Halvautomatisk isolering av den stromala vaskulära fraktionen från murin vit fettvävnad med användning av en vävnadsdissociator
Summary
Detta protokoll beskriver den halvautomatiska isoleringen av den stromala vaskulära fraktionen (SVF) från murin fettvävnad för att erhålla preadipocyter och uppnå adipocytdifferentiering in vitro. Användning av en vävnadsdissociator för kollagenassmältning minskar experimentell variation och ökar reproducerbarheten.
Abstract
In vitro-studien av vit, brun och beige adipocytdifferentiering möjliggör undersökning av cellautonoma funktioner hos adipocyter och deras mekanismer. Odödliga vita preadipocytcellinjer är allmänt tillgängliga och används ofta. Framväxten av beige adipocyter i vit fettvävnad som svar på externa signaler är emellertid svår att rekapitulera i full utsträckning med hjälp av allmänt tillgängliga vita adipocytcellinjer. Isolering av den stromala vaskulära fraktionen (SVF) från murin fettvävnad utförs vanligen för att erhålla primära preadipocyter och utföra adipocytdifferentiering. Malning och kollagenasnedbrytning av fettvävnad för hand kan dock resultera i experimentell variation och är benägen för kontaminering. Här presenterar vi ett modifierat halvautomatiskt protokoll som använder en vävnadsdissociator för kollagenassmältning för att uppnå enklare isolering av SVF, i syfte att minska experimentell variation, minska kontaminering och öka reproducerbarheten. De erhållna preadipocyterna och differentierade adipocyterna kan användas för funktionella och mekanistiska analyser.
Introduction
Fettvävnadsbiologi har väckt allt större uppmärksamhet på grund av den växande förekomsten av fetma och typ 2-diabetes globalt1. Adipocyter lagrar överflödig energi i form av lipiddroppar, som frigörs vid svält. Dessutom upprätthåller fettvävnad systemisk energihomeostas genom att fungera som ett endokrint organ och kommunicera med andra vävnader 2,3. Intressant nog är både överskott av fettvävnad (fetma) och fettförlust (lipodystrofi) kopplade till insulinresistens och diabetes1. Adipocyter är indelade i tre typer: vit, brun och beige1. Vita adipocyter lagrar huvudsakligen överskottsenergi som lipider, medan bruna och beige adipocyter sprider energi i form av värme via mitokondriell frikopplingsprotein-1 (Ucp1)1,4. I synnerhet förekommer beige adipocyter (även kallade “inducerbara” bruna adipocyter) i vit fettvävnad som svar på kall eller sympatisk stimulering och uppvisar genuttrycksmönster som överlappar men skiljer sig från de “klassiska” bruna adipocyterna5. Nyligen har bruna och beige adipocyter förväntats som potentiella mål för behandlingar mot fetma och diabetes som syftar till att “förbättra energiavledningen” snarare än att “undertrycka energiintaget”4. Stödjande rapporteras riskallelen av FTO-fetmavarianten rs1421085 hos människor, som uppvisar den starkaste kopplingen till högre kroppsmassindex (BMI) bland vanliga varianter 6,7 och uppvisar olika gen-miljöinteraktioner8,9, att negativt reglera beige adipocytdifferentiering och funktion10. Peroxisomproliferatoraktiverad receptor γ (PPARγ) är känd som en mastertranskriptionsregulator för adipogenesis och är nödvändig och tillräcklig för adipocytdifferentiering11. Transkriptionsregulatorer, såsom PRD1-BF1-RIZ1 homolog domän innehållande 16 (PRDM16), tidig b-cellfaktor 2 (EBF2) och kärnfaktor I-A (NFIA), är avgörande för brun och beige adipocytdifferentiering och funktion 12,13,14,15,16,17,18. Å andra sidan kräver programmering av vita adipocytgener transkriptionsregulatorer, såsom transducinliknande förstärkareprotein 3 (TLE3) och zinkfingerprotein 423 (ZFP423)19,20,21.
In vitro-modellsystem möjliggör molekylära studier som syftar till att förbättra förståelsen för mekanismerna bakom adipocyternas funktioner och dysfunktioner. Även om offentligt tillgängliga och odödliga preadipocytcellinjer såsom 3T3-L1 och 3T3-F442A existerar22,23,24, skulle odling av primära preadipocyter och differentiering till adipocyter vara en mer lämplig modell för att studera adipogenes in vivo. Isolering av den stromala vaskulära fraktionen (SVF) från murin fettvävnad är en välkänd metod för att erhålla primära preadipocyter25,26. Kollagenasnedbrytning av fettvävnad, som vanligtvis utförs med hjälp av en bakteriell shaker med ett rörställ, kan dock resultera i experimentell variation och är benägen att kontaminera27,28. Här beskriver vi ett alternativt protokoll som använder en mild magnetaktiverad cellsortering (MACS) vävnadsdissociator för kollagenassmältning för att uppnå enklare isolering av SVF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrev vi ett protokoll för isolering av SVF från murin fettvävnad för att erhålla preadipocyter och utföra adipocytdifferentiering in vitro. Användningen av en vävnadsdissociator för kollagenasuppslutning minskade experimentell variation, minskade risken för kontaminering och ökad reproducerbarhet. Även om denna procedur är ett kritiskt steg inom det presenterade protokollet, är processen mycket automatiserad och optimering behövs inte. Beroende på musens ålder och fettvävnadsdepå kan o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Takahito Wada och Saiko Yoshida (University of Tokyo, Tokyo, Japan) för deras experimentella hjälp. Detta arbete finansierades av följande bidrag till Y.H.: forskningsbidrag från University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, bidragsnummer 19K17976; bidrag till Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) från Japan Foundation for Applied Enzymology, bidragsnummer 17F005; anslag från Stiftelsen för farmakologisk forskning; bidrag från Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; bidrag från MSD Life Science Foundation; bidrag från Daiwa Securities Health Foundation; bidrag från Tokyo Biochemical Research Foundation; Life Science Research bidrag från Takeda Science Foundation; och bidrag från SENSHIN Medical Research Foundation.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
