Summary
该协议描述了从小鼠脂肪组织中半自动分离基质血管部分（SVF）以获得前脂肪细胞并在 体外实现脂肪细胞分化。使用组织解离剂进行胶原酶消化可减少实验变异并提高可重复性。
Abstract
白色、棕色和米色脂肪细胞分化的 体外 研究能够研究脂肪细胞的细胞自主功能及其机制。永生化的白色前脂肪细胞系是公开的，并被广泛使用。然而，使用公开的白色脂肪细胞系很难充分概括白色脂肪细胞响应外部线索在白色脂肪组织中出现米色脂肪细胞。通常从小鼠脂肪组织中分离基质血管部分（SVF）以获得原代前脂肪细胞并进行脂肪细胞分化。然而，用手切碎和胶原酶消化脂肪组织会导致实验变化，并且容易受到污染。在这里，我们提出了一种改进的半自动方案，该方案利用组织解离剂进行胶原酶消化，以实现更容易的SVF分离，目的是减少实验变异，减少污染并提高可重复性。获得的前脂肪细胞和分化的脂肪细胞可用于功能和机理分析。
Introduction
由于全球肥胖和2型糖尿病的患病率日益增加，脂肪组织生物学一直受到越来越多的关注1。脂肪细胞以脂滴的形式储存多余的能量，这些脂滴在饥饿时释放。此外，脂肪组织通过充当内分泌器官并与其他组织交流来维持全身能量稳态2，3。有趣的是，过多的脂肪组织（肥胖）和脂肪损失（脂肪营养不良）都与胰岛素抵抗和糖尿病有关1。脂肪细胞分为三种类型：白色、棕色和米色1.白色脂肪细胞主要以脂质的形式储存多余的能量，而棕色和米色的脂肪细胞通过线粒体解偶联蛋白-1（Ucp1）以热量的形式耗散能量1，4。值得注意的是，米色脂肪细胞（也称为“诱导”棕色脂肪细胞）响应寒冷或交感神经刺激出现在白色脂肪组织中，并表现出与“经典”棕色脂肪细胞重叠但不同的基因表达模式5。最近，棕色和米色脂肪细胞有望成为抗肥胖和抗糖尿病治疗的潜在靶标，旨在“增强能量耗散”而不是“抑制能量摄入”4。支持性地，FTO肥胖变体rs1421085在人类中的风险等位基因，在常见变异6，7中表现出与较高体重指数（BMI）的最强关联，并表现出各种基因 - 环境相互作用8，9，据报道对米色脂肪细胞分化和功能产生负调节10.过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）被称为脂肪生成的主要转录调节因子，对于脂肪细胞分化是必要且充分的11。转录调节因子，例如含有 16 （PRDM16）、早期 B 细胞因子 2 （EBF2） 和核因子 I-A （NFIA） 的 PRD1-BF1-RIZ1 同源结构域，对于棕色和米色脂肪细胞分化和功能至关重要 12，13，14，15，16，17，18.另一方面，白色脂肪细胞基因编程需要转录调节因子，例如转导蛋白样增强蛋白3（TLE3）和锌指蛋白423（ZFP423）19，20，21。
体外模型系统能够进行分子研究，旨在提高对脂肪细胞功能和功能障碍机制的理解。尽管存在公开可用且永生化的前脂肪细胞系，例如3T3-L1和3T3-F442A222222，但原代前脂肪细胞的培养和分化为脂肪细胞将是更适合研究体内脂肪生成的模型。从小鼠脂肪组织中分离基质血管部分（SVF）是获得原代前脂肪细胞25，26的公知方法。然而，脂肪组织的胶原酶消化通常使用带有试管架的细菌摇床进行，可导致实验变化，并且容易受到污染27，28。在这里，我们描述了一种替代方案，该方案使用温和的磁激活细胞分选（MACS）组织解离剂进行胶原酶消化，以实现更容易的SVF分离。
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Protocol
本协议中描述的所有动物实验均由东京大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并根据东京大学的机构指南进行。
1. 酶溶液和培养基的制备
- 将来自7-8周龄小鼠的腹股沟白色脂肪组织（右侧和左侧，约150mg）和2.5mL酶溶液放入解离器的管C中。
- 用 3 mL 不含胎牛血清 （FBS） 或抗生素的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）/F12 复溶酶 D，用不含胎牛血清 （FBS） 或抗生素的 2.7 mL DMEM/F12 复溶酶 R，用不含 FBS 或抗生素的酶 A 复溶酶 A，用 1 mL 缓冲液 A 复溶酶 A。
- 通过将 100 μL 酶 D、50 μL 酶 R、12.5 μL 酶 A 和 2.35 mL 不含 FBS 或抗生素的 DMEM/F12 加入试管 C 中制备 2.5 mL 酶溶液。
2.脂肪组织的分离
- 通过颈椎脱位对7-8周龄的雄性C57BL / 6J小鼠（约20g）实施安乐死。
- 在干净的工作台上，为了分离腹股沟白色脂肪组织，用钝/锋利的剪刀在腹部和下肢切开皮肤。使用锋利/锋利的剪刀从大腿内侧分离脂肪组织。腹股沟脂肪组织的一侧~75毫克。
- 将分离出的脂肪组织放入冰上装有酶溶液的试管C中，并将管子放在干净的工作台内以保持无菌。
3.脂肪组织的切碎和消化
- 在洁净工作台上，向管C中加入2.5 mL酶溶液。
- 用锋利/锋利的剪刀切50次，将脂肪组织切成小块。将脂肪组织切成~2毫米2 块。
- 紧紧关闭管C的盖子，将管子倒置，并将其连接到组织解离器的套筒上，盖上盖子。然后，将样品在37°C下消化~40分钟。
注意：本研究使用带有加热器的gentleMACS Octo解离器（Miltenyi Biotec 130-096-427），并遵循预装程序“37C_mr_ATDK_1”。
4. 细胞悬液的过滤
- 将含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12预热至37°C。
- 从组织解离器中分离管 C，并通过加入含有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素的 5 mL DMEM/F12 并轻轻移液四次来停止消化。
- 在20°C下以700× g 离心10分钟。
- 小心吸出上清液而不干扰细胞沉淀。
- 通过加入含有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素的 10 mL DMEM/F12 并轻轻移液 5 次来重悬沉淀。
- 通过放置在新的 50 mL 管上的 70 μm 直径细胞过滤器过滤细胞悬液。
- 以 250 x g 离心 5 分钟，并将沉淀重悬于 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
5. 电池电镀
- 以500× g 离心5分钟。
- 除去上清液，通过加入含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 10 mL DMEM/F12 并移液十次来重悬沉淀。
- 将细胞悬液铺在10cm胶原蛋白包被的培养皿上，并将培养皿置于细胞培养箱（37°C，5%CO 2）中1-2小时。
注意：胶原蛋白涂层的菜肴不是绝对必需的。然而，根据经验，胶原蛋白包衣的培养皿确实有助于前脂肪细胞的粘附，从而提高细胞的存活率。 - 吸出培养基，每次洗涤用 3 mL PBS 洗涤细胞两次。
- 加入含有10%FBS和1%青霉素链霉素的10mL DMEM / F12，并将培养皿放回细胞培养箱（37°C，5%CO2）。
6. 前脂肪细胞的传代
- 第二天，吸出培养基（细胞将贴壁，因此可以吸出培养基），每次洗涤用 3 mL PBS 洗涤细胞两次，并加入 10 mL 含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12。
- 当细胞达到80%汇合时（通常在SVF分离后4天），将细胞分成四个10厘米胶原蛋白包被的培养皿。
- 具体来说，吸出培养基，用PBS（室温[RT]）洗涤细胞，加入1mL预热的0.05%胰蛋白酶，并在细胞培养箱中孵育5分钟。
- 加入含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 10 mL DMEM/F12 以淬灭胰蛋白酶活性。移液后，以440 x g 离心5分钟。
- 吸出上清液，通过加入含有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素的 40 mL DMEM/F12 重悬细胞，并将细胞接种在四个 10 cm 胶原蛋白包衣的培养皿中。
- 当细胞达到80%汇合时再次传代细胞。
7.制备表达SV40大T抗原的逆转录病毒，用于前脂肪细胞永生化（可选）
- 在永生化前至少 3 天，将 Platinum-E （Plat-E） 细胞29 以 3.0 x 105 个细胞 /mL 的密度包装在 2 mL 的 DMEM 中，加入不含抗生素的 10% FBS。使用血细胞计数器计数细胞。
- 第二天，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000转染4μgpBABE-neo largeTcDNA（添加基因质粒#1780）。
- 24小时后，吸出培养基并加入2mL DMEM和10%FBS和1%青霉素 - 链霉素。
- 第二天，收获逆转录病毒上清液。逆转录病毒可立即用于永生化或储存在-80°C。
8.用SV40大T抗原使前脂肪细胞永生化（可选）
- SVF分离后传代并扩增前脂肪细胞两次。
- 将细胞以 0.5-1.0 x 10 的密度将细胞接种在 6 孔板中4 个细胞/mL 的 2 mL DMEM/F12 中，含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素。使用血细胞计数器计数细胞。
- 第二天，在 6 孔板的每孔中制备 250 μL 表达 SV40 大 T 抗原的新鲜或解冻逆转录病毒。以440× g 离心5分钟，并将上清液放入新管中。
- 每 250 μL 逆转录病毒上清液中加入 750 μL 含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素和 1 μL 聚溴乙烯的 DMEM/F12，制成工作病毒。
- 吸出培养基，并向每个含有前脂肪细胞的孔中加入 1，000 μL 工作逆转录病毒。
- 4 小时后加入 1 mL DMEM/F12 和 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素。
- 第二天，将感染的前脂肪细胞分离到10厘米的培养皿中，并用含有10%FBS，1%青霉素 - 链霉素和500μg/ mL新霉素的DMEM / F12选择感染细胞。为了监测抗生素的选择，用新霉素准备一个未感染细胞的培养皿。
- 继续用新霉素传代感染的细胞，直到监测培养皿中所有未感染的细胞都死亡。
9.脂肪细胞分化
- 将细胞铺板。对于 12 孔板，将细胞以 4.0 x 104 个细胞 /mL 的密度接种在含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 1 mL DMEM/F12 中。
- 当前脂肪细胞汇合时（铺板后48-72小时），吸出培养基并用分化培养基代替（组成见 表1 ）。
- 在分化的第2天（即诱导分化后48小时），用维持培养基替换培养基（成分见 表1 ）。之后，每 2 天更换一次维护介质。在分化的第 7 天实现末端分化。
- 油红o染色
- 对于油红o染色，吸出培养基并用每孔1mL PBS冲洗细胞。通过每孔加入 1 mL 4% 甲醛来固定细胞，并在室温下孵育细胞 15 分钟。
- 在孵育期间，使用ddH 2O将0.5%油红O储备溶液（在异丙醇中）稀释至0.3%，并使用滤纸过滤工作溶液。
- 孵育15分钟后，除去甲醛，用60%异丙醇冲洗细胞，加入1mL过滤油红o工作溶液，在室温下孵育1小时。
- 孵育后，用流水洗涤细胞。然后，在倒置显微镜下观察富含脂质的脂肪细胞（放大倍率：20倍物镜和10倍目镜）。
- mRNA表达分析
注意：有关本研究中使用的引物列表，请参阅 表2 。- 吸出培养基并向孔中加入 1 mL/孔的曲唑。
- 在室温下孵育15分钟，通过移液分离细胞，并将样品收集在1.5mL管中。样品可以储存在-80°C直到RNA提取。
- 将冷冻样品解冻至室温，向样品中加入 200 μL 氯仿，剧烈摇动 15 秒。
- 将样品在室温下孵育3分钟，然后在4°C下以20，000× g 旋转15分钟。
- 小心地去除水相（顶部，无色）并转移到新管中。切勿转移蛋白质相（中间，白色）或苯酚/氯仿相（底部，粉红色）。
- 慢慢加入等体积的70%EtOH并轻轻混合。不要涡旋。
- 将样品（最多 700 μL）加载到位于收集管中的 RNA 离心柱中。确保包括可能已经形成的任何沉淀物。
- 在4°C下以9，000× g 旋转30秒，然后丢弃流通物。
- 加入 700 μL 缓冲液 RW1，在 4 °C 下以 9，000 x g 离心 30 秒，然后丢弃流通物。
- 将色谱柱转移到新的收集管中，并加入500 μL缓冲液RPE。
- 在4°C下以9，000× g 旋转30秒，然后丢弃流出物。
- 加入 500 μL 缓冲液 RPE，在 4 °C 下以 9，000 x g 离心 2 分钟，然后弃去流通物。
- 将色谱柱转移到新的收集管中，并在4°C下以9，000× g 旋转（无缓冲液的柱）1-2分钟。
- 将色谱柱转移到新的 1.5 mL 收集管中，并将 30 μL 无 RNase 的水直接添加到柱膜上。
- 将样品在室温下孵育1-2分钟。然后，在4°C下以9，000× g 旋转1分钟以洗脱RNA。
- 使用透光谱仪检查RNA浓度。
注意：建议在此处对齐浓度。 - 使用 ~200 ng 的 RNA 模板进行逆转录。使用商用定量实时聚合酶链反应 （qPCR-RT） 试剂盒并遵循制造商的方案。反应后，将cDNA稀释20倍至200μL。
- 向 384 孔板的每个孔中加入 2.0 μL cDNA、3.0 μL Power Sybr Green 预混液、0.018 μL 100 μM qPCR 正向引物、0.018 μL 100 μM qPCR 反向引物和 0.96 μL ddH 2 O。
- 运行qPCR（保持阶段：50°C2分钟和95°C2分钟;PCR阶段：40个循环，95°C持续15秒，60°C循环1分钟;熔融曲线阶段：95°C15秒，60°C1分钟，95°C15秒）。使用标准曲线法进行定量。
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Representative Results
该方案在诱导脂肪细胞分化后 7 天产生完全分化的、富含脂质的脂肪细胞。脂肪细胞分化的程度可以通过甘油三酯和脂质的油红o染色（图1A）或使用脂肪细胞基因的qPCR-RT进行mRNA表达分析来评估，例如脂肪生成Pparg的主调节因子及其靶标Fabp4（图1B）。为了在体外诱导米色脂肪细胞分化，可以使用一类噻唑烷二酮类PPARγ激动剂，例如罗格列酮。事实上，在罗格列酮的实验中，我们观察到浓度高达1μM对棕色脂肪特异性基因（如Ucp1和Ppargc1a）的表达水平的剂量依赖性影响。另一方面，罗格列酮对Fabp4的影响在0.1μM的浓度下饱和（图1C）。
通过该方案获得的分化脂肪细胞可用于各种功能和机理分析，例如耗氧率（OCR）分析16，30 （图2A）和染色质免疫沉淀31 （ChIP; 图 2B）。永生化的前脂肪细胞可以储存在液氮细胞存储系统中而不会损失活力，并且可以随时解冻以用于实验。
图1：前脂肪细胞分化为富含脂质的脂肪细胞。 （A）野生型小鼠腹股沟白色脂肪组织（iWAT）的SVF在脂肪细胞分化的第0天或第7天用油红o染色。（B）脂肪细胞分化第0天和第7天Pparg和Fabp4的mRNA表达水平（平均值±平均值的标准误差[S.E.M.];N = 3）。（C）用0.1、0.2、0.5和1.0μM罗格列酮以及分化和维持培养基处理的SVF衍生脂肪细胞中一般脂肪细胞标志物Fabp4和棕色脂肪特异性基因Ucp1和Ppargc1a的mRNA表达。请点击此处查看此图的大图。
图2：分化脂肪细胞的功能和机制分析示例。 （A）iWAT SVF衍生脂肪细胞的OCR分析（N = 10）。（B） 在分化的第 0 天和第 7 天对 Nfiaflox/flox iWAT SVF 衍生的脂肪细胞中的 H3K27Ac 进行 ChIP-qPCR。Ins-0.4 kb 和 Fabp4-13 kb 站点显示为背景站点（平均值± S.E.M.;N = 2）。对于两个实验，将1.0μM罗格列酮与分化和维持培养基一起加入以诱导米色脂肪细胞分化。请点击此处查看此图的大图。
表1：分化和维持培养基的组成。请按此下载此表格。
表2：本研究中使用的引物列表。请按此下载此表格。
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Discussion
在这里，我们描述了一种从小鼠脂肪组织中分离SVF以获得前脂肪细胞并在 体外进行脂肪细胞分化的方案。使用组织解离剂进行胶原酶消化减少了实验变异，降低了污染风险，并提高了可重复性。虽然此过程是所提出的协议中的关键步骤，但该过程是高度自动化的，不需要优化。但是，根据小鼠年龄和脂肪组织库，可能需要优化切碎，例如大小碎片或切割时间。
SVF 被称为由前脂肪细胞、免疫细胞（如巨噬细胞）、内皮细胞和其他细胞组成的异质群体。由于前脂肪细胞粘附在培养皿上并且耐洗涤和培养基变化，因此它们在传代过程中富集在细胞群中。然而，可以合理地假设通过该方案获得的“前脂肪细胞”仍然是异质的。需要使用针对先前报道的前脂肪细胞表面标志物（如PDGFRα32 ）的抗体进行荧光激活细胞分选（FACS），以获得更纯的前脂肪细胞群。
总之，我们在这里描述了使用组织解离剂进行胶原酶消化的SVF分离方案。与使用带管架的细菌摇床的传统方案相比，该协议提供了更容易的SVF分离，并减少了实验变化，减少了污染，并提高了重现性16，17，18。
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Disclosures
没有一个作者与这项工作有竞争性的经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢Takahito Wada和Saiko Yoshida（东京大学，东京，日本）的实验帮助。这项工作由以下对Y.H.的赠款资助：东京大学优秀青年研究员计划的研究资助;日本科学促进会（JSPS）KAKENHI早期职业科学家补助金，资助号19K17976;日本应用酶学基金会未来糖尿病研究领跑者（FFDR）资助，资助号17F005;药理学研究基金会的资助;Mochida纪念医学和药物研究基金会的资助;默沙东生命科学基金会的资助;大和证券健康财团的赠款;东京生化研究财团资助;武田科学基金会生命科学研究基金;以及SENSSHIN医学研究基金会的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
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