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Neuroscience

Ex Vivo Imágenes multimodales basadas en OCT de ojos de donantes humanos para la investigación de la degeneración macular relacionada con la edad

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65240
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4, 5, *6, *1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn
* These authors contributed equally

Summary

Los ensayos de laboratorio pueden aprovechar el valor pronóstico de la tomografía de coherencia óptica longitudinal (OCT) basada en imágenes multimodales de la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). Los ojos de donantes humanos con y sin DMAE se obtienen imágenes mediante OCT, color, oftalmoscopia láser de escaneo de reflectancia en el infrarrojo cercano y autofluorescencia en dos longitudes de onda de excitación antes de la sección del tejido.

Abstract

Una secuencia de progresión para la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) aprendida a partir de imágenes clínicas multimodales (MMI) basadas en la tomografía de coherencia óptica (OCT) podría agregar valor pronóstico a los hallazgos de laboratorio. En este trabajo, se aplicaron OCT y MMI ex vivo a los ojos de donantes humanos antes de la sección del tejido retiniano. Los ojos fueron recuperados de donantes blancos no diabéticos de ≥80 años de edad, con un tiempo de muerte a preservación (DtoP) de ≤6 h. Los globos se recuperaron in situ, se marcaron con un trepano de 18 mm para facilitar la extracción de la córnea y se sumergieron en paraformaldehído al 4% tamponado. Las imágenes de fondo de ojo en color se adquirieron después de la extracción del segmento anterior con un endoscopio de disección y una cámara SLR que usaba iluminación trans, epi y flash a tres aumentos. Los globos se colocaron en un búfer dentro de una cámara diseñada a medida con una lente de 60 dioptrías. Se obtuvieron imágenes con OCT de dominio espectral (cubo de mácula de 30 °, espaciado de 30 μm, promedio = 25), reflectancia en el infrarrojo cercano, autofluorescencia de 488 nm y autofluorescencia de 787 nm. Los ojos de la DMAE mostraron un cambio en el epitelio pigmentario de la retina (EPR), con drusas o depósitos druenoides subretinianos (SDD), con o sin neovascularización, y sin evidencia de otras causas. Entre junio de 2016 y septiembre de 2017, se recuperaron 94 ojos derechos y 90 ojos izquierdos (DtoP: 3,9 ± 1,0 h). De los 184 ojos, el 40,2% tenía DMAE, incluyendo DMAE intermedia temprana (22,8%), atrófica (7,6%) y neovascular (9,8%), y el 39,7% tenía máculas poco notables. Las drusas, las SDD, los focos hiperreflectantes, la atrofia y las cicatrices fibrovasculares se identificaron mediante OCT. Los artefactos incluyeron opacificación tisular, desprendimientos (bacilar, retinal, EPR, coroideo), cambio quístico foveal, un EPR ondulado y daño mecánico. Para guiar la criosección, se utilizaron volúmenes de OCT para encontrar los puntos de referencia de la fóvea y la cabeza del nervio óptico y patologías específicas. Los volúmenes ex vivo se registraron con los volúmenes in vivo seleccionando la función de referencia para el seguimiento ocular. La visibilidad ex vivo de la patología observada in vivo depende de la calidad de conservación. En 16 meses, se recuperaron y estadificaron 75 ojos de donantes de DtoP rápida en todas las etapas de la DMAE utilizando métodos clínicos de IMM.

Introduction

Quince años de manejo de la degeneración macular neovascular relacionada con la edad (DMAE) con terapia anti-VEGF bajo la guía de la tomografía de coherencia óptica (OCT) ha ofrecido nuevos conocimientos sobre la secuencia de progresión y la microarquitectura de esta causa prevalente de pérdida de visión. Un reconocimiento clave es que la DMAE es una enfermedad tridimensional que involucra la retina neurosensorial, el epitelio pigmentario de la retina (EPR) y la coroides. Como resultado de las imágenes de OCT de los pacientes del ensayo y los ojos de los pacientes clínicos tratados, ahora se reconocen las características de la patología más allá de las observadas por la fotografía de fondo de ojo en color, un estándar clínico durante décadas. Estos incluyen neovascularización intrarretiniana (neovascularización macular tipo 31, anteriormente proliferación angiomatosa), depósitos drusenoides subretinianos (SDD, también llamados pseudodrusas reticulares)2, múltiples vías de destino del EPR3,4 y células de Müller intensamente glióticas en la atrofia 5,6.

Los sistemas modelo que carecen de máculas (células y animales) recrean algunas rebanadas de esta compleja enfermedad 7,8,9. El éxito adicional en la mejora de la carga de la DMAE podría provenir del descubrimiento y la exploración de la patología primaria en los ojos humanos, la comprensión de la composición celular única de la mácula, seguido de la traducción a sistemas modelo. Este informe retrata una colaboración de tres décadas entre un laboratorio de investigación académica y un banco de ojos. Los objetivos de los métodos de caracterización tisular descritos en este documento son dobles: 1) informar la evolución de la tecnología de diagnóstico al demostrar la base de la apariencia del fondo de ojo y las fuentes de señales de imagen con microscopía, y 2) clasificar las muestras de DMAE para técnicas de descubrimiento molecular dirigidas (inmunohistoquímica) y no dirigidas (espectrometría de masas de imágenes, IMS y transcriptómica espacial) que preservan la fóvea y la fóvea y perifovea ricas en conos y barras. Dichos estudios podrían acelerar la traducción a OCT clínica, para lo cual es posible una secuencia de progresión y un seguimiento longitudinal a través del seguimiento ocular. Esta tecnología, que está diseñada para monitorear los efectos del tratamiento, registra escaneos de una visita clínica a la siguiente utilizando vasos retinianos. Vincular la OCT con seguimiento ocular con los resultados de laboratorio obtenidos con técnicas destructivas podría proporcionar un nuevo nivel de valor pronóstico a los hallazgos moleculares.

En 1993, el laboratorio de investigación capturó fotografías en color del fondo de ojo postmortem en la película10. Este esfuerzo fue inspirado por la excelente fotomicroscopía e histología de la retina periférica humana por Foos y colegas 11,12,13 y las extensas correlaciones clinicopatológicas de DMAE por Sarks et al.14,15. A partir de 2009, se adoptaron imágenes multimodales ex vivo (MMI) ancladas en OCT de dominio espectral. Esta transición fue inspirada por los esfuerzos similares de otros 16,17 y especialmente por la comprensión de que gran parte de la ultraestructura descrita por los Sarks estaba disponible en tres dimensiones, con el tiempo, en la clínica 18,19. El objetivo era adquirir ojos con máculas adheridas en un marco de tiempo razonable para estudios con buena potencia de fenotipos a nivel celular en la retina, RPE y coroides. La intención era ir más allá de las estadísticas "por ojo" a "por tipo de lesión", un estándar influenciado por los conceptos de "placa vulnerable" de la enfermedad cardiovascular20,21.

El protocolo en este informe refleja la experiencia con casi 400 pares de ojos de donantes accedidos en varias corrientes. En 2011-2014, se creó el sitio web del Proyecto MACULA de histopatología de DMAE, que incluye espesores de capas y anotaciones de 142 especímenes archivados. Estos ojos se conservaron de 1996 a 2012 en un fijador de glutaraldehído-paraformaldehído para histología de resina epoxi de alta resolución y microscopía electrónica. Todos los fundi habían sido fotografiados en color cuando se recibieron y fueron reimaginados por OCT justo antes de la histología. Se utilizó un soporte para ojos diseñado originalmente para estudios del nervio óptico22 para acomodar un punzón de tejido de espesor total de 8 mm de diámetro centrado en la fóvea. Se cargaron en el sitio web exploraciones B de OCT a través del centro foveal y un sitio 2 mm superior, correspondiente a histología en los mismos niveles, además de una fotografía de fondo de ojo en color. La elección de los planos OCT fue dictada por la prominencia de la patología DMAE bajo la fóvea23 y la prominencia de las SDD en áreas ricas en varillas superiores a la fóvea24,25.

A partir de 2013, los ojos fotografiados con IMM anclada en OCT durante la vida estaban disponibles para correlaciones clinicopatológicas directas. La mayoría (7 de 10 donantes) involucraron a pacientes en una práctica de derivación de retina (autor: K.B.F.), que ofrecía un registro de directivas avanzadas para pacientes interesados en donar sus ojos después de la muerte con fines de investigación. Los ojos fueron recuperados y preservados por el banco de ojos local, transferidos al laboratorio y preparados de la misma manera que los ojos del Proyecto MACULA. Los volúmenes clínicos de OCT pre-mortem fueron leídos sin problemas en el laboratorio, alineando así las características patológicas observadas durante la vida con las características observadas bajo el microscopio26.

A partir de 2014, la recolección prospectiva de ojos comenzó con la detección de DMAE en ojos de donantes sin antecedentes clínicos, pero conservados durante un límite de tiempo definido (6 h). Para este propósito, el soporte del ojo se modificó para acomodar todo un globo. Esto redujo la posibilidad de desprendimiento alrededor de los bordes cortados del punzón de 8 mm utilizado anteriormente. Los ojos se conservaron en paraformaldehído tamponado al 4% para inmunohistoquímica y se transfirieron al 1% al día siguiente para el almacenamiento a largo plazo. En 2016-2017 (antes de la pandemia), se recuperaron 184 ojos de 90 donantes. Las estadísticas e imágenes de este informe se generan a partir de esta serie. Durante la era de la pandemia (cierres y secuelas de 2020), las colecciones prospectivas para la transcriptómica y las colaboraciones de IMS continuaron a un ritmo reducido, esencialmente utilizando los métodos de 2014.

Existen otros métodos para la evaluación ocular del donante. El Minnesota Grading System (MGS)27,28 se basa en el sistema clínico AREDS para la fotografía de fondo de ojo en color 29. Las limitaciones de este método incluyen la combinación de DMAE atrófica y neovascular en una etapa de "DMAE tardía". Además, el MGS implica la extirpación de la retina neurosensorial antes de la fotodocumentación de la coroides del EPR. Este paso desaloja las SDD en diversos grados30,31 y elimina la correspondencia espacial de la retina externa y su sistema de soporte. Por lo tanto, los esfuerzos para vincular la demanda metabólica y la señalización de la retina a la patología en el EPR-coroides pueden verse obstaculizados. El Sistema de Utah implementó MMI utilizando fotografía en color ex vivo y OCT para categorizar los ojos destinados a la disección en regiones para extracciones de ARN y proteínas32. Aunque es preferible a las extracciones enteras del ocular, el área de 3 mm de diámetro con mayor riesgo de progresión de la DMAE33,34 representa solo el 25% de un punzón centrado en la fóvea de 6 mm de diámetro. Por lo tanto, las técnicas que pueden localizar los hallazgos en referencia a la fóvea, como la sección seriada para inmunohistoquímica, son ventajosas.

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Protocol

La junta de revisión institucional de la Universidad de Alabama en Birmingham aprobó los estudios de laboratorio, que se adhirieron a las Buenas Prácticas de Laboratorio y al Nivel de Bioseguridad 2/2+. Todos los bancos de ojos de EE.UU. cumplen con la Ley Uniforme de Regalos Anatómicos de 2006 y la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. La mayoría de los bancos de ojos de los Estados Unidos, incluida Advancing Sight Network, cumplen con los estándares médicos de la Eye Bank Association of America.

La Tabla de materiales enumera los suministros y equipos. El material complementario 1 proporciona una visión general de la disección, la fotografía de fondo de ojo en color y el MMI basado en OCT. El material complementario 2 proporciona detalles del MMI basado en PTU.

1. Criterios para la recogida de tejidos

  1. Para maximizar el rendimiento de los ojos de DMAE en una pantalla de donantes indocumentados, establezca los siguientes criterios para donantes aceptables: edad ≥80 años, blanco, no diabético y ≤6 h de muerte a preservación (DtoP).
    NOTA: DtoP se define como el tiempo entre la muerte y cuando el ojo se coloca en un conservante provisto, ya sea en el hospital o en el laboratorio.

2. Medio de conservación y otros preparados (laboratorio)

  1. Hacer paraformaldehído tamponado con fosfato al 4% a partir de existencias al 20% (compradas). Prepare 1 L agregando 200 ml de paraformaldehído al 20% (factor de dilución de 5) a 800 ml de tampón fosfato de Sorenson 0.1 M. Pruebe y ajuste para asegurarse de que el pH sea 7.2, si es necesario. Conservar a 4 °C.
  2. Dispense 30 ml de paraformaldehído tamponado con fosfato al 4% en frascos de 40 ml.
  3. Envases de 40 ml de conservante etiquetados en el banco de ojos para que el tejido se pueda recuperar en cualquier momento y en cualquier día.
  4. Para el almacenamiento de ojos preservados, haga paraformaldehído al 1% de la solución al 4%. Prepare 1 L agregando 250 ml de paraformaldehído al 4% (factor de dilución de 4) a 750 ml de tampón fosfato de Sorenson 0.1 M. Pruebe y ajuste el pH si es necesario. Conservar a 4 °C.
    1. Preparar 1 L de una solución 0,1 M de la solución 0,2 M del tampón fosfato de Sorenson, pH 7,2, combinando 500 ml de agua destilada y 500 ml de tampón de Sorenson.
    2. Ajuste el pH gota a gota usando ácido clorhídrico 1 N o hidróxido de sodio 1 N. Conservar a 4 °C.
  5. Cree un soporte para estabilizar los ojos durante la disección. Llene una placa de Petri con cera dental calentada hasta que esté líquida. Cuando esté ligeramente frío, haga una impresión hemisférica en él con un rodamiento de bolas grande y luego congele el plato para facilitar la extracción del rodamiento de bolas.

3. Métodos de banco de ojos

  1. Para garantizar la rápida recuperación de los tejidos de investigación, recuperar rápidamente todos los tejidos, incluidos los destinados al trasplante.
  2. Reciba referencias de muerte, según lo exige la ley, dentro de 1 h de la muerte, y haga un seguimiento de cada donante con un número de secuencia de referencia que siga el tejido.
  3. Para encontrar casos con documentación clínica potencial, haga preguntas específicas sobre DMAE y enfermedades oculares en la entrevista de evaluación de riesgos del donante.
  4. Para minimizar el tiempo de viaje, recupere globos enteros (a diferencia de solo córneas para trasplante) dentro de un área compacta (es decir, ciudad y condado suburbano adyacente).
  5. Lleve dos frascos de conservante (paraformaldehído tamponado al 4%) a la habitación del hospital del difunto para la recuperación del tejido (en lugar de esperar a que el cuerpo sea trasladado a una morgue).
  6. Antes y durante la recuperación, comuníquese con los investigadores para confirmar el parto y el momento.
  7. Recupere los globos in situ en el hospital, ábralos mediante métodos de manipulación consistentes y sumerja el ojo abierto en conservante (Figura 1).
    1. Mantenga el ojo del donante extirpado en su lugar con una funda de gasa estabilizada por un hemostático.
    2. Para facilitar la extracción de la córnea con un borde de esclerótica de 2 mm de ancho, use un trepano de 18 mm de diámetro para marcar el globo.
    3. Para liberar la córnea con un borde acompañante de esclerótica, corte a lo largo del círculo marcado con tijeras accionadas por resorte con puntas curvas mientras estabiliza el globo con la gasa hemostática recortada.
    4. Levante la córnea de la esclerótica, exponiendo el iris y el cuerpo ciliar.
    5. Para facilitar la penetración del conservante en la cámara vítrea, haga una hendidura de 2 mm de largo en el iris perpendicular al margen pupilar. Colocar los ojos en frascos de muestras con 30 ml de conservante a 4 °C y transferirlos al laboratorio sobre hielo húmedo.
  8. Transmita electrónicamente la información del donante anónimo desde el banco de ojos a la base de datos del laboratorio de investigación.
    NOTA: La base de datos mantiene el número de referencia, el número de tejido del banco de ojos y el número de identificación del laboratorio para el seguimiento, además de otra información relevante.

4. Preparación del tejido para fotografía de fondo de ojo en color ex vivo

  1. Utilice dos microscopios estéreo, uno para la disección y otro para la fotografía de fondo de ojo en color.
    NOTA: Para que la transiluminación visualice los cambios pigmentarios, utilice una base para microscopía de campo oscuro.
  2. Retire los restos del segmento anterior (iris y cristalino). Para estabilizar el ojo durante la disección, colóquelo en la placa de Petri llena de cera (Material suplementario 1, diapositivas 7-8). Para evitar que el cuerpo ciliar y la retina unida colapsen en la cavidad vítrea, minimice la perturbación del anillo de vítreo grueso unido al cuerpo ciliar (base vítrea).
  3. Marque el poste superior para orientación. Coloque el globo con el lado anterior hacia abajo en el plato. Encuentra los tendones de inserción del recto superior y los músculos oblicuos superiores. Usando un aplicador de madera, aplique con moderación una tinta de marcado en una línea de 10 mm en dirección anterior a posterior (es decir, perpendicular a la inserción tendinosa del músculo recto superior).
  4. Antes de la fotografía, llene el fondo de ojo con el tampón de fosfato frío de Sorensen.
  5. Inserte una cuenta de rubí de 1 mm en el fondo de ojo como una barra de escala interna para que aparezca en cada imagen27.
  6. Adquiera imágenes en color con una cámara réflex de lente única montada en un microscopio estéreo equipado con un flash de anillo. Utilice iluminación trans, epi y flash en cada uno de los tres aumentos estándar para capturar imágenes destinadas a resaltar áreas específicas (Material Suplementario 1, diapositiva 11): 1) el fondo de ojo hasta el ecuador, 2) el polo posterior (arcadas vasculares, cabeza del nervio óptico, fóvea) y 3) la fóvea dentro de la mácula lútea (mancha amarilla).

5. Preparación para la fotografía de fondo de ojo en color ex vivo

  1. Encienda la cámara y el monitor. Conecte el obturador remoto y suelte el actuador en el monitor de la cámara/televisión (TV) de la interfaz multimedia de alta definición (HDMI) y en el cable de visualización.
  2. Ajuste la configuración de la cámara a la función ISO manual y la posición de bloqueo del espejo (bloqueada en su lugar para reducir la vibración).
    NOTA: Consulte el manual del usuario del fabricante para conocer los ajustes de la cámara utilizada. Aprenda de la pantalla de la cámara los ajustes de sobreexposición o subexposición relativos al histograma y las lecturas de exposición.
  3. Coloque dos fuentes de luz, cada una con dos guías de luz flexibles colocadas perpendiculares entre sí, para la iluminación en las cuatro direcciones cardinales en la etapa del microscopio (Material suplementario 1, página 10).
  4. Encienda las fuentes de luz de epiiluminación a plena potencia.
    NOTA: Es útil pero no necesario tener un sudario de fieltro negro alrededor del escenario para limitar la dispersión de luz / flash para el fotógrafo.
  5. En el microscopio de disección, use fórceps para insertar el polo posterior en un crisol de cuarzo de 30 ml lleno de tampón. Permita que el tejido se hunda hasta el fondo. Inserte un aparato ortopédico, como una esponja de tejido, entre el ojo y la pared del crisol para evitar el movimiento. Inserte la cuenta de rubí de 1 mm en el polo posterior.
    NOTA: La cuenta puede caer en la copa del nervio óptico.
  6. Coloque cuidadosamente el globo en el crisol sobre la platina del microscopio estereoscópico y observe el fondo ocular interior a través de los oculares del microscopio. Usando el aumento más bajo, oriente el ojo identificando la marca de tejido en la posición de las 12 en punto, la cabeza del nervio óptico (ONH) y la fóvea 5 ° por debajo de la ONH. Gire el ojo para que la fóvea caiga por debajo de una línea a través de la ONH en 5°.
    NOTA: Si se trata de un ojo derecho, la ONH está a la derecha de la fóvea, como se ve a través de los oculares del microscopio. Si es un ojo izquierdo, la ONH está a la izquierda de la fóvea.
  7. Encienda la visualización del monitor remoto desde la cámara. Asegúrese de que el control deslizante del divisor de haz del microscopio esté configurado para observar a través del puerto de fotos y no a través del puerto para los oculares. Dependiendo de la trayectoria de la luz y el espejo, prepárese para girar el tejido 180° en el escenario para una orientación adecuada.

6. Adquisición de imágenes mediante fotografía de fondo de ojo en color ex vivo

  1. Con la epiiluminación encendida, ajuste el aumento de modo que toda la incisión trefina de 18 mm ocupe todo el campo de visión. Aumente el aumento para que sea posible enfocar el fondo del hoyo foveal. Reduzca la ampliación a la configuración anterior.
  2. Ajuste la configuración ISO en el rango de 1,600-3,000 para que los tiempos de exposición caigan en el rango central del medidor en la cámara.
  3. Pulse el disparador del obturador remoto. Escuche que el espejo se bloquee en la posición hacia arriba. Presione el gatillo nuevamente para la exposición.
  4. Observe la imagen en el monitor, con los metadatos preestablecidos que muestran rojo, verde, azul (RGB) y un histograma de color para la exposición correcta. Si la exposición es aceptable, proceda; Si no es así, elimine, vuelva a evaluar los parámetros y vuelva a crear una imagen.
  5. Apague las luces de cuello de cisne para la epiiluminación para resaltar las drusas, y encienda el flash, con una exposición de 1/4 s, una velocidad de obturación de la cámara de 1/250 s y un ISO de 100-320. Ajuste la velocidad del flash a la predeterminada o modifíquela durante la configuración inicial de la cámara. Adquiera una imagen y verifique el histograma para la exposición adecuada.
  6. Apague el flash y encienda la fuente de luz de transiluminación. Restablezca el ISO por encima de 5.000 y asegúrese de que el tiempo de exposición no baje de 1/30 s debido a la posible vibración en el sistema fotográfico. Adquiera una imagen y verifique el histograma para la exposición adecuada.
  7. Aumente el aumento para ver tanto la ONH como la fóvea en el campo de visión. Encienda las lámparas de epiiluminación. Establezca el rango ISO en 1.600-3.000. Asegúrese de que los tiempos de exposición caigan en el rango central de la cámara.
  8. Apague las luces de epiiluminación y encienda el flash, con una exposición de 1/4 s, la velocidad de obturación de la cámara preestablecida en 1/250 s y el ISO ajustado en 400-800. Adquiera una imagen y verifique el histograma para la exposición adecuada.
  9. Apague el flash y encienda la transiluminación utilizando la base de campo oscuro. Restablezca el ISO por encima de 5.000. Asegúrese de que el tiempo de exposición no sea inferior a 1/30 s debido a la vibración potencial en el sistema fotográfico. Adquiera una imagen y verifique un histograma adecuado.
  10. Apague la transiluminación y vuelva a encender las lámparas de epiiluminación.
  11. Aumente el aumento al utilizado en el paso 6.7. Vuelva a enfocarse si es necesario.
  12. Aumente el ISO dentro del rango de 3,000-6,000 y ajuste el tiempo de exposición para que caiga dentro del rango de exposición adecuado de la cámara. Adquirir una imagen.
    NOTA: Es posible que la cuenta de rubí ya no aparezca en el campo de visión. Si es así, capture imágenes separadas de la cuenta en este aumento como referencia.
  13. Apague las lámparas de epiiluminación. Encienda el flash con una exposición de 1/4 s y con la velocidad de obturación de la cámara a 1/250 s. Ajuste la velocidad del flash a la predeterminada, o cámbiela durante la configuración inicial de la cámara, y establezca el ISO en 500-1,000. Adquiere la imagen. Compruebe el histograma para la exposición adecuada.
  14. Apague el flash y encienda las luces de transiluminación. Restablezca el ISO por encima de 8.000 para permitir un tiempo de exposición más rápido con un sensor de imagen más sensible. Asegúrese de que el tiempo de exposición no sea inferior a 1/30 s debido a la vibración potencial en el sistema fotográfico. Adquirir una imagen.
  15. Exporte las imágenes de la cámara a un ordenador. Revise las imágenes antes de retirar la muestra de la etapa de microscopio en caso de que sea necesario capturar algunas nuevamente.

7. Descripción general de la adquisición de imágenes para OCT ex vivo y oftalmoscopia láser de barrido (SLO)

  1. Para OCT de dominio espectral, coloque los globos en tampón fosfato en un soporte ocular personalizado con una cámara con una lente de 60 dioptrías35. Monte el soporte del ojo en un soporte en un dispositivo de imágenes de OCT clínica y colóquelo donde el paciente apoyaría su frente. El dispositivo OCT inserta automáticamente una barra de escala en cada imagen.
  2. Al mismo tiempo, utilizando el mismo dispositivo y con el ojo todavía en el soporte, obtenga una imagen de los globos con un oftalmoscopio láser de barrido (SLO) utilizando reflectancia infrarroja cercana (NIR, utilizada como imagen localizadora por el software permanente), autofluorescencia del fondo de ojo de excitación (FAF) de 488 nm y reflectancia libre de rojo (RF).
    NOTA: El FAF de excitación de 787 nm en este dispositivo solo es adecuado ocasionalmente porque un divisor de haz reduce la transmitancia de luz al SLO. Por esta razón, se utiliza un segundo dispositivo para imágenes FAF de 787 nm (ver siguiente punto).
  3. Por separado, pero con el ojo todavía en el soporte del ojo, tome una imagen de los globos con FAF de 787 nm para detectar la perturbación del EPR36 utilizando un dispositivo separado que muestre bien esta modalidad.

8. Protocolo de adquisición de imágenes para OCT/SLO ex vivo (ver diapositivas en Material complementario 2)

  1. Indique el músculo recto superior con tinte de marcado tisular. Encienda el láser (flecha azul, Material suplementario 2, página 1).
  2. Haciendo referencia a la página 2 del material complementario 2, coloque el cabezal OCT moviendo toda la unidad en dos ejes con respecto a la base (flecha verde) y luego elevando la altura (y) girando el joystick en el sentido de las agujas del reloj/antihorario (cw/ccw, flechas azules). Enfoque la imagen girando la perilla (flecha naranja), con la palanca negra en la posición R (*). Bloquee la unidad asegurando el tornillo del pulgar (flecha púrpura).
  3. Inserte el ojo en el soporte y estabilícelo desde la cara posterior con espaciadores (Material suplementario 1, página 13). Ejerza la menor presión posible para evitar abollar la esclerótica. Oriente con la marca de tejido para el músculo recto superior hacia arriba.
    NOTA: La distancia aproximada desde la parte frontal del portaojos hasta el dispositivo OCT es de 25 mm.
  4. Abra el software de visualización y análisis patentado para el dispositivo OCT. Aparecerá una lista de pacientes en la columna izquierda. Los donantes de ojos indexados por un número de código interno son los "pacientes". Consulte el manual del usuario del fabricante.
  5. Seleccione el icono Nuevo paciente . Complete la información de datos del paciente según sea necesario. Seleccione Aceptar. Utilice un sistema de numeración ordenado lógicamente para ojos individuales, como AAAAYNNNL,R_agesex. Por ejemplo, esto podría ser 2017016R_97F.
  6. Después de continuar con la entrada de datos en la siguiente ventana, presione OK. Seleccione el operador y estudie en el menú desplegable.
    NOTA: La información introducida aparecerá en los metadatos exportables.
  7. Después de ver una pantalla en blanco, toque el botón amarillo para iniciar la adquisición de la imagen.
  8. Presione IR + OCT (reflectancia infrarroja cercana + OCT). Permita que el láser adquiera una imagen SLO en vivo del fondo de ojo y OCT B-scan.
    1. Finalice la posición anatómica correcta en función de la ONH y la fóvea, y utilice un aplicador de madera para ajustar la posición de los ojos en el soporte. En el panel de control, gire el botón redondo negro para ajustar la intensidad.
    2. Presione el mismo botón para promediar 9-100 cuadros (flechas rojas; 9 es suficiente, 100 se ve cremoso). Si la unidad está orientada correctamente, el fondo de ojo debe estar enfocado y el escaneo B de OCT debe aparecer en el tercio superior de la pantalla (Material complementario 2, página 9, flecha roja doble).
    3. En la imagen del fondo de ojo, use el cursor para mover la línea azul para centrar la fóvea (Material complementario 2, página 9, flecha blanca). Presione Adquirir.
      NOTA: Otros botones predeterminados son Retina, EDI (desactivado) y Escaneo de línea.
  9. Presione RF + OCT para la próxima adquisición. Vuelva a comprobar la posición para asegurarse de que la imagen no se ha movido o degradado. Presione el botón negro para promediar. Presione Adquirir.
  10. Cambie el cubo interno para obtener imágenes de autofluorescencia a las longitudes de onda de excitación de 488 nm y 787 nm (Material complementario 2, página 10).
    NOTA: Se muestra la posición del cubo después del interruptor.
  11. Seleccione Modo de autofluorescencia . Vuelva a comprobar la alineación. Presione Adquirir.
  12. Para casos sospechosos de alteración y atrofia del EPR, seleccione ICGA (angiografía verde de indocianina) para autofluorescencia de 787 nm. Vuelva a comprobar la posición de los ojos y, a continuación, presione Adquirir.
    NOTA: Una imagen de fondo de ojo a menudo no aparece en esta modalidad porque el cubo interno atenúa el haz.
  13. Vuelva a cambiar el cubo interno a R para IR e imágenes sin rojo para la adquisición de volumen.
    NOTA: La posición del cubo después del interruptor se muestra en la página 13 del Material complementario 2.
  14. Para adquirir los volúmenes de OCT, seleccione IR y la configuración del volumen. Haga coincidir todos los ajustes de la página 14 del Material complementario 2 alternando los botones apropiados en el módulo de control (cubo de mácula de 30°, espaciado de 30 μm, promedio según los requisitos experimentales).
  15. Observe que la vista del fondo de ojo de reflectancia del infrarrojo cercano está cubierta de líneas azules de escaneo B. Vuelva a comprobar la posición de la OCT en el tercio superior de la ventana derecha. Presione Adquirir en el módulo de control y espere 5 minutos para que se complete el escaneo de volumen. Cuando se complete la adquisición de imágenes, seleccione SALIR. Las imágenes se guardarán (flecha roja).
    NOTA: Las líneas azules delimitan las distancias mostradas en la vista anterior en micrómetros. Los escaneos comienzan a numerarse desde la parte inferior (inferior) y continúan hacia arriba. Tenga en cuenta la progresión de la línea roja.
  16. Permita que la computadora procese las imágenes adquiridas, que aparecerán en la pantalla (Material complementario 2, página 16).
  17. Cuando obtenga imágenes de los ojos de un donante, no cambie la posición del soporte de montaje entre los ojos. Si primero se toma una imagen del ojo izquierdo, los resultados se mostrarán en la columna OD (ojo derecho). Haga clic con el botón secundario para seleccionar todas las imágenes y, a continuación, seleccione Exchange OS/OD. Las imágenes cambiarán a la columna del sistema operativo.
  18. Pulse Seleccionar ventana > > base de datos. La pantalla predeterminada es el panel 6 con la adición del ojo donante fotografiado en la columna derecha (Material complementario 2, página 18). Haga clic derecho en el paciente en el menú desplegable, elija Lote y exporte el archivo E2E.
  19. Vaya a la carpeta predeterminada creada en el escritorio para las transferencias de archivos. Seleccione Aceptar. La carpeta contiene los archivos E2E que se copiarán en un disco duro externo y se archivarán.
  20. Lleve el ojo en su soporte al oftalmoscopio láser de escaneo, que se utiliza principalmente para la autofluorescencia de 787 nm.
    NOTA: consulte la guía del usuario del fabricante para la adquisición y el archivo de las imágenes.
  21. Encienda la computadora y el láser.
  22. Seleccione el icono Nuevo paciente . Complete los datos del paciente según sea necesario.
  23. Para mantener la misma hoja de datos del ojo, pulse OK. Como la curva C permanece igual, pulse Continuar.
  24. Seleccione Modo de estudio e introduzca la contraseña si es necesario. Mantenga la curva C en 7,7 mm. Pulse Aceptar.
  25. Seleccione Continuar para verificar la curva C. Seleccione el indicador amarillo para iniciar la cámara.
  26. Seleccione la posición R . Alinear y orientar el globo. Seleccione el modo IR para enfocar y orientar como se indica arriba.
  27. Oriente el cabezal de la cámara moviendo toda la unidad en dos ejes con respecto a la base (Material suplementario 2, página 28, flecha verde) y luego elevando la altura (y) de la unidad (flechas azules). Enfoca la imagen girando la perilla (flecha naranja). La palanca negra está en la posición R (*). Después de que este cabezal esté en posición, bloquee la unidad girando el tornillo del pulgar (flecha púrpura).
  28. Obsérvese que la pantalla aparece como se muestra en la página 29 del Material complementario 2.
  29. Mueva la perilla selectora de R a A. Seleccione ICGA (para lograr una autofluorescencia de 787 nm) en azul, intensidad del 100%, un campo de visión de 30° e imágenes monofásicas.
    NOTA: Al igual que el colorante verde indocianina, la melanina es excitada por la luz de longitud de onda de 787 nm.
  30. Obsérvese que la pantalla aparece como se muestra en la página 31 del Material Suplementario 2. Presione el disco negro para promediar y, a continuación, seleccione Adquirir.
  31. Elija Windows > Database. Seleccione Importar archivos E2E desde el dispositivo SLO; Estos archivos se almacenan en un disco duro externo y se cargan en el escritorio.
  32. Seleccione Abrir. Compruebe que las marcas son las predeterminadas y seleccione Aceptar.
  33. Tenga en cuenta que el paciente ahora tiene dos pestañas: una que muestra las imágenes adquiridas del SLO (flecha azul) y la otra pestaña que muestra las imágenes adquiridas del dispositivo OCT (flecha roja) (Material complementario 2, página 34).
  34. Haga clic con el botón derecho en la imagen de 786 nm (ICGA) y exporte la imagen a un archivo etiquetado como SLO 786 en el escritorio.
  35. Para guardar la imagen SLO de autofluorescencia de 786 nm, seleccione el paciente y haga clic con el botón derecho para exportar imágenes como archivos RAW (para archivos .vol) a una carpeta del escritorio.
  36. Para exportar imágenes desde el dispositivo OCT para transferirlas al equipo de archivo, copie y pegue desde RAWEXPORT a una carpeta etiquetada como RAW.

9. Revisión de imágenes

  1. Reúna las imágenes (color, archivo .vol, imágenes SLO) en carpetas para cada donante con subcarpetas para cada ojo e indexe las carpetas consecutivamente por ID de laboratorio.
  2. Registre las impresiones de tejido (calidad, patología) en una base de datos para un informe estandarizado.
  3. Revise los volúmenes de OCT exportados con un complemento interno de ImageJ.
    1. Encuentra el centro de fóvea, que se puede reconocer por el centro de la inmersión foveal, el aumento hacia adentro de las bandas retinianas externas o el punto más delgado. En la mayoría de los casos, estos coincidirán, pero no siempre, ya que esto depende de la preservación foveal, la variabilidad individual y la presencia de patología.
    2. Encuentre una exploración estándar en la perifóvea superior (2 mm/67 exploraciones B de distancia en la dirección superior; es decir, aumentando el número de exploraciones).
    3. Guarde una pila .tif de todo el volumen para una referencia rápida en el futuro.
    4. Desplácese por el volumen de OCT en su totalidad, comenzando desde el escaneo 1 (inferior), mientras registra los números de escaneo en los que se reconocen las características.
    5. Revise el área peripapilar además de la mácula.
      NOTA: La atrofia coriorretiniana peripapilar en ojos más viejos incluye un depósito laminar basal distintivo y neovascularización. Esta es un área común de cambio pigmentario en los ojos miopes y el glaucoma, así como en el envejecimiento y la DMAE37.
  4. Inspeccione las fotografías en color y vincule cualquier hallazgo con los vistos por OCT si es posible.
    NOTA: En general, es más fácil ver primero la mayoría de los hallazgos de la OCT. Las fotografías en color proporcionan una gran vista del área fuera del área en el SLO, la pigmentación coroidea que incluye nevos, la presencia de hemo y exudados duros, y el pigmento negro en la DMAE neovascular. El pigmento oscuro en la fóvea puede representar melanosomas sueltos del segmento anterior y debe lavarse suavemente con tampón usando una pipeta.
  5. Inspeccione las imágenes de SLO y vincule cualquier hallazgo con los vistos por OCT si es posible.
  6. Guarde las exploraciones B estándar en la fóvea y la perifóvea, las exploraciones B adicionales con patología notable u otras características, y las imágenes SLO en un informe de patología.
  7. Clasifique los ojos de la siguiente manera: No notable, Cuestionable, DMAE temprana-intermedia, DMAE atrófica, DMAE neovascular, Otro, Desconocido, No graduable, No registrado. "Cuestionable" se usa si no está claro si los cambios son lo suficientemente graves como para otra categorización. "No graduable" se reserva para los ojos que carecen de exploraciones OCT útiles, como aquellos con retinas severamente desprendidas. "No grabado" está reservado para los ojos que se procesan inmediatamente después de recibirlos sin fotografía.
  8. Utilice estos criterios para la DMAE: cambio grave del EPR con depósitos drusos o drusas subretinianas, con o sin signos de neovascularización, como líquido o fibrosis, y sin evidencia de otras causas (actualizado de Curcio et al.10 para acomodar SDD).
    NOTA: El diagnóstico final se confirma mediante análisis histológico.

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Representative Results

La Tabla 1 muestra que durante 2016-2017, se recuperaron 184 ojos de 94 donantes blancos no diabéticos >80 años de edad. El tiempo medio de muerte a la preservación fue de 3,9 h (rango: 2,0-6,4 h). De los 184 ojos revisados, 75 (40,2%) tenían cierta DMAE. Se identificaron las siguientes categorías: No notable (39,7%), Cuestionable (11,4%), DMAE intermedia temprana (22,8%), atrófica (7,6%), Neovascular (9,8%), Otros (8,7%) y Desconocido/No registrado/No clasificable (<1%). La Figura 2, la Figura 3, la Figura 4 y la Figura 5 muestran imágenes ex vivo multiescala y multimodal de ojos excepcionalmente bien conservados de esta serie. Los ojos fueron revisados en colaboración con un oftalmólogo especializado en enfermedades de la retina (J.A.K.). Mientras que algunos ojos mostraron características individuales mejor que otros, estos casos fueron elegidos para la alta calidad general.

Como se describe38, la fotografía en color ex vivo difiere de la fotografía in vivo correspondiente. El edema y/o desprendimiento de retina puede reducir la visibilidad de los tejidos pigmentados posteriores. Las observaciones a nuevos ojos indican que estos cambios ocurren postmortem y no empeoran notablemente con una fijación rápida. Además, los vasos coroideos se vacían después de la muerte. Debido a un fondo ondulado de vasos pálidos y tejido intersticial oscuro, la evaluación de las variaciones pigmentarias en el plano del EPR debe ser asistida por modalidades distintas del color. En la OCT ex vivo , hay más información disponible que en la fotografía en color. Ex vivo La OCT también difiere significativamente de la OCT in vivo . Las principales diferencias incluyen el aumento general de la reflectividad del tejido, especialmente en la retina interna, la reflectividad consistente de algunas bandas (capa de fibra nerviosa, capa plexiforme interna y externa, EPR), la menor visibilidad de los detalles coroideos, especialmente debajo de la retina edematosa, y la visibilidad de desprendimientos de capas de tejido (ver más abajo). Las bandas hiperreflectantes retinianas externas, que involucran fotorreceptores y el EPR (zona elipsoide, EZ; zona de interdigitación, IZ), son inconsistentemente visibles ex vivo y no se utilizan como puntos de referencia en este contexto. El consenso clínico para la OCT de dominio espectral utiliza el término banda de membrana de RPE-Bruch (BrM). Sin embargo, se prefiere el término RPE-lámina basal (BL)-BrM porque se adapta a la aparición de depósitos laminares basales en la DMAE24.

La Figura 2 muestra una mácula poco notable y vasos coroides grandes hiporreflectantes, con una banda reflectante RPE-BL-BrM entre los dos. Un vaso grande en la retina interna proyecta una sombra sobre las capas posteriores. La IPL y la OPL son moderadamente reflectantes. En el NIR SLO, tanto la vasculatura retiniana como la coroides son visibles. El SLO de reflectancia libre de rojo funciona mejor para las características de la retina interna y las interfaces vitreorretinianas como las fibras arqueadas y el haz papilomacular de la NFL. En ojos normales, el SLO de autofluorescencia de 488 nm muestra un área de señal reducida general en la mácula central debido al engrosamiento de la parafóvea y, en algunos casos, la absorción por el pigmento amarillo xantofila, así como la hiperautofluorescencia que recubre los grandes vasos retinianos, lo que sugiere vainas de tejido conectivo. La autofluorescencia a 787 nm muestra una pequeña región de aumento de la señal en la mácula central del EPR, una señal en el estroma coroideo y rayas hipoautofluorescentes correspondientes a los vasos coroideos.

La figura 3 muestra una mácula con DMAE intermedia temprana. Las características visibles incluyen una drusa suave (elevación del EPR en forma de cúpula cerca de la fóvea), SDD (reflectividad intermitente con una apariencia dentada interna a la banda ERE-BL-BRM), focos hiperrreflectantes (HRF, material reflectante con la misma reflectividad que el EPR en la capa, ubicado en la retina) y cambio viteliforme (una expansión hacia adentro de los orgánulos del EPR, tanto intracelular como extracelular, en conjunción con depósitos laminares basales39). La fotografía en color muestra una fuerte pigmentación correspondiente a la lesión viteliforme, rodeada de pigmentación reducida. Ni las drusas ni las SDD son claramente visibles por color. La reflectancia NIR muestra la reflectividad en la fóvea. La autofluorescencia a 488 nm de excitación muestra una señal moteada en la fóvea. Las SDD aparecen ocasionalmente en las modalidades SLO; esto es más probable si las SDD son abundantes, y las SDD se ven más fácilmente como un patrón punteado regularmente espaciado (ver Spaide y Curcio19, Figura 6). El patrón superior y temporal a la fóvea de la Figura 3I no es SDD, porque es irregular y localizado en un plano focal superficial. Todas las modalidades en cara muestran pliegues finos que irradian desde la fóvea. En ojos menos bien conservados, pliegues similares pueden ser lo suficientemente grandes como para ser visibles con los aumentos de visualización más bajos.

La figura 4 muestra una mácula con DMAE atrófica. La fotografía de fondo de ojo en color muestra áreas atróficas circulares, hiperpigmentación central y pequeños puntos hiperpigmentados en la parafóvea que corresponden en la OCT a HRF a nivel de capa de fibra de Henle-capa nuclear externa (HFL-ONL). Además, en la OCT, una elevación plana baja del EPR puede representar un depósito laminar basal, neovascularización tipo 1 no exudativa o ambas. La atrofia en la gammagrafía B foveal es reconocible por el hundimiento del HFL-ONL, un área de hipertransmisión (luz que brilla a través de la coroides), un cambio viteliforme con un aumento de la sombra en el centro foveal y HRF que proyecta sombras. En este ojo, la reflectancia NIR muestra puntos hiperrreflectantes en la fóvea. La autofluorescencia a 787 nm muestra efectivamente una señal correspondiente a la hiperpigmentación foveal y la ausencia de una señal en las áreas atróficas circulares. La autofluorescencia libre de rojo y 488 nm muestra las características internas de la retina.

La figura 5 muestra una mácula con atrofia macular secundaria a DMAE neovascular. La fotografía del fondo de ojo en color muestra pigmentación negra dentro del área atrófica. La OCT muestra atrofia por la flacidez (hundimiento) de HFL-ONL y aumento de la hipertransmisión. La gammagrafía B foveal muestra un montículo de material hiperreflectante subfoveal y quistes intrarretinianos. La reflectancia del infrarrojo cercano muestra reflectividad en el área atrófica debido a la pérdida de EPR y vasos coroideos. Un área pequeña e intensamente reflectante en la fóvea no es visible en el color. La reflectancia libre de rojo muestra vasos retinianos y, dentro de una zona anular, vasos coroideos. La autofluorescencia (488 nm) muestra claramente un borde atrófico aproximadamente circular e islas de atrofia incipiente. Un área central desprovista de señal está rodeada por un anillo de señal moderada y vasos coroideos visibles.

La Figura 6 muestra artefactos comunes en imágenes de OCT ex vivo. El edema puede ser prominente en la retina interna, creando protuberancias y pliegues a través de la fóvea (Figura 6A, I). El daño mecánico puede ocurrir con la tracción sobre el vítreo o por contacto directo de la retina con las herramientas de disección, lo que resulta en la dislocación del material y, a veces, la pérdida de ese material (Figura 6F, G). Los desprendimientos pueden ocurrir a lo largo de múltiples planos de tejido y pueden representar fuerzas de tracción relativas entre las capas que también ocurren in vivo. Cualquier desprendimiento puede ampliarse aún más en el procesamiento posterior. El desprendimiento más común es retiniano (es decir, entre los segmentos externos de los fotorreceptores y los procesos apicales del EPR) (Figura 6B-D, F-I). Los procesos apicales pueden desprenderse de los segmentos externos o permanecer con los cuerpos celulares del EPR, según lo determinado por la histología. Los desprendimientos de retina pueden ser grandes y ondulantes (Figura 6B, D, I) o estrechos y apenas discernibles (Figura 6C, F, G). El desprendimiento de la capa bacilar (BALAD40) se observó por primera vez en el laboratorio y luego se encontró en la OCT clínica. BALAD se atribuye a una división a través de la porción mioide de los segmentos internos de los fotorreceptores, que deja la porción elipsoide del segmento interno y el segmento externo unido al EPR (Figura 6A, D, I). BALAD no debe confundirse con SDD en PTU ex vivo. Un tercer plano de desprendimiento es la membrana limitante interna (ILM), y a menudo hay líquido reflectante residual entre la ILM y las capas retinianas restantes (Figura 6A, B, I). El desprendimiento menos común es entre la coroides y la esclerótica (Figura 6C). La fóvea a menudo exhibe espacios cistoides que no deben considerarse patológicos sin evidencia de apoyo, como signos de neovascularización (Figura 6H). En las exploraciones B individuales, las ondulaciones del EPR pueden dar la impresión de drusas. La vista 3D de un volumen OCT aclara que estos viajan a lo largo de los vasos coroideos (Figura 6E, J). Las ondulaciones pueden deberse a cambios de volumen diferenciales entre los vasos y estroma intermedio después de la muerte y durante la fijación.

Para calibrar las expectativas de calidad y explorar las limitaciones de la OCT ex vivo, la Figura 7 compara las imágenes in vivo, las imágenes ex vivo y la histología de tres ojos clínicamente documentados con la DMAE. Estos tres ojos se conservaron de manera diferente a los de la Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5. Para confirmar las fuentes estructurales de reflectividad de la OCT, que son subcelulares41, los ojos de la Figura 7 se conservaron en glutaraldehído al 2,5% y glutaraldehído al 1% para permitir la histología de resina epoxi de alta resolución y la microscopía electrónica correlativa. El glutaraldehído agrega opacidad a estos especímenes en relación con los de la Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5. El efecto de un DtoP más corto versus más largo es evidente (Figura 7A-F, 2.1 h vs. Figura 7G-I, 8.9 h). En el ojo con una DtoP más larga, el edema postmortem cambió el contorno de la retina y la ILM se desprendió. La patología de interés (tubulación retiniana externa) fue sutil en la imagen ex vivo. Se encontró porque la OCT in vivo rastreada por el ojo identificó la exploración B relevante, y los vasos coroideos pudieron coincidir. En los dos ojos con una DtoP más corta, algunas patologías importantes (neovascularización macular tipo 3) fueron inmediatamente evidentes (Figura 7A-C). Otros fueron encontrados con la ayuda del seguimiento ocular (Figura 7D-F).

Figure 1
Figura 1: Escisión corneal de un ojo de donante humano para la fijación por inmersión de la retina. Arriba a la izquierda, el ojo del donante extirpado se mantiene en su lugar mediante una vaina de gasa estabilizada por un hemostático; arriba a la derecha, un trefinano de 18 mm se utiliza para hacer una partitura circular que incluye la córnea y un borde de esclerótica de 2 mm de ancho; en el medio, el círculo marcado se termina con un corte con tijeras curvas con punta de resorte, mientras que el globo se estabiliza; abajo a la izquierda, la córnea y el borde escleral se levantan, exponiendo el iris (azul) y el cuerpo ciliar (marrón tostado); medio inferior, la córnea con el borde se levanta por completo; Abajo a la derecha, el iris se corta perpendicular al margen pupilar para facilitar la penetración del conservante en la cámara vítrea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes multimodales ex vivo de una mácula poco notable. Una mácula de una donante femenina de 82 años con un intervalo de muerte a preservación de 1,97 h. (A) El fondo del ojo derecho visto con el segmento anterior eliminado (epiiluminación). (B) Primer plano de la mácula (epi-iluminación). (C) Vista en primer plano de la fóvea (epi-iluminación). Las líneas verdes indican las ubicaciones de los escaneos B de OCT en los paneles D y E. (D,E) OCT B-exploraciones a través de la (D) perifóvea superior (E) y fóvea. La retina (R), la coroides (C) con vasos grandes hiporreflectantes y la banda hiperrreflectante RPE-BL-BrM son visibles. En este ojo excepcionalmente bien conservado, la IPL y OPL moderadamente reflectantes también son visibles. (D) Un vaso grande en la retina interna proyecta una sombra en las capas posteriores. (E) La separación entre la retina y el EPR en el panel E (punta de flecha amarilla) es artificial. (F) La reflectancia del infrarrojo cercano muestra el detalle de las vasculaturas retiniana y coroidea. (G) La reflectancia libre de rojo muestra las fibras arqueadas (flecha curva verde izquierda) y el haz papilomacular (flecha verde) de la capa de fibra nerviosa. (H) La autofluorescencia de longitud de onda de 488 nm muestra un área de señal reducida general en la mácula central debido a una parafovea edematosa engrosada, así como anillos y un punto de baja señal en el centro foveal e hiperautofluorescencia que recubre los grandes vasos retinianos, lo que sugiere vainas de tejido conectivo. (I) La autofluorescencia a 787 nm muestra una pequeña región de señal aumentada en la mácula central del EPR, una señal en el estroma coroideo y rayas hipoautofluorescentes correspondientes a los vasos coroideos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Imágenes multimodales ex vivo de un ojo donante con DMAE intermedia temprana. Ojo de donante de una donante femenina de 97 años con un intervalo de muerte a preservación de 3,1 h. (A) El fondo del ojo derecho visto con el segmento anterior eliminado (epiiluminación). (B) Primer plano de la mácula (epi-iluminación). Las líneas verdes indican las ubicaciones de los escaneos B de OCT en los paneles D, E y F. (C) Vista en primer plano de la fóvea que muestra hiperpigmentación (flecha, iluminación de flash). (D) Un SDD en la perifóvea superior (flechas naranjas) se observa en OCT. I Cambio viteliforme en el EPR bajo la fóvea (flechas blancas). (F) Inferior a la fóvea es una drusa suave con una línea hiporreflectante en la base (flecha amarilla) y un foco hiperrreflectante arriba (flecha azul claro). (G-I) Las imágenes del oftalmoscopio láser de barrido muestran pliegues estrellados muy finos en la fóvea (también se ve en C). (G) La reflectancia del infrarrojo cercano muestra un material de reflectividad en la fóvea correspondiente en parte al material viteliforme. (H) La reflectancia libre de rojo muestra la superficie de la retina. (I) La autofluorescencia de longitud de onda de 488 nm muestra un área de señal reducida general en la mácula central debido a una parafóvea ligeramente engrosada. Las SDD no son claramente visibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagen multimodal ex vivo de un EPR completo y atrofia retiniana en la degeneración macular asociada a la edad. Ojo donante de una mujer de 97 años con un intervalo de muerte a preservación de 2,33 h. (A) Fondo de ojo izquierdo visto con iluminación trans. (B) Primer plano de la mácula (epi-iluminación). Las líneas verdes indican las ubicaciones de los escaneos B de OCT en los paneles D y E. (C) Primer plano de la fóvea (epiiluminación) que muestra hiperpigmentación central (punta de flecha verde) y pequeños puntos hiperpigmentados (puntas de flecha amarillas). El punto central es de color marrón intenso porque la retina suprayacente es muy delgada. Los puntos aparecen desaturados porque la retina suprayacente es gruesa. Se indican áreas atróficas circulares (puntas de flecha blancas). (D,E) OCT B-exploraciones a través de la (D) perifóvea (E) y fóvea. La retina (R) y la coroides delgada (C) son visibles. (D) Los focos hiperrreflectantes (puntas de flecha amarillas) a nivel del HFL-ONL corresponden a los puntos hiperpigmentados en C. La baja elevación plana del EPR debajo de ellos puede representar un depósito laminar basal, neovascularización tipo 1 no exudativa, o ambos. (E) La gammagrafía B a través de la fóvea muestra atrofia reconocible por el hundimiento del HFL-ONL (punta de flecha roja), un área de hipertransmisión, un cambio viteliforme con mayor sombreado en el centro foveal (asterisco verde) y focos hiperrreflectantes (punta de flecha verde azulado) con sombreado. El espacio hiporreflectante entre la retina y la banda RPE puede representar líquido subretiniano. (F) La reflectancia del infrarrojo cercano muestra puntos hiperrreflectantes en la fóvea. (G) La imagen sin rojo muestra las fibras arqueadas de la NFL y las floraciones reflectantes en la superficie de la retina. (H) La autofluorescencia de 488 nm enfocada en la retina muestra una señal asociada con los vasos retinianos, ninguna señal asociada con el EPR y puntos autofluorescentes débiles en el área macular central. (I) La autofluorescencia de 787 nm muestra una señal correspondiente a la pigmentación en C. Las áreas atróficas circulares son evidentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imagen multimodal ex vivo de neovascularización tipo 1 y atrofia macular en la degeneración macular asociada a la edad. Un ojo donante de una donante femenina de 86 años con un intervalo de muerte a preservación de 3,5 h. (A) El fondo del ojo izquierdo visto con el segmento anterior eliminado (transiluminación). (B) Primer plano de la mácula que detalla bordes atróficos (puntas de flecha amarillas). Las líneas verdes indican las ubicaciones de los escaneos B de OCT en los paneles D y E. (C) El primer plano de la fóvea muestra pigmentación negra (puntas de flecha verdes) dentro del área atrófica. (D,E) OCT B-Explora a través de la (D) perifóvea (E) y fóvea. La retina I y la coroides delgada (C) son visibles. En este ojo excepcionalmente bien conservado, la IPL y OPL moderadamente reflectantes también son visibles. (D) La gammagrafía B perifoveal roza el borde superior del área atrófica. La atrofia se evidencia por la flacidez del HFL-ONL y el aumento de la hipertransmisión (puntas de flecha rojas). Se indican posibles depósitos drusenoideos subretinianos (puntas de flecha fucsia). (E) La gammagrafía B foveal muestra un montículo de material hiperrreflectante subfoveal y quistes intrarretinianos (asterisco). O = cabeza del nervio óptico. (F) La reflectancia del infrarrojo cercano muestra un área reflectante de atrofia y vasos coroideos (puntas de flecha verde azulado), incluida una pequeña área intensa en la mácula central (punta de flecha naranja) no visible por imágenes en color. (G) La reflectancia libre de rojo muestra vasos retinianos y, dentro de una zona anular, vasos coroideos. (H) La autofluorescencia de 488 nm representa un borde atrófico aproximadamente circular (puntas de flecha amarillas) e islas de atrofia incipiente. Un área central desprovista de autofluorescencia está rodeada por un anillo de autofluorescencia moderada y vasos coroideos visibles (puntas de flecha blancas). La autofluorescencia de 787 nm no fue posible en este ojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Artefactos comunes observados en las imágenes de OCT ex vivo de ojos de donantes. Estos ojos provienen de la serie de ojos 2016-2017. La mayoría de las retinas son hiperrreflectantes en relación con las retinas fotografiadas in vivo, y las capas internas de la retina son más reflectantes que las capas externas de la retina. El desprendimiento bacilar (puntas de flecha amarillas en los paneles A, D, G e I) se define como una división a nivel del segmento interno fotorreceptor mioide, que crea una cavidad intrarretiniana distintiva40. El desprendimiento de retina (puntas de flecha verdes en los paneles B, C, D, F, G e I) describe una separación de toda la retina neurosensorial del EPR subyacente42. Los desprendimientos de la membrana limitante interna (ILM) separan la ILM y la capa de fibra nerviosa (puntas de flecha rojas en los paneles A, B e I). Un desprendimiento coroideo (punta de flecha azul en el panel C) es una separación dentro de la coroides o entre la coroides y la esclerótica. Los daños mecánicos (flecha púrpura en los paneles F y G) pueden aparecer en cualquier nivel y con cualquier dimensión, como se aplica al material faltante (flecha verde en el panel G) y al material dislocado (flecha amarilla en el panel G). El edema retiniano (estrellas púrpuras en los paneles A e I) aparece como un engrosamiento del tejido retiniano con límites mal definidos entre las capas retinianas separadas. Un RPE ondulado (flechas azules en los paneles E y J) aparece como una capa de RPE ondulada y desigual. Las lesiones cistoides (cuadrado rojo en el panel H) se correlacionan con alteraciones hiporreflectantes en forma de cámara dentro del tejido retiniano, comúnmente en la fóvea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Visibilidad ex vivo de la patología observada in vivo dependiendo de la calidad de conservación. (Un-Yo) Paneles Un, By CPaneles D, Ey F, y paneles G, Hy Yo representan tres ojos clínicamente documentados de dos donantes, cada uno visto por seguimiento ocular in vivo (Un1-Un2,D1-D2,G1-G2) y ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2) imágenes, seguidas de histología (C,F,Yo). Las líneas verdes en la reflectancia del infrarrojo cercano (NIR, Un1,B1,D1,E1,G1,H1) representan los niveles de tomografía de coherencia óptica (OCT) B-scans e histología panorámica. Paneles Un, By C y paneles D, Ey F, presentan el ojo derecho e izquierdo, respectivamente, de una donante de unos 90 años. Paneles G, Hy Yo mostrar el ojo derecho de una segunda donante, también de unos 90 años. (Un-C) El tejido ocular bien conservado (DtoP: 2,1 h) permite una buena visibilidad de la patología principal. (Un) Una neovascularización macular intrarretiniana hiperrreflectante (MNV tipo 3, punta de flecha verde) está rodeada de líquido intrarretiniano 17 meses antes de la muerte (Un2). El complejo de membrana de RPE/Bruch está dividido por material hiporreflectante y aparece como un signo de "doble capa" (Un2). A la izquierda hay otro signo de doble capa con hipertransmisión de código de barras en la coroides (punta de flecha naranja). En ex vivo PTU (B2), el MNV de tipo 3 y la hipertransmisión de códigos de barras son claramente visibles y están delineados. La retina está separada artificialmente, como lo muestra la punta de flecha blanca. La histología panorámica muestra una lesión del VNM tipo 3 orientada verticalmente (punta de flecha verde, C1). Ver investigaciones anteriores43,44 para detalles del caso original. (D-F) Un tejido ocular bien conservado (DtoP: 2,1 h) puede dar lugar a una transparencia reducida pero suficiente para detectar patologías graves. Los PTU (D2) muestra una pila de focos hiperrreflectantes intrarretinianos (HRF, punta de flecha fucsia) en un ojo seguido de MNV exudativo tipo 3. No hay quistes intrarretinianos visibles a los 11 meses antes de la muerte. En ex vivo PTU (E2), la pila de HRF está comprimida verticalmente (punta de flecha fucsia) pero claramente delineada. Sobre la histología panorámica (F1), una torre de epitelio pigmentario retiniano (punta de flecha fucsia) se eleva hacia arriba desde una drusa blanda. (G-Yo) Un tejido ocular menos conservado (DtoP: 8,9 h) reduce la visibilidad de la patología mayor. La OCT indica una tubulación retiniana externa (TRO, punta de flecha amarilla) a los 48 meses antes de la muerte (G2). En el ex vivo OCT, la ORT aparece como una perturbación sutil, y esto habría sido difícil de discernir sin conocimiento previo (H2). La membrana limitante interna está separada artificialmente (punta de flecha blanca). El edema ha distorsionado el contorno retiniano. El análisis histológico muestra la luz de la TRO delimitada por la membrana limitante externa y los fotorreceptores que sobresalen en ella (Yo1). Ver investigaciones anteriores26,45 para detalles del caso original. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Números Porcentajes
Categoría diagnóstica Ojos Correctos Ojos izquierdos Total Ojos Correctos Ojos izquierdos Total
Unremarkable 39 34 73 41.50% 37.80% 39.70%
AMD cuestionable 10 11 21 10.60% 12.20% 11.40%
Primeros años de AMD 20 22 42 21.30% 24.40% 22.80%
DMAE atrófica 6 8 14 6.40% 8.90% 7.60%
DMAE neovascular 11 7 18 11.70% 7.80% 9.80%
Otro 7 8 15 7.40% 8.90% 8.20%
Desconocido 0 0 0 0.00% 0.00% 0.00%
No grabado 1 0 1 1.10% 0.00% 0.50%
Total 94 90 184 100.00% 100.00% 100.00%
Ciertos AMD 37 37 75 39.40% 41.10% 40.20%
Posible DMAE 47 48 95 50.00% 53.30% 51.60%
Los ojos fueron accedidos durante el período 6/17/16 - 9/14/17. Criterio: ≥ 80 años, blanco, no diabético, ≤6 h muerte hasta preservación. Objetivo: 184 ojos (180 ojos de 90 donantes, preservados; 4 ojos de 4 donantes, preservados) Tiempo de muerte hasta la preservación (media, máxima, mínima): 3.9 h, 6.4 h, 2.0 h

Tabla 1: Recuperación ocular del donante de 2016-2017.

Material complementario 1: Descripción general de la disección, fotografía de fondo de ojo en color e imágenes multimodales basadas en OCT. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Material complementario 2: Detalles de la imagen multimodal basada en OCT para ilustrar los pasos en las secciones 5-8. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Utilizando un enfoque de detección basado en la población durante un período de 16 meses en la era pre-COVID, fue posible adquirir 75 ojos de donantes con DMAE. Todos fueron recuperados con un DtoP corto y escalonados usando MMI anclado en OCT. El criterio de edad (>80 años) está fuera del rango de edad típico para las recuperaciones de tejidos destinadas a córneas trasplantables. A pesar de la edad avanzada, nuestros criterios dieron como resultado ojos en todas las etapas de la DMAE. Muchos fenotipos de EPR son comunes a todos los estadios de la DMAE, y algunos son exclusivos de la DMAE neovascular 3,46. La comparación directa de imágenes ex vivo e in vivo (Figura 7) confirmó que la DtoP corta es un factor crítico, junto con el manejo experto (Figura 1), para producir imágenes ex vivo de la retina externa suficientes para la clasificación diagnóstica de alto nivel, y algunas de estas muestras fueron adecuadas para correlaciones directas entre imágenes e histología 4,35, 47. No toda patología es visible ex vivo. Sin embargo, mucho más es visible cuando se utiliza OCT en comparación con los métodos basados en la fotografía en color10, especialmente aquellos que implican separar la retina del EPR / coroides27. Además, el seguimiento ocular de la OCT clínica dirige la atención a las características focales y, a veces, pequeñas (Figura 7).

Este sistema de preservación implica procedimientos típicos de bancos oculares y herramientas para la extracción de córnea, seguidos de la inmersión de un ojo abierto en un conservante proporcionado de antemano. De esta manera, el personal del banco de ojos puede recuperar tejidos de investigación de forma continua (24/7). Esta última característica es crítica, ya que los tejidos destinados a disecciones complejas inmediatas27,32 requieren personal durante todo el día, ya sea por parte de los investigadores, el banco de ojos o ambos. Otros estabilizadores que permitirían la recuperación del tejido a cualquier hora seguida de disecciones y extracciones especializadas durante las horas de trabajo, como el sistema tisular PAXgene y Hibernate-A, pueden ser útiles en el futuro si son compatibles con las imágenes de OCT.

Este enfoque produce retinas que permanecen en gran medida unidas al EPR y, por lo tanto, son capaces de generar datos traducibles a imágenes de OCT. La localización precisa es esencial porque la mácula es pequeña (<3% del área de la retina). Además, la progresión de la DMAE impulsada por depósitos se alinea con la topografía de los conos y bastones48, y los defectos visuales de inicio más temprano y más persistentes ocurren en un lugar específico (es decir, la parafóvea que contiene la varilla junto a la fóvea de todo el cono)49. Para la comparación con OCT, la inmunohistoquímica con colorantes colorimétricos es compatible con microscopía integral (por ejemplo, campo claro) para tener en cuenta todos los elementos tisulares, tanto marcados como no marcados4. Los ensayos moleculares no dirigidos basados en matrices de muestreo pueden aprovechar la alineación horizontal de fotorreceptores compartimentados verticalmente y el RPE para aumentar efectivamente la resolución. La espectrometría de masas de imágenes con pulsos láser ionizantes de 8 μm de diámetro y 10-15 μm de separación puede localizar docenas de lípidos en compartimentos subcelulares de las células externas de la retina50. La transcriptómica resuelta espacialmente utiliza un conjunto preestablecido de cebadores de transcripción inversa con código de barras en portaobjetos de vidrio, a los que se aplican secciones de tejido51. Esta tecnología se limita actualmente a la captura de 55 μm de diámetro y a una separación de 100 μm; Se anticipan mejoras en la resolución que harían que esta tecnología sea adecuada para la investigación de AMD.

Este protocolo tiene limitaciones. El criterio de recuperación omite los diagnósticos de diabetes (30% entre los beneficiarios de Medicare en Alabama)52 debido a la importancia de la coroides en ambas enfermedades. Esta exclusión reduce el grupo general de donantes y alarga el tiempo necesario para recolectar suficientes ojos para un estudio. Por razones históricas, los criterios de 2016-2017 omitieron a los donantes negros, que ahora representan el 14% de los donantes oculares en todo el estado, y los donantes negros ahora están incluidos en los proyectos prospectivos actuales. El registro de instrucciones anticipadas para las personas que desean ser donantes de ojos es extenso, pero aún no incluye un registro conveniente en las prácticas locales especializadas en retina que atienden a pacientes con DMAE; Este proyecto se encuentra actualmente en desarrollo. Durante una prueba de detección poblacional como esta, aparecerán ojos con afecciones que se superponen en fenotipo con DMAE y deben ser reconocidos en consulta con la literatura clínica en evolución y un oftalmólogo especializado en enfermedades de la retina. Por ejemplo, esta serie de ojos incluía nevos condrusas 53 y una línea de alteración del EPR sobre un paquivaso (un vaso grueso en la coroides interna)54. Finalmente, la DMAE temprana e intermedia se combinaron debido a la falta de un sistema de clasificación basado en OCT para la DMAE, que está siendo desarrollado por el grupo55 de la Reunión de Clasificación de la Atrofia. Sin embargo, la optimización de la recuperación de tejidos y la caracterización basada en OCT permite que la investigación de AMD se centre en aprovechar el elemento de tiempo del MMI anclado a OCT con seguimiento ocular para planificar, potenciar, programar y presupuestar en las solicitudes de financiación.

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Disclosures

C.A.C. recibe apoyo de investigación de Heidelberg Engineering y asesora a Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience y Osanni. T.A. recibe apoyo de investigación de Novartis y asesora a Roche, Novartis, Bayer, Nidek y Apellis. K.B.F. es consultor de Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer y Novartis.

Acknowledgments

Agradecemos a Heidelberg Engineering por la instrumentación y el diseño del soporte del ojo original, a Richard F. Spaide MD por la introducción a las imágenes multimodales basadas en OCT, a Christopher Girkin MD por facilitar el acceso a los dispositivos de imágenes clínicas y a David Fisher por la Figura 1. La recuperación de los ojos de donantes humanos para la investigación fue apoyada por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) y U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), la EyeSight Foundation of Alabama, la International Retinal Research Foundation (C.A.C.), la Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) y Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers, 250 mL Fisher # 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex  Fisher # 10-462-719 storage for preservative
Bunsen burner or heat source Eisco # 17-12-818 To melt wax
Camera, digital Nikon D7200 D7200
Computer and storage Apple iMac Pro; 14 TB external hard drive Image storage
Container, insulated Fisher # 02-591-45 For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL Fisher Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86 For preservative
Crucible, quartz 30 mL Fisher # 08-072D Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL Fisher # 08-549G
Disinfectant cleaning supplies   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket contact J. Messinger jeffreymessinger@uabmc.edu custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks Fisher # 19-910-667
Forceps, Harmon Fix Roboz  # RS-8247
Forceps, Micro Adson Roboz  # RS-5232
Forceps, Tissue Roboz # RS-5172
Glass petri dish, Kimax Fisher # 23064
Gloves Diamond Grip Fisher # MF-300
Gowns GenPro Fisher # 19-166-116
Image editing software Adobe Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes Fisher # 06-666
Lamps, 3 goosenecks Schott Imaging # A20800
Microscope, stereo Nikon SMZ 1000 for dissection
Microscope, stereo Olympus  SZX9 color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%  EMS # 15713-S for preservative; dilute for storage
pH meter Fisher  # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2  EMS # 11600-10
Ring flash B & H Photo Video Sigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameter Meller Optics # MRB10MD
Safety Glasses 3M Fisher # 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope Heidelberg Engineering HRA2
Scissors, curved spring Roboz # RS-5681
Sharps container Fisher # 1482763
Shutter cord, remote Nikon MC-DC2
Spectral Domain OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA&OCT https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter McMaster-Carr # 9529K31
Tissue marking dye, black Cancer Diagnostics Inc # 0727-1
Tissue slicer blades Thomas Scientific # 6767C18
Trephine, 18-mm diameter Stratis Healthcare # 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera B&H Photo Video BH # COHD18G6PROB for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental EMS  # 72670
Wooden applicators Puritan # 807-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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