Summary
Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.
Abstract
De in vitro studie van witte, bruine en beige adipocytendifferentiatie maakt het mogelijk om celautonome functies van adipocyten en hun mechanismen te onderzoeken. Vereeuwigde witte preadipocytencellijnen zijn openbaar beschikbaar en worden veel gebruikt. De opkomst van beige adipocyten in wit vetweefsel als reactie op externe signalen is echter moeilijk volledig samen te vatten met behulp van openbaar beschikbare witte adipocytencellijnen. Isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel wordt vaak uitgevoerd om primaire preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie uit te voeren. Het hakken en collagenaseverteren van vetweefsel met de hand kan echter resulteren in experimentele variatie en is gevoelig voor besmetting. Hier presenteren we een aangepast semi-geautomatiseerd protocol dat een weefseldissociator gebruikt voor collagenasevertering om een eenvoudigere isolatie van de SVF te bereiken, met als doel experimentele variatie te verminderen, verontreiniging te verminderen en de reproduceerbaarheid te vergroten. De verkregen preadipocyten en gedifferentieerde adipocyten kunnen worden gebruikt voor functionele en mechanistische analyses.
Introduction
Vetweefselbiologie trekt steeds meer aandacht vanwege de groeiende prevalentie van obesitas en diabetes type 2 wereldwijd1. Adipocyten slaan overtollige energie op in de vorm van lipidedruppeltjes, die vrijkomen bij uithongering. Bovendien handhaaft vetweefsel systemische energiehomeostase door te dienen als een endocrien orgaan en te communiceren met andere weefsels 2,3. Intrigerend is dat zowel overtollig vetweefsel (obesitas) als vetverlies (lipodystrofie) verband houden met insulineresistentie en diabetes1. Adipocyten zijn onderverdeeld in drie soorten: wit, bruin en beige1. Witte adipocyten slaan voornamelijk overtollige energie op als lipiden, terwijl bruine en beige adipocyten energie in de vorm van warmte afvoeren via mitochondriaal ontkoppelingseiwit-1 (Ucp1)1,4. Met name beige adipocyten (ook wel "induceerbare" bruine adipocyten genoemd) verschijnen in wit vetweefsel als reactie op koude of sympathische stimulatie en vertonen genexpressiepatronen die overlappen met maar verschillen van die van "klassieke" bruine adipocyten5. Onlangs zijn bruine en beige adipocyten verwacht als potentiële doelwitten van anti-obesitas en anti-diabetes behandelingen gericht op "het verbeteren van de energiedissipatie" in plaats van "het onderdrukken van de energie-inname"4. Ondersteunend wordt gemeld dat het risico-allel van de FTO-obesitasvariant rs1421085 bij mensen, dat de sterkste associatie vertoont met een hogere body mass index (BMI) onder veel voorkomende varianten6,7 en verschillende gen-omgevingsinteracties vertoont 8,9, de beige adipocytendifferentiatie en -functie negatief reguleert10. Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) staat bekend als een master transcriptionele regulator van adipogenesis en is noodzakelijk en voldoende voor adipocytendifferentiatie11. Transcriptionele regulatoren, zoals PRD1-BF1-RIZ1 homoloog domein met 16 (PRDM16), vroege b-celfactor 2 (EBF2) en nucleaire factor I-A (NFIA), zijn cruciaal voor bruine en beige adipocytendifferentiatie en functie 12,13,14,15,16,17,18. Aan de andere kant vereist witte adipocytengenprogrammering transcriptionele regulatoren, zoals transducine-achtig versterkereiwit 3 (TLE3) en zinkvingereiwit 423 (ZFP423)19,20,21.
In vitro modelsystemen maken het mogelijk om moleculaire studies uit te voeren die gericht zijn op het verbeteren van het begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de functies en disfuncties van adipocyten. Hoewel openbaar beschikbare en vereeuwigde preadipocytencellijnen zoals 3T3-L1 en 3T3-F442A 22,23,24 bestaan, zou de cultuur van primaire preadipocyten en differentiatie in adipocyten een geschikter model zijn voor het bestuderen van in vivo adipogenese. Isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel is een bekende methode voor het verkrijgen van primaire preadipocyten25,26. Collagenasevertering van vetweefsel, die vaak wordt uitgevoerd met behulp van een bacteriële shaker met een buizenrek, kan echter resulteren in experimentele variatie en is gevoelig voor besmetting27,28. Hier beschrijven we een alternatief protocol dat een zachte magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS) weefseldissociator gebruikt voor collagenasevertering om gemakkelijker isolatie van de SVF te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Tokio en uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van de Universiteit van Tokio.
1. Bereiding van enzymoplossing en medium
- Plaats beide zijden van inguinaal wit vetweefsel (rechter- en linkerkant, ongeveer 150 mg) van een 7-8 weken oude muis en 2,5 ml enzymoplossing in buis C van de dissociator.
- Reconstitueer Enzym D met 3 ml Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM)/F12 zonder foetaal runderserum (FBS) of antibiotica, Enzym R met 2,7 ml DMEM/F12 zonder FBS of antibiotica en Enzym A met 1 ml buffer A.
- Bereid 2,5 ml enzymoplossing door 100 μL enzym D, 50 μL enzym R, 12,5 μl enzym A en 2,35 ml DMEM/F12 zonder FBS of antibiotica toe te voegen aan buis C. Zet buis C met enzymoplossing op ijs.
2. Isolatie van vetweefsel
- Euthanaseer 7-8 weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen (ongeveer 20 g) door cervicale dislocatie.
- Op een schone bank, om inguinaal wit vetweefsel te isoleren, knipt u de huid met een stompe / scherpe schaar bij de buik en naar de onderste ledematen. Isoleer het vetweefsel van de binnenkant van de dijen met een scherpe/scherpe schaar. De ene kant van het liesweefsel wieghs ~75 mg.
- Plaats het geïsoleerde vetweefsel in buis C met enzymoplossing op ijs en houd de buis in de schone bank om de steriliteit te behouden.
3. Gehakt en vertering van vetweefsel
- Voeg op de schone bank 2,5 ml enzymoplossing toe aan buis C.
- Hak het vetweefsel in kleine stukjes door 50 keer met een scherpe/scherpe schaar te knippen. Snijd het vetweefsel in ~2 mm2 stukjes.
- Sluit de dop van buis C goed af, draai de buis ondersteboven en bevestig deze aan de huls van de weefseldissociator met de dop erop. Vergist het monster vervolgens gedurende ~40 minuten bij 37 °C.
OPMERKING: Deze studie gebruikte gentleMACS Octo Dissociator met kachels (Miltenyi Biotec 130-096-427) en het vooraf geïnstalleerde programma "37C_mr_ATDK_1" werd gevolgd.
4. Filtratie van celsuspensie
- Voorwarm DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine tot 37 °C.
- Maak buis C los van de weefseldissociator en stop de spijsvertering door 5 ml DMEM / F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine toe te voegen en vier keer voorzichtig te pipetteren.
- Centrifugeer bij 700 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C.
- Zuig het supernatant voorzichtig op zonder de celkorrel te verstoren.
- Resuspensie van de pellet door toevoeging van 10 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine en vijf keer voorzichtig pipetteren.
- Filter de celsuspensie door een celzeef met een diameter van 70 μm die op een nieuwe buis van 50 ml wordt geplaatst.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten op 250 x g en resuspensie van de pellet in 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
5. Celbeplating
- Centrifugeer op 500 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet door 10 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine toe te voegen en tien keer te pipetteren.
- Plaats de celsuspensie op een met collageen beklede schaal van 10 cm en plaats de gerechten gedurende 1-2 uur in een celkweekincubator (37 °C, 5% CO2).
OPMERKING: Collageen gecoate gerechten zijn niet absoluut vereist. Op basis van ervaring helpen met collageen bedekte gerechten echter de hechting van preadipocyten en verhogen zo de overleving van de cellen. - Zuig het medium aan en was de cellen tweemaal met 3 ml PBS per wasbeurt.
- Voeg 10 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine toe en breng de gerechten terug naar de celkweekincubator (37 °C, 5% CO2).
6. Doorgeven van preadipocyten
- Zuig de volgende dag het medium op (de cellen zullen hechten en dus kan het medium worden aangezogen), was de cellen twee keer met 3 ml PBS per wasbeurt en voeg 10 ml DMEM / F12 toe met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
- Wanneer de cellen 80% samenvloeiing bereiken (meestal 4 dagen na SVF-isolatie), splitst u de cellen in vier met collageen bedekte gerechten van 10 cm.
- Zuig specifiek het medium op, was de cellen met PBS (kamertemperatuur [RT]), voeg 1 ml voorverwarmd 0,05% trypsine toe en incubeer gedurende 5 minuten in de celkweekincubator.
- Voeg 10 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine toe om de trypsine-activiteit te doven. Na het pipetteren, centrifugeer op 440 x g gedurende 5 min.
- Zuig het supernatant op, resuspendineer de cellen door 40 ml DMEM / F12 toe te voegen met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine en plaats de cellen in vier met collageen bedekte schalen van 10 cm.
- Passeer de cellen opnieuw wanneer ze 80% samenvloeiing bereiken.
7. Bereiding van retrovirus dat SV40 groot T-antigeen tot expressie brengt voor vereeuwiging van preadipocyten (optioneel)
- Ten minste 3 dagen voor de vereeuwiging, plaat Platinum-E (Plat-E) verpakkingscellen29 bij een dichtheid van 3,0 x 105 cellen / ml in 2 ml DMEM met 10% FBS zonder antibiotica. Gebruik een hemacytometer om de cellen te tellen.
- De volgende dag, transfect 4 μg pBABE-neo largeTcDNA (voeg gen plasmide #1780 toe) met behulp van Lipofectamine 2000, volgens de instructies van de fabrikant.
- Zuig na 24 uur het medium aan en voeg 2 ml DMEM toe met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
- Oogst de volgende dag het retrovirale supernatant. Het retrovirus kan onmiddellijk worden gebruikt voor vereeuwiging of worden bewaard bij -80 °C.
8. Onsterfelijkheid van preadipocyten met SV40 groot T-antigeen (optioneel)
- Passage en breid de preadipocyten tweemaal uit na SVF-isolatie.
- Plaats de cellen in 6-putplaten met een dichtheid van 0,5-1,0 x 104 cellen / ml in 2 ml DMEM / F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Gebruik een hemacytometer om de cellen te tellen.
- Bereid de volgende dag 250 μL vers of ontdooid retrovirus dat SV40 groot T-antigeen tot expressie brengt per put van de 6-putplaten. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 440 x g en plaats het supernatant in een nieuwe buis.
- Voeg 750 μL DMEM/F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine en 1 μL polybreen per 250 μL retroviraal supernatant toe om het werkende virus te maken.
- Zuig het medium aan en voeg 1.000 μL van het werkende retrovirus toe aan elke put die preadipocyten bevat.
- Voeg 4 uur later 1 ml DMEM/F12 toe met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
- Scheid de volgende dag de geïnfecteerde preadipocyten in een schaal van 10 cm en selecteer de geïnfecteerde cellen met DMEM / F12 met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 500 μg / ml neomycine. Om de antibioticaselectie te controleren, bereidt u een schaal met niet-geïnfecteerde cellen met neomycine.
- Ga door met het passeren van de geïnfecteerde cellen met neomycine totdat alle niet-geïnfecteerde cellen in de monitorschaal dood zijn.
9. Adipocytendifferentiatie
- Plaats de cellen. Voor 12-well platen, plaat de cellen met een dichtheid van 4,0 x 104 cellen / ml in 1 ml DMEM / F12 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
- Wanneer de preadipocyten confluent worden (48-72 h na plating), zuig het medium op en vervang het door differentiatiemedium (zie tabel 1 voor samenstelling).
- Vervang op dag 2 van de differentiatie (d.w.z. 48 uur na het induceren van differentiatie) het medium door het onderhoudsmedium (zie tabel 1 voor de samenstelling). Vervang daarna het onderhoudsmedium om de 2 dagen. Terminale differentiatie wordt bereikt op dag 7 van differentiatie.
- Olie rood o kleuring
- Voor olierode o-kleuring, zuig het medium op en spoel de cellen met 1 ml PBS per put. Bevestig de cellen door 1 ml 4% formaldehyde per put toe te voegen en incuber de cellen gedurende 15 minuten bij RT.
- Verdun tijdens de incubatie de 0,5% olie rode o stockoplossing (in isopropylalcohol) tot 0,3% met ddH2O en filtreer de werkoplossing met een filtreerpapier.
- Verwijder na de 15 minuten incubatie de formaldehyde, spoel de cellen met 60% isopropylalcohol, voeg 1 ml gefilterde olie rode o-werkoplossing toe en incubeer gedurende 1 uur bij RT.
- Was na de incubatie de cellen met stromend water. Observeer vervolgens met lipiden beladen adipocyten onder een omgekeerde microscoop (vergroting: 20x objectief en 10x oculair).
- mRNA-expressie analyse
OPMERKING: Zie tabel 2 voor de lijst van primers die in dit onderzoek zijn gebruikt.- Zuig het medium aan en voeg 1 ml/putje trizol toe aan de put.
- Incubeer gedurende 15 minuten bij RT, maak de cellen los door pipetteren en verzamel de monsters in buizen van 1,5 ml. De monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C tot RNA-extractie.
- Ontdooi het bevroren monster tot RT, voeg 200 μL chloroform toe aan het monster en schud krachtig gedurende 15 s.
- Incubeer het monster gedurende 3 minuten bij RT en draai vervolgens gedurende 15 minuten bij 20.000 x g bij 4 °C.
- Verwijder voorzichtig de waterige fase (boven, kleurloos) en breng over op nieuwe buizen. Breng nooit de eiwitfase (midden, wit) of de fenol/chloroformfase (onder, roze) over.
- Voeg langzaam een gelijk volume van 70% EtOH toe en meng voorzichtig. Niet vortexen.
- Laad het monster (tot 700 μL) in een RNA-spinkolom in een verzamelbuis. Zorg ervoor dat u eventuele neerslag opneemt.
- Draai op 9.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C en gooi de doorstroming dan weg.
- Voeg 700 μL buffer RW1 toe, draai bij 9.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C en gooi de doorstroming weg.
- Breng de kolom over in een nieuwe opvangbuis en voeg 500 μL buffer RPE toe.
- Draai op 9.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C en gooi de doorstroming dan weg.
- Voeg 500 μL buffer RPE toe, draai gedurende 2 minuten bij 4 °C op 9.000 x g en gooi de doorstroming weg.
- Breng de kolom over in een nieuwe opvangbuis en draai (kolommen zonder buffer) gedurende 1-2 minuten bij 4 °C op 9.000 x g .
- Breng de kolom over in een nieuwe opvangbuis van 1,5 ml en voeg 30 μL RNase-vrij water rechtstreeks toe aan het kolommembraan.
- Incubeer het monster bij RT gedurende 1-2 min. Draai vervolgens op 9.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C om het RNA te elueren.
- Controleer de RNA-concentratie met behulp van een fluorspectrometer.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de concentratie hier uit te lijnen. - Voer omgekeerde transcriptie uit met behulp van ~ 200 ng RNA-sjabloon. Gebruik een commerciële kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR-RT) kit en volg het protocol van de fabrikant. Verdun na de reactie het cDNA 20 keer tot 200 μL.
- Voeg 2,0 μL cDNA, 3,0 μL Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL 100 μM qPCR forward primer, 0,018 μL 100 μM qPCR reverse primer en 0,96 μL ddH2O toe aan elke put van een 384-well plaat.
- Voer een qPCR uit (houd de fase 20 °C 2 minuten en 95 °C gedurende 2 minuten vast; PCR-fase: 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 1 min; smeltcurvefase: 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 1 minuut en 95 °C gedurende 15 s). Gebruik de standaardcurvemethode voor kwantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol levert volledig gedifferentieerde, lipide-beladen adipocyten 7 dagen na het induceren van adipocytendifferentiatie. De mate van adipocytendifferentiatie kan worden geëvalueerd door de olierode o-kleuring van triglyceriden en lipiden (figuur 1A), of mRNA-expressieanalyse met behulp van qPCR-RT van adipocytengenen, zoals de hoofdregulator van adipogenese Pparg en zijn doelwit Fabp4 (figuur 1B). Om beige adipocytendifferentiatie in vitro te induceren, kan een thiazolidinedionenklasse van PPARγ-agonist, zoals rosiglitazon, worden gebruikt. Inderdaad, in experimenten met rosiglitazon zien we een dosisafhankelijk effect van concentraties tot 1 μM op de expressieniveaus van de bruine vetspecifieke genen, zoals Ucp1 en Ppargc1a. Aan de andere kant is het effect van rosiglitazon op Fabp4 verzadigd bij een concentratie van 0,1 μM (figuur 1C).
Gedifferentieerde adipocyten verkregen door dit protocol kunnen worden gebruikt voor verschillende functionele en mechanistische analyses, zoals zuurstofverbruikssnelheid (OCR) analyse 16,30 (figuur 2A) en chromatine immunoprecipitatie 31 (ChIP; Figuur 2B). Vereeuwigde preadipocyten kunnen worden opgeslagen in een opslagsysteem voor vloeibare stikstofcellen zonder verlies van levensvatbaarheid en kunnen op elk moment worden ontdooid voor gebruik in experimenten.
Figuur 1: Differentiatie van preadipocyten in met lipiden beladen adipocyten. (A) SVF's van inguinaal wit vetweefsel (iWAT) van wildtype muizen werden gekleurd met olierood o op dag 0 of 7 van adipocytendifferentiatie. B) mRNA-expressieniveaus van Pparg en Fabp4 op dag 0 en dag 7 van adipocytendifferentiatie (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde [S.E.M.]; N = 3). (C) mRNA-expressie van de algemene adipocytenmarker Fabp4 en de bruine vetspecifieke genen Ucp1 en Ppargc1a in van SVF afgeleide adipocyten behandeld met 0,1, 0,2, 0,5 en 1,0 μM rosiglitazon, samen met het differentiatie- en onderhoudsmedium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeelden van functionele en mechanistische analyses met gedifferentieerde adipocyten. (A) OCR-analyse van iWAT SVF-afgeleide adipocyten (N = 10). (B) ChIP-qPCR voor H3K27Ac in Nfia flox/flox iWAT SVF-afgeleide adipocyten op dag 0 en 7 van differentiatie. De Ins-0.4 kb en Fabp4-13 kb site worden weergegeven als achtergrond sites (gemiddelde ± S.E.M.; N = 2). Voor beide experimenten werd 1,0 μM rosiglitazon toegevoegd, samen met het differentiatie- en onderhoudsmedium om beige adipocytendifferentiatie te induceren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Samenstelling differentiatie- en onderhoudsmedium. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: De lijst van primers die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven we een protocol voor isolatie van de SVF uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro uit te voeren. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering verminderde de experimentele variatie, verminderde het risico op besmetting en verhoogde reproduceerbaarheid. Hoewel deze procedure een cruciale stap is binnen het gepresenteerde protocol, is het proces sterk geautomatiseerd en is optimalisatie niet nodig. Afhankelijk van de leeftijd van de muis en het vetweefseldepot kan echter optimalisatie van het gehakt, bijvoorbeeld de grootte van de stukken of de snijtijd, nodig zijn.
De SVF staat bekend als een heterogene populatie bestaande uit preadipocyten, immuuncellen zoals macrofagen, endotheelcellen en andere cellen. Omdat preadipocyten zich hechten aan kweekschalen en tolerant zijn voor wassen en mediumveranderingen, worden ze tijdens de passages verrijkt in de celpopulatie. Het is echter redelijk om aan te nemen dat de "preadipocyten" die door dit protocol worden verkregen nog steeds heterogeen zijn. Fluorescerend-geactiveerde celsortering (FACS) met behulp van antilichamen tegen eerder gerapporteerde oppervlaktemarkers van preadipocyten zoals PDGFRα32 zou nodig zijn om een zuiverdere preadipocytenpopulatie te verkrijgen.
Samenvattend hebben we hier een protocol beschreven voor SVF-isolatie met behulp van een weefseldissociator voor collagenasevertering. Dit protocol biedt een eenvoudigere isolatie van de SVF in vergelijking met het conventionele protocol met behulp van een bacteriële shaker met een buizenrek, en biedt verminderde experimentele variatie, verminderde verontreiniging en verhoogde reproduceerbaarheid16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft een concurrerend financieel belang met betrekking tot dit werk.
Acknowledgments
De auteurs willen Takahito Wada en Saiko Yoshida (The University of Tokyo, Tokyo, Japan) bedanken voor hun experimentele hulp. Dit werk werd gefinancierd door de volgende beurzen aan Y.H.: onderzoeksbeurs van het University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, subsidienummer 19K17976; subsidie voor de Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) van de Japan Foundation for Applied Enzymology, subsidienummer 17F005; subsidie van de Stichting Farmacologisch Onderzoek; subsidie van de Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; subsidie van de MSD Life Science Foundation; subsidie van de Daiwa Securities Health Foundation; subsidie van de Tokyo Biochemical Research Foundation; Life Science Research subsidie van de Takeda Science Foundation; en subsidie van de SENSHIN Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
