Conserver à 4 °C.
  2. Distribuer 30 mL de paraformaldéhyde tamponné au phosphate à 4 % dans des bocaux de 40 mL.
  3. Stockez des contenants étiquetés de 40 ml d’agent de conservation à la banque oculaire afin que le tissu puisse être récupéré à tout moment et n’importe quel jour.
  4. Pour le stockage des yeux préservés, faire du paraformaldéhyde à 1% à partir de la solution à 4%. Préparer 1 L en ajoutant 250 mL de paraformaldéhyde à 4 % (facteur de dilution de 4) à 750 mL de tampon phosphate de Sorenson 0,1 M. Testez et ajustez le pH si nécessaire. Conserver à 4 °C.
    1. Préparer 1 L d’une solution de 0,1 M à partir de la solution 0,2 M du tampon phosphate de Sorenson, pH 7,2, en combinant 500 mL d’eau distillée et 500 mL de tampon de Sorenson.
    2. Ajuster le pH goutte par goutte en utilisant 1 N d’acide chlorhydrique ou 1 N d’hydroxyde de sodium. Conserver à 4 °C.
  5. Créez un support pour stabiliser les yeux pendant la dissection. Remplissez une boîte de Petri avec de la cire dentaire chauffée jusqu’à ce qu’elle soit liquide. Quand il fait légèrement froid, faites-y une impression hémisphérique avec un grand roulement à billes, puis congelez le plat pour faciliter le retrait du roulement à billes.

3. Méthodes de banque d’yeux

  1. Pour assurer la récupération rapide des tissus de recherche, récupérez rapidement tous les tissus, y compris ceux destinés à la transplantation.
  2. Recevoir les références de décès, comme l’exige la loi, dans les 1 heure suivant le décès, et suivre chaque donneur avec un numéro de séquence de référence qui suit le tissu.
  3. Pour trouver des cas avec une documentation clinique potentielle, posez des questions spécifiques à la DMLA et aux maladies oculaires dans l’entrevue d’évaluation des risques du donneur de recherche.
  4. Pour minimiser le temps de déplacement, récupérez des globes entiers (par opposition aux cornées pour la transplantation) dans une zone compacte (c.-à-d. ville et comté suburbain adjacent).
  5. Apportez deux pots d’agent de conservation (tamponné à 4 % de paraformaldéhyde) dans la chambre d’hôpital du défunt pour le prélèvement de tissus (au lieu d’attendre que le corps soit transporté à la morgue).
  6. Avant et pendant le rétablissement, communiquez avec les enquêteurs pour confirmer la livraison et le moment.
  7. Récupérez les globes sur place dans l’hôpital, ouvrez-les par des méthodes de manipulation cohérentes et immergez l’œil ouvert dans un agent de conservation (Figure 1).
    1. Maintenez l’œil du donneur excisé en place à l’aide d’une gaine de gaze stabilisée par un hémostatique.
    2. Pour faciliter l’enlèvement de la cornée avec un bord de sclérotique de 2 mm de large, utilisez un tréphine de 18 mm de diamètre pour marquer le globe.
    3. Pour libérer la cornée avec un bord de sclérotique d’accompagnement, coupez le long du cercle marqué à l’aide de ciseaux à ressort avec des pointes incurvées tout en stabilisant le globe avec la gaze coupée par hémostatique.
    4. Soulevez la cornée de la sclérotique, exposant l’iris et le corps ciliaire.
    5. Pour faciliter la pénétration du conservateur dans la chambre vitrée, faire une fente de 2 mm de long dans l’iris perpendiculaire au bord pupillaire. Placer les yeux dans des bocaux d’échantillons contenant 30 ml d’agent de conservation à 4 °C et transférer au laboratoire sur de la glace humide.
  8. Transmettre électroniquement les renseignements anonymisés sur les donneurs de la banque d’yeux à la base de données du laboratoire de recherche.
    REMARQUE : La base de données conserve le numéro de référence, le numéro de tissu de la banque oculaire et le numéro d’identification du laboratoire pour le suivi, ainsi que d’autres informations pertinentes.

4. Préparation des tissus pour la photographie couleur du fond d’œil ex vivo

  1. Utilisez deux stéréomicroscopes, un pour la dissection et un pour la photographie couleur du fond d’œil.
    REMARQUE: Pour que la transillumination visualise les changements pigmentaires, utilisez une base pour la microscopie à fond noir.
  2. Retirez les restes du segment antérieur (iris et lentille). Pour stabiliser l’œil pendant la dissection, placez-le dans la boîte de Petri remplie de cire (matériel supplémentaire 1, diapositives 7-8). Pour empêcher le corps ciliaire et la rétine attachée de s’effondrer dans la cavité vitrée, minimisez la perturbation de l’anneau vitré épais attaché au corps ciliaire (base vitrée).
  3. Marquez le pôle supérieur pour l’orientation. Placez le globe face antérieure vers le bas dans le plat. Trouvez les tendons d’insertion des muscles droits supérieurs et obliques supérieurs. À l’aide d’un applicateur en bois, appliquer avec parcimonie une encre de marquage dans une ligne de 10 mm dans une direction antérieure à postérieure (c.-à-d. perpendiculaire à l’insertion tendineuse du muscle droit supérieur).
  4. Avant la photographie, remplissez le fond d’œil avec le tampon phosphate froid de Sorensen.
  5. Insérez une perle de rubis de 1 mm dans le fond d’œil comme une barre d’échelle interne pour apparaître dans chaque image27.
  6. Obtenez des images couleur avec une caméra reflex à objectif unique montée sur un stéréomicroscope équipé d’un flash annulaire. Utilisez l’éclairage trans, épi- et flash à chacun des trois grossissements standard pour capturer des images destinées à mettre en évidence des zones spécifiques (matériel supplémentaire 1, diapositive 11) : 1) le fond d’œil à l’équateur, 2) le pôle postérieur (arcades vasculaires, tête du nerf optique, fovéa) et 3) la fovéa dans la macula lutea (tache jaune).

5. Préparation à la photographie couleur du fond d’œil ex vivo

  1. Allumez l’appareil photo et le moniteur. Branchez l’obturateur de la télécommande et relâchez l’actionneur dans le câble d’affichage de l’interface multimédia haute définition (HDMI), de la caméra/télévision (TV).
  2. Réglez les paramètres de l’appareil photo sur la fonction ISO manuelle et la position de verrouillage du miroir (verrouillée en place pour réduire les vibrations).
    REMARQUE: Reportez-vous au manuel d’utilisation du fabricant pour les paramètres de l’appareil photo utilisé. Apprenez à partir de l’appareil photo affichez les paramètres de surexposition / sous-exposition par rapport à l’histogramme et aux lectures d’exposition.
  3. Disposer deux sources lumineuses, chacune avec deux guides de lumière flexibles positionnés perpendiculairement l’un à l’autre, pour l’éclairage dans les quatre directions cardinales sur la platine du microscope (Matériel supplémentaire 1, page 10).
  4. Allumez les sources lumineuses epi-illumination à pleine puissance.
    REMARQUE: Il est utile mais pas nécessaire d’avoir un linceul de feutre noir autour de la scène pour limiter la diffusion de la lumière / flash pour le photographe.
  5. Au microscope à dissection, utilisez une pince pour insérer le pôle postérieur dans un creuset de quartz de 30 ml rempli de tampon. Laissez le tissu couler au fond. Insérez un renfort, comme une éponge tissulaire, entre l’œil et la paroi du creuset pour empêcher tout mouvement. Insérez la perle rubis de 1 mm dans le pôle postérieur.
    REMARQUE: Le cordon peut tomber dans la coupelle du nerf optique.
  6. Placez soigneusement le globe dans le creuset sur la scène du stéréomicroscope et observez le fond d’œil intérieur à travers les oculaires du microscope. À l’aide du grossissement le plus bas, orienter l’œil en identifiant la marque tissulaire à la position 12 heures, la tête du nerf optique (ONH) et la fovéa à 5° sous l’ONH. Faire pivoter l’œil de manière à ce que la fovéa tombe de 5° en dessous d’une ligne traversant l’ONH.
    REMARQUE: S’il s’agit d’un œil droit, l’ONH est à droite de la fovéa, comme on le voit à travers les oculaires du microscope. S’il s’agit d’un œil gauche, l’ONH est à gauche de la fovéa.
  7. Activez l’affichage du moniteur distant à partir de l’appareil photo. Assurez-vous que le curseur du séparateur de faisceau du microscope est réglé pour observer à travers le port photo et non à travers le port pour les oculaires. Selon la trajectoire de la lumière et du miroir, préparez-vous à faire pivoter le tissu de 180° sur la scène pour une orientation correcte.

6. Acquisition d’images à l’aide de la photographie de fond d’œil couleur ex vivo

  1. Lorsque l’épi-illumination est activée, réglez le grossissement de manière à ce que l’ensemble de l’incision en tréphine de 18 mm occupe tout le champ de vision. Augmentez le grossissement afin qu’il soit possible de se concentrer sur le fond de la fosse fovéale. Réduisez l’agrandissement au réglage précédent.
  2. Ajustez les paramètres ISO dans la plage de 1 600 à 3 000 afin que les temps d’exposition se situent dans la plage centrale du compteur de l’appareil photo.
  3. Appuyez sur la gâchette de l’obturateur à distance. Écoutez le miroir se verrouiller en position haute. Appuyez à nouveau sur la gâchette pour l’exposition.
  4. Observez l’image sur le moniteur, avec les métadonnées prédéfinies affichant le rouge, le vert, le bleu (RVB) et un histogramme de couleur pour une exposition correcte. Si l’exposition est acceptable, procéder; Si ce n’est pas le cas, supprimez, réévaluez les paramètres et réimagez.
  5. Éteignez les lampes à col de cygne pour l’epi-illumination pour mettre en évidence les drusen et allumez le flash, avec une exposition de 1/4 s, une vitesse d’obturation de l’appareil photo de 1/250 s et une sensibilité ISO de 100-320. Réglez la vitesse du flash sur la valeur par défaut ou modifiez-la lors de la configuration initiale de l’appareil photo. Acquérir une image et vérifier l’histogramme pour une exposition correcte.
  6. Éteignez le flash et allumez la source lumineuse trans-éclairage. Réinitialisez l’ISO à plus de 5 000 et assurez-vous que le temps d’exposition ne descend pas en dessous de 1/30 s en raison de vibrations potentielles dans le système photographique. Acquérir une image et vérifier l’histogramme pour une exposition correcte.
  7. Augmentez le grossissement pour visualiser à la fois l’ONH et la fovéa dans le champ de vision. Allumez les lampes d’epi-illumination. Définissez la plage ISO sur 1 600-3 000. Assurez-vous que les temps d’exposition se situent dans la plage centrale de l’appareil photo.
  8. Éteignez les lampes epi-illumination et allumez le flash, avec une exposition de 1/4 s, la vitesse d’obturation préréglée de l’appareil photo sur 1/250 s et l’ISO réglée sur 400-800. Acquérir une image et vérifier l’histogramme pour une exposition correcte.
  9. Éteignez le flash et activez la trans-illumination à l’aide de la base en fond noir. Réinitialisez l’ISO à plus de 5 000. Assurez-vous que le temps d’exposition n’est pas plus lent que 1/30 s en raison des vibrations potentielles dans le système photographique. Acquérir une image et vérifier un histogramme approprié.
  10. Éteignez la transillumination et rallumez les lampes d’epi-illumination.
  11. Augmentez le grossissement à celui utilisé à l’étape 6.7. Recentrez-vous si nécessaire.
  12. Augmentez l’ISO dans la plage de 3 000 à 6 000 et ajustez le temps d’exposition pour qu’il se situe dans la plage d’exposition appropriée de l’appareil photo. Acquérir une image.
    REMARQUE: La perle de rubis peut ne plus apparaître dans le champ de vision. Si c’est le cas, capturez des images séparées de la perle à ce grossissement pour référence.
  13. Éteignez les lampes d’épi-illumination. Allumez le flash avec une exposition de 1/4 s et avec la vitesse d’obturation de l’appareil photo à 1/250 s. Réglez la vitesse du flash sur la vitesse par défaut, ou modifiez-la lors de la configuration initiale de l’appareil photo, et réglez l’ISO sur 500-1 000. Acquérir l’image. Vérifiez l’histogramme pour une exposition appropriée.
  14. Éteignez le flash et allumez les lampes à trans-éclairage. Réinitialisez l’ISO au-dessus de 8 000 pour permettre un temps d’exposition plus rapide avec un capteur d’image plus sensible. Assurez-vous que le temps d’exposition ne descend pas en dessous de 1/30 s en raison de vibrations potentielles dans le système photographique. Acquérir une image.
  15. Exportez les images de l’appareil photo vers un ordinateur. Examinez les images avant de retirer l’échantillon de l’étape du microscope au cas où il faudrait en capturer à nouveau.

7. Vue d’ensemble de l’acquisition d’images pour la TCO ex vivo et l’ophtalmoscopie au laser à balayage (SLO)

  1. Pour le domaine spectral OCT, placer les globes dans un tampon phosphate dans un porte-œil personnalisé avec une chambre avec une lentille dioptrique60 35. Fixez le porte-œil à un support sur un appareil d’imagerie OCT clinique et fixez-le à l’endroit où un patient reposerait son front. Le périphérique OPO insère automatiquement une barre d’échelle dans chaque image.
  2. En même temps, à l’aide du même appareil et avec l’œil toujours dans le support, imagez les globes avec un ophtalmoscope laser à balayage (SLO) en utilisant la réflectance proche infrarouge (NIR, utilisée comme image de localisation par le logiciel à demeure), l’autofluorescence du fond d’excitation (FAF) de 488 nm et la réflectance sans rouge (RF).
    REMARQUE: Le FAF d’excitation de 787 nm dans cet appareil ne convient qu’occasionnellement car un séparateur de faisceau réduit la transmission de la lumière au SLO. Pour cette raison, un deuxième appareil pour les images FAF 787 nm (voir point suivant) est utilisé.
  3. Séparément, mais avec l’œil toujours dans le porte-œil, imagez les globes avec 787 nm FAF pour détecter la perturbation RPE36 à l’aide d’un dispositif séparé qui affiche bien cette modalité.

8. Protocole d’acquisition d’images pour les OCM/SLO ex vivo (voir les diapositives dans le matériel supplémentaire 2)

  1. Indiquer le muscle droit supérieur avec un colorant de marquage tissulaire. Allumez le laser (flèche bleue, matériel supplémentaire 2, page 1).
  2. En se référant à la page 2 du matériel supplémentaire 2, positionnez la tête OCT en déplaçant l’ensemble de l’unité sur deux axes par rapport à la base (flèche verte), puis en augmentant la hauteur (y) en tournant le joystick dans le sens horaire / antihoraire (cw / ccw, flèches bleues). Focalisez l’image en tournant le bouton (flèche orange), avec le levier noir en position R (*). Verrouillez l’appareil en fixant la vis du pouce (flèche violette).
  3. Insérez l’œil dans le support et stabilisez-le à partir de la face postérieure avec des entretoises (Matériel supplémentaire 1, page 13). Exercez le moins de pression possible pour éviter de bosseler la sclérotique. Orientez avec la marque tissulaire pour le muscle droit supérieur tournée vers le haut.
    REMARQUE: La distance approximative entre l’avant du porte-œil et le dispositif OCT est de 25 mm.
  4. Ouvrez le logiciel de visualisation et d’analyse propriétaire pour l’appareil OCT. Une liste de patients apparaîtra dans la colonne de gauche. Les donneurs oculaires indexés par un numéro de code interne sont les « patients ». Reportez-vous au manuel d’utilisation du fabricant.
  5. Sélectionnez l’icône Nouveau patient . Complétez les informations sur les données du patient au besoin. Sélectionnez OK. Utilisez un système de numérotation ordonné logiquement pour les yeux individuels, tel que YYYYNNNL,R_agesex. Par exemple, cela pourrait être 2017016R_97F.
  6. Après avoir poursuivi la saisie des données dans la fenêtre suivante, appuyez sur OK. Sélectionnez l’opérateur et étudiez dans le menu déroulant.
    REMARQUE : Les informations saisies apparaîtront dans les métadonnées exportables.
  7. Après avoir visualisé un écran vide, appuyez sur le bouton jaune pour lancer l’acquisition de l’image.
  8. Appuyez sur IR + OCT (réflectance proche infrarouge + OCT). Laissez le laser acquérir une image SLO en direct du fond d’œil et OCT B-scan.
    1. Finalisez la position anatomique correcte en fonction de l’ONH et de la fovéa, et utilisez un applicateur en bois pour ajuster la position des yeux dans le support. Sur le panneau de commande, faites pivoter le bouton rond noir pour régler l’intensité.
    2. Appuyez sur le même bouton pour faire la moyenne de 9 à 100 images (flèches rouges; 9 suffisent, 100 semble crémeux). Si l’appareil est orienté correctement, le fond d’œil doit être mis au point et le balayage B de l’OCT doit apparaître dans le tiers supérieur de l’écran (matériel supplémentaire 2, page 9, double flèche rouge).
    3. Sur l’image du fond d’œil, utilisez le curseur pour déplacer la ligne bleue afin de centrer la fovéa (Matériel supplémentaire 2, page 9, flèche blanche). Appuyez sur Acquérir.
      REMARQUE: Les autres boutons par défaut sont Retina, EDI (désactivé) et Line Scan.
  9. Appuyez sur RF + OCT pour la prochaine acquisition. Vérifiez à nouveau la position pour vous assurer que l’image n’a pas bougé ou dégradé. Appuyez sur le bouton noir pour la moyenne. Appuyez sur Acquérir.
  10. Basculer le cube interne pour l’imagerie par autofluorescence aux longueurs d’onde d’excitation de 488 nm et 787 nm (Supplementary Material 2, page 10).
    REMARQUE: La position du cube après le commutateur est affichée.
  11. Sélectionnez le mode Autofluorescence . Vérifiez à nouveau l’alignement. Appuyez sur Acquérir.
  12. Pour les cas suspects de perturbation et d’atrophie de l’EPR, sélectionnez ICGA (angiographie au vert d’indocyanine) pour l’autofluorescence à 787 nm. Vérifiez à nouveau la position des yeux, puis appuyez sur Acquérir.
    Remarque : Une image du fond d’œil n’apparaît souvent pas dans cette modalité car le cube interne atténue le faisceau.
  13. Remettez le cube interne en R pour l’IR et l’imagerie sans rouge pour l’acquisition de volume.
    REMARQUE : La position du cube après le commutateur est indiquée à la page 13 du Matériel supplémentaire 2.
  14. Pour acquérir les volumes de l’OPO, sélectionnez IR et le paramètre de volume. Faites correspondre tous les paramètres de la page 14 du matériel supplémentaire 2 en basculant les boutons appropriés sur le module de commande (cube de macula à 30°, espacement de 30 μm, moyenne en fonction des exigences expérimentales).
  15. Notez que la vue du fond d’œil de réflectance dans le proche infrarouge est recouverte de lignes bleues B-scan. Vérifiez à nouveau la position de l’OPO dans le tiers supérieur de la fenêtre de droite. Appuyez sur Acquérir sur le module de contrôle et attendez 5 minutes que l’analyse du volume soit terminée. Une fois l’acquisition de l’image terminée, sélectionnez EXIT. Les images seront sauvegardées (flèche rouge).
    Remarque : Les lignes bleues délimitent les distances indiquées dans la vue précédente en micromètres. Les scans commencent la numérotation à partir du bas (inférieur) et se poursuivent vers le haut. Notez la progression de la ligne rouge.
  16. Laissez l’ordinateur traiter les images acquises, qui apparaîtront à l’écran (Matériel supplémentaire 2, page 16).
  17. Lorsque vous imagez les autres yeux d’un donneur, ne modifiez pas la position du support de montage entre les yeux. Si l’œil gauche est imagé en premier, les résultats apparaîtront dans la colonne OD (œil droit). Cliquez avec le bouton droit pour sélectionner toutes les images, puis sélectionnez Exchange OS/OD. Les images seront déplacées vers la colonne du système d’exploitation.
  18. Appuyez sur Select > Window > Database. L’écran affiche par défaut le panneau 6 avec l’ajout de l’œil du donneur illustré dans la colonne de droite (matériel supplémentaire 2, page 18). Cliquez avec le bouton droit sur le patient dans le menu déroulant, choisissez Lot et exportez le fichier E2E.
  19. Accédez au dossier prédéterminé créé sur le bureau pour les transferts de fichiers. Sélectionnez OK. Le dossier contient les fichiers E2E à copier sur un disque dur externe et à archiver.
  20. Apportez l’œil dans son support à l’ophtalmoscope laser à balayage, qui est principalement utilisé pour l’autofluorescence de 787 nm.
    REMARQUE: reportez-vous au guide d’utilisation du fabricant pour l’acquisition et l’archivage des images.
  21. Allumez l’ordinateur et le laser.
  22. Sélectionnez l’icône Nouveau patient . Complétez les données du patient au besoin.
  23. Pour conserver la même fiche technique pour les yeux, appuyez sur OK. Comme la courbe en C reste la même, appuyez sur Continuer.
  24. Sélectionnez Mode étude et entrez le mot de passe si nécessaire. Maintenez la courbe en C à 7,7 mm. Appuyez sur OK.
  25. Sélectionnez Continuer pour vérifier la courbe C. Sélectionnez l’indicateur jaune pour démarrer l’appareil photo.
  26. Sélectionnez la position R . Alignez et orientez le globe. Sélectionnez le mode IR pour effectuer la mise au point et l’orientation comme ci-dessus.
  27. Orientez la tête de caméra en déplaçant l’ensemble de l’appareil sur deux axes par rapport à la base (matériel supplémentaire 2, page 28, flèche verte), puis en augmentant la hauteur (y) de l’appareil (flèches bleues). Faites la mise au point de l’image en faisant pivoter le bouton (flèche orange). Le levier noir est en position R (*). Une fois cette tête en position, verrouillez l’appareil en tournant la vis du pouce (flèche violette).
  28. Notez que l’écran apparaît comme indiqué à la page 29 du matériel supplémentaire 2.
  29. Déplacez le bouton de sélection de R à A. Sélectionnez ICGA (pour atteindre une autofluorescence de 787 nm) en bleu, intensité de 100 %, champ de vision de 30° et imagerie monophasée.
    REMARQUE: Comme le colorant vert indocyanine, la mélanine est excitée par une lumière de longueur d’onde de 787 nm.
  30. Notez que l’écran apparaît comme indiqué à la page 31 du Matériel supplémentaire 2. Appuyez sur le disque noir pour faire la moyenne, puis sélectionnez Acquérir.
  31. Choisissez Fenêtre > base de données. Sélectionnez Importer des fichiers E2E à partir du périphérique SLO ; Ces fichiers sont stockés sur un disque dur externe et téléchargés sur le bureau.
  32. Sélectionnez Ouvrir. Vérifiez que les marques sont les marques par défaut et sélectionnez OK.
  33. Notez que le patient a maintenant deux onglets : l’un montrant les images acquises à partir du SLO (flèche bleue), et l’autre onglet montrant les images acquises à partir du dispositif OCT (flèche rouge) (Matériel supplémentaire 2, page 34).
  34. Cliquez avec le bouton droit sur l’image 786 nm (ICGA) et exportez l’image vers un fichier intitulé SLO 786 sur le bureau.
  35. Pour enregistrer l’image SLO d’autofluorescence 786 nm, sélectionnez le patient, puis cliquez avec le bouton droit de la souris pour exporter des images en tant que fichiers RAW (pour les fichiers .vol) vers un dossier sur le bureau.
  36. Pour exporter des images à partir de l’unité OPO en vue de les transférer vers l’ordinateur d’archivage, copiez/collez depuis RAWEXPORT dans un dossier intitulé RAW.

9. Examen de l’imagerie

  1. Assemblez les images (couleur, fichier .vol, images SLO) dans des dossiers pour chaque donneur avec des sous-dossiers pour chaque œil, et indexez les dossiers consécutivement par ID de laboratoire.
  2. Enregistrer les empreintes tissulaires (qualité, pathologie) dans une base de données pour un rapport standardisé.
  3. Examinez les volumes de l’OPO exportés à l’aide d’un plug-in ImageJ interne.
    1. Trouvez le centre de la fovéa, qui peut être reconnu par le centre du plongeon fovéal, la montée vers l’intérieur des bandes rétiniennes externes ou le point le plus mince. Dans la plupart des cas, ceux-ci coïncident, mais pas toujours, car cela dépend de la préservation fovéale, de la variabilité individuelle et de la présence d’une pathologie.
    2. Trouvez un balayage standard dans la périfovéa supérieure (2 mm/67 B-scans dans la direction supérieure; c’est-à-dire augmenter le nombre de balayages).
    3. Enregistrez une pile .tif de l’ensemble du volume pour une référence rapide à l’avenir.
    4. Faites défiler le volume de l’OPO dans son intégralité, à partir de la numérisation 1 (inférieure), tout en enregistrant les numéros de numérisation dans lesquels les entités sont reconnues.
    5. Vérifiez la zone péripapillaire en plus de la macula.
      REMARQUE: L’atrophie choriorétinienne péripapillaire dans les yeux plus âgés comprend un dépôt laminaire basal distinctif et une néovascularisation. Il s’agit d’une zone commune de changement pigmentaire dans les yeux myopes et le glaucome, ainsi que dans le vieillissement et la DMLA37.
  4. Inspectez les photographies en couleur et reliez les résultats à ceux vus par l’EAO si possible.
    REMARQUE : En général, il est plus facile de voir d’abord la plupart des constatations par l’EAO. Les photographies couleur offrent une vue d’ensemble de la zone située à l’extérieur de la zone sur le SLO, de la pigmentation choroïdienne, y compris les naevus, de la présence d’hème et d’exsudats durs, et du pigment noir dans la DMLA néovasculaire. Le pigment foncé dans la fovéa peut représenter des mélanosomes lâches du segment antérieur et doit être lavé doucement avec un tampon à l’aide d’une pipette.
  5. Inspectez les images SLO et reliez les résultats à ceux vus par l’OCT si possible.
  6. Enregistrez les B-scans standard au niveau de la fovéa et de la périfovéa, les B-scans supplémentaires avec une pathologie notable ou d’autres caractéristiques, et les images SLO dans un rapport de pathologie.
  7. Classez les yeux comme suit : banal, douteux, DMLA précoce à intermédiaire, DMLA atrophique, DMLA néovasculaire, autre, inconnu, non gradable, non enregistré. « Douteux » est utilisé s’il n’est pas clair si les changements sont suffisamment importants pour une autre catégorisation. « Non gradable » est réservé aux yeux dépourvus de tomodensitogrammes utiles, tels que ceux dont la rétine est gravement détachée. « Non enregistré » est réservé aux yeux qui sont traités immédiatement après réception sans photographie.
  8. Utilisez ces critères pour la DMLA : modification sévère de l’EPR avec dépôts drusen ou drusenoïdes sous-rétiniens, avec ou sans signes de néovascularisation, tels que liquide ou fibrose, et sans preuve d’autres causes (mis à jour à partir de Curcio et coll.10 pour tenir compte des TDS).
    NOTE: Le diagnostic final est confirmé par une analyse histologique.

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Representative Results

Le tableau 1 montre qu’en 2016-2017, 184 yeux de 94 donneurs blancs non diabétiques âgés de >80 ans ont été récupérés. Le temps moyen de décès jusqu’à la préservation était de 3,9 h (intervalle : 2,0-6,4 h). Sur les 184 yeux examinés, 75 (40,2%) avaient une certaine DMLA. Les catégories suivantes ont été identifiées : banale (39,7 %), douteuse (11,4 %), DMLA intermédiaire précoce (22,8 %), atrophique (7,6 %), néovasculaire (9,8 %), autre (8,7 %) et inconnue/non enregistrée/non graduable (<1 %). La figure 2, la figure 3, la figure 4 et la figure 5 montrent l’imagerie ex vivo multi-échelle et multimodale d’yeux exceptionnellement bien conservés de cette série. Les yeux ont été examinés en collaboration avec un ophtalmologiste spécialisé dans les maladies de la rétine (J.A.K.). Alors que certains yeux présentaient des caractéristiques individuelles mieux que d’autres, ces boîtiers ont été choisis pour leur haute qualité.

Comme décrit38, la photographie couleur ex vivo diffère de la photographie in vivo correspondante. L’œdème et/ou le décollement de la rétine peuvent réduire la visibilité des tissus pigmentés postérieurs. Les observations dans les yeux neufs indiquent que ces changements se produisent post-mortem et ne s’aggravent pas de manière marquée avec une fixation rapide. De plus, les vaisseaux choroïdiens se vident après la mort. En raison d’un fond ondulant de vaisseaux pâles et de tissu interstitiel sombre, l’évaluation des variations pigmentaires dans le plan de l’EPR doit être facilitée par des modalités autres que la couleur. Dans l’OCO ex vivo , plus d’informations sont disponibles que dans la photographie couleur. Ex vivo La TCO diffère également de manière significative de la TCO in vivo . Les principales différences comprennent l’augmentation globale de la réflectivité des tissus, en particulier dans la rétine interne, la réflectivité constante de certaines bandes (couche de fibres nerveuses, couche plexiforme interne et externe, EPR), la visibilité plus faible des détails choroïdes, en particulier sous la rétine œdémateuse, et la visibilité des décollements de la couche tissulaire (voir ci-dessous). Les bandes hyperréfléchissantes externes de la rétine, impliquant les photorécepteurs et l’EPR (zone ellipsoïde, EZ; zone d’interdigitation, IZ), sont insystématiquement visibles ex vivo et ne sont pas utilisées comme points de repère dans ce contexte. Le consensus clinique pour la TCO du domaine spectral utilise le terme bande membranaire de RPE-Bruch (BrM). Cependant, le terme RPE-lame basale (BL)-bande BrM est préféré car il s’adapte à l’apparition de dépôts laminaires basaux dans AMD24.

La figure 2 montre une macula banale et de grands vaisseaux choroïdiens hyporéfléchissants, avec une bande réfléchissante RPE-BL-BrM entre les deux. Un gros vaisseau dans la rétine interne projette une ombre sur les couches postérieures. L’IPL et la BPO sont modérément réfléchissantes. Dans le NIR SLO, les vascularisations rétinienne et choroïdienne sont visibles. Le SLO à réflectance sans rouge fonctionne mieux pour les caractéristiques de la rétine interne et des interfaces vitréo-rétiniennes comme les fibres arquées et le faisceau papillomaculaire de la NFL. Dans les yeux normaux, le SLO d’autofluorescence de 488 nm montre une zone de signal globalement réduit dans la macula centrale en raison de l’épaississement des parafovées et, dans certains cas, de l’absorption par le pigment xanthophylle jaune, ainsi que de l’hyperautofluorescence tapissant les gros vaisseaux rétiniens, ce qui suggère des gaines de tissu conjonctif. L’autofluorescence à 787 nm montre une petite région de signal accru dans la macula centrale de l’EPR, un signal dans le stroma choroïdien et des bandes hypoautofluorescentes correspondant aux vaisseaux choroïdiens.

La figure 3 montre une macula atteinte de DMLA précoce à intermédiaire. Les caractéristiques visibles comprennent un drusen mou (élévation de l’EPR en forme de dôme près de la fovéa), des SDD (réflectivité intermittente avec un aspect denté interne à la bande RPE-BL-BrM), des foyers hyper-réfléchissants (HRF, matériau réfléchissant avec la même réflectivité que l’EPR dans la couche, situé dans la rétine) et un changement vitelliforme (une expansion vers l’intérieur des organites RPE, à la fois intracellulaires et extracellulaires, en conjonction avec les dépôts laminaires basaux39). La photographie couleur montre une forte pigmentation correspondant à la lésion vitelliforme, entourée d’une pigmentation réduite. Ni les drusen ni les SDD ne sont clairement visibles par la couleur. La réflectance NIR montre la réflectivité dans la fovéa. L’autofluorescence à 488 nm d’excitation montre un signal tacheté dans la fovéa. Les SDD apparaissent occasionnellement sur les modalités SLO; cela est plus probable si les SDD sont abondants et que les SDD sont plus facilement considérés comme un motif ponctué régulièrement espacé (voir Spaide et Curcio19, figure 6). Le motif supérieur et temporel à la fovéa de la figure 3I n’est pas SDD, car il est irrégulier et localisé à un plan focal superficiel. Toutes les modalités en face montrent de fins plis rayonnant à partir de la fovéa. Dans les yeux moins bien conservés, des plis similaires peuvent être assez grands pour être visibles aux grossissements d’observation les plus bas.

La figure 4 montre une macula atteinte de DMLA atrophique. La photographie du fond d’œil en couleur montre des zones atrophiques circulaires, une hyperpigmentation centrale et de petits points hyperpigmentés dans les parafovéa qui correspondent dans l’OCT à HRF au niveau de la couche de fibres Henle-couche nucléaire externe (HFL-ONL). De plus, dans l’OCT, une faible élévation plate de l’EPR peut représenter un dépôt laminaire basal, une néovascularisation non exsudative de type 1, ou les deux. L’atrophie dans le B-scan fovéal est reconnaissable par l’affaissement du HFL-ONL, une zone d’hypertransmission (lumière brillant à travers la choroïde), un changement vitelliforme avec une ombrage accrue dans le centre fovéal et HRF qui projette des ombres. Dans cet œil, la réflectance NIR montre des taches hyper-réfléchissantes dans la fovéa. L’autofluorescence à 787 nm d’excitation montre effectivement un signal correspondant à l’hyperpigmentation fovéale et à l’absence de signal dans les zones atrophiques circulaires. L’autofluorescence sans rouge et 488 nm montre les caractéristiques rétiniennes internes.

La figure 5 montre une macula présentant une atrophie maculaire secondaire à une DMLA néovasculaire. La photographie du fond d’œil en couleur montre une pigmentation noire dans la zone atrophique. L’OCT montre une atrophie par l’affaissement (affaissement) du HFL-ONL et une hypertransmission accrue. Le balayage fovéal B montre un monticule de matériel hyperréfléchissant sous-fovéal et de kystes intrarétiniens. La réflectance proche infrarouge montre une réflectivité dans la zone atrophique due à la perte de RPE et de vaisseaux choroïdiens. Une petite zone intensément réfléchissante dans la fovéa n’est pas visible sur la couleur. La réflectance sans rouge montre les vaisseaux rétiniens et, à l’intérieur d’une zone annulaire, les vaisseaux choroïdiens. L’autofluorescence (488 nm) montre clairement une bordure atrophique grossièrement circulaire et des îlots d’atrophie naissante. Une zone centrale dépourvue de signal est entourée d’un anneau de signaux modérés et de vaisseaux choroïdiens visibles.

La figure 6 montre des artefacts courants dans l’imagerie OCT ex vivo. L’œdème peut être proéminent dans la rétine interne, créant des renflements et des plis à travers la fovéa (Figure 6A, I). Des dommages mécaniques peuvent survenir avec la traction sur le vitré ou par contact direct de la rétine avec les outils de dissection, ce qui entraîne la luxation du matériau et, parfois, la perte de ce matériau (Figure 6F, G). Les décollements peuvent se produire le long de plusieurs plans tissulaires et peuvent représenter des forces de traction relatives entre les couches qui se produisent également in vivo. Tout détachement peut s’élargir davantage lors du traitement ultérieur. Le décollement le plus courant est rétinien (c.-à-d. entre les segments externes du photorécepteur et les processus apicaux de l’EPR) (figure 6B-D,F-I). Les processus apical peuvent soit se détacher des segments externes, soit rester avec les corps cellulaires de l’EPR, comme déterminé par l’histologie. Les décollements de rétine peuvent être grands et ondulants (Figure 6B, D, I) ou étroits et à peine discernables (Figure 6C, F, G). Le décollement de la couche bacillaire (BALAD40) a d’abord été observé en laboratoire, puis plus tard dans l’OCT clinique. BALAD est attribué à une scission à travers la partie myoïde des segments internes du photorécepteur, qui laisse la partie ellipsoïde du segment interne et le segment externe attachés à l’EPR (Figure 6A, D, I). BALAD ne doit pas être confondu avec SDD in ex vivo OCT. Un troisième plan de décollement est la membrane limite interne (ILM), et il y a souvent un liquide réfléchissant résiduel entre l’ILM et les couches rétiniennes restantes (Figure 6A, B, I). Le détachement le moins fréquent se situe entre la choroïde et la sclérotique (figure 6C). La fovéa présente souvent des espaces cystoïdes qui ne doivent pas être considérés comme pathologiques sans preuves à l’appui, tels que des signes de néovascularisation (Figure 6H). Dans les balayages B simples, les ondulations de l’EPR peuvent donner l’impression d’un drusen. La vue 3D d’un volume PTOM précise que ceux-ci se déplacent le long des vaisseaux choroïdiens (Figure 6E,J). Les ondulations peuvent être dues à des changements de volume différentiels entre les vaisseaux et le stroma intervenant après la mort et pendant la fixation.

Pour calibrer les attentes en matière de qualité et explorer les limites de l’OCT ex vivo, la figure 7 compare l’imagerie in vivo, l’imagerie ex vivo et l’histologie de trois yeux cliniquement documentés atteints de DMLA. Ces trois yeux ont été conservés différemment de ceux de la figure 2, de la figure 3, de la figure 4 et de la figure 5. Pour confirmer les sources structurelles de réflectivité OCT, qui sont subcellulaires41, les yeux de la figure 7 ont été conservés dans 2,5% de glutaraldéhyde et 1% de glutaraldéhyde pour permettre une histologie de résine époxy à haute résolution et une microscopie électronique corrélative. Le glutaraldéhyde ajoute de l’opacité à ces spécimens par rapport à ceux des figures 2, 3, 4 et 5. L’effet d’une DtoP plus courte par rapport à une plus longue est apparent (Figure 7A-F, 2,1 h vs Figure 7G-I, 8,9 h). Dans l’œil avec un DtoP plus long, l’œdème post-mortem a modifié le contour rétinien et l’ILM a été détachée. La pathologie d’intérêt (tubulation rétinienne externe) était subtile dans l’imagerie ex vivo. Il a été trouvé parce que l’OCT in vivo suivi oculaire a identifié le B-scan pertinent, et les vaisseaux choroïdiens ont pu être appariés. Dans les deux yeux avec un DtoP plus court, certaines pathologies majeures (néovascularisation maculaire de type 3) étaient immédiatement apparentes (Figure 7A-C). D’autres ont été trouvés avec l’aide d’un suivi oculaire (figure 7D-F).

Figure 1
Figure 1 : Excision cornéenne de l’œil d’un donneur humain pour la fixation par immersion de la rétine. En haut à gauche, l’œil du donneur excisé est maintenu en place par une gaine de gaze stabilisée par un hémostatique ; en haut à droite, une tréphine de 18 mm est utilisée pour faire une partition circulaire comprenant la cornée et un bord de sclérotique de 2 mm de large ; au milieu, le cercle marqué est terminé par une coupe avec des ciseaux à pointe incurvée à ressort, tandis que le globe est stabilisé; En bas à gauche, la cornée et le bord scléral sont soulevés, exposant l’iris (bleu) et le corps ciliaire (brun feu); en bas au milieu, la cornée avec le bord est complètement soulevée; En bas à droite, l’iris est coupé perpendiculairement à la marge pupillaire pour faciliter la pénétration du conservateur dans la chambre vitrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Imagerie ex vivo multimodale d’une macula banale. Une macula d’une donneuse de 82 ans avec un intervalle de mort à la préservation de 1,97 h. (A) Le fond de l’œil droit vu avec le segment antérieur enlevé (épi-illumination). (B) Gros plan de la macula (épi-illumination). (C) Vue rapprochée de la fovéa (épi-illumination). Les lignes vertes indiquent l’emplacement des balayages B de l’OCO dans les panneaux D et E. (D, E) OCT B-scanne à travers la (D) périfovéa supérieure (E) et fovéa. La rétine (R), la choroïde (C) avec de gros vaisseaux hyporéfléchissants et la bande RPE-BL-BrM hyperréfléchissante intervenante sont visibles. Dans cet œil exceptionnellement bien préservé, l’IPL et la POL modérément réfléchissantes sont également visibles. (D) Un gros vaisseau dans la rétine interne projette une ombre sur les couches postérieures. (E) La séparation entre la rétine et l’EPR dans le panneau E (pointe de flèche jaune) est artificielle. (F) La réflectance dans le proche infrarouge montre le détail des systèmes vasculaires rétinien et choroïdien. (G) La réflectance sans rouge montre les fibres arquées (flèche incurvée verte gauche) et le faisceau papillomaculaire (flèche verte) de la couche de fibres nerveuses. (H) L’autofluorescence de longueur d’onde de 488 nm montre une zone de signal globalement réduit dans la macula centrale en raison d’un épaississement des parafovés œdémateux, ainsi que des anneaux et un point de signal faible dans le centre fovéal et une hyperautofluorescence tapissant les grands vaisseaux rétiniens, ce qui suggère des gaines de tissu conjonctif. (I) L’autofluorescence à 787 nm montre une petite région de signal accru dans la macula centrale de l’EPR, un signal dans le stroma choroïdien et des bandes hypoautofluorescentes correspondant aux vaisseaux choroïdiens. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Imagerie ex vivo multimodale d’un œil de donneur avec DMLA intermédiaire précoce. Œil de donneur d’une donneuse de 97 ans avec un intervalle de mort à la préservation de 3,1 h. (A) Le fond de l’œil droit vu avec le segment antérieur enlevé (épi-illumination). (B) Gros plan de la macula (épi-illumination). Les lignes vertes indiquent l’emplacement des balayages B de l’OCO dans les panneaux D, E et F. (C) Vue rapprochée de la fovéa montrant une hyperpigmentation (flèche, éclairage du flash). (D) Un SDD dans la périfovéa supérieure (flèches orange) est vu sur OCT. I Changement vitelliforme de l’EPR sous la fovéa (flèches blanches). (F) Inférieur à la fovéa est un drusen mou avec une ligne hyporéfléchissante à la base (flèche jaune) et un foyer hyper-réfléchissant au-dessus (flèche bleu clair). (G-I) Les images de l’ophtalmoscope laser à balayage montrent de très fins plis étoilés dans la fovéa (également observés en C). (G) La réflectance dans le proche infrarouge montre un matériau réflectif dans la fovéa correspondant en partie à un matériau vitelliforme. (H) La réflectance sans rouge montre la surface rétinienne. (I) L’autofluorescence de longueur d’onde de 488 nm montre une zone de signal globalement réduit dans la macula centrale en raison d’une parafovéa légèrement épaissie. Les SDD ne sont pas clairement visibles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Imagerie ex vivo multimodale d’une EPR complète et d’une atrophie rétinienne dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Œil de donneur d’une femme de 97 ans avec un intervalle de mort à la préservation de 2,33 h. (A) Fond d’œil gauche vu avec trans-illumination. (B) Gros plan de la macula (épi-illumination). Les lignes vertes indiquent l’emplacement des balayages B de l’OCO dans les panneaux D et E. (C) Gros plan de la fovéa (épi-illumination) montrant une hyperpigmentation centrale (pointe de flèche verte) et de petits points hyperpigmentés (pointes de flèches jaunes). Le point central est brun intense car la rétine sus-jacente est très fine. Les points semblent désaturés parce que la rétine sus-jacente est épaisse. Les zones atrophiques circulaires sont indiquées (pointes de flèches blanches). (D, E) OCT B-scanne à travers le (D) périfovéa (E) et fovéa. La rétine (R) et la choroïde mince (C) sont visibles. (D) Les foyers hyperréfléchissants (pointes de flèches jaunes) au niveau du HFL-ONL correspondent aux points hyperpigmentés en C. La faible élévation plate de l’EPR sous eux peut représenter un dépôt laminaire basal, une néovascularisation de type 1 non exsudative, ou les deux. (E) Le balayage B à travers la fovéa montre une atrophie reconnaissable par l’affaissement du HFL-ONL (pointe de flèche rouge), une zone d’hypertransmission, un changement vitelliforme avec une ombrage accrue au centre fovéal (astérisque vert) et des foyers hyperréfléchissants (pointe de flèche sarcelle) avec ombrage. L’espace hyporéfléchissant entre la rétine et la bande RPE peut représenter le liquide sous-rétinien. (F) La réflectance dans le proche infrarouge montre des taches hyperréfléchissantes dans la fovéa. (G) L’image sans rouge montre les fibres arquées de la NFL et les fleurs réfléchissantes sur la surface rétinienne. (H) L’autofluorescence de 488 nm focalisée sur la rétine montre un signal associé aux vaisseaux rétiniens, aucun signal associé à l’EPR et de faibles taches autofluorescentes dans la région maculaire centrale. (I) L’autofluorescence de 787 nm montre un signal correspondant à la pigmentation en C. Des zones atrophiques circulaires sont apparentes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Imagerie ex vivo multimodale de la néovascularisation de type 1 et de l’atrophie maculaire dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Un œil de donneur d’une donneuse de 86 ans avec un intervalle de mort à la préservation de 3,5 h. (A) Le fond de l’œil gauche vu avec le segment antérieur enlevé (trans-illumination). (B) Gros plan de la macula détaillant les bordures atrophiques (pointes de flèches jaunes). Les lignes vertes indiquent l’emplacement des balayages B de l’OCO dans les panneaux D et E. (C) Le gros plan de la fovéa montre une pigmentation noire (pointes de flèches vertes) dans la zone atrophique. (D, E) OCT B-Scanne à travers la (D) périfovéa (E) et fovéa. La rétine I et la choroïde mince (C) sont visibles. Dans cet œil exceptionnellement bien préservé, l’IPL et la POL modérément réfléchissantes sont également visibles. (D) Le B-scan périfovéal frôle le bord supérieur de la zone atrophique. L’atrophie est mise en évidence par l’affaissement du HFL-ONL et l’augmentation de l’hypertransmission (pointes de flèches rouges). Drusénoïdes sous-rétiniens possibles sont indiqués (pointes de flèches fuchsia). (E) La scintigraphie fovéale B montre un monticule de matériel hyperréfléchissant sous-fovéal et des kystes intrarétiniens (astérisque). O = tête du nerf optique. (F) La réflectance dans le proche infrarouge montre une zone réfléchissante d’atrophie et de vaisseaux choroïdiens (pointes de flèches sarcelle), y compris une petite zone intense dans la macula centrale (pointe de flèche orange) non visible par imagerie couleur. (G) La réflectance sans rouge montre les vaisseaux rétiniens et, à l’intérieur d’une zone annulaire, les vaisseaux choroïdiens. (H) L’autofluorescence de 488 nm représente une bordure atrophique grossièrement circulaire (pointes de flèches jaunes) et des îlots d’atrophie naissante. Une zone centrale dépourvue d’autofluorescence est entourée d’un anneau d’autofluorescence modérée et de vaisseaux choroïdiens visibles (pointes de flèches blanches). L’autofluorescence de 787 nm n’était pas possible dans cet œil. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Artefacts communs observés dans l’imagerie OCT ex vivo des yeux de donneurs. Ces yeux proviennent de la série d’yeux 2016-2017. La plupart des rétines sont hyper-réfléchissantes par rapport aux rétines imagées in vivo, et les couches rétiniennes internes sont plus réfléchissantes que les couches rétiniennes externes. Le décollement bacillaire (pointes de flèches jaunes dans les panneaux A, D, G et I) est défini comme une scission au niveau du myoïde du segment interne du photorécepteur, qui crée une cavité intrarétinienne distinctive40. Le décollement de la rétine (pointes de flèches vertes dans les panneaux B, C, D, F, G et I) décrit une séparation de toute la rétine neurosensorielle de l’EPR42 sous-jacente. Des détachements de la membrane limitante interne (ILM) séparent l’ILM et la couche de fibres nerveuses (pointes de flèches rouges dans les panneaux A, B et I). Un détachement choroïdien (pointe de flèche bleue dans le panneau C) est une séparation à l’intérieur de la choroïde ou entre la choroïde et la sclérotique. Les dommages mécaniques (flèche violette dans les panneaux F et G) peuvent apparaître à n’importe quel niveau et avec n’importe quelle dimension, comme c’est le cas pour le matériau manquant (flèche verte dans le panneau G) et le matériau disloqué (flèche jaune dans le panneau G). L’œdème rétinien (étoiles violettes dans les panneaux A et I) apparaît comme un épaississement du tissu rétinien avec des limites mal définies entre les couches rétiniennes séparées. Un RPE ondulant (flèches bleues dans les panneaux E et J) apparaît comme une couche RPE inégale et ondulée. Les lésions cystoïdes (carré rouge dans le panneau H) sont corrélées à des altérations hyporéfléchissantes en forme de chambre dans le tissu rétinien, généralement dans la fovéa. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Graphique 7: Visibilité ex vivo de la pathologie observée in vivo en fonction de la qualité de conservation. (Un-Je) Tables rondes Un, Bet CPanneaux D, Eet F, et panneaux G, Het Je représentent trois yeux cliniquement documentés de deux donneurs, chacun vu par suivi oculaire in vivo (Un1-Un2,D1-D2,G1-G2) et ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2), suivie de l’histologie (C,F,Je). Les lignes vertes sur la réflectance proche infrarouge (NIR, Un1,B1,D1,E1,G1,H1) représentent les niveaux de tomographie par cohérence optique (TCO), de balayage B et d’histologie panoramique. Panneaux Un, Bet C et panels D, Eet F, présentent respectivement l’œil droit et l’œil gauche d’une donneuse âgée de 90 ans. Panneaux G, Het Je montrer l’œil droit d’une deuxième donneuse, également âgée de 90 ans (Un-C) Un tissu oculaire bien conservé (DtoP : 2,1 h) permet une bonne visibilité de la pathologie majeure. (Un) Une néovascularisation maculaire intrarétinienne hyperréfléchissante (MNV de type 3, pointe de flèche verte) est entourée de liquide intrarétinien 17 mois avant le décès (Un2). Le complexe membranaire RPE/Bruch est divisé par un matériau hyporéfléchissant et apparaît comme un signe « double couche » (Un2). À gauche se trouve un autre signe à double couche avec hypertransmission de code-barres dans la choroïde (pointe de flèche orange). Sur ex vivo PTOM (B2), la MNV de type 3 et l’hypertransmission par code-barres sont clairement visibles et délimitées. La rétine est artificiellement détachée, comme le montre la pointe de flèche blanche. L’histologie panoramique montre une lésion MNV de type 3 orientée verticalement (pointe de flèche verte, C1). Voir les recherches antérieures43,44 pour plus de détails sur le cas d’origine. (D-F) Un tissu oculaire bien conservé (DtoP : 2,1 h) peut entraîner une transparence réduite tout en restant suffisante pour détecter une pathologie majeure. Le PTOM (D2) montre une pile de foyers intra-rétiniens hyperréfléchissants (HRF, pointe de flèche fuchsia) dans un œil suivi pour la MNV exsudative de type 3. Aucun kyste intrarétinien n’est visible 11 mois avant le décès. Sur ex vivo PTOM (E2), la pile de HRF est comprimée verticalement (pointe de flèche fuchsia) mais clairement délimitée. Sur l’histologie panoramique (F1), une tour d’épithélium pigmentaire rétinien (pointe de flèche fuchsia) s’élève vers le haut à partir d’une douce druse. (G-Je) Un tissu oculaire moins bien conservé (DtoP : 8,9 h) entraîne une visibilité réduite de la pathologie majeure. L’OCT indique une tubulation rétinienne externe (ORT, pointe de flèche jaune) 48 mois avant le décès (G2). Sur le ex vivo OCT, l’ORT apparaît comme une perturbation subtile, ce qui aurait été difficile à discerner sans connaissance préalable (H2). La membrane limitante interne est détachée artificiellement (pointe de flèche blanche). L’œdème a déformé le contour rétinien. L’analyse histologique montre que la lumière ORT délimitée par la membrane limitante externe et les photorécepteurs qui y font saillie (Je1). Voir les recherches antérieures26,45 pour plus de détails sur le cas d’origine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nombres Pourcentages
Catégorie de diagnostic Yeux droits Yeux gauches Total Yeux droits Yeux gauches Total
Banale 39 34 73 41.50% 37.80% 39.70%
AMD douteuse 10 11 21 10.60% 12.20% 11.40%
Débuts de la DMLA 20 22 42 21.30% 24.40% 22.80%
DMLA atrophique 6 8 14 6.40% 8.90% 7.60%
DMLA néovasculaire 11 7 18 11.70% 7.80% 9.80%
Autre 7 8 15 7.40% 8.90% 8.20%
Inconnu 0 0 0 0.00% 0.00% 0.00%
Non enregistré 1 0 1 1.10% 0.00% 0.50%
Total 94 90 184 100.00% 100.00% 100.00%
Certains DMLA 37 37 75 39.40% 41.10% 40.20%
Possibilité de DMLA 47 48 95 50.00% 53.30% 51.60%
Les yeux ont été capturés au cours de la période du 17/06/16 au 14/09/17. Critères : ≥ 80 ans, blanc, non diabétique, ≤6 h mort à la conservation. Cible : 184 yeux (180 yeux de 90 donneurs, préservés; 4 yeux de 4 donneurs, préservés) Temps de mort à la préservation (moyenne, maximum, minimum) : 3,9 h, 6,4 h, 2,0 h

Tableau 1 : Récupération oculaire du donneur de 2016 à 2017.

Matériel supplémentaire 1 : Vue d’ensemble de la dissection, photographie du fond d’œil en couleur et imagerie multimodale basée sur l’EAO. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Matériel supplémentaire 2 : Détails de l’imagerie multimodale basée sur l’EAO pour illustrer les étapes décrites dans les sections 5 à 8. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

En utilisant une approche de dépistage basée sur la population pendant une période de 16 mois dans l’ère pré-COVID, il a été possible d’obtenir 75 yeux de donneurs atteints de DMLA. Tous ont été récupérés avec un DtoP court et mis en scène à l’aide de MMI ancrés dans les OCT. Le critère d’âge (>80 ans) se situe en dehors de la tranche d’âge typique pour les récupérations tissulaires destinées aux cornées transplantables. Malgré l’âge avancé, nos critères ont abouti à des yeux à tous les stades de la DMLA. De nombreux phénotypes d’EPR sont communs à tous les stades de DMLA, et certains sont exclusifs à la DMLA 3,46 néovasculaire. La comparaison directe de l’imagerie ex vivo et in vivo (figure 7) a confirmé que le DtoP court est un facteur critique, avec une manipulation experte (figure 1), dans la production d’images ex vivo de la rétine externe suffisantes pour une classification diagnostique de haut niveau, et certains de ces échantillons convenaient à des corrélations directes entre l’imagerie et l’histologie 4,35, 47. Toutes les pathologies ne sont pas visibles ex vivo. Cependant, beaucoup plus est visible lors de l’utilisation de l’OCT par rapport aux méthodes basées sur la photographie couleur10, en particulier celles impliquant la séparation de la rétine de l’EPR / choroïde27. De plus, le suivi oculaire de la TCO clinique attire l’attention sur les caractéristiques focales et parfois petites (Figure 7).

Ce système de conservation implique des procédures typiques de mise en banque d’yeux et des outils pour l’ablation de la cornée, suivis de l’immersion d’un œil ouvert dans un agent de conservation fourni à l’avance. De cette façon, le personnel de la banque oculaire peut récupérer les tissus de recherche en continu (24 heures sur 24, 7 jours sur 7). Cette dernière caractéristique est essentielle, car les tissus destinés à des dissections complexes immédiates27,32 nécessitent un personnel permanent de la part des investigateurs, de la banque d’yeux ou des deux. D’autres stabilisateurs qui permettraient la récupération des tissus à n’importe quelle heure suivie d’une dissection spécialisée et d’extractions pendant les heures de travail, tels que le système tissulaire PAXgene et Hibernate-A, pourraient être utiles à l’avenir s’ils sont compatibles avec l’imagerie OCT.

Cette approche produit des rétines qui restent largement attachées à l’EPR et sont donc capables de générer des données traduisibles en imagerie OCT. Une localisation précise est essentielle car la macula est petite (<3% de la zone rétinienne). De plus, la progression de la DMLA induite par les dépôts s’aligne sur la topographie des cônes et des bâtonnets48, et les défauts visuels les plus précoces et les plus persistants se produisent à un endroit précis (c.-à-d. la parafovéa contenant des bâtonnets à côté de la fovéa entièrement conique)49. À des fins de comparaison avec l’OCT, l’immunohistochimie avec des colorants colorimétriques est compatible avec la microscopie complète (p. ex. fond clair) pour tenir compte de tous les éléments tissulaires, marqués et non marqués4. Les tests moléculaires non ciblés basés sur des réseaux d’échantillonnage peuvent tirer parti de l’alignement horizontal des photorécepteurs compartimentés verticalement et de l’EPR pour augmenter efficacement la résolution. La spectrométrie de masse imageuse avec des impulsions laser ionisantes de 8 μm de diamètre et espacées de 10 à 15 μm permet de localiser des dizaines de lipides dans les compartiments subcellulaires des cellules rétiniennes externes50. La transcriptomique à résolution spatiale utilise un ensemble préétabli d’amorces de transcription inverse à code-barres sur des lames de verre, sur lesquelles des coupes de tissus sont appliquées51. Cette technologie est actuellement limitée à un captage de 55 μm de diamètre et à un espacement de 100 μm; Des améliorations de la résolution qui rendraient cette technologie adaptée à la recherche sur AMD sont prévues.

Ce protocole a des limites. Le critère de rétablissement omet les diagnostics de diabète (30 % chez les bénéficiaires de Medicare en Alabama)52 en raison de l’importance de la choroïde dans les deux maladies. Cette exclusion réduit le bassin global de donneurs et allonge le temps nécessaire pour recueillir suffisamment d’yeux pour une étude. Pour des raisons historiques, les critères 2016-2017 ont omis les donneurs noirs, qui représentent maintenant 14% des donneurs oculaires à l’échelle de l’État, et les donneurs noirs sont maintenant inclus dans les projets potentiels actuels. Le registre des directives préalables pour les personnes qui souhaitent être donneurs d’yeux est vaste, mais ne comprend pas encore d’inscription pratique dans les cabinets locaux spécialisés de la rétine qui soignent les patients atteints de DMLA; Ce projet est actuellement en cours d’élaboration. Lors d’un dépistage basé sur la population comme celui-ci, des yeux dont le phénotype se chevauche avec la DMLA apparaîtront et devront être reconnus en consultation avec la littérature clinique en évolution et un ophtalmologiste spécialisé dans les maladies de la rétine. Par exemple, cette série d’yeux comprenait des naevus avec drusen53 et une ligne de perturbation de l’EPR au-dessus d’un vaisseau pachy (un vaisseau épais dans la choroïde interne)54. Enfin, les DMLA précoce et intermédiaire ont été combinés en raison de l’absence d’un système de classement basé sur l’OCM pour la DMLA, qui est en cours d’élaboration par le groupe55 de la réunion de classification de l’atrophie. Néanmoins, l’optimisation de la récupération tissulaire et de la caractérisation basée sur les OCT permet à la recherche sur la DMLA de se concentrer sur l’exploitation de l’élément temps de l’IMM ancré dans les OCM oculaires d’être planifiée, alimentée, programmée et budgétisée dans les demandes de financement.

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Disclosures

C.A.C. reçoit un soutien de recherche de Heidelberg Engineering et consulte Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience et Osanni. T.A. reçoit un soutien à la recherche de Novartis et consulte Roche, Novartis, Bayer, Nidek et Apellis. K.B.F. est consultant pour Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer et Novartis.

Acknowledgments

Nous remercions Heidelberg Engineering pour l’instrumentation et la conception du porte-œil original, Richard F. Spaide MD pour l’introduction à l’imagerie multimodale basée sur OCT, Christopher Girkin MD pour avoir facilité l’accès aux dispositifs d’imagerie clinique et David Fisher pour la figure 1. La récupération des yeux de donneurs humains pour la recherche a été soutenue par des subventions des National Institutes of Health (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) et U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), l’EyeSight Foundation of Alabama, l’International Retinal Research Foundation (C.A.C.), l’Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) et Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers, 250 mL Fisher # 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex  Fisher # 10-462-719 storage for preservative
Bunsen burner or heat source Eisco # 17-12-818 To melt wax
Camera, digital Nikon D7200 D7200
Computer and storage Apple iMac Pro; 14 TB external hard drive Image storage
Container, insulated Fisher # 02-591-45 For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL Fisher Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86 For preservative
Crucible, quartz 30 mL Fisher # 08-072D Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL Fisher # 08-549G
Disinfectant cleaning supplies   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket contact J. Messinger jeffreymessinger@uabmc.edu custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks Fisher # 19-910-667
Forceps, Harmon Fix Roboz  # RS-8247
Forceps, Micro Adson Roboz  # RS-5232
Forceps, Tissue Roboz # RS-5172
Glass petri dish, Kimax Fisher # 23064
Gloves Diamond Grip Fisher # MF-300
Gowns GenPro Fisher # 19-166-116
Image editing software Adobe Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes Fisher # 06-666
Lamps, 3 goosenecks Schott Imaging # A20800
Microscope, stereo Nikon SMZ 1000 for dissection
Microscope, stereo Olympus  SZX9 color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%  EMS # 15713-S for preservative; dilute for storage
pH meter Fisher  # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2  EMS # 11600-10
Ring flash B & H Photo Video Sigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameter Meller Optics # MRB10MD
Safety Glasses 3M Fisher # 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope Heidelberg Engineering HRA2
Scissors, curved spring Roboz # RS-5681
Sharps container Fisher # 1482763
Shutter cord, remote Nikon MC-DC2
Spectral Domain OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA&OCT https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter McMaster-Carr # 9529K31
Tissue marking dye, black Cancer Diagnostics Inc # 0727-1
Tissue slicer blades Thomas Scientific # 6767C18
Trephine, 18-mm diameter Stratis Healthcare # 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera B&H Photo Video BH # COHD18G6PROB for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental EMS  # 72670
Wooden applicators Puritan # 807-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurosciences numéro 195 Banque oculaire biobanque tomographie par cohérence optique imagerie multimodale dégénérescence maculaire liée à l’âge
<em>Ex Vivo</em> Imagerie multimodale basée sur l’OCT des yeux de donneurs humains pour la recherche sur la dégénérescence maculaire liée à l’âge
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