Summary
Detta dokument beskriver protokoll för att konstruera och driva ett kylsteg för att immobilisera C. elegans på sina ursprungliga odlingsplattor i massor.
Abstract
Högupplösta in vivo-mikroskopimetoder kan avslöja subtil information och fina detaljer inuti modelldjuret Caenorhabditis elegans (C. elegans), men kräver stark djurimmobilisering för att förhindra rörelseoskärpa i bilderna. Tyvärr kräver de flesta nuvarande immobiliseringstekniker betydande manuell ansträngning, vilket gör högupplöst bildbehandling med låg genomströmning. Immobilisering av C. elegans förenklas kraftigt genom att använda en kylningsmetod som lätt kan immobilisera hela populationer direkt på sina odlingsplattor. Kylsteget kan etablera och upprätthålla ett brett temperaturområde med en jämn fördelning på odlingsplattan. I den här artikeln dokumenteras hela processen med att bygga kylsteget. Målet är att en typisk forskare utan svårighet kan bygga ett operativt kylsteg i sitt laboratorium enligt detta protokoll. Användning av kylsteget efter tre protokoll visas, och varje protokoll har fördelar för olika experiment. Dessutom visas ett exempel på en kylprofil för scenen när den närmar sig sin slutliga temperatur och några användbara tips för att använda kylimmobilisering.
Introduction
Högupplöst optisk mikroskopi ger ett oumbärligt verktyg för att studera biologiska strukturer in vivo på subcellulär nivå. Många biologiska studier kräver avbildning med submikronupplösning för att lösa subtila anatomiska detaljer, inklusive neuronmorfologi 1,2, membranstruktur3,4 och proteinlokalisering 5,6. En högupplöst bild kräver en exponeringstid på flera millisekunder till sekunder, beroende på bildmodalitet och sond 7,8. För att uppnå optimala resultat är det viktigt att noggrant planera och genomföra mikroskopibaserade experiment. Avgörande för detta arbete är en effektiv djurberedningsmetod som underlättar högupplöst bildbehandling.
Nematoden C. elegans är en allmänt använd modellorganism för att studera många biologiska processer9. Detta lilla djur odlas vanligtvis på agarplattor med nematodtillväxtmedium (NGM), och de reproducerar sig snabbt genom självbefruktning, vilket gör dem väl lämpade för storskaliga studier. Deras transparens och ett brett utbud av märkningstekniker möjliggör enkel visualisering av deras inre anatomi10,11. De fina strukturerna i C. elegans är idealiska för att studera biologiska processer på subcellulär nivå, såsom neuronregenerering 12, neurondegeneration13 och celldelning14. Sådana studier kräver avbildning vid submikronupplösning och djurimmobilisering tillräckligt stark för att förhindra bildsuddighet. Stark immobilisering är särskilt avgörande för tekniker som involverar flera bilder i rum eller tid, såsom 3D-bildstaplar (dvs. z-stackar) och time-lapse-avbildning. Alla djurrörelser mellan exponeringarna kan dölja resultatet. För C. elegans innebär stark immobilisering vanligtvis manuell manipulation av enskilda djur och montering av dem på objektglas med bedövningsmedel15,16. Dessa tids- och arbetsintensiva procedurer gör storskaliga experiment mycket svåra. En immobiliseringsstrategi där djur direkt och reversibelt immobiliseras på sina ursprungliga odlingsplattor kan möjliggöra högupplöst avbildning med hög genomströmning.
Kylning immobilisering av C. elegans har visats i några studier men används inte allmänt. Det kombineras vanligtvis med en mikrofluidisk anordning för att ytterligare begränsa djur17,18,19. Mikrofluidiska enheter är emellertid komplexa, kräver betydande operativ utbildning och kan inte enkelt integreras med typiska fasta odlingsarbetsflöden för C. elegans-experiment. Således används mikrofluidik inte i stor utsträckning för C. elegans immobilisering. Presenteras här, i samband med Chung-laboratoriets senaste publikation20, är införandet av en ny kylimmobiliseringsmetod med hjälp av ett termoelektriskt kylsteg (figur 1) för att ta itu med dessa brister. Med kylsteget kan en typisk 60 mm polystyrenodlingsplatta kylas ner till valfri måltemperatur (T-uppsättning) mellan -8 °C till rumstemperatur. Denna kylningsstegsmetod kan enkelt och reversibelt immobilisera en hel djurpopulation med minimal användaransträngning, vilket eliminerar 98% av djurbearbetningstiden20.
Nedan beskrivs procedurerna för att bygga ett kylsteg från början. Med undantag för bearbetning av delar och 3D-utskrift förväntas hela proceduren ta 4 timmar utan krav på specialverktyg eller expertis. Därefter beskrivs ytterligare tre olika kylstrategier med varierande kylhastigheter och användarinsatser för att immobilisera C. elegans på ett typiskt upprätt mikroskop. Vilken strategi som föredras kan bero på användarprogrammet. Protokollen för dessa tre strategier för kylningimmobilisering beskrivs i detalj.
Protocol
1. Tillverkning och beredning av varje komponent i kylsteget
OBS: Kylsteget består av flera komponenter (se materialförteckning). De flesta komponenterna är färdiga. Safirfönstret kräver en anpassad beställning, medan kopparplattan, hållfästet och isoleringsplattan kan tillverkas på plats med en dator numerisk kontrollkvarn eller 3D-skrivare. Efter den första tillverkningen tar den senare monteringsprocessen cirka 2-3 timmar.
- Använd en dator numerisk kontrollkvarn för att bearbeta kopparplattan från en 170 mm x 120 mm x 3 mm, 99,9% ren kopparmetallplåt (figur 2A). 2D-ritningen för denna tillverkning finns i tilläggsfilen 1. Använd finkornigt sandpapper för att ta bort vassa kanter och smutsiga rester.
- För att tillverka hållarfästet och isoleringsplattan, använd en 3D-skrivare och 1,75 mm diameter polymjölksyra (PLA) filament (figur 2B, C). För bättre kvalitet bör 3D-skrivaren ge en lagerhöjd finare än 0,2 mm.3D modeller finns i Kompletterande fil 2 och Kompletterande fil 3.
2. Konstruktion av vattenkylningsenheten
- Förbered det platinahärdade silikonröret, pumptanken, kopparkylblocket och kylaren (figur 3A) för att bygga vattenkylningsenheten. Förbered ett rakblad, sax och insexnyckel redo att användas. Var medveten om elektriska faror på grund av användning av vatten under hela monteringen.
- Skär silikonröret i tre sektioner med föreslagna längder på 40 cm, 50 cm och 80 cm. Justera längden vid behov.
- Anslut silikonrörssektionerna från steg 2.2 till portarna på kylaren, pumptanken och kopparkylblocket, som visas i figur 3B. Se till att alla anslutningar är vattentäta. Vattenkylningsenheten är nu byggd.
- Förbered vattenkylningsenheten, en 12 V strömförsörjning, tre röda och tre svarta bygeltrådar, en brödbräda och 500 ml renat vatten.
- Se till att arbetsbänken är fri från vätska för elsäkerhet.
- Anslut pumptankarna och kylarens ledningar till 12 V-strömförsörjningen via kopplingsplattan (bild 3C). Brödbrädan används för enkelhets skull.
OBS: För en mer permanent och säker anslutning kan forskare ersätta brödbrädan med lödtrådar. - Öppna pumptanklocket med en platt skruvmejsel. Använd en tratt för att tillsätta vatten tills pumptanken är cirka 80% full (figur 3D). Täck inte pumptanken efter denna fyllning.
- Slå på vattenkylningsenheten genom att ansluta 12 V-strömförsörjningen eller slå på den (om en strömbrytare finns). Efter uppstart kommer vattnet att strömma inuti enheten och fläktarna på kylaren ska blåsa.
- På grund av vattenflödet från pumptanken sjunker vätskenivån i tanken. Tillsätt mer vatten till pumptanken tills den stabiliseras vid nästan 2/3 full (figur 3E).
- Skaka kylaren för att bli av med luftbubblor och täck sedan kyltanken.
- Stäng av strömförsörjningen innan du går till nästa steg.
3. Testa Peltier kalla och heta ytor
OBS: Peltier, en nyckelkomponent i kylsteget, är en aktiv värmepump i fast tillstånd som överför värme från ena sidan till den andra21. En yta på Peltier blir varm och den andra ytan blir kall när den ger elkraft. Som standard markerar Peltier-tillverkare den kalla ytan innan de säljer, men det är fortfarande bra att testa den manuellt innan de monteras.
- Förbered den justerbara strömförsörjningen och peltiern enligt figur 4A.
- Se till att den justerbara strömförsörjningen är avstängd för att förhindra eventuella elektriska faror.
- Anslut den röda kabeln på Peltier till den positiva utgången och den svarta ledningen till den negativa utgången från den avstämbara strömförsörjningen med alligatorklämmor, som är försedda med strömförsörjningen (figur 4B).
- Slå på den justerbara strömförsörjningen och ställ in den på cirka 2 V genom att modulera både spännings- och strömknapparna på strömförsörjningens övre rad. Använd omedelbart ett naket finger för att känna på de två ytorna på Peltier. En yta blir kall inom några sekunder.
- Efter att ha identifierat vilken yta som är kall, stäng omedelbart av strömförsörjningen och koppla bort Peltier.
- Använd en markör för att indikera den kalla ytan för framtida montering.
4. Konstruera enheten för att kyla Peltier med vattenkylningsenhet
- Som visas i figur 4A, förbered den avstängda vattenkylningsenheten, Peltier (kall yta markerad) och termisk pasta (för förbättrad värmeledning).
- Rengör alla ytor på kopparkylblocket med 70% etanol (eller annan renare lösning) i vattenkylningsenheten.
- Applicera cirka 0,4 g termisk pasta på en yta av kopparvattenkylningsblocket och se till att denna ytorientering förhindrar att rören korsar eller böjer sig när de vetter nedåt. Använd en handske för att skydda huden och försök att fördela termisk pasta tunt och jämnt (figur 4C).
- Rengör på samma sätt den heta ytan på Peltier och applicera sedan termisk pasta på ytan (figur 4D).
- Anslut Peltiers heta yta till kopparkylblockets yta med termisk pasta. Tryck på för att säkerställa att den är säker. Följ ledningarnas orientering på Peltier och rören i kopparkylblocket, som visas i figur 4E. Rengör överskottet av termisk pasta.
- Håll både 12 V-strömförsörjningen och den justerbara strömförsörjningen avstängda. Anslut Peltier till den justerbara strömförsörjningen, som i avsnitt 3.
- Kontrollera både el- och vattenkylningsenhetens anslutningar igen och slå sedan på 12 V-strömförsörjningen och den justerbara strömförsörjningen sekventiellt.
- Vrid gradvis den justerbara strömförsörjningen till 12 V. Med den föreslagna Peltier bör strömmen vara cirka 7,3 A.
- Vänta i 2 minuter; temperaturen på Peltiers kalla yta bör bli kallare än -35 °C. Mät denna temperatur med en infraröd termometer (figur 4F). Rör inte vid den kalla ytan för att förhindra skador på händerna.
- Kontrollera alla anslutningar och komponenter om temperaturen inte kan nå under -30 °C. Luftbubblor inuti vattenkylningsaggregatet är en möjlig orsak till suboptimal kylprestanda.
- För att garantera säkerheten i senare steg, stäng av den justerbara strömförsörjningen, vänta 1 minut och stäng sedan av 12 V-strömförsörjningen.
5. Konstruktion av kopparplåt och safirfönstermontering
- Förbered kopparplattan, safirfönstret med en diameter på 80 mm, termisk pasta, ett 4 tum brett band och ett skarpt blad för skärning (figur 5A).
- Rengör försiktigt kopparplattan och safirfönstret med 70% etanol och använd finkornigt sandpapper för att släta grova ytor.
- Applicera termisk pasta på tre inre ytor, som visas i figur 5B. Se till att termisk pasta täcker alla tre ytorna men inte är för tjock, cirka 0,5 mm.
- Lägg kopparplattan på bänkskivan skyddad med skrivarpapper. Papperet gör den senare rengöringen enklare.
- Sätt in safirfönstret i kopparplåthålet (figur 5C). Se till att safiren inte roterar under införandet för att förhindra att termisk pasta flyttas till andra områden. Ta bort överskott av termisk pasta.
- Fäst den 4 tum breda tejpen på den övre ytan av kopparplattan-safirfönsterenheten (ytan som har det fyrkantiga fördjupningsområdet, som visas i figur 5D). Undvik luftbubblor mellan tejpen och kopparytorna under klistring genom att styra vidhäftningen långsamt från ena sidan till den andra.
- Klipp ut de angivna blå streckade områdena på tejpen med ett vasst blad enligt figur 5E. Skärning exponerar de två gänghålen, den fyrkantiga fördjupningen och safirfönstrets 70 mm diameter.
- Tejpa fast bottenytan på kopparplåt-safirfönstret och upprepa sedan skärproceduren (endast safirområdet) på denna yta, såsom visas i figur 5F.
OBS: Nu är safirfönstret fixerat på kopparplattan och kopparytorna är skyddade mot rost.
6. Slutmontering av kylsteg
- Se till att alla viktiga underenheter och komponenter är klara.
- Applicera ca 0,4 g termisk pasta på kopparplattans kvadratiska fördjupning (figur 6A).
- Applicera cirka 0,4 g termisk pasta på Peltiers kalla yta. Observera att Peltier redan är fäst vid kopparkylblocket (figur 6B).
- Anslut Peltiers kalla yta till kopparplattans fördjupning med nedåttryck. Rengör allt överskott av termisk pasta (figur 6C).
- Montera det 3D-tryckta fästet på toppen av kopparkylblocket och använd sedan en insexnyckel för att dra åt två 8-32, 0,5 tum långa skruvar för att fästa fästet på kopparplattan (figur 6D). Använd åtdragning med lågt vridmoment så att det tryckta fästet inte går sönder eller deformeras för att säkerställa korrekt värmeledning från Peltier till koppar.
- Placera kopparplattan i den 3D-utskrivna isoleringsbasen för värmeisolering från bänkskivan eller mikroskopbasen under drift (figur 6D).
- Kylsteget är monterat och klart att användas (figur 6E).
- För mikroskopi, placera det färdiga kylsteget på en upprätt mikroskopplattform (figur 7A).
- Montering av kylsteget är klart. Ytterligare detaljer finns tillgängliga från Chung-laboratoriets följeslagare, som fullständigt karakteriserar de detaljerade strategierna och djurrörelsen20.
OBS: I följande avsnitt diskuteras långsamma, snabba och plötsliga kylprotokoll. N2-hermafroditer vid L4-ålder eller ung vuxen ålder användes för att producera följande data. Strategin för långsam kylning är användbar för immobilisering av 20 °C odlade N2-djur vid 6 °C. 15 °C-odlade N2-djur är starkast immobiliserade vid 1 °C20. En kort jämförelse mellan dessa tre kylprotokoll visas i tabell 1.
7. Protokoll för immobilisering med långsam kylning
- Flytta odlingsplattan med lock till ett kylskåp på 4 °C.
- När du har flyttat odlingsplattan till kylskåpet, slå på kylstegets 12 V-strömförsörjning och ställ in den justerbara strömförsörjningsspänningen på 5,5 V.
- När odlingsplattan med lock har stannat i kylskåpet med 4 °C i 1 timme, överför plattan omedelbart till kylsteget och ta bort locket (figur 7A). Sådana odlingsplattor är vanligtvis runt 6 °C. Det förkylda steget är stabilt och tillräckligt kallt för att hålla agarytan vid 6 °C.
- Om agarens yttemperatur ändras, mätt eller genom notering av djurens rörelser, justera spänningen något tills den stabiliseras vid 6 °C.
- Djur är ordentligt immobiliserade vid tidpunkten för överföringen.
8. Snabbkylande immobiliseringsprotokoll
OBS: Den snabba kylningsstrategin är den mest grundläggande immobiliseringsmetoden (se film 1); emellertid upptar agarplattor ledigt scenen under en längre tid medan de nårT-uppsättningen. När en stark immobilisering behövs ochT-uppsättningen är 6 ° C, förlängs tomgångstiden till cirka 1 h20.
- Slå på kylstegets 12 V-strömförsörjning och ställ in den justerbara strömförsörjningsspänningen på cirka 12 V. Vänta i 10 minuter.
- Ta en odlingsplatta från inkubatorn direkt till kylsteget och ta bort locket.
- När agarytans temperatur har sjunkit till (T set + ΔT) °C, justera den justerbara strömförsörjningen till Vset och vänta tills agaren når Tset. V-uppsättningen är lämplig spänning för att stabilisera agar vidT-uppsättning. ΔT är en variabel som förhindrar överkylning. Se tabell 2 för kombinationen avT-uppsättning, ΔT ochV-uppsättning.
OBS: De data som presenteras i tabell 2 avser specifikt Chung-laboratoriet, och därför bör det noteras att experimentella parametrar kan variera beroende på de unika miljö- och användningsförhållandena för varje enskilt experiment. - Djur immobiliseras när agaren nårT-uppsättningen. Immobilisering förbättras med tiden fram till ~ 50 min efter påbörjad kylning.
9. Abrupt kylimmobiliseringsprotokoll
OBS: Den plötsliga kylningsstrategin förbrukar mest användartid men immobiliserar djuren snabbast från deras odlingstemperatur.
- Slå på kylstegets 12 V-strömförsörjning och vrid den justerbara strömförsörjningsspänningen till cirka 12 V. Håll i 10 minuter.
- Ta med en ledig agarplatta till kylsteget. Använd steg 8.3 i immobiliseringsprotokollet för snabbkylning för att stabilisera agarytans temperatur vidT-uppsättning.
- Flytta djuren från deras ursprungliga odlingsplatta till den kylda plattan som sitter på kylsteget.
- Baserat på den lilla djurstorleken förväntas djuren svalna till Tpå några sekunder och immobiliseras. Immobilisering förbättras med tiden fram till ~ 50 min efter påbörjad kylning.
10. Återupplivning av djur efter kylning immobilisering
- Flytta den kylda odlingsplattan tillbaka till den ursprungliga inkubatorn eller till rumstemperatur.
- Vänta i 20 minuter till 1 h tills alla maskar på plattan återupplivar till sitt normala kryp- och matningsbeteende.
Representative Results
Mätning av kyltemperatur
För de första kylimmobiliseringsexperimenten är det viktigt att spåra agarytans temperatur för att säkerställa att djuren kan immobiliseras ordentligt. Framtida experiment som replikeras från den ursprungliga kan använda samma parametrar, vanligtvis utan frekvent temperaturspårning. För temperaturmätning steriliseras termoelementspetsen på termometern med 70% etanollösning och väntar tills etanolen helt avdunstar innan den används. Därefter förs termoelementspetsen in 1 mm i NGM-agarn för att säkerställa en korrekt temperaturavläsning. Termometerspetsen hålls med hjälp av en klämhållare eller andra hållare (figur 7B).
Temperaturmätning med en infraröd kamera
Kylsteget är utformat för att säkerställa att temperaturfördelningen i plattans centrala yta med en diameter på 40 mm är jämn. En framåtblickande infraröd (FLIR) kamera används för att avbilda temperaturfördelningen på agarytan. Den maximala temperaturskillnaden är cirka 1 °C närT-uppsättningen är 1, 3 eller 6 °C (figur 8A).
Bedömning av kylningshastigheten med strategin för snabb kylning
Den snabba kylningsstrategin används för att karakterisera kylningshastigheten för ett steg vid 12 V. En platta på 20 °C placeras på kylsteget och en termoelementtermometer används för att spåra yttemperaturen. Steget kyler ner plattorna vid 20 °C till 6 °C på 6 minuter, till 1 °C på 10 minuter och stabiliseras slutligen under -7 °C på cirka 40 minuter (figur 8B).
Använda kylsteget på en upprätt mikroskopplattform
Ett upprätt mikroskop innefattar vanligtvis ett mål för avbildning, ett stadium för provhållning och belysning. Detta kylsteg är utformat för användning på ett typiskt upprätt mikroskopsteg med enkel insättning och borttagning (figur 8C). När kylningsimmobilisering behövs för avbildning eller screening placeras kylsteget helt enkelt på mikroskopsteget för att avsluta avbetalningen och vice versa.
Immobilisering av maskar på kylplattan visas i film 1.
Figur 1: 3D-modell av kylstegsapparaten. Elektroniska anslutningar visas inte för tydlighetens skull. En tank pumpar vatten genom kylblocket för att avlägsna värme som överförs av Peltier inbäddad i scenen. En typisk 60 mm polystyrenodlingsplatta kan sitta på det transparenta safirfönstret och kylas av scenen. Modell genererad i Solidworks. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: 3D-modeller av komponenter som ska tillverkas. (A) Kopparplåt. (B) 3D-tryckt hållarfäste. (C) 3D-tryckt isoleringsplatta. Modeller genererade i Solidworks. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Vattenkylningsenhet . a) Enskilda komponenter. Rör skurna till angivna längder. (B) Anslutna vattenkylningskomponenter. (C) Ledningar som ansluter pumptanken och kylaren till 12 V-strömförsörjningen. I allmänhet ansluter röda ledningar till den positiva änden och svarta ledningar till den negativa änden. (D) Renat vatten hälls i pumpen. (E) Tanken fylldes till mer än två tredjedelar för optimal pumpeffektivitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Anslutning av Peltier och vattenkylningsenheten. (A) Komponenter för drift av Peltier. (B) Använda den avstämbara strömförsörjningen för att bestämma Peltiers varma och kalla sidor. För säkerhet används inte mer än 2 V. (C) Även applicering av termisk pasta på ytan av kopparblock. (D) Jämn applicering av termisk pasta på Peltiers heta yta. (E) Peltiers heta sida pressas på kopparblocket med termisk pasta. (F) Infraröd termometer som används för att mäta Peltiers kalla yttemperatur. Helst kan den kalla temperaturen nå nära -35 ° C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Montering av kopparplåt och safirfönster . (A) Komponenter som krävs. (B) Termisk pasta applicerad på tre inre ytor av kopparplattan där safirfönstret kommer i kontakt. Två nedåtriktade vyer av kopparplattan som visar placeringen av de tre ytorna. (C) Safirfönster i kopparplåthålet. (D) Tejp fäst på aggregatets ovansida. (E) Ovansida: Blå streckade linjer anger platserna för att klippa och ta bort tejp: fyrkantig fördjupning, två hål och en safiryta med en diameter på 70 mm. (F) Undersida: Tejpen skärs och tas bort enligt bilden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Slutmontering i kylsteg . (A) Termisk pasta applicerad på kopparplattans fördjupning. (B) Termisk pasta applicerad på den kalla sidan av Peltier. (C) Peltiers kalla yta ansluten till fördjupningen. (D) Kopparkylblock fäst vid kopparplattan med skruvar. Kylsteg i isoleringsbasen. (E) Avslutat kylningssteg. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Kylsteg på mikroskopet och termoelementmätning. (A) Kylsteg placerat på mikroskopbasen för avbildning. Safirfönstret är transparent, vilket möjliggör transillumination. (B) Termoelementtermometer som används för att mäta NGM-agarytans temperatur. Spetsen fördes in ca 1 mm i NGM-agarn. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Karakterisering och användning av kylsteg . a) Värmebilder som visar agarytan kyld till 1, 3 och 6 °C. Jämn temperaturfördelning inom det centrala 40 mm-området (vit streckad cirkel). (B) NGM-agarytans temperatur över tiden på kylsteget vid 12 V. NGM-agarytan kan kylas under -7 °C. Temperatur uppmätt med metoden i figur 7B. (C) Kylsteg som används i ett typiskt upprätt mikroskop. Kylsteget kan enkelt installeras eller tas bort. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| långsam kylning | snabb kylning | plötslig kylning | |
| Scen ockupation | minimum | lång | Medium |
| tid tills djuren är immobiliserade | lång | Medium | mycket kort |
| immobilisering styrka | stark | Medium | Medium |
| Användarens ansträngning | minimum | Något mer än minimum | maximal |
Tabell 1: Jämförelse av kylstrategier.
| T-uppsättning (°C) | ΔT (°C) | V-uppsättning (V) |
| 1 | 2 | 8 |
| 2 | 3 | 7.4 |
| 3 | 4.5 | 7 |
| 4 | 5.5 | 6.5 |
| 5 | 6 | 5.9 |
| 6 | 6 | 5.5 |
Tabell 2: Parametrar för att uppnå önskad temperatur i snabbkylningsstrategin.
Kompletterande fil 1: Kopparplåt i metrisk. A2D-ritning för bearbetning av kopparplattan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Håll fäste. En 3D-ritning av ett hållarfäste som kan öppnas eller modifieras av Solidworks och exporteras till 3D-utskriftsprogram. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Isoleringsplatta. En 3D-ritning av en isoleringsplatta som kan öppnas eller modifieras av Solidworks och exporteras till 3D-utskriftsprogram. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Film 1: Kyla video. Immobiliseringsmaskar på NGM-agarplattan vid 2 °C. Plattan kyldes ner från rumstemperatur till 2 °C och stannade vid 2 °C i flera minuter. Sedan stängdes kylsteget av och plattorna började värmas upp till rumstemperatur naturligt. Videon påskyndas med 10x för att passa en 1 timmes video på 6 minuter. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande tabell 1: Prisuppskattning Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Kylningssteget tillverkning, montering och användning visas i detta manuskript. De flesta komponenterna är färdiga artiklar som kan köpas online. Vissa komponenter, som kopparplattan och safirfönstret, behöver en anpassad beställning och kan ta upp till 1 månad att tillverka. Andra komponenter som kan 3D-printas tillverkas enkelt i de flesta forskningsinstitutioner (kompletterande tabell 1). Monteringsprocessen behöver bara några verktyg och kan snabbt göras av en icke-expert på några timmar. Således bör de flesta biologiska laboratorier enkelt kunna implementera denna enhet.
Kylningssteget och kylningsimmobiliseringsmetoden har flera betydande förbättringar jämfört med befintliga immobiliseringsmetoder, noggrant detaljerade i den ursprungliga publikationen20. I korthet möjliggör kylningssteget en stark immobilisering av stora populationer av C. elegans i alla åldrar, inklusive embryon och dauers, på deras typiska odlingsplattor under standardmikroskopiarbetsflöden. Det eliminerar behovet av komplexa hårdvaruinställningar, som mikrofluidik, samtidigt som det ger en starkare immobiliseringseffekt. Dessutom minimerar det eventuell giftig kemisk exponering för djur och forskare eftersom inga kemikalier används, samtidigt som det ger en liknande immobiliseringseffekt. Dessa tekniska möjligheter möjliggör en bred tillämpning av denna enhet och tillvägagångssätt för många experiment som kräver högupplöst in vivo-mikroskopi på ett stort antal djur.
Det finns några kritiska steg under byggandet av enheten, inklusive all termisk pastaapplikation och den breda tejpen för att fixera safirfönstret på cooperplattan. Den termiska pastan säkerställer stark värmeledningsförmåga genom att ersätta luckor med ett material med låg värmebeständighet. För att uppnå önskad kylprestanda måste pastan föras in ordentligt mellan alla angränsande / kontaktytor, inklusive Peltier kalla ytan till kopparplattan, Peltier heta ytan till kopparkylblocket och kopparplattan till safirfönstret. Den breda tejpen som appliceras på scenen isolerar kopparplattan för att förhindra uppvärmning från luft och kondens, vilket leder till rost. Det stärker också anslutningen mellan safirfönstret och kopparplattan. Således kräver både applicering av termisk pasta och den breda tejpen extra omsorg.
I ett verkligt kylimmobiliseringsexperiment beror parametrarna i detta manuskript, såsom spänningar och tider, på de specifika egenskaperna hos odlingsplattorna och steget, såsom mängden agar i plattorna, scenens effektivitet och omgivningstemperaturen och fuktigheten. I framtida modifieringar kan en återkopplingsregulator installeras, som ett proportionellt integralderivat (PID), för att aktivt justera spänningsingången till kylsteget för att uppnå önskad temperatur och stabilisera den.
Det finns flera begränsningar av denna immobilisering av kylsteget, noggrant detaljerad i originalpublikationen20. Kort sagt, djur som föds upp vid olika temperaturer immobiliseras i olika grad, vilket kan behöva extra finjustering. Dessutom är detta nuvarande kylsteg inte konstruerat för ett inverterat mikroskop. Vidare kan avbildning eller screening på en odlingsplatta direkt införa kontaminering på plattan.
Vi designar nya versioner av kylsteget som är lämpliga för olika bildplattformar, inklusive sammansatta upprättstående mikroskop och inverterade mikroskop. Dessa nya konstruktioner möjliggör direkt immobilisering av djurkylning på odlingsplattor under avbildning på dessa plattformar. Avbildningen på dessa kylsteg kommer att använda långa arbetsavstånd luftnedsänkningsmål, liknande den upprättstående konfigurationen. Numera kan luftsänkningsmål ha en numerisk bländare på upp till 0,9, vilket ger en upplösning på cirka 300 nm för grön fluorescensproteinavbildning. Således kan kombinationen av ett nytt kylsteg med ett mikroskop möjliggöra fluorescensavbildning med submikronupplösning rutinmässigt.
Vi ger också några användbara tips för att använda kylsteget enligt vår erfarenhet. Till exempel bör individer kontrollera om det finns några luftbubblor inuti vattenkylningsaggregatet. Luftbubblor försämrar kylningen till Peltiers heta yta och försämrar därmed kylstegets kyleffektivitet. Om luftbubblor är närvarande ska 12 V-strömförsörjningen slås på för att få vattnet att flöda och alla komponenter i vattenflödet ska skakas. Luftbubblor kan spolas ut från instängda områden och ventileras av pumptanken. Forskare bör se till att vattenflödesröret inte böjs eller korsas vid montering av vattenkylningsaggregatet. Rörböjning eller korsning kan förhindra tillräckligt vattenflöde och minska kyleffektiviteten. Röranslutningarna ska vara ordentligt passande och täta. Vid behov kan ett mjukt rör med en annan diameter användas istället för att säkerställa täthet. Pasta bör inte appliceras, även om anslutningen inte är tillräckligt tät, eftersom pasta kan införa träskor under framtida användning. Luftfuktigheten i rummet påverkar kylprestandan och inför kondens och is i kylsteget. Innan du placerar en odlingsplatta på kylsteget rekommenderas att du använder en pappersvävnad för att ta bort kondens eller använder en kylfläns för att snabbt ta bort is som har bildats på safirfönstret. Pumptanken och radiatorfläktarna kan orsaka små vibrationer i mikroskopet om de arbetar på samma bord. Mikroskopvibrationer suddar ut den förvärvade bilden och bör därför undvikas. En kudde kan användas för att mekaniskt isolera tanken och kylaren, eller de kan placeras på ett separat närliggande bord. Kylsteget kan bli ett uppvärmningssteg genom att vända den elektriska anslutningen till Peltier.
Disclosures
Författarna redovisar inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi erkänner Noah Joseph (Northeastern Bioengineering Department) för kopparplåtbearbetningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
| 8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
| bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
| copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
| copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
| digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
| isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
| multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
| Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
| packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
| pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
| radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
| sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
| thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
| tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |
References
- Wearne, S. L., et al. New techniques for imaging, digitization and analysis of three-dimensional neural morphology on multiple scales. Neuroscience. 136 (3), 661-680 (2005).
- Zhou, Z., Sorensen, S., Zeng, H., Hawrylycz, M., Peng, H. Adaptive image enhancement for tracing 3D morphologies of neurons and brain vasculatures. Neuroinformatics. 13 (2), 153-166 (2015).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Optical techniques for imaging membrane topography. Cell Biochemistry and Biophysics. 41 (3), 391-414 (2004).
- Chan, C. Y., Faragalla, Y., Wu, L. -G. Illuminating membrane structural dynamics of fusion and endocytosis with advanced light imaging techniques. Biochemical Society Transactions. 50 (4), 1157-1167 (2022).
- Chen, Y., Periasamy, A. Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 72-80 (2004).
- Chen, Y., Mills, J. D., Periasamy, A. Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM. Differentiation. 71 (9-10), 528-541 (2003).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 311-318 (2012).
- Brenner, S.
- Hobert, O., Loria, P.
- Emmons, S. W., Yemini, E., Zimmer, M. Methods for analyzing neuronal structure and activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 218 (4), (2021).
- Chung, S. H., et al. Novel DLK-independent neuronal regeneration in Caenorhabditis elegans shares links with activity-dependent ectopic outgrowth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), E2852-E2860 (2016).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A.
- Pintard, L., Bowerman, B. Mitotic cell division in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (1), 35-73 (2019).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Chung, K. H., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nature Communications. 2, 271 (2011).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Wang, Y. L., Grooms, N. W. F., Jaklitsch, E. L., Schulting, L. G., Chung, S. H. High-throughput submicron-resolution microscopy of Caenorhabditis elegans populations under strong immobilization by cooling cultivation plates. iScience. 26 (2), 105999 (2023).
- Zhao, D., Tan, G. A review of thermoelectric cooling: Materials, modeling and applications. Applied Thermal Engineering. 66 (1-2), 15-24 (2014).
