Summary
Ce protocole décrit l’isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et obtenir une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase réduit la variation expérimentale et augmente la reproductibilité.
Abstract
L’étude in vitro de la différenciation des adipocytes blancs, bruns et beiges permet d’étudier les fonctions autonomes cellulaires des adipocytes et leurs mécanismes. Les lignées cellulaires de préadipocytes blancs immortalisés sont accessibles au public et largement utilisées. Cependant, l’émergence d’adipocytes beiges dans le tissu adipeux blanc en réponse à des signaux externes est difficile à récapituler dans son intégralité en utilisant des lignées cellulaires adipocytaires blanches accessibles au public. L’isolement de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin est couramment exécuté pour obtenir des préadipocytes primaires et effectuer la différenciation des adipocytes. Cependant, le hachage et la digestion de la collagénase du tissu adipeux à la main peuvent entraîner des variations expérimentales et sont sujets à la contamination. Ici, nous présentons un protocole semi-automatisé modifié qui utilise un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase afin d’isoler plus facilement la SVF, dans le but de réduire la variation expérimentale, de réduire la contamination et d’augmenter la reproductibilité. Les préadipocytes obtenus et les adipocytes différenciés peuvent être utilisés pour des analyses fonctionnelles et mécanistes.
Introduction
La biologie du tissu adipeux attire de plus en plus l’attention en raison de la prévalence croissante de l’obésité et du diabète de type 2 dans le monde1. Les adipocytes stockent l’excès d’énergie sous forme de gouttelettes lipidiques, qui sont libérées en cas de famine. De plus, le tissu adipeux maintient l’homéostasie énergétique systémique en servant d’organe endocrinien et en communiquant avec d’autres tissus 2,3. Curieusement, l’excès de tissu adipeux (obésité) et la perte adipeuse (lipodystrophie) sont liés à la résistance à l’insuline et au diabète1. Les adipocytes sont divisés en trois types: blanc, brun et beige1. Les adipocytes blancs stockent principalement l’excès d’énergie sous forme de lipides, tandis que les adipocytes bruns et beiges dissipent l’énergie sous forme de chaleur via la protéine de découplage mitochondrial-1 (Ucp1)1,4. Notamment, les adipocytes beiges (aussi appelés adipocytes bruns « inductibles ») apparaissent dans le tissu adipeux blanc en réponse à une stimulation froide ou sympathique et présentent des schémas d’expression génique qui se chevauchent avec ceux des adipocytes bruns « classiques» 5 mais qui sont distincts de ceux-ci. Récemment, les adipocytes bruns et beiges ont été anticipés comme cibles potentielles des traitements anti-obésité et anti-diabète visant à « améliorer la dissipation énergétique » plutôt qu’à « supprimer l’apport énergétique »4. À l’appui, l’allèle de risque de la variante d’obésité FTO rs1421085 chez l’homme, qui présente la plus forte association avec un indice de masse corporelle (IMC) plus élevé parmi les variantes courantes 6,7 et présente diverses interactions gène-environnement8,9, régulerait négativement la différenciation et la fonction des adipocytes beiges10. Le récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes γ (PPARγ) est connu comme un régulateur transcriptionnel maître de l’adipogenèse et est nécessaire et suffisant pour la différenciation des adipocytes11. Les régulateurs transcriptionnels, tels que le domaine homologue PRD1-BF1-RIZ1 contenant 16 (PRDM16), le facteur 2 précoce des cellules b (EBF2) et le facteur nucléaire I-A (NFIA), sont cruciaux pour la différenciation et la fonction des adipocytes bruns et beiges 12,13,14,15,16,17,18 . D’autre part, la programmation du gène adipocytaire blanc nécessite des régulateurs transcriptionnels, tels que la protéine 3 amplificateur de type transducine (TLE3) et la protéine 423 (ZFP423)19,20,21.
Les systèmes modèles in vitro permettent de réaliser des études moléculaires visant à améliorer la compréhension du ou des mécanismes sous-jacents aux fonctions et aux dysfonctionnements des adipocytes. Bien qu’il existe des lignées cellulaires de préadipocytes accessibles au public et immortalisées telles que 3T3-L1 et 3T3-F442A22,23,24, la culture de préadipocytes primaires et la différenciation en adipocytes seraient un modèle plus approprié pour étudier l’adipogenèse in vivo. L’isolement de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin est une méthode bien connue pour obtenir des préadipocytes primaires25,26. Cependant, la digestion de la collagénase du tissu adipeux, qui est généralement effectuée à l’aide d’un agitateur bactérien avec une grille à tubes, peut entraîner des variations expérimentales et est sujette à la contamination27,28. Ici, nous décrivons un protocole alternatif qui utilise un dissociateur de tissu doux de tri cellulaire activé magnétique (MACS) pour la digestion de la collagénase afin d’obtenir une isolation plus facile de la SVF.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Tokyo et réalisées conformément aux directives institutionnelles de l’Université de Tokyo.
1. Préparation de la solution enzymatique et du milieu
- Mettez les deux côtés du tissu adipeux blanc inguinal (côté droit et gauche, environ 150 mg) d’une souris âgée de 7 à 8 semaines et 2,5 mL de solution enzymatique dans le tube C du dissociateur.
- Reconstituer l’enzyme D avec 3 mL de milieu aigle modifié (DMEM)/F12 de Dulbecco sans sérum fœtal bovin (FBS) ni antibiotiques, l’enzyme R avec 2,7 mL de DMEM/F12 sans FBS ni antibiotiques, et l’enzyme A avec 1 mL de tampon A.
- Préparer 2,5 mL de solution enzymatique en ajoutant 100 μL d’enzyme D, 50 μL d’enzyme R, 12,5 μL d’enzyme A et 2,35 mL de DMEM/F12 sans FBS ni antibiotiques dans le tube C. Placer le tube C avec la solution enzymatique sur de la glace.
2. Isolement du tissu adipeux
- Euthanasier des souris C57BL/6J mâles âgées de 7 à 8 semaines (environ 20 g) par luxation cervicale.
- Sur un banc propre, pour isoler le tissu adipeux blanc inguinal, couper la peau avec des ciseaux émoussés / tranchants à l’abdomen et vers les membres inférieurs. Isolez le tissu adipeux de l’intérieur des cuisses à l’aide de ciseaux tranchants/tranchants. Un côté du tissu adipeux inguinal se comporte ~ 75 mg.
- Mettez le tissu adipeux isolé dans le tube C avec une solution enzymatique sur de la glace et maintenez le tube dans le banc propre pour maintenir la stérilité.
3. Hacher et digestion du tissu adipeux
- Au banc propre, ajouter 2,5 mL de solution enzymatique dans le tube C.
- Hacher le tissu adipeux en petits morceaux en coupant 50 fois avec des ciseaux tranchants / tranchants. Couper le tissu adipeux en ~2 mm2 morceaux.
- Fermez hermétiquement le capuchon du tube C, retournez le tube et fixez-le au manchon du dissociateur tissulaire avec le capuchon allumé. Ensuite, digérer l’échantillon pendant ~40 min à 37 °C.
REMARQUE: Cette étude a utilisé un dissociateur d’octo doux MACS avec appareils de chauffage (Miltenyi Biotec 130-096-427), et le programme préinstallé « 37C_mr_ATDK_1 » a été suivi.
4. Filtration de la suspension cellulaire
- DMEM/F12 préchaud contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C.
- Détacher le tube C du dissociateur tissulaire et arrêter la digestion en ajoutant 5 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et en pipetant doucement quatre fois.
- Centrifuger à 700 x g pendant 10 min à 20 °C.
- Aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille de cellule.
- Remettez la pastille en suspension en ajoutant 10 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et en pipetant doucement cinq fois.
- Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 μm de diamètre placée sur un nouveau tube de 50 mL.
- Centrifuger à 250 x g pendant 5 min et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
5. Placage cellulaire
- Centrifuger à 500 x g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille en ajoutant 10 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et en pipetant dix fois.
- Déposer la suspension cellulaire sur une capsule enrobée de collagène de 10 cm et placer les plats dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5% CO 2) pendant1-2 h.
REMARQUE: Les plats enrobés de collagène ne sont pas absolument nécessaires. Cependant, sur la base de l’expérience, les plats enrobés de collagène aident à l’adhérence des préadipocytes et augmentent ainsi la survie des cellules. - Aspirer le milieu et laver les cellules deux fois avec 3 mL de PBS par lavage.
- Ajouter 10 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et remettre les plats dans l’incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO2).
6. Passage des préadipocytes
- Le lendemain, aspirez le milieu (les cellules seront adhérentes, et donc le milieu peut être aspiré), laver les cellules deux fois avec 3 mL de PBS par lavage, et ajouter 10 mL de DMEM/F12 contenant 10% FBS et 1% de pénicilline-streptomycine.
- Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence (généralement 4 jours après l’isolement de SVF), divisez les cellules en quatre boîtes enrobées de collagène de 10 cm.
- Plus précisément, aspirez le milieu, lavez les cellules avec du PBS (température ambiante [RT]), ajoutez 1 mL de trypsine préchauffée à 0,05% et incuber pendant 5 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire.
- Ajouter 10 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine pour éteindre l’activité de la trypsine. Après pipetage, centrifuger à 440 x g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant, remettre les cellules en suspension en ajoutant 40 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine, et placer les cellules dans quatre boîtes enduites de collagène de 10 cm.
- Passez à nouveau les cellules lorsqu’elles atteignent 80% de confluence.
7. Préparation du rétrovirus exprimant le grand antigène T SV40 pour l’immortalisation des préadipocytes (facultatif)
- Au moins 3 jours avant l’immortalisation, plaquer les cellules d’emballage en platine-E (Plat-E)29 à une densité de 3,0 x 105 cellules/mL dans 2 mL de DMEM avec 10% FBS sans antibiotiques. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.
- Le lendemain, transfecter 4 μg de pBABE-neo largeTcDNA (ajouter le plasmide du gène #1780) en utilisant Lipofectamine 2000, selon les instructions du fabricant.
- Après 24 h, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de DMEM avec 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine.
- Le lendemain, récoltez le surnageant rétroviral. Le rétrovirus peut être utilisé pour l’immortalisation immédiate ou stocké à -80 °C.
8. Immortalisation des préadipocytes avec le grand antigène T SV40 (facultatif)
- Passage et expansion des préadipocytes deux fois après isolement de SVF.
- Plaquer les cellules dans des plaques à 6 puits à une densité de 0,5-1,0 x 104 cellules/mL dans 2 mL de DMEM/F12 avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.
- Le lendemain, préparer 250 μL de rétrovirus frais ou décongelé exprimant le grand antigène T SV40 par puits des plaques à 6 puits. Centrifuger à 440 x g pendant 5 min et placer le surnageant dans un tube neuf.
- Ajouter 750 μL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et 1 μL de polybrene par 250 μL de surnageant rétroviral pour fabriquer le virus fonctionnel.
- Aspirer le milieu et ajouter 1 000 μL du rétrovirus fonctionnel à chaque puits contenant des préadipocytes.
- Ajouter 1 mL de DMEM/F12 avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine 4 h plus tard.
- Le lendemain, séparer les préadipocytes infectés dans une boîte de 10 cm et sélectionner les cellules infectées avec DMEM/F12 contenant 10% FBS, 1% pénicilline-streptomycine et 500 μg/mL de néomycine. Pour surveiller la sélection des antibiotiques, préparez un plat de cellules non infectées avec de la néomycine.
- Continuez à faire passer les cellules infectées avec de la néomycine jusqu’à ce que toutes les cellules non infectées dans la boîte de moniteur soient mortes.
9. Différenciation des adipocytes
- Plaquez les cellules. Pour les plaques à 12 puits, plaquer les cellules à une densité de 4,0 x 104 cellules/mL dans 1 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine.
- Lorsque les préadipocytes deviennent confluents (48-72 h après le placage), aspirer le milieu et le remplacer par un milieu de différenciation (voir tableau 1 pour la composition).
- Au jour 2 de la différenciation (c.-à-d. 48 h après avoir induit la différenciation), remplacer le milieu par un milieu d’entretien (voir le tableau 1 pour la composition). Ensuite, changez le support d’entretien tous les 2 jours. La différenciation terminale est réalisée au jour 7 de la différenciation.
- Coloration rouge huile o
- Pour la coloration au rouge huile, aspirer le milieu et rincer les cellules avec 1 mL de PBS par puits. Fixez les cellules en ajoutant 1 mL de formaldéhyde à 4 % par puits, et incuber les cellules pendant 15 min à TA.
- Pendant l’incubation, diluer la solution mère d’huile rouge à 0,5 % (dans de l’alcool isopropylique) à 0,3 % à l’aide deddH2Oet filtrer la solution de travail à l’aide d’un papier filtre.
- Après les 15 min d’incubation, retirer le formaldéhyde, rincer les cellules avec de l’alcool isopropylique à 60%, ajouter 1 mL d’huile filtrée rouge o solution de travail, et incuber pendant 1 h à TA.
- Après l’incubation, lavez les cellules à l’eau courante. Ensuite, observez les adipocytes chargés de lipides sous un microscope inversé (grossissement : objectif 20x et oculaire 10x).
- Analyse de l’expression de l’ARNm
REMARQUE : Veuillez consulter le tableau 2 pour obtenir la liste des amorces utilisées dans la présente étude.- Aspirer le milieu et ajouter 1 mL/puits de trizol au puits.
- Incuber pendant 15 min à TA, détacher les cellules par pipetage et recueillir les échantillons dans des tubes de 1,5 mL. Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARN.
- Décongeler l’échantillon congelé à TA, ajouter 200 μL de chloroforme à l’échantillon et agiter vigoureusement pendant 15 s.
- Incuber l’échantillon à TA pendant 3 min, puis tourner à 20 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Retirer délicatement la phase aqueuse (supérieure, incolore) et transférer dans de nouveaux tubes. Ne transférez jamais la phase protéique (moyenne, blanche) ou la phase phénol/chloroforme (en bas, rose).
- Ajouter lentement un volume égal de 70% d’EtOH et mélanger délicatement. Ne pas vortex.
- Chargez l’échantillon (jusqu’à 700 μL) dans une colonne de spin d’ARN placée dans un tube de collecte. Assurez-vous d’inclure tout précipité qui pourrait s’être formé.
- Faire tourner à 9 000 x g pendant 30 s à 4 °C, puis jeter l’écoulement.
- Ajouter 700 μL de tampon RW1, faire tourner à 9 000 x g pendant 30 s à 4 °C, puis jeter l’écoulement.
- Transférer la colonne dans un nouveau tube collecteur et ajouter 500 μL de tampon RPE.
- Faire tourner à 9 000 x g pendant 30 s à 4 °C, puis jeter l’écoulement.
- Ajouter 500 μL de RPE tampon, faire tourner à 9 000 x g pendant 2 min à 4 °C, puis jeter l’écoulement.
- Transférer la colonne dans un nouveau tube collecteur et faire tourner (colonnes sans tampon) à 9 000 x g pendant 1 à 2 min à 4 °C.
- Transférer la colonne dans un nouveau tube collecteur de 1,5 mL et ajouter 30 μL d’eau exempte de RNase directement sur la membrane de la colonne.
- Incuber l’échantillon à TA pendant 1-2 min. Ensuite, faire tourner à 9 000 x g pendant 1 min à 4 °C pour éluer l’ARN.
- Vérifiez la concentration d’ARN à l’aide d’un fluorospectromètre.
REMARQUE: Il est recommandé d’aligner la concentration ici. - Effectuer une transcription inverse en utilisant ~200 ng de modèle d’ARN. Utilisez un kit commercial de réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR-RT) et suivez le protocole du fabricant. Après la réaction, diluer l’ADNc 20 fois à 200 μL.
- Ajouter 2,0 μL d’ADNc, 3,0 μL de Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL d’amorce directe qPCR 100 μM, 0,018 μL d’amorce inversée qPCR 100 μM et 0,96 μL de ddH2O à chaque puits d’une plaque de 384 puits.
- Exécuter une qPCR (maintien : 50°C pendant 2 min et 95°C pendant 2 min ; Phase PCR : 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 1 min ; stade de courbe de fusion : 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min et 95 °C pendant 15 s). Utilisez la méthode de la courbe standard pour la quantification.
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Representative Results
Ce protocole produit des adipocytes entièrement différenciés et chargés de lipides 7 jours après avoir induit la différenciation des adipocytes . Le degré de différenciation des adipocytes peut être évalué par la coloration rouge d’huile des triglycérides et des lipides (Figure 1A), ou l’analyse de l’expression de l’ARNm à l’aide de qPCR-RT de gènes adipocytaires, tels que le régulateur maître de l’adipogenèse Pparg et sa cible Fabp4 (Figure 1B). Pour induire la différenciation des adipocytes beiges in vitro, une classe de thiazolidinediones d’agonistes PPARγ, telle que la rosiglitazone, peut être utilisée. En effet, dans les expériences avec la rosiglitazone, on observe un effet dose-dépendant de concentrations allant jusqu’à 1 μM sur les niveaux d’expression des gènes spécifiques de la graisse brune, tels que Ucp1 et Ppargc1a. D’autre part, l’effet de la rosiglitazone sur Fabp4 est saturé à une concentration de 0,1 μM (Figure 1C).
Les adipocytes différenciés obtenus par ce protocole peuvent être utilisés pour diverses analyses fonctionnelles et mécanistes, telles que l’analyse du taux de consommation d’oxygène (OCR)16,30 (Figure 2A) et l’immunoprécipitation de la chromatine 31 (ChIP; Figure 2B). Les préadipocytes immortalisés peuvent être stockés dans un système de stockage de cellules azotées liquides sans perte de viabilité et peuvent être décongelés à tout moment pour être utilisés dans des expériences.
Figure 1 : Différenciation des préadipocytes en adipocytes chargés de lipides. (A) Les SVF provenant de tissus adipeux blancs inguinaux (iWAT) de souris de type sauvage ont été colorés au rouge d’huile o au jour 0 ou 7 de la différenciation des adipocytes. (B) les niveaux d’expression de l’ARNm de Pparg et Fabp4 aux jours 0 et 7 de la différenciation adipocytaire (moyenne ± erreur type de la moyenne [S.E.M.]; N = 3). (C) l’expression de l’ARNm du marqueur adipocytaire général Fabp4 et des gènes spécifiques de la graisse brune Ucp1 et Ppargc1a dans les adipocytes dérivés de SVF traités avec 0,1, 0,2, 0,5 et 1,0 μM rosiglitazone, ainsi que le milieu de différenciation et d’entretien. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemples d’analyses fonctionnelles et mécanistiques avec des adipocytes différenciés. (A) Analyse OCR des adipocytes dérivés de la SVF iWAT (N = 10). (B) ChIP-qPCR pour H3K27Ac dans les adipocytes dérivés de Nfia flox/flox iWAT SVF aux jours 0 et 7 de différenciation. Les sites Ins-0.4 kb et Fabp4-13 kb sont présentés comme sites d’arrière-plan (moyenne ± S.E.M.; N = 2). Pour les deux expériences, 1,0 μM de rosiglitazone a été ajouté avec le milieu de différenciation et d’entretien pour induire la différenciation des adipocytes beiges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Composition du milieu de différenciation et de maintenance. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Liste des amorces utilisées dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Ici, nous avons décrit un protocole d’isolement de la SVF à partir du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et effectuer une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase a diminué la variation expérimentale, diminué le risque de contamination et augmenté la reproductibilité. Bien que cette procédure soit une étape critique du protocole présenté, le processus est hautement automatisé et l’optimisation n’est pas nécessaire. Cependant, en fonction de l’âge de la souris et du dépôt de tissu adipeux, l’optimisation du hachage, par exemple la taille des morceaux ou le temps de coupe, peut être nécessaire.
Le SVF est connu comme une population hétérogène composée de préadipocytes, de cellules immunitaires telles que les macrophages, les cellules endothéliales et d’autres cellules. Parce que les préadipocytes adhèrent aux plats de culture et sont tolérants au lavage et aux changements de milieu, ils sont enrichis dans la population cellulaire pendant les passages. Cependant, il est raisonnable de supposer que les « préadipocytes » obtenus par ce protocole sont encore hétérogènes. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) à l’aide d’anticorps dirigés contre des marqueurs de surface précédemment signalés de préadipocytes tels que PDGFRα32 serait nécessaire pour obtenir une population de préadipocytes plus pure.
En résumé, nous avons décrit ici un protocole d’isolement de la SVF utilisant un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase. Ce protocole offre une isolation plus facile du SVF par rapport au protocole conventionnel utilisant un agitateur bactérien avec un rack à tubes, et offre une variation expérimentale réduite, une contamination réduite et une reproductibilité accrue16,17,18.
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Disclosures
Aucun des auteurs n’a d’intérêt financier concurrent lié à ce travail.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Takahito Wada et Saiko Yoshida (Université de Tokyo, Tokyo, Japon) pour leur aide expérimentale. Ce travail a été financé par les subventions suivantes à Y.H.: subvention de recherche du programme Excellent Young Researcher de l’Université de Tokyo; Subvention KAKENHI de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) pour les scientifiques en début de carrière, numéro de subvention 19K17976; subvention pour le Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) de la Fondation japonaise pour l’enzymologie appliquée, numéro de subvention 17F005; subvention de la Pharmacological Research Foundation; subvention de la Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; subvention de la Fondation MSD pour les sciences de la vie; subvention de la Daiwa Securities Health Foundation; subvention de la Tokyo Biochemical Research Foundation; Subvention de recherche en sciences de la vie de la Takeda Science Foundation; et subvention de la Fondation pour la recherche médicale SSENSHIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
