Summary
यह पेपर सी. एलिगेंस को उनकी मूल खेती प्लेटों पर बड़े पैमाने पर गतिहीन करने के लिए एक शीतलन चरण के निर्माण और संचालन के प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
Abstract
विवो माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण में उच्च-रिज़ॉल्यूशन मॉडल पशु केनोरहाब्डिस एलिगेंस (सी एलिगेंस) के अंदर सूक्ष्म जानकारी और ठीक विवरण प्रकट कर सकता है, लेकिन छवियों में गति धुंधला होने से रोकने के लिए मजबूत पशु स्थिरीकरण की आवश्यकता होती है। दुर्भाग्य से, अधिकांश वर्तमान स्थिरीकरण तकनीकों को पर्याप्त मैनुअल प्रयास की आवश्यकता होती है, जिससे उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग कम-थ्रूपुट प्रदान होता है। एलिगेंस के स्थिरीकरण को शीतलन दृष्टिकोण का उपयोग करके बहुत सरल बनाया जाता है जो आसानी से पूरी आबादी को सीधे उनकी खेती की प्लेटों पर स्थिर कर सकता है। शीतलन चरण खेती की प्लेट पर एक समान वितरण के साथ तापमान की एक विस्तृत श्रृंखला को स्थापित और बनाए रख सकता है। इस लेख में, शीतलन चरण के निर्माण की पूरी प्रक्रिया प्रलेखित है। उद्देश्य यह है कि एक विशिष्ट शोधकर्ता कठिनाई के बिना इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए अपनी प्रयोगशाला में एक परिचालन शीतलन चरण का निर्माण कर सकता है। तीन प्रोटोकॉल के बाद शीतलन चरण का उपयोग दिखाया गया है, और प्रत्येक प्रोटोकॉल में विभिन्न प्रयोगों के लिए फायदे हैं। इसके अलावा दिखाया गया है कि चरण का एक उदाहरण शीतलन प्रोफ़ाइल है क्योंकि यह अपने अंतिम तापमान तक पहुंचता है और शीतलन स्थिरीकरण का उपयोग करने में कुछ उपयोगी सुझाव देता है।
Introduction
उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी उपकोशिकीय स्तर पर विवो जैविक संरचनाओं में अध्ययन के लिए एक अनिवार्य उपकरण प्रदान करता है। कई जैविक अध्ययनों में सूक्ष्म शारीरिक विवरणों को हल करने के लिए सबमाइक्रोन रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की आवश्यकता होती है, जिसमें न्यूरॉन आकृति विज्ञान 1,2, झिल्ली संरचना3,4 और प्रोटीन स्थानीयकरण 5,6 शामिल हैं। एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि को इमेजिंग साधन और जांच 7,8 के आधार पर कई मिलीसेकंड से सेकंड तक के एक्सपोज़र समय की आवश्यकता होती है। इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, माइक्रोस्कोपी-आधारित प्रयोगों की सावधानीपूर्वक योजना बनाना और संचालन करना आवश्यक है। इस प्रयास के लिए महत्वपूर्ण एक कुशल पशु तैयारी विधि है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की सुविधा प्रदान करती है।
नेमाटोड सी एलिगेंस कई जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मॉडल जीवहै। इस छोटे जानवर को आमतौर पर नेमाटोड विकास माध्यम (एनजीएम) अगर प्लेटों पर खेती की जाती है, और वे स्व-निषेचन द्वारा तेजी से प्रजनन करते हैं, जिससे उन्हें बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल बनाया जाता है। उनकी पारदर्शिता और लेबलिंग तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला उनके आंतरिक शरीर रचनाविज्ञान 10,11 के सीधे दृश्य की अनुमति देती है। एलिगेंस में ठीक संरचनाएं उपकोशिकीय स्तर पर जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए आदर्श हैं, जैसे कि न्यूरॉन पुनर्जनन12, न्यूरॉन अपघटन13, और कोशिका विभाजन14। इस तरह के अध्ययनों में सबमाइक्रोन रिज़ॉल्यूशन पर इमेजिंग की आवश्यकता होती है और छवि धुंधला होने से रोकने के लिए पशु स्थिरीकरण काफी मजबूत होता है। अंतरिक्ष या समय में कई छवियों को शामिल करने वाली तकनीकों के लिए मजबूत स्थिरीकरण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जैसे कि 3 डी छवि स्टैक (यानी, जेड-स्टैक) और टाइम-लैप्स इमेजिंग। एक्सपोजर के बीच कोई भी पशु आंदोलन परिणाम को अस्पष्ट कर सकता है। एलिगेंस के लिए, मजबूत स्थिरीकरण में आमतौर पर व्यक्तिगत जानवरों का मैनुअल हेरफेर शामिल होता है और उन्हें एनेस्थेटिक15,16 के साथ स्लाइड पर चढ़ाना शामिल होता है। ये समय- और श्रम-गहन प्रक्रियाएं बड़े पैमाने पर प्रयोगों को बहुत मुश्किल बनाती हैं। एक स्थिरीकरण रणनीति जहां जानवरों को सीधे और विपरीत रूप से उनकी मूल खेती प्लेटों पर स्थिर किया जाता है, उच्च-थ्रूपुट उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम कर सकता है।
एलिगेंस के शीतलन स्थिरीकरण को कुछ अध्ययनों में दिखाया गया है लेकिन व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है। यह आमतौर पर जानवरों को17,18,19 को रोकने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के साथ जोड़ा जाता है। हालांकि, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण जटिल हैं, महत्वपूर्ण परिचालन प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, और सी एलिगेंस प्रयोगों के विशिष्ट ठोस खेती वर्कफ़्लो के साथ आसानी से एकीकृत नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, सी एलिगेंस स्थिरीकरण के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स का व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है। चुंग प्रयोगशाला के हालिया प्रकाशन20 के संयोजन के साथ यहां प्रस्तुत, इन कमियों को दूर करने के लिए थर्मोइलेक्ट्रिक कूलिंग स्टेज (चित्रा 1) का उपयोग करके एक नए शीतलन स्थिरीकरण दृष्टिकोण की शुरुआत है। शीतलन चरण के साथ, एक विशिष्ट 60 मिमी पॉलीस्टाइनिन खेती प्लेट को कमरे के तापमान -8 डिग्री सेल्सियस के बीच किसी भी लक्ष्य तापमान (टीसेट) तक ठंडा किया जा सकता है। यह शीतलन चरण दृष्टिकोण न्यूनतम उपयोगकर्ता प्रयास के साथ पूरी पशु आबादी को आसानी से और विपरीत रूप से गतिहीन कर सकता है, जिससे पशु प्रसंस्करण समय20 का 98% समाप्त हो जाता है।
नीचे, स्क्रैच से शीतलन चरण के निर्माण की प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। भागों और 3 डी प्रिंटिंग की मशीनिंग को छोड़कर, पूरी प्रक्रिया में विशेष उपकरण या विशेषज्ञता की आवश्यकता के बिना 4 घंटे लगने की उम्मीद है। फिर, अलग-अलग शीतलन दरों के साथ तीन अलग-अलग शीतलन रणनीतियों और एक विशिष्ट ईमानदार माइक्रोस्कोप पर सी एलिगेंस को गतिहीन करने के लिए उपयोगकर्ता के प्रयासों का आगे वर्णन किया गया है। पसंदीदा रणनीति उपयोगकर्ता अनुप्रयोग पर निर्भर हो सकती है। उन तीन शीतलन स्थिरीकरण रणनीतियों के प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णित हैं।
Protocol
1. शीतलन चरण के प्रत्येक घटक का निर्माण और तैयारी
नोट: शीतलन चरण में कई घटक शामिल हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। अधिकांश घटक ऑफ-द-शेल्फ हैं। नीलम खिड़की को एक कस्टम ऑर्डर की आवश्यकता होती है, जबकि कॉपर प्लेट, होल्डिंग ब्रैकेट, और आइसोलेशन प्लेट को कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण मिल या 3 डी प्रिंटर के साथ साइट पर निर्मित किया जा सकता है। प्रारंभिक विनिर्माण के बाद, बाद की असेंबली प्रक्रिया में लगभग 2-3 घंटे लगते हैं।
- 170 मिमी x 120 मिमी x 3 मिमी, 99.9% शुद्ध तांबा धातु शीट (चित्रा 2 ए) से तांबे की प्लेट को मशीन करने के लिए कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण मिल का उपयोग करें। इस विनिर्माण के लिए 2 डी ड्राइंग पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान की गई है। किसी भी तेज किनारों और गंदे अवशेषों को हटाने के लिए बारीक-ग्रिट सैंडपेपर का उपयोग करें।
- होल्डिंग ब्रैकेट और अलगाव प्लेट का निर्माण करने के लिए, एक 3 डी प्रिंटर और 1.75 मिमी व्यास पॉलीलैक्टिक एसिड (पीएलए) फिलामेंट (चित्रा 2 बी, सी) का उपयोग करें। बेहतर गुणवत्ता के लिए, 3 डी प्रिंटर को 0.2 मिमी से बेहतर परत ऊंचाई प्रदान करनी चाहिए.3D मॉडल पूरक फ़ाइल 2 और पूरक फ़ाइल 3 में प्रदान किए जाते हैं।
2. जल-शीतलन विधानसभा का निर्माण
- पानी-शीतलन असेंबली के निर्माण के लिए प्लैटिनम-ठीक सिलिकॉन ट्यूब, पंप टैंक, कॉपर कूलिंग ब्लॉक और रेडिएटर (चित्रा 3 ए) तैयार करें। उपयोग के लिए तैयार रेजर ब्लेड, कैंची और हेक्स कुंजी तैयार करें। पूरे विधानसभा में पानी के उपयोग के कारण बिजली के खतरों के बारे में जागरूक रहें।
- सिलिकॉन ट्यूब को 40 सेमी, 50 सेमी और 80 सेमी की सुझाई गई लंबाई के साथ तीन वर्गों में काटें। जरूरत पड़ने पर लंबाई समायोजित करें।
- सिलिकॉन ट्यूब वर्गों को चरण 2.2 से रेडिएटर, पंप टैंक और कॉपर कूलिंग ब्लॉक के बंदरगाहों में प्लग करें, जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है। सुनिश्चित करें कि सभी कनेक्शन वाटरटाइट हैं। वाटर-कूलिंग असेंबली अब बनाई गई है।
- वाटर-कूलिंग असेंबली, एक 12 वी बिजली की आपूर्ति, तीन लाल और तीन काले जम्पर तार, एक ब्रेडबोर्ड और 500 एमएल शुद्ध पानी तैयार करें।
- सुनिश्चित करें कि वर्कबेंच विद्युत सुरक्षा के लिए तरल से साफ है।
- पंप टैंक और रेडिएटर के तारों को ब्रेडबोर्ड के माध्यम से 12 वी बिजली की आपूर्ति से कनेक्ट करें (चित्रा 3 सी)। ब्रेडबोर्ड का उपयोग सुविधा के लिए किया जाता है।
नोट: अधिक स्थायी और सुरक्षित कनेक्शन के लिए, शोधकर्ता ब्रेडबोर्ड को सोल्डरिंग तारों से बदल सकते हैं। - फ्लैटहेड स्क्रूड्राइवर का उपयोग करके पंप टैंक कैप खोलें। पानी जोड़ने के लिए एक फ़नल का उपयोग करें जब तक कि पंप टैंक लगभग 80% भरा न हो (चित्रा 3 डी)। इस भरने के बाद पंप टैंक को कैप न करें।
- 12 वी बिजली की आपूर्ति में प्लग करके या इसे चालू करके (यदि कोई स्विच मौजूद है) पानी-शीतलन असेंबली को पावर दें। बिजली देने के बाद, पानी विधानसभा के अंदर बह जाएगा और रेडिएटर पर पंखे उड़ने चाहिए।
- पंप टैंक से पानी के प्रवाह के कारण, टैंक में तरल स्तर गिर जाएगा। पंप टैंक में अधिक पानी जोड़ें जब तक कि यह लगभग 2/3 पूर्ण पर स्थिर न हो जाए (चित्रा 3 ई)।
- हवा के बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए रेडिएटर को हिलाएं और फिर कूलिंग टैंक को कैप करें।
- अगले चरण पर जाने से पहले बिजली की आपूर्ति बंद कर दें।
3. पेल्टियर ठंडी और गर्म सतहों का परीक्षण
नोट: पेल्टियर, शीतलन चरण का एक प्रमुख घटक, एक ठोस-राज्य सक्रिय गर्मी पंप है जो गर्मी को एक तरफसे दूसरी तरफ स्थानांतरित करता है। पेल्टियर की एक सतह गर्म हो जाती है, और विद्युत शक्ति प्रदान करते समय दूसरी सतह ठंडी हो जाती है। डिफ़ॉल्ट रूप से, पेल्टियर निर्माता बेचने से पहले ठंडी सतह को चिह्नित करते हैं, लेकिन संयोजन से पहले इसे मैन्युअल रूप से परीक्षण करना अभी भी सहायक है।
- जैसा कि चित्र 4 ए में दिखाया गया है, असमर्थ बिजली की आपूर्ति और पेल्टियर तैयार करें।
- सुनिश्चित करें कि संभावित बिजली के खतरों को रोकने के लिए असमर्थ बिजली की आपूर्ति बंद है।
- पेल्टियर के लाल तार को सकारात्मक आउटपुट से और काले तार को मगरमच्छ क्लिप के साथ असमर्थ बिजली की आपूर्ति के नकारात्मक आउटपुट से कनेक्ट करें, जो बिजली की आपूर्ति के साथ प्रदान किए जाते हैं (चित्रा 4 बी)।
- बिजली की आपूर्ति चालू करें और बिजली की आपूर्ति की शीर्ष पंक्ति पर वोल्टेज और वर्तमान नॉब्स दोनों को संशोधित करके इसे लगभग 2 वी पर सेट करें। पेल्टियर की दो सतहों को महसूस करने के लिए तुरंत एक नंगी उंगली का उपयोग करें। एक सतह कुछ सेकंड के भीतर ठंडी हो जाती है।
- यह पहचानने के बाद कि कौन सी सतह ठंडी है, तुरंत बिजली की आपूर्ति बंद कर दें और पेल्टियर को डिस्कनेक्ट कर दें।
- भविष्य की असेंबली के लिए ठंडी सतह को इंगित करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें।
4. वाटर-कूलिंग असेंबली का उपयोग करके पेल्टियर को ठंडा करने के लिए असेंबली का निर्माण करना।
- जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है, स्विच-ऑफ वॉटर-कूलिंग असेंबली, पेल्टियर (ठंडी सतह चिह्नित), और थर्मल पेस्ट (बेहतर थर्मल चालन के लिए) तैयार करें।
- कॉपर कूलिंग ब्लॉक की सभी सतहों को पानी-शीतलन असेंबली में 70% इथेनॉल (या अन्य क्लीनर समाधान) के साथ साफ करें।
- तांबे के पानी-शीतलन ब्लॉक की एक सतह पर लगभग 0.4 ग्राम थर्मल पेस्ट लागू करें और सुनिश्चित करें कि यह सतह अभिविन्यास नीचे की ओर सामना करते समय ट्यूबों को पार करने या झुकने से रोक देगा। त्वचा की रक्षा के लिए एक दस्ताने का उपयोग करें और थर्मल पेस्ट को पतला और समान रूप से वितरित करने का प्रयास करें (चित्रा 4 सी)।
- इसी तरह, पेल्टियर की गर्म सतह को साफ करें, फिर थर्मल पेस्ट को सतह पर लागू करें (चित्रा 4 डी)।
- पेल्टियर गर्म सतह को थर्मल पेस्ट के साथ कॉपर कूलिंग ब्लॉक की सतह से कनेक्ट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए दबाव लागू करें कि यह सुरक्षित है। पेल्टियर और कॉपर कूलिंग ब्लॉक के ट्यूबों पर तारों के अभिविन्यास का पालन करें, जैसा कि चित्रा 4 ई में दिखाया गया है। अतिरिक्त थर्मल पेस्ट को साफ करें।
- 12 वोल्ट बिजली की आपूर्ति और असमर्थ बिजली की आपूर्ति दोनों को बंद रखें। पेल्टियर को असमर्थ बिजली की आपूर्ति से कनेक्ट करें, जैसा कि अनुभाग 3 में है।
- विद्युत और पानी-शीतलन असेंबली कनेक्शन दोनों को फिर से जांचें, और फिर 12 वी बिजली की आपूर्ति और अक्षम बिजली की आपूर्ति को क्रमिक रूप से चालू करें।
- धीरे-धीरे बिजली की आपूर्ति को 12 वोल्ट तक चालू करें। सुझाए गए पेल्टियर के साथ, वर्तमान लगभग 7.3 ए होना चाहिए।
- 2 मिनट तक प्रतीक्षा करें; पेल्टियर ठंडी सतह का तापमान -35 डिग्री सेल्सियस से अधिक ठंडा हो जाना चाहिए। इन्फ्रारेड थर्मामीटर (चित्रा 4 एफ) के साथ इस तापमान को मापें। हाथों को चोट से बचाने के लिए ठंडी सतह को न छुएं।
- यदि तापमान -30 डिग्री सेल्सियस से नीचे नहीं पहुंच सकता है तो सभी कनेक्शन और घटकों की जांच करें। वाटर-कूलिंग असेंबली के अंदर हवा के बुलबुले सबऑप्टिमल कूलिंग प्रदर्शन का एक संभावित कारण है।
- बाद के चरणों में सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए, असमर्थ बिजली की आपूर्ति बंद करें, 1 मिनट प्रतीक्षा करें, फिर 12 वी बिजली की आपूर्ति बंद करें।
5. तांबे की प्लेट और नीलम खिड़की असेंबली का निर्माण
- तांबे की प्लेट, 80 मिमी व्यास नीलम खिड़की, थर्मल पेस्ट, एक 4 इंच चौड़ा टेप और काटने के लिए एक तेज ब्लेड तैयार करें (चित्रा 5 ए)।
- तांबे की प्लेट और नीलम खिड़की को 70% इथेनॉल के साथ सावधानीपूर्वक साफ करें और खुरदरी सतहों को चिकना करने के लिए बारीक-ग्रिट सैंडपेपर का उपयोग करें।
- थर्मल पेस्ट को तीन आंतरिक सतहों पर लागू करें, जैसा कि चित्रा 5 बी में दिखाया गया है। सुनिश्चित करें कि थर्मल पेस्ट सभी तीन सतह क्षेत्रों को कवर करता है लेकिन बहुत मोटा नहीं है, लगभग 0.5 मिमी।
- प्रिंटर पेपर से सुरक्षित बेंचटॉप पर तांबे की प्लेट बिछाएं। कागज बाद की सफाई को आसान बनाता है।
- नीलम खिड़की को तांबे की प्लेट के छेद में डालें (चित्र 5 सी)। सुनिश्चित करें कि थर्मल पेस्ट को अन्य क्षेत्रों में जाने से रोकने के लिए सम्मिलन के दौरान नीलम नहीं घूमता है। अतिरिक्त थर्मल पेस्ट को हटा दें।
- कॉपर प्लेट-नीलम विंडो असेंबली की शीर्ष सतह पर 4 इंच चौड़े टेप का पालन करें (सतह जिसमें वर्ग अवसाद क्षेत्र है, जैसा कि चित्र 5 डी में दिखाया गया है)। चिपकाने के दौरान टेप और तांबे की सतहों के बीच हवा के बुलबुले से बचें, आसंजन को धीरे-धीरे एक तरफ से दूसरी तरफ निर्देशित करके।
- चित्र 5E का अनुसरण करते हुए, एक तेज ब्लेड का उपयोग करके टेप के निर्दिष्ट नीले डैश किए गए क्षेत्रों को काट लें। काटने से दो धागे के छेद, चौकोर अवसाद और नीलम खिड़की के 70 मिमी व्यास क्षेत्र को उजागर किया जाता है।
- कॉपर प्लेट-नीलम विंडो असेंबली की निचली सतह को टेप करें और फिर इस सतह पर काटने की प्रक्रिया (केवल नीलम क्षेत्र) को दोहराएं, जैसा कि चित्र 5 एफ में दिखाया गया है।
नोट: अब, नीलम खिड़की तांबे की प्लेट पर तय की गई है, और तांबे की सतहों को जंग से बचाया जाता है।
6. शीतलन चरण अंतिम संयोजन
- सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक उप-असेंबली और घटक तैयार हैं।
- तांबे की प्लेट के वर्ग अवसाद पर लगभग 0.4 ग्राम थर्मल पेस्ट लागू करें (चित्रा 6 ए)।
- पेल्टियर की ठंडी सतह पर लगभग 0.4 ग्राम थर्मल पेस्ट लागू करें। ध्यान दें कि पेल्टियर पहले से ही कॉपर कूलिंग ब्लॉक (चित्रा 6 बी) से जुड़ा हुआ है।
- पेल्टियर ठंडी सतह को नीचे की ओर दबाव के साथ तांबे की प्लेट अवसाद से कनेक्ट करें। सभी अतिरिक्त थर्मल पेस्ट को साफ करें (चित्रा 6 सी)।
- कॉपर कूलिंग ब्लॉक के शीर्ष पर 3 डी-मुद्रित ब्रैकेट माउंट करें, और फिर कॉपर प्लेट (चित्रा 6 डी) को ब्रैकेट को ठीक करने के लिए दो 8-32, 0.5 इंच लंबे स्क्रू को कसने के लिए हेक्स कुंजी का उपयोग करें। कम टोक़ कसने का उपयोग करें ताकि पेल्टियर से तांबे तक उचित थर्मल चालन सुनिश्चित करने के लिए मुद्रित ब्रैकेट टूट या ख़राब न हो।
- ऑपरेशन के दौरान बेंचटॉप या माइक्रोस्कोप बेस से थर्मल अलगाव के लिए तांबे की प्लेट को 3 डी-मुद्रित अलगाव आधार में रखें (चित्रा 6 डी)।
- शीतलन चरण इकट्ठा होता है और उपयोग करने के लिए तैयार होता है (चित्रा 6 ई)।
- माइक्रोस्कोपी के लिए, पूर्ण शीतलन चरण को एक ईमानदार माइक्रोस्कोप प्लेटफॉर्म (चित्रा 7 ए) पर रखें।
- शीतलन चरण की असेंबली पूरी हो गई है। चुंग प्रयोगशाला के साथी प्रकाशन से अधिक विवरण उपलब्ध हैं, जो विस्तृत रणनीतियों और पशु आंदोलन20 को पूरी तरह से चिह्नित करते हैं।
नोट: निम्नलिखित अनुभागों में, धीमी, तेज और अचानक शीतलन प्रोटोकॉल पर चर्चा की जाती है। एल 4 या युवा वयस्क उम्र में एन 2 हेर्मैफ्रोडाइट्स का उपयोग निम्नलिखित डेटा का उत्पादन करने के लिए किया गया था। धीमी शीतलन रणनीति 6 डिग्री सेल्सियस पर 20 डिग्री सेल्सियस खेती वाले एन 2 जानवरों को स्थिर करने के लिए उपयोगी है; 15 डिग्री सेल्सियस की खेती वाले एन 2 जानवर 1 डिग्री सेल्सियस20 पर सबसे दृढ़ता से स्थिर होते हैं। इन तीन शीतलन प्रोटोकॉल के बीच एक संक्षिप्त तुलना तालिका 1 में दिखाई गई है।
7. धीमी शीतलन स्थिरीकरण प्रोटोकॉल
- खेती की प्लेट को ढक्कन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में ले जाएं।
- खेती की प्लेट को रेफ्रिजरेटर में ले जाने के बाद, शीतलन चरण की 12 वी बिजली की आपूर्ति चालू करें और असमर्थ बिजली आपूर्ति वोल्टेज को 5.5 वी पर सेट करें।
- ढक्कन वाली खेती की प्लेट 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रहने के बाद, प्लेट को तुरंत शीतलन चरण में स्थानांतरित करें और ढक्कन को हटा दें (चित्रा 7 ए)। ऐसी खेती की प्लेटें आमतौर पर 6 डिग्री सेल्सियस के आसपास होती हैं। प्री-कूल्ड चरण स्थिर और ठंडा है जो 6 डिग्री सेल्सियस पर आगर की सतह को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है।
- यदि आगर की सतह का तापमान बदलता है, जैसा कि मापा जाता है या जानवरों की गति को ध्यान में रखते हुए, वोल्टेज को थोड़ा समायोजित करें जब तक कि यह 6 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर न हो जाए।
- स्थानांतरण के समय जानवरों को ठीक से स्थिर किया जाता है।
8. फास्ट कूलिंग इमोबिलाइजेशन प्रोटोकॉल
नोट: तेजी से शीतलन रणनीति सबसे बुनियादी स्थिरीकरण विधि है (मूवी 1 देखें); हालांकि, टीसेट तक पहुंचने के दौरान अगर प्लेटें एक विस्तारित समय के लिए मंच पर कब्जा कर लेती हैं। इसके अलावा, जब एक मजबूत स्थिरीकरण की आवश्यकता होती है और टीसेट 6 डिग्री सेल्सियस होता है, तो निष्क्रिय समय लगभग 1 घंटे20 तक बढ़ाया जाता है।
- शीतलन चरण की 12 वी बिजली की आपूर्ति चालू करें और असमर्थ बिजली आपूर्ति वोल्टेज को लगभग 12 वी पर सेट करें।
- इसके इनक्यूबेटर से सीधे शीतलन अवस्था में एक खेती की प्लेट लाएं और ढक्कन हटा दें।
- एक बार जब आगर की सतह का तापमान (टी सेट + त्रिभुज) डिग्री सेल्सियस तक कम हो जाता है, तो पावर की आपूर्ति को वी सेट में समायोजित करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि एगर टीसेट तक न पहुंच जाए। टी सेट पर आगर को स्थिर करने के लिए वीसेट उपयुक्त वोल्टेज है। त्रिभुज एक चर है जो ओवरकूलिंग को रोकता है। Tसेट, त्रिभुज और Vसेट के संयोजन के लिए तालिका 2 देखें।
नोट: तालिका 2 में प्रस्तुत डेटा विशेष रूप से चुंग प्रयोगशाला से संबंधित है, और इसलिए यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रयोगात्मक पैरामीटर प्रत्येक व्यक्तिगत प्रयोग के अद्वितीय पर्यावरण और उपयोग की स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। - जब एगर टीसेट तक पहुंचता है तो जानवर स्थिर हो जाते हैं। शीतलन की शुरुआत के बाद ~ 50 मिनट तक समय के साथ स्थिरीकरण में सुधार होता है।
9. अचानक शीतलन स्थिरीकरण प्रोटोकॉल
नोट: अचानक शीतलन रणनीति सबसे अधिक उपयोगकर्ता समय का उपभोग करती है लेकिन जानवरों को उनकी खेती के तापमान से सबसे तेजी से गतिहीन करती है।
- कूलिंग स्टेज की 12 वोल्ट बिजली की आपूर्ति चालू करें और असमर्थ बिजली आपूर्ति वोल्टेज को लगभग 12 वी तक चालू करें।
- ठंडा करने की अवस्था में एक खाली पड़ी आगर प्लेट लाएं। टीसेट पर आगर सतह के तापमान को स्थिर करने के लिए फास्ट कूलिंग स्थिरीकरण प्रोटोकॉल में चरण 8.3 का उपयोग करें।
- जानवरों को उनकी मूल खेती की प्लेट से ठंडा करने की अवस्था में बैठे ठंडे प्लेट में ले जाएं।
- छोटे जानवरों के आकार के आधार पर, जानवरों को सेकंड में टीसेट तक ठंडा होने और स्थिर होने की उम्मीद है। शीतलन की शुरुआत के बाद ~ 50 मिनट तक समय के साथ स्थिरीकरण में सुधार होता है।
10. शीतलन स्थिरीकरण के बाद जानवरों का पुनरुद्धार
- ठंडा कल्चर प्लेट को मूल इनक्यूबेटर या कमरे के तापमान पर वापस ले जाएं।
- 20 मिनट से 1 घंटे तक प्रतीक्षा करें जब तक कि प्लेट के सभी कीड़े अपने सामान्य रेंगने और खिलाने के व्यवहार में पुनर्जीवित न हो जाएं।
Representative Results
शीतलन तापमान माप
प्रारंभिक शीतलन स्थिरीकरण प्रयोगों के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि जानवरों को ठीक से स्थिर किया जा सकता है, अगर सतह के तापमान को ट्रैक करना महत्वपूर्ण है। भविष्य के प्रयोग जो प्रारंभिक से दोहराए जाते हैं, वे समान मापदंडों का उपयोग कर सकते हैं, आमतौर पर लगातार तापमान ट्रैकिंग के बिना। तापमान माप के लिए, थर्मामीटर के थर्मोकपल टिप को 70% इथेनॉल समाधान का उपयोग करके निष्फल किया जाता है, जब तक कि उपयोग करने से पहले इथेनॉल पूरी तरह से वाष्पित न हो जाए। फिर, थर्मोकपल टिप को एनजीएम एगर में 1 मिमी डाला जाता है ताकि सटीक तापमान रीडिंग सुनिश्चित हो सके। थर्मामीटर टिप को क्लैंप धारक या अन्य धारकों (चित्रा 7 बी) का उपयोग करके आयोजित किया जाता है।
इन्फ्रारेड कैमरे के साथ तापमान माप
शीतलन चरण को यह सुनिश्चित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि प्लेट के केंद्रीय 40 मिमी व्यास क्षेत्र में तापमान वितरण समान है। एक फॉरवर्ड-लुकिंग इन्फ्रारेड (एफएलआईआर) कैमरे का उपयोग आगर की सतह पर तापमान वितरण की छवि बनाने के लिए किया जाता है। अधिकतम तापमान अंतर लगभग 1 डिग्री सेल्सियस है जब टीसेट 1, 3, या 6 डिग्री सेल्सियस है (चित्रा 8 ए)।
तेजी से शीतलन रणनीति के साथ शीतलन दर का आकलन
फास्ट कूलिंग रणनीति का उपयोग 12 वी पर एक चरण की शीतलन दर को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। शीतलन चरण पर एक 20 डिग्री सेल्सियस प्लेट रखी जाती है और सतह के तापमान को ट्रैक करने के लिए एक थर्मोकपल थर्मामीटर का उपयोग किया जाता है। चरण 20 डिग्री सेल्सियस प्लेटों को 6 मिनट में 6 डिग्री सेल्सियस तक, 10 मिनट में 1 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करता है, और अंततः लगभग 40 मिनट में -7 डिग्री सेल्सियस से नीचे स्थिर हो जाता है (चित्रा 8 बी)।
एक ईमानदार माइक्रोस्कोप प्लेटफॉर्म पर शीतलन चरण का उपयोग करना
एक ईमानदार माइक्रोस्कोप में आमतौर पर इमेजिंग के लिए एक उद्देश्य, नमूना धारण और रोशनी के लिए एक चरण शामिल होता है। यह शीतलन चरण आसान सम्मिलन और हटाने (चित्रा 8 सी) के साथ एक विशिष्ट ईमानदार माइक्रोस्कोप चरण पर उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया है। जब इमेजिंग या स्क्रीनिंग के लिए शीतलन स्थिरीकरण की आवश्यकता होती है, तो शीतलन चरण को केवल किस्त को पूरा करने के लिए माइक्रोस्कोप चरण पर रखा जाता है और इसके विपरीत।
कूलिंग प्लेट पर कीड़े का स्थिरीकरण मूवी 1 में दिखाया गया है।
चित्रा 1: शीतलन चरण तंत्र का 3 डी मॉडल। इलेक्ट्रॉनिक कनेक्शन स्पष्टता के लिए नहीं दिखाए जाते हैं। एक टैंक स्टेज में एम्बेडेड पेल्टियर द्वारा स्थानांतरित गर्मी को हटाने के लिए कूलिंग ब्लॉक के माध्यम से पानी पंप करता है। एक विशिष्ट 60 मिमी पॉलीस्टाइनिन खेती प्लेट पारदर्शी नीलम खिड़की पर बैठ सकती है और चरण द्वारा ठंडा किया जा सकता है। सॉलिडवर्क्स में उत्पन्न मॉडल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: निर्मित होने वाले घटकों के 3 डी मॉडल। (ए) कॉपर प्लेट। (बी) 3 डी-मुद्रित होल्डिंग ब्रैकेट। (सी) 3 डी-मुद्रित अलगाव प्लेट। सॉलिडवर्क्स में उत्पन्न मॉडल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: जल-शीतलन विधानसभा । (ए) व्यक्तिगत घटक। ट्यूबों को निर्दिष्ट लंबाई तक काटा जाता है। (बी) पानी ठंडा करने वाले घटक जुड़े हुए हैं। (सी) पंप टैंक और रेडिएटर को 12 वी बिजली की आपूर्ति से जोड़ने वाले तार। सामान्य तौर पर, लाल तार सकारात्मक अंत से जुड़ते हैं, और काले तार नकारात्मक छोर से जुड़ते हैं। (डी) पंप में डाला गया शुद्ध पानी। (ई) इष्टतम पंप दक्षता के लिए टैंक दो-तिहाई से अधिक तक भर गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: पेल्टियर और वाटर-कूलिंग असेंबली को जोड़ना। (ए) पेल्टियर को संचालित करने के लिए घटक। (बी) पेल्टियर के गर्म और ठंडे किनारों को निर्धारित करने के लिए असमर्थ बिजली की आपूर्ति का उपयोग करना। सुरक्षा के लिए, 2 V से अधिक का उपयोग नहीं किया जाता है। (सी) तांबे के ब्लॉक की सतह पर थर्मल पेस्ट का भी अनुप्रयोग। (डी) यहां तक कि पेल्टियर गर्म सतह पर थर्मल पेस्ट का अनुप्रयोग। (ई) पेल्टियर के गर्म पक्ष को थर्मल पेस्ट के साथ तांबे के ब्लॉक पर दबाया जाता है। (एफ) इन्फ्रारेड थर्मामीटर का उपयोग पेल्टियर ठंडी सतह के तापमान को मापने के लिए किया जाता है। आदर्श रूप से, ठंडा तापमान -35 डिग्री सेल्सियस के पास पहुंच सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: तांबे की प्लेट और नीलम खिड़की को इकट्ठा करना। (ए) आवश्यक घटक। (बी) थर्मल पेस्ट तांबे की प्लेट की तीन आंतरिक सतहों पर लागू होता है जहां नीलम खिड़की संपर्क करेगी। तांबे की प्लेट के दो नीचे की ओर दिखने वाले दृश्य तीन सतहों के स्थान को दर्शाते हैं। (सी) तांबे की प्लेट के छेद में नीलम खिड़की। (डी) टेप विधानसभा की ऊपरी सतह पर लागू होता है। (ई) शीर्ष-पक्ष: नीली डैश्ड लाइनें टेप को काटने और हटाने के स्थानों को इंगित करती हैं: वर्ग अवसाद, दो छेद, और 70 मिमी व्यास नीलम क्षेत्र। (एफ) नीचे-तरफ: टेप को दिखाया गया है और हटा दिया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: शीतलन चरण अंतिम असेंबली । (ए) तांबे की प्लेट के अवसाद पर थर्मल पेस्ट लागू होता है। (बी) पेल्टियर के ठंडे पक्ष पर थर्मल पेस्ट लगाया जाता है। (सी) पेल्टियर की ठंडी सतह अवसाद से जुड़ी हुई है। (डी) कॉपर कूलिंग ब्लॉक को स्क्रू का उपयोग करके तांबे की प्लेट में लगाया जाता है। अलगाव आधार में शीतलन चरण। (ई) पूर्ण शीतलन अवस्था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: माइक्रोस्कोप और थर्मोकपल माप पर शीतलन चरण। (ए) इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप बेस पर रखा गया शीतलन चरण। नीलम खिड़की पारदर्शी है, जिससे ट्रांसइल्यूमिनेशन की अनुमति मिलती है। (बी) थर्मोकपल थर्मामीटर का उपयोग एनजीएम अगर सतह के तापमान को मापने के लिए किया जाता है। टिप एनजीएम आगर में लगभग 1 मिमी डाली गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 8: शीतलन चरण लक्षण वर्णन और उपयोग । (ए) थर्मल छवियां जो एगर सतह को 1, 3 और 6 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा दिखाती हैं। यहां तक कि केंद्रीय 40 मिमी क्षेत्र (सफेद डैश्ड सर्कल) के भीतर तापमान वितरण। (बी) 12 वोल्ट पर शीतलन चरण पर समय के साथ एनजीएम एगर सतह का तापमान। एनजीएम अगर सतह को -7 डिग्री सेल्सियस से नीचे ठंडा किया जा सकता है। चित्रा 7 बी में विधि द्वारा मापा गया तापमान। (सी) एक विशिष्ट ईमानदार माइक्रोस्कोप पर उपयोग में शीतलन चरण। शीतलन चरण को आसानी से स्थापित या हटाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| धीमी गति से ठंडा करना | तेजी से ठंडा करना | अचानक ठंडा होना | |
| मंच व्यवसाय | कम से कम | लंबा | मध्यम |
| जानवरों के स्थिर होने तक का समय | लंबा | मध्यम | बहुत छोटा |
| स्थिरीकरण की ताकत | बलवान | मध्यम | मध्यम |
| उपयोगकर्ता प्रयास | कम से कम | न्यूनतम से थोड़ा अधिक | अधिकतम |
तालिका 1: शीतलन रणनीतियों की तुलना।
| टीसेट (°C) | त्रिभुज (°C) | Vसेट (V) |
| 1 | 2 | 8 |
| 2 | 3 | 7.4 |
| 3 | 4.5 | 7 |
| 4 | 5.5 | 6.5 |
| 5 | 6 | 5.9 |
| 6 | 6 | 5.5 |
तालिका 2: तेजी से शीतलन रणनीति में वांछित तापमान प्राप्त करने के लिए पैरामीटर।
पूरक फ़ाइल 1: मीट्रिक में कॉपर प्लेट। तांबे की प्लेट को मशीनिंग के लिए ए 2 डी ड्राइंग। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 2: होल्डिंग ब्रैकेट। होल्डिंग ब्रैकेट का एक 3 डी ड्राइंग जिसे सॉलिडवर्क्स द्वारा खोला या संशोधित किया जा सकता है और 3 डी प्रिंटिंग सॉफ्टवेयर में निर्यात किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 3: अलगाव प्लेट। एक अलगाव प्लेट का 3 डी ड्राइंग जिसे सॉलिडवर्क्स द्वारा खोला या संशोधित किया जा सकता है और 3 डी प्रिंटिंग सॉफ्टवेयर में निर्यात किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
मूवी 1: कूलिंग वीडियो। एनजीएम एगर प्लेट पर 2 डिग्री सेल्सियस पर स्थिरीकरण कीड़े। प्लेट को कमरे के तापमान से 2 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया गया था, और कई मिनटों तक 2 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। फिर, शीतलन चरण को बंद कर दिया गया और प्लेटें स्वाभाविक रूप से कमरे के तापमान तक गर्म होने लगीं। वीडियो को 6 मिनट में 1 घंटे के वीडियो को फिट करने के लिए 10 गुना तक तेज किया जाता है। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक तालिका 1: मूल्य अनुमान कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
शीतलन चरण निर्माण, संयोजन और उपयोग इस पांडुलिपि में दिखाया गया है। अधिकांश घटक ऑफ-द-शेल्फ आइटम हैं जिन्हें ऑनलाइन खरीदा जा सकता है। कॉपर प्लेट और नीलम खिड़की जैसे कुछ घटकों को एक कस्टम ऑर्डर की आवश्यकता होती है और इसे बनाने में 1 महीने तक का समय लग सकता है। अन्य घटक जो 3 डी-मुद्रित हो सकते हैं, वे अधिकांश अनुसंधान संस्थानों में आसानी से निर्मित होते हैं (पूरक तालिका 1)। संयोजन प्रक्रिया को केवल कुछ उपकरणों की आवश्यकता होती है और कुछ घंटों में एक गैर-विशेषज्ञ द्वारा जल्दी से किया जा सकता है। इस प्रकार, अधिकांश जैविक प्रयोगशालाओं को इस उपकरण को आसानी से लागू करने में सक्षम होना चाहिए।
शीतलन चरण और शीतलन स्थिरीकरण दृष्टिकोण में मौजूदा स्थिरीकरण विधियों पर कई महत्वपूर्ण सुधार हैं, जो मूल प्रकाशन20 में सावधानीपूर्वक विस्तृत हैं। संक्षेप में, शीतलन चरण मानक माइक्रोस्कोपी वर्कफ़्लो के तहत अपनी विशिष्ट संस्कृति प्लेटों पर भ्रूण और ड्यूअर सहित सभी उम्र के सी एलिगेंस की बड़ी आबादी के मजबूत स्थिरीकरण को सक्षम बनाता है। यह एक मजबूत स्थिरीकरण प्रभाव प्रदान करते हुए, माइक्रोफ्लुइडिक्स जैसे जटिल हार्डवेयर सेटअप की आवश्यकता को समाप्त करता है। इसके अतिरिक्त, यह जानवरों और शोधकर्ताओं के लिए संभावित विषाक्त रासायनिक जोखिम को कम करता है क्योंकि किसी भी रसायन का उपयोग नहीं किया जाता है, जबकि एक समान स्थिरीकरण प्रभाव प्रदान करता है। ये तकनीकी क्षमताएं इस उपकरण के व्यापक अनुप्रयोग और कई प्रयोगों के दृष्टिकोण को सक्षम करती हैं जिनके लिए बड़ी संख्या में जानवरों पर विवो माइक्रोस्कोपी में उच्च-रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है।
डिवाइस के निर्माण के दौरान कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं, जिसमें कूपर प्लेट पर नीलम खिड़की को ठीक करने के लिए सभी थर्मल पेस्ट एप्लिकेशन और चौड़ा टेप शामिल है। थर्मल पेस्ट कम-तापीय प्रतिरोध सामग्री के साथ अंतराल को बदलकर मजबूत तापीय चालकता सुनिश्चित करता है। वांछित शीतलन प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए, पेस्ट को सभी एब्यूटिंग / संपर्क सतहों के बीच ठीक से पेश करने की आवश्यकता होती है, जिसमें पेल्टियर ठंडी सतह से तांबे की प्लेट, पेल्टियर गर्म सतह से कॉपर कूलिंग ब्लॉक और कॉपर प्लेट से नीलम की खिड़की शामिल है। मंच पर लगाया गया चौड़ा टेप हवा और संघनन से हीटिंग को रोकने के लिए तांबे की प्लेट को अलग करता है, जिससे जंग लग जाती है। यह नीलम खिड़की और तांबे की प्लेट के बीच संबंध को भी मजबूत करता है। इस प्रकार, थर्मल पेस्ट और चौड़े टेप दोनों को लागू करने के लिए अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है।
एक वास्तविक शीतलन स्थिरीकरण प्रयोग में, इस पांडुलिपि में प्रदान किए गए पैरामीटर, जैसे वोल्टेज और समय, खेती की प्लेटों और चरण के विशिष्ट गुणों पर निर्भर करते हैं, जैसे कि प्लेटों में आगर की मात्रा, चरण की दक्षता, और परिवेश का तापमान और आर्द्रता। भविष्य के संशोधनों में, वांछित तापमान प्राप्त करने और इसे स्थिर करने के लिए वोल्टेज इनपुट को शीतलन चरण में सक्रिय रूप से समायोजित करने के लिए आनुपातिक-अभिन्न-व्युत्पन्न (पीआईडी) की तरह एक प्रतिक्रिया नियंत्रक स्थापित किया जा सकता है।
इस शीतलन चरण स्थिरीकरण की कई सीमाएं हैं, जिन्हें मूल प्रकाशन20 में सावधानीपूर्वक विस्तृत किया गया है। संक्षेप में, अलग-अलग तापमान पर उठाए गए जानवरों को अलग-अलग डिग्री तक स्थिर किया जाता है, जिन्हें अतिरिक्त बारीक-ट्यूनिंग की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, यह वर्तमान शीतलन चरण उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है। इसके अलावा, खेती की प्लेट पर इमेजिंग या स्क्रीनिंग सीधे प्लेट में संदूषण का परिचय दे सकती है।
हम विभिन्न इमेजिंग प्लेटफार्मों के लिए उपयुक्त शीतलन चरण के नए संस्करणों को डिजाइन कर रहे हैं, जिसमें यौगिक ईमानदार माइक्रोस्कोप और उल्टे माइक्रोस्कोप शामिल हैं। ये नए डिजाइन इन प्लेटफार्मों पर इमेजिंग के दौरान कल्चर प्लेटों पर प्रत्यक्ष पशु शीतलन स्थिरीकरण की अनुमति देंगे। इन शीतलन चरणों पर इमेजिंग सीधे विन्यास के समान लंबी कामकाजी दूरी के वायु विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग करेगी। आजकल, वायु विसर्जन उद्देश्यों में 0.9 तक का संख्यात्मक एपर्चर हो सकता है, जो ग्रीन फ्लोरेसेंस प्रोटीन इमेजिंग के लिए लगभग 300 एनएम रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। इस प्रकार, माइक्रोस्कोप के साथ एक नए शीतलन चरण का संयोजन नियमित रूप से सबमाइक्रोन रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग की अनुमति दे सकता है।
हम अपने अनुभव के अनुसार शीतलन चरण का उपयोग करने के लिए कुछ उपयोगी सुझाव भी प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, व्यक्तियों को यह जांचना चाहिए कि क्या पानी-शीतलन असेंबली के अंदर कोई हवा के बुलबुले हैं। हवा के बुलबुले पेल्टियर गर्म सतह पर शीतलन को नीचा दिखाते हैं और इस प्रकार शीतलन चरण की शीतलन प्रभावशीलता को कम करते हैं। यदि हवा के बुलबुले मौजूद हैं, तो पानी के प्रवाह को बनाने के लिए 12 वी बिजली की आपूर्ति को चालू किया जाना चाहिए और पानी के प्रवाह के सभी घटकों को हिलाया जाना चाहिए। फंसे हुए क्षेत्रों से हवा के बुलबुले को बाहर निकाला जा सकता है और पंप टैंक द्वारा बाहर निकाला जा सकता है। शोधकर्ताओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि वॉटर-कूलिंग असेंबली को इकट्ठा करते समय पानी के प्रवाह ट्यूबिंग को मोड़ा या पार नहीं किया जाता है। ट्यूब झुकने या पार करने से पानी के पर्याप्त प्रवाह को रोका जा सकता है और शीतलन प्रभावकारिता को कम किया जा सकता है। ट्यूब कनेक्शन ठीक से फिट और तंग होना चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो जकड़न सुनिश्चित करने के बजाय एक अलग व्यास के साथ एक नरम ट्यूब का उपयोग किया जा सकता है। पेस्ट को लागू नहीं किया जाना चाहिए, भले ही कनेक्शन पर्याप्त तंग न हो, क्योंकि पेस्ट भविष्य के उपयोग के दौरान क्लॉग पेश कर सकता है। कमरे की आर्द्रता शीतलन प्रदर्शन को प्रभावित करती है और शीतलन चरण पर संघनन और बर्फ का परिचय देती है। शीतलन चरण पर एक खेती प्लेट रखने से पहले, संघनन को हटाने के लिए एक पेपर ऊतक का उपयोग करने या नीलम खिड़की पर बनने वाली बर्फ को जल्दी से हटाने के लिए हीटसिंक का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। पंप टैंक और रेडिएटर पंखे माइक्रोस्कोप में छोटे कंपन पैदा कर सकते हैं यदि वे एक ही मेज पर काम करते हैं। माइक्रोस्कोप कंपन प्राप्त छवि को धुंधला कर देता है और इस प्रकार इससे बचा जाना चाहिए। टैंक और रेडिएटर को यांत्रिक रूप से इन्सुलेट करने के लिए एक कुशन का उपयोग किया जा सकता है, या उन्हें पास की एक अलग मेज पर रखा जा सकता है। पेल्टियर के विद्युत कनेक्शन को उलटकर शीतलन चरण एक हीटिंग चरण बन सकता है।
Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों या हितों के अन्य संघर्षों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
हम तांबा प्लेट मशीनिंग के लिए नूह जोसेफ (पूर्वोत्तर बायोइंजीनियरिंग विभाग) को स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
| 8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
| bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
| copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
| copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
| digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
| isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
| multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
| Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
| packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
| pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
| radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
| sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
| thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
| tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |
References
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