Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido
Summary
Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.
Abstract
O estudo in vitro da diferenciação de adipócitos brancos, marrons e beges permite a investigação das funções autônomas celulares dos adipócitos e seus mecanismos. Linhagens celulares de pré-adipócitos brancos imortalizadas são publicamente disponíveis e amplamente utilizadas. No entanto, a emergência de adipócitos beges no tecido adiposo branco em resposta a pistas externas é difícil de recapitular em toda a extensão usando linhagens de células de adipócitos brancos disponíveis publicamente. O isolamento da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino é comumente realizado para obtenção de pré-adipócitos primários e diferenciação de adipócitos. No entanto, a picagem e digestão manual do tecido adiposo pela colagenase pode resultar em variação experimental e é propensa à contaminação. Apresentamos um protocolo semi-automatizado modificado que utiliza um dissociador tecidual para digestão da colagenase para facilitar o isolamento da FVS, com o objetivo de reduzir a variação experimental, reduzir a contaminação e aumentar a reprodutibilidade. Os pré-adipócitos e adipócitos diferenciados obtidos podem ser utilizados para análises funcionais e mecanísticas.
Introduction
A biologia do tecido adiposo tem atraído cada vez mais atenção devido à crescente prevalência de obesidade e diabetes tipo 2 em todo omundo1. Os adipócitos armazenam energia em excesso na forma de gotículas lipídicas, que são liberadas após a fome. Além disso, o tecido adiposo mantém a homeostase energética sistêmica por servir como órgão endócrino e se comunicar com outros tecidos 2,3. Curiosamente, tanto o excesso de tecido adiposo (obesidade) quanto a perda adiposa (lipodistrofia) estão ligados à resistência à insulina e ao diabetes1. Os adipócitos são divididos em três tipos: branco, marrom e bege1. Os adipócitos brancos armazenam principalmente o excesso de energia na forma de lipídios, enquanto os adipócitos marrom e bege dissipam energia na forma de calor via proteína desacopladora mitocondrial-1 (Ucp1)1,4. Notavelmente, adipócitos beges (também chamados de adipócitos marrons “induzíveis”) aparecem no tecido adiposo branco em resposta à estimulação fria ou simpática e exibem padrões de expressão gênica que se sobrepõem, mas são distintos daqueles adipócitos marrons “clássicos”5. Recentemente, adipócitos marrons e beges têm sido antecipados como alvos potenciais de tratamentos antiobesidade e antidiabetes que visam “aumentar a dissipação de energia” em vez de “suprimir a ingestão de energia”4. De forma favorável, o alelo de risco da variante de obesidade FTO rs1421085 em humanos, que exibe a associação mais forte com maior índice de massa corporal (IMC) entre variantes comuns6,7 e exibe várias interações gene-ambiente 8,9, é relatado para regular negativamente a diferenciação e função de adipócitos beges10. O receptor ativado por proliferadores de peroxissoma γ (PPARγ) é conhecido como um regulador transcricional mestre da adipogênese, sendo necessário e suficiente para a diferenciação dos adipócitos11. Reguladores transcricionais, como o domínio homólogo PRD1-BF1-RIZ1 contendo 16 (PRDM16), o fator 2 inicial de células b (EBF2) e o fator nuclear I-A (NFIA), são cruciais para a diferenciação e função dos adipócitos marrom e bege 12,13,14,15,16,17,18. Por outro lado, a programação gênica do adipócito branco requer reguladores transcricionais, como a proteína intensificadora do tipo transducina 3 (TLE3) e a proteína dedo de zinco 423 (ZFP423)19,20,21.
Sistemas modelo in vitro permitem a realização de estudos moleculares que visam melhorar a compreensão do(s) mecanismo(s) subjacente(s) às funções e disfunções dos adipócitos. Emboraexistam linhagens celulares de pré-adipócitos publicamente disponíveis e imortalizadas, como 3T3-L1 e 3T3-F442A22,23,24, a cultura de pré-adipócitos primários e a diferenciação em adipócitos seriam um modelo mais adequado para o estudo da adipogênese in vivo. O isolamento da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino é um método bem conhecido para a obtenção de pré-adipócitos primários25,26. No entanto, a digestão do tecido adiposo pela colagenase, comumente realizada com agitador bacteriano com cremalheira, pode resultar em variação experimental e é propensa à contaminação27,28. Aqui, descrevemos um protocolo alternativo que usa um dissociador de tecido suave de triagem celular ativada por magnetismo (MACS) para digestão de colagenase para obter um isolamento mais fácil da SVF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, descrevemos um protocolo de isolamento da FVS do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de dissociador tecidual para digestão da colagenase diminuiu a variação experimental, diminuiu o risco de contaminação e aumentou a reprodutibilidade. Embora esse procedimento seja uma etapa crítica dentro do protocolo apresentado, o processo é altamente automatizado e a otimização não é necessária. No entanto, dependendo da idade …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Takahito Wada e Saiko Yoshida (Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão) por sua assistência experimental. Este trabalho foi financiado pelas seguintes bolsas para Y.H.: bolsa de pesquisa do Programa de Jovens Pesquisadores Excelentes da Universidade de Tóquio; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, bolsa número 19K17976; bolsa para o Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) da Japan Foundation for Applied Enzymology, bolsa número 17F005; bolsa da Fundação de Pesquisa Farmacológica; bolsa da Fundação Memorial Mochida para Pesquisa Médica e Farmacêutica; bolsa da MSD Life Science Foundation; bolsa da Daiwa Securities Health Foundation; bolsa da Fundação de Pesquisa Bioquímica de Tóquio; Bolsa de Pesquisa em Ciências da Vida da Takeda Science Foundation; e bolsa da SENSHIN Medical Research Foundation.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
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