Summary
Dette papiret beskriver protokoller for konstruksjon og drift av et kjøletrinn for å immobilisere C. elegans på deres originale dyrkingsplater i massevis.
Abstract
Høyoppløselige in vivo-mikroskopitilnærminger kan avsløre subtil informasjon og fine detaljer inne i modelldyret Caenorhabditis elegans (C. elegans), men krever sterk dyreimmobilisering for å forhindre bevegelsesuskarphet i bildene. Dessverre krever de fleste nåværende immobiliseringsteknikker betydelig manuell innsats, noe som gir høyoppløselig bildebehandling lav gjennomstrømning. Immobilisering av C. elegans er sterkt forenklet ved å bruke en kjølemetode som lett kan immobilisere hele populasjoner direkte på dyrkingsplater. Kjøletrinnet kan etablere og opprettholde et bredt temperaturområde med en jevn fordeling på dyrkingsplaten. I denne artikkelen er hele prosessen med å bygge kjøletrinnet dokumentert. Målet er at en typisk forsker kan bygge et operativt kjøletrinn i laboratoriet sitt etter denne protokollen uten problemer. Utnyttelse av kjøletrinnet etter tre protokoller vises, og hver protokoll har fordeler for forskjellige eksperimenter. Også vist er et eksempel på kjøleprofil av scenen når den nærmer seg sin endelige temperatur og noen nyttige tips ved bruk av kjøling immobilisering.
Introduction
Høyoppløselig optisk mikroskopi gir et uunnværlig verktøy for å studere in vivo biologiske strukturer på subcellulært nivå. Mange biologiske studier krever avbildning med submikronoppløsning for å løse subtile anatomiske detaljer, inkludert nevronmorfologi 1,2, membranstruktur3,4 og proteinlokalisering 5,6. Et høyoppløselig bilde krever en eksponeringstid på flere millisekunder til sekunder, avhengig av bildemodaliteten og sonden 7,8. For å oppnå optimale resultater er det viktig å planlegge og gjennomføre mikroskopibaserte eksperimenter nøye. Avgjørende for denne innsatsen er en effektiv dyreforberedelsesmetode som muliggjør høyoppløselig bildebehandling.
Nematoden C. elegans er en mye brukt modellorganisme for å studere mange biologiske prosesser9. Dette lille dyret dyrkes vanligvis på nematodevekstmedium (NGM) agarplater, og de reproduserer raskt ved selvbefruktning, noe som gjør dem godt egnet for store studier. Deres gjennomsiktighet og et bredt spekter av merkingsteknikker tillater enkel visualisering av deres indre anatomi10,11. De fine strukturene i C. elegans er ideelle for å studere biologiske prosesser på subcellulært nivå, som nevronregenerering 12, nevrondegenerasjon13 og celledeling14. Slike studier nødvendiggjør avbildning ved submikronoppløsning og immobilisering av dyr som er sterk nok til å forhindre uskarphet i bildet. Sterk immobilisering er spesielt viktig for teknikker som involverer flere bilder i rom eller tid, for eksempel 3D-bildestakker (dvs. z-stabler) og time-lapse-avbildning. Enhver dyrebevegelse mellom eksponeringene kan skjule resultatet. For C. elegans innebærer sterk immobilisering vanligvis manuell manipulering av individuelle dyr og montering av dem på lysbilder med bedøvelse15,16. Disse tids- og arbeidskrevende prosedyrene gjør storskala eksperimenter svært vanskelige. En immobiliseringsstrategi der dyr direkte og reversibelt immobiliseres på sine originale dyrkingsplater, kan muliggjøre høyoppløselig avbildning med høy gjennomstrømning.
Kjøling immobilisering av C. elegans har blitt vist i noen få studier, men er ikke mye brukt. Det er vanligvis kombinert med en mikrofluidisk enhet for å begrense dyreneytterligere 17,18,19. Imidlertid er mikrofluidiske enheter komplekse, krever betydelig operativ trening, og kan ikke enkelt integreres med typiske faste dyrkingsarbeidsflyter av C. elegans-eksperimenter. Dermed er mikrofluidikk ikke mye brukt for C. elegans immobilisering. Presentert her, i forbindelse med Chung-laboratoriets nylige publikasjon20, er introduksjonen av en ny kjøleimmobiliseringstilnærming ved hjelp av et termoelektrisk kjøletrinn (figur 1) for å løse disse manglene. Med kjøletrinnet kan en typisk 60 mm dyrkingsplate av polystyren kjøles ned til en hvilken som helst måltemperatur (T-sett) mellom -8 °C og romtemperatur. Denne tilnærmingen til kjøletrinn kan lett og reversibelt immobilisere en hel dyrepopulasjon med minimal brukerinnsats, og eliminere 98% av dyrebehandlingstiden20.
Nedenfor beskrives prosedyrene for å bygge et kjøletrinn fra bunnen av. Bortsett fra maskinering av deler og 3D-utskrift, forventes hele prosedyren å ta 4 timer uten krav om spesialverktøy eller ekspertise. Deretter beskrives tre forskjellige kjølestrategier med varierende kjølehastigheter og brukerinnsats for å immobilisere C. elegans på et typisk oppreist mikroskop. Den foretrukne strategien kan avhenge av brukerapplikasjonen. Protokollene for disse tre kjøleimmobiliseringsstrategiene er beskrevet i detalj.
Protocol
1. Fremstilling og klargjøring av hver komponent i kjøletrinnet
MERK: Kjøletrinnet består av flere komponenter (se Materialfortegnelse). De fleste komponentene er hyllevare. Safirvinduet krever en tilpasset bestilling, mens kobberplaten, holdebraketten og isolasjonsplaten kan produseres på stedet med en numerisk kontrollfres eller 3D-skriver. Etter den første produksjonen tar den senere monteringsprosessen rundt 2-3 timer.
- Bruk en numerisk kontrollfres til å bearbeide kobberplaten fra en 170 mm x 120 mm x 3 mm, 99,9 % ren kobbermetallplate (figur 2A). 2D-tegningen for denne produksjonen finnes i tilleggsfilen 1. Bruk finkornet sandpapir for å fjerne skarpe kanter og skitne rester.
- For å produsere holdebraketten og isolasjonsplaten, bruk en 3D-skriver og 1,75 mm diameter polymelkesyre (PLA) filament (figur 2B,C). For bedre kvalitet bør 3D-skriveren ha en laghøyde som er finere enn 0,2 mm.3D Tilleggsfil 2 og Tilleggsfil 3.
2. Konstruksjon av vannkjølingsenheten
- Forbered det platinaherdede silikonrøret, pumpetanken, kjøleblokken i kobber og radiatoren (figur 3A) for å bygge vannkjølingsenheten. Forbered et barberblad, saks og sekskantnøkkel klar til bruk. Vær oppmerksom på elektriske farer på grunn av bruk av vann under hele monteringen.
- Klipp silikonrøret i tre seksjoner med foreslåtte lengder på 40 cm, 50 cm og 80 cm. Juster lengden etter behov.
- Koble silikonrørseksjonene fra trinn 2.2 til portene på radiatoren, pumpetanken og kobberkjøleblokken, som vist i figur 3B. Forsikre deg om at alle tilkoblingene er vanntette. Den vannkjølende enheten er nå bygget.
- Forbered vannkjølingsenheten, en 12 V strømforsyning, tre røde og tre svarte jumperledninger, et brødbrett og 500 ml renset vann.
- Forsikre deg om at arbeidsbenken er fri for væske for elektrisk sikkerhet.
- Koble pumpetankene og radiatorledningene til 12 V strømforsyningen gjennom brødfjølen (figur 3C). Brødbrettet brukes for enkelhets skyld.
NOTAT: For en mer permanent og sikker tilkobling kan forskere erstatte brødbrettet med loddetråder. - Åpne pumpetanklokket med en flatskrutrekker. Bruk en trakt til å tilsette vann til pumpetanken er ca. 80 % full (figur 3D). Ikke sett lokk på pumpetanken etter denne fyllingen.
- Slå på vannkjølingsenheten ved å koble til 12 V strømforsyningen eller slå den på (hvis det er en bryter). Etter oppstart vil vannet strømme inne i forsamlingen og viftene på radiatoren skal blåse.
- På grunn av vannstrømmen fra pumpetanken vil væskenivået i tanken synke. Tilsett mer vann i pumpetanken til den stabiliserer seg på nesten 2/3 full (figur 3E).
- Rist radiatoren for å bli kvitt luftbobler, og dekk deretter kjøletanken.
- Slå av strømforsyningen før du går til neste trinn.
3. Testing av Peltier kalde og varme overflater
MERK: Peltier, en nøkkelkomponent i kjøletrinnet, er en solid-state aktiv varmepumpe som overfører varme fra den ene siden til den andre21. En overflate av Peltier blir varm, og den andre overflaten blir kald når den gir elektrisk kraft. Som standard markerer Peltier-produsenter den kalde overflaten før de selger, men det er fortsatt nyttig å teste den manuelt før montering.
- Klargjør den justerbare strømforsyningen og Peltier, som vist i figur 4A.
- Forsikre deg om at den justerbare strømforsyningen er slått av for å forhindre mulige elektriske farer.
- Koble den røde ledningen til Peltier til den positive utgangen og den svarte ledningen til den negative utgangen til den justerbare strømforsyningen med alligatorklips, som følger med strømforsyningen (figur 4B).
- Slå på den justerbare strømforsyningen og sett den til rundt 2 V ved å modulere både spennings- og strømknappene på den øverste raden i strømforsyningen. Bruk umiddelbart en bar finger for å føle de to overflatene på Peltier. En overflate blir kald i løpet av få sekunder.
- Når du har identifisert hvilken overflate som er kald, må du umiddelbart slå av strømforsyningen og koble fra Peltier.
- Bruk en markør for å indikere den kalde overflaten for fremtidig montering.
4. Konstruere forsamlingen for å avkjøle Peltier ved hjelp av vannkjølende montering
- Som vist i figur 4A, klargjør du den avslåtte vannkjølingsenheten, Peltier (merket med kald overflate) og termisk pasta (for forbedret varmeledning).
- Rengjør alle overflater av kobberkjøleblokken med 70% etanol (eller annen renere løsning) i vannkjølingsenheten.
- Påfør rundt 0,4 g termisk pasta på en overflate av kobbervannkjøleblokken, og sørg for at denne overflateretningen forhindrer at rørene krysser eller bøyer seg når de vender ned. Bruk en hanske for å beskytte huden og prøv å fordele den termiske pastaen tynt og jevnt (figur 4C).
- Rengjør på samme måte den varme overflaten på Peltier, og påfør deretter termisk pasta på overflaten (figur 4D).
- Koble Peltier varm overflate til kobberkjøleblokkoverflaten med termisk pasta. Bruk press for å sikre at det er sikkert. Følg retningen på ledningene på Peltier og rørene til kobberkjøleblokken, som vist i figur 4E. Rengjør overflødig termisk pasta.
- Hold både 12 V-strømforsyningen og den justerbare strømforsyningen av. Koble Peltier til den justerbare strømforsyningen, som i avsnitt 3.
- Kontroller monteringstilkoblingene for både elektrisk og vannkjøling, og slå deretter på 12 V-strømforsyningen og den justerbare strømforsyningen sekvensielt.
- Vri gradvis den justerbare strømforsyningen til 12 V. Med den foreslåtte Peltier, bør strømmen være rundt 7,3 A.
- Vent i 2 min; temperaturen på Peltiers kalde overflate bør bli kaldere enn -35 °C. Mål denne temperaturen med et infrarødt termometer (figur 4F). Ikke berør den kalde overflaten for å unngå skade på hendene.
- Kontroller alle tilkoblinger og komponenter hvis temperaturen ikke kan nå under -30 °C. Luftbobler inne i den vannkjølende enheten er en mulig årsak til suboptimal kjøleytelse.
- For å sikre sikkerhet i senere trinn, slå av den justerbare strømforsyningen, vent 1 min og slå deretter av 12 V strømforsyningen.
5. Konstruksjon av kobberplate og safirvindusmontering
- Forbered kobberplaten, safirvinduet på 80 mm diameter, termisk pasta, et 4 tommers bredt tape og et skarpt blad for skjæring (figur 5A).
- Rengjør kobberplaten og safirvinduet forsiktig med 70 % etanol og bruk finkornet sandpapir til å glatte grove overflater.
- Påfør termisk pasta på tre indre overflater, som vist i figur 5B. Forsikre deg om at termisk pasta dekker alle tre overflatene, men ikke er for tykk, rundt 0,5 mm.
- Legg kobberplaten på benken beskyttet med skriverpapir. Papiret gjør den senere oppryddingen enklere.
- Sett safirvinduet inn i kobberplatehullet (figur 5C). Forsikre deg om at safiren ikke roterer under innsetting for å forhindre at termisk pasta beveger seg til andre områder. Fjern overflødig termisk pasta.
- Fest det 4 tommer brede båndet til den øverste overflaten av kobberplaten-safirvindusenheten (overflaten som har det firkantede forsenkningsområdet, som vist i figur 5D). Unngå luftbobler mellom tape- og kobberoverflatene under liming ved å lede vedheftet sakte fra den ene siden til den andre.
- Klipp ut de angitte blå stiplede områdene på båndet med et skarpt blad, etter figur 5E. Skjæring eksponerer de to trådhullene, den firkantede forsenkningen og 70 mm diameterarealet til safirvinduet.
- Teip den nederste overflaten av kobberplatesafirvinduet, og gjenta deretter skjæreprosedyren (kun safirområde) på denne overflaten, som vist i figur 5F.
NOTAT: Nå er safirvinduet festet til kobberplaten, og kobberflatene er beskyttet mot rust.
6. Sluttmontering av kjøletrinn
- Forsikre deg om at all viktig undermontering og komponenter er klare.
- Påfør ca. 0,4 g termisk pasta på kobberplatens firkantede fordypning (figur 6A).
- Påfør ca. 0,4 g termisk pasta på den kalde overflaten av Peltier. Merk at Peltier allerede er festet til kjøleblokken i kobber (figur 6B).
- Koble Peltier kald overflate til kobberplaten depresjon med nedadgående trykk. Rengjør alt overflødig termisk pasta (figur 6C).
- Monter den 3D-printede braketten på toppen av kobberkjøleblokken, og bruk deretter en sekskantnøkkel til å stramme to 8-32, 0,5 tommers lange skruer for å feste braketten til kobberplaten (figur 6D). Bruk stramming med lavt dreiemoment slik at den trykte braketten ikke går i stykker eller deformeres for å sikre riktig varmeledning fra Peltier til kobber.
- Plasser kobberplaten i den 3D-printede isolasjonsbasen for termisk isolasjon fra benkeplaten eller mikroskopbunnen under drift (figur 6D).
- Kjøletrinnet er montert og klart til bruk (figur 6E).
- For mikroskopi, plasser det fullførte kjøletrinnet på en stående mikroskopplattform (figur 7A).
- Montering av kjøletrinnet er fullført. Ytterligere detaljer er tilgjengelig fra Chung Laboratorys ledsagende publikasjon, som fullt ut karakteriserer de detaljerte strategiene og dyrebevegelsene20.
MERK: I de følgende avsnittene diskuteres langsomme, raske og brå kjøleprotokoller. N2-hermafroditter ved L4 eller ung voksen alder ble brukt til å produsere følgende data. Den langsomme kjølestrategien er nyttig for immobilisering av 20 °C dyrkede N2-dyr ved 6 °C; 15 °C-dyrkede N2-dyr immobiliseres sterkest ved 1 °C20. En kort sammenligning mellom disse tre kjøleprotokollene er vist i tabell 1.
7. Langsom avkjøling immobiliseringsprotokoll
- Flytt dyrkingsplaten med lokket over på et kjøleskap på 4 °C.
- Etter å ha flyttet planteplaten til kjøleskapet, slå på kjøletrinnets 12 V strømforsyning og sett den justerbare strømforsyningsspenningen til 5,5 V.
- Etter at dyrkingsplaten med lokk har stått i 4 °C kjøleskap i 1 time, overfør platen umiddelbart til kjøletrinnet og fjern lokket (figur 7A). Slike dyrkingsplater ligger vanligvis rundt 6 °C. Det forkjølte stadiet er stabilt og kaldt nok til å holde agaroverflaten ved 6 °C.
- Hvis agaroverflatetemperaturen endres, målt eller ved å registrere dyrs bevegelser, juster spenningen litt til den stabiliserer seg ved 6 °C.
- Dyrene er riktig immobilisert på overføringstidspunktet.
8. Rask avkjøling immobiliseringsprotokoll
MERK: Hurtigkjølingsstrategien er den mest grunnleggende immobiliseringsmetoden (se film 1); agarplater okkuperer imidlertid scenen i lengre tid mens de nårT-settet. Også når en sterk immobilisering er nødvendig ogT-settet er 6 ° C, forlenges tomgangstiden til rundt 1 time20.
- Slå på kjøletrinnets 12 V strømforsyning og sett den justerbare strømforsyningsspenningen til rundt 12 V. Vent i 10 minutter.
- Ta en dyrkingsplate fra inkubatoren direkte til kjøletrinnet og fjern lokket.
- Når agaroverflatetemperaturen synker til (T-sett + ΔT) °C, justerer du den justerbare strømforsyningen tilV-sett og venter til agaren når T-innstillingen. V-settet er riktig spenning for å stabilisere agar vedT-sett. ΔT er en variabel som forhindrer overkjøling. Se tabell 2 for kombinasjonen av T-sett, ΔT ogV-sett.
MERK: Dataene som presenteres i tabell 2 gjelder spesifikt for Chung-laboratoriet, og det bør derfor bemerkes at eksperimentelle parametere kan variere basert på de unike miljø- og bruksforholdene til hvert enkelt eksperiment. - Dyr immobiliseres når agar nårT-settet. Immobilisering forbedres med tiden til ~ 50 min etter initiering av kjøling.
9. Brå kjøling immobiliseringsprotokoll
MERK: Den brå kjølestrategien bruker mest brukertid, men immobiliserer dyrene raskest fra dyrkingstemperaturen.
- Slå på kjøletrinnets 12 V strømforsyning og vri den justerbare strømforsyningsspenningen til rundt 12 V. Oppbevares i 10 minutter.
- Ta en ledig agarplate til kjøletrinnet. Bruk trinn 8.3 i immobiliseringsprotokollen for hurtigkjøling for å stabilisere agaroverflatetemperaturen vedT-innstilling.
- Flytt dyrene fra den originale dyrkingsplaten til den avkjølte platen som sitter på kjøletrinnet.
- Basert på den lille dyrestørrelsen, forventes dyrene å avkjøles tilT-sett i løpet av sekunder og bli immobilisert. Immobilisering forbedres med tiden til ~ 50 min etter initiering av kjøling.
10. Gjenoppliving av dyr etter avkjøling immobilisering
- Flytt den avkjølte kulturplaten tilbake til den opprinnelige inkubatoren eller til romtemperatur.
- Vent i 20 minutter til 1 time til alle ormene på tallerkenen gjenoppliver til normal kryping og fôringsadferd.
Representative Results
Måling av kjøletemperatur
For de første immobiliseringsforsøkene for kjøling er det viktig å spore agaroverflatetemperaturen for å sikre at dyrene kan immobiliseres riktig. Fremtidige eksperimenter som replikeres fra den opprinnelige, kan bruke de samme parametrene, vanligvis uten hyppig temperatursporing. For temperaturmåling steriliseres termoelementspissen til termometeret ved bruk av 70% etanolløsning, og venter til etanolen fordamper helt før bruk. Deretter settes termoelementspissen 1 mm inn i NGM-agaren for å sikre en nøyaktig temperaturavlesning. Termometerspissen holdes ved hjelp av en klemmeholder eller andre holdere (figur 7B).
Temperaturmåling med infrarødt kamera
Kjøletrinnet er utformet for å sikre at temperaturfordelingen i platens sentrale areal på 40 mm diameter er jevn. Et fremoverskuende infrarødt (FLIR) kamera brukes til å avbilde temperaturfordelingen på agaroverflaten. Maksimal temperaturforskjell er rundt 1 °C nårT-innstillingen er 1, 3 eller 6 °C (figur 8A).
Vurdering av kjølehastigheten med hurtigkjølingsstrategien
Den raske kjølestrategien brukes til å karakterisere kjølehastigheten til et trinn ved 12 V. En 20 ° C plate er plassert på kjøletrinnet og et termoelement termometer brukes til å spore overflatetemperaturen. Trinnet kjøler ned 20 °C-platene til 6 °C på 6 minutter til 1 °C på 10 minutter, og stabiliserer seg til slutt under -7 °C på rundt 40 minutter (figur 8B).
Bruke kjøletrinnet på en oppreist mikroskopplattform
Et oppreist mikroskop består vanligvis av et mål for avbildning, et stadium for prøveoppbevaring og belysning. Dette kjøletrinnet er designet for bruk på et typisk stående mikroskopstadium med enkel innsetting og fjerning (figur 8C). Når kjøling immobilisering er nødvendig for avbildning eller screening, er kjøletrinnet ganske enkelt plassert på mikroskoptrinnet for å fullføre installasjonen og omvendt.
Immobilisering av ormer på kjøleplaten er vist i film 1.
Figur 1: 3D-modell av kjøletrinnsapparatet. Elektroniske tilkoblinger vises ikke for klarhet. En tank pumper vann gjennom kjøleblokken for å fjerne varme overført av Peltier innebygd i scenen. En typisk 60 mm dyrkingsplate av polystyren kan sitte på det gjennomsiktige safirvinduet og avkjøles av trinnet. Modell generert i Solidworks. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: 3D-modeller av komponenter som skal produseres. (A) Kobberplate. (B) 3D-trykt holdeparentes. (C) 3D-trykt isolasjonsplate. Modeller generert i Solidworks. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vannkjølende montering . (A) Individuelle komponenter. Rør kuttet til bestemte lengder. (B) Vannkjølende komponenter tilkoblet. (C) Ledninger som forbinder pumpetanken og radiatoren til 12 V strømforsyningen. Generelt kobles røde ledninger til positiv ende, og svarte ledninger til den negative enden. (D) Renset vann helles i pumpen. (E) Tanken fylt til mer enn to tredjedeler for optimal pumpeeffektivitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Koble til Peltier og vannkjølingsenheten. (A) Komponenter for å betjene Peltier. (B) Bruk av den justerbare strømforsyningen for å bestemme de varme og kalde sidene av Peltier. For sikkerhets skyld brukes ikke mer enn 2 V. (C) Jevn påføring av termisk pasta på overflaten av kobberblokk. (D) Jevn påføring av termisk pasta på Peltier varm overflate. (E) Varm side av Peltier presset på kobberblokken med termisk pasta. (F) Infrarødt termometer som brukes til å måle Peltiers kalde overflatetemperatur. Ideelt sett kan den kalde temperaturen komme opp i nær -35 °C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Montering av kobberplaten og safirvinduet . (A) Komponenter som kreves. (B) Termisk pasta påført tre indre overflater av kobberplaten der safirvinduet kommer i kontakt. To nedadgående bilder av kobberplaten som viser plasseringen av de tre flatene. (C) Safirvindu i kobberplatehullet. (D) Tape påført på den øverste overflaten av enheten. (E) Overside: Blå stiplede linjer indikerer stedene som skal kuttes og fjernes tape: firkantet forsenkning, to hull og et safirområde med en diameter på 70 mm. (F) Nederst: Teip kuttes og fjernes som vist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Sluttmontering av kjøletrinn . (A) Termisk pasta påført fordypningen av kobberplaten. (B) Termisk pasta påført den kalde siden av Peltier. (C) Kald overflate av Peltier koblet til depresjonen. (D) Kjøleblokk av kobber festet til kobberplaten ved hjelp av skruer. Kjøletrinn i isolasjonsbasen. (E) Fullført kjøletrinn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Kjøletrinn på mikroskop og termoelementmåling. (A) Kjøletrinn plassert på mikroskopbasen for avbildning. Safirvinduet er gjennomsiktig, noe som tillater transilluminasjon. (B) Termoelementtermometer som brukes til å måle NGM-agaroverflatetemperaturen. Spissen satte inn ca. 1 mm i NGM-agar. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Karakterisering og bruk av kjøletrinn . (A) Termiske bilder som viser agaroverflaten avkjølt til 1, 3 og 6 °C. Jevn temperaturfordeling innenfor det sentrale 40 mm-området (hvit stiplet sirkel). (B) Temperaturen på NGM-agaroverflaten over tid på kjøletrinnet ved 12 V. NGM-agaroverflaten kan avkjøles til under -7 °C. Temperatur målt ved metoden i figur 7B. (C) Kjøletrinn i bruk på et typisk stående mikroskop. Kjøletrinnet kan enkelt installeres eller fjernes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| langsom avkjøling | rask kjøling | brå nedkjøling | |
| scene okkupasjon | minimum | lang | Middels |
| tid til dyrene er immobilisert | lang | Middels | veldig kort |
| immobilisering styrke | sterk | Middels | Middels |
| Bruker innsats | minimum | litt mer enn minimum | maksimum |
Tabell 1: Sammenligning av kjølestrategier.
| T-innstilt (°C) | ΔT (°C) | V-sett (V) |
| 1 | 2 | 8 |
| 2 | 3 | 7.4 |
| 3 | 4.5 | 7 |
| 4 | 5.5 | 6.5 |
| 5 | 6 | 5.9 |
| 6 | 6 | 5.5 |
Tabell 2: Parametere for å oppnå ønsket temperatur i hurtigkjølingsstrategien.
Tilleggsfil 1: Kobberplate i metrisk. A2D-tegning for bearbeiding av kobberplaten. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Holdingparentes. En 3D-tegning av en holdebrakett som kan åpnes eller modifiseres av Solidworks og eksporteres til 3D-printprogramvare. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Isolasjonsplate. En 3D-tegning av en isolasjonsplate som kan åpnes eller modifiseres av Solidworks og eksporteres til 3D-utskriftsprogramvare. Klikk her for å laste ned denne filen.
Film 1: Avkjølende video. Immobiliseringsormer på NGM-agarplaten ved 2 °C. Platen ble kjølt ned fra romtemperatur til 2 °C og holdt seg på 2 °C i flere minutter. Deretter ble kjøletrinnet slått av og platene begynte å varme opp til romtemperatur naturlig. Videoen er fremskyndet med 10x for å passe en 1 h video i 6 min. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Tilleggstabell 1: Prisestimering Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Produksjon, montering og bruk av kjøletrinn er vist i dette manuskriptet. De fleste komponentene er hyllevarer som kan kjøpes online. Noen komponenter, som kobberplaten og safirvinduet, trenger en tilpasset bestilling og kan ta opptil 1 måned å fremstille. Andre komponenter som kan 3D-printes, fremstilles enkelt ved de fleste forskningsinstitusjoner (tilleggstabell 1). Monteringsprosessen trenger bare noen få verktøy og kan raskt gjøres av en ikke-ekspert på noen få timer. Dermed bør de fleste biologiske laboratorier enkelt kunne implementere denne enheten.
Kjøletrinnet og kjøleimmobiliseringstilnærmingen har flere betydelige forbedringer i forhold til eksisterende immobiliseringsmetoder, nøye beskrevet i den opprinnelige publikasjonen20. Kort fortalt muliggjør avkjølingstrinnet sterk immobilisering av store populasjoner av C. elegans i alle aldre, inkludert embryoer og dauer, på deres typiske dyrkningsplater under standard mikroskopiarbeidsflyter. Det eliminerer behovet for komplekse maskinvareoppsett, som mikrofluidikk, samtidig som det gir en sterkere immobiliseringseffekt. I tillegg minimerer det mulig giftig kjemisk eksponering for dyr og forskere siden ingen kjemikalier brukes, samtidig som det gir en lignende immobiliseringseffekt. Disse tekniske egenskapene muliggjør bred anvendelse av denne enheten og tilnærming til mange eksperimenter som krever høy oppløsning in vivo mikroskopi på et stort antall dyr.
Det er noen kritiske trinn under byggingen av enheten, inkludert all termisk pastaapplikasjon og det brede båndet for å feste safirvinduet til cooper-platen. Den termiske pastaen sikrer sterk varmeledningsevne ved å erstatte hull med et materiale med lav termisk motstand. For å oppnå ønsket kjøleytelse må pastaen innføres riktig mellom alle tilstøtende / kontaktflater, inkludert Peltier kald overflate til kobberplaten, Peltier varm overflate til kobberkjøleblokken og kobberplaten til safirvinduet. Det brede båndet som påføres scenen isolerer kobberplaten for å forhindre oppvarming fra luft og kondens, noe som fører til rust. Det styrker også forbindelsen mellom safirvinduet og kobberplaten. Dermed krever både påføring av termisk pasta og det brede båndet ekstra forsiktighet.
I et faktisk avkjølende immobiliseringseksperiment avhenger parametrene gitt i dette manuskriptet, for eksempel spenninger og tider, av de spesifikke egenskapene til dyrkingsplatene og scenen, for eksempel mengden agar i platene, scenens effektivitet og omgivelsestemperatur og fuktighet. I fremtidige modifikasjoner kan en tilbakemeldingskontroller installeres, som en proporsjonal-integral-derivat (PID), for aktivt å justere spenningsinngangen til kjøletrinnet for å oppnå ønsket temperatur og stabilisere den.
Det er flere begrensninger ved denne immobiliseringen av kjøletrinnet, nøye beskrevet i den opprinnelige publikasjonen20. Kort sagt, dyr oppdratt ved forskjellige temperaturer er immobilisert i forskjellige grader, noe som kan trenge ekstra finjustering. Også dette nåværende kjøletrinnet er ikke designet for et omvendt mikroskop. Videre kan avbildning eller screening på en dyrkingsplate direkte introdusere forurensning til platen.
Vi designer nye versjoner av kjøletrinnet som passer for forskjellige bildeplattformer, inkludert sammensatte stående mikroskoper og inverterte mikroskoper. Disse nye designene vil tillate direkte dyrekjøling immobilisering på kulturplater under avbildning på disse plattformene. Avbildningen på disse kjøletrinnene vil bruke langdistanse luftnedsenkingsmål, som ligner på den stående konfigurasjonen. I dag kan luftnedsenkingsmål ha en numerisk blenderåpning på opptil 0,9, noe som gir rundt en oppløsning på 300 nm for grønn fluorescensproteinavbildning. Dermed kan kombinasjonen av et nytt kjøletrinn med et mikroskop tillate submikronoppløsning fluorescensavbildning rutinemessig.
Vi gir også noen nyttige tips for bruk av kjøletrinnet i henhold til vår erfaring. For eksempel bør enkeltpersoner sjekke om det er noen luftbobler inne i vannkjølingsenheten. Luftbobler nedbryter kjølingen til Peltiers varme overflate og forringer dermed kjøletrinnets kjøleeffektivitet. Hvis luftbobler er til stede, bør 12 V strømforsyningen slås på for å få vannstrømmen til å strømme og alle komponentene i vannstrømmen skal ristes. Luftbobler kan spyles ut fra fangede områder og ventileres ut av pumpetanken. Forskere bør sørge for at vannstrømningsslangen ikke bøyes eller krysses ved montering av vannkjølingsenheten. Rørbøyning eller kryssing kan forhindre tilstrekkelig vannstrøm og redusere kjøleeffektiviteten. Rørforbindelser skal være riktig passform og tett. Om nødvendig kan et mykt rør med en annen diameter brukes i stedet for å sikre tetthet. Lim bør ikke brukes, selv om forbindelsen ikke er tett nok, da lim kan introdusere tresko under fremtidig bruk. Luftfuktigheten i rommet påvirker kjøleytelsen og introduserer kondens og is på kjøletrinnet. Før du legger en dyrkingsplate på kjøletrinnet, anbefales det å bruke et papirlommetørkle for å fjerne kondens eller bruke en kjøleribbe for raskt å fjerne is som har dannet seg på safirvinduet. Pumpetanken og radiatorviftene kan forårsake små vibrasjoner i mikroskopet hvis de jobber på samme bord. Mikroskopvibrasjon gjør bildet som er tatt uskarpt og bør derfor unngås. En pute kan brukes til å isolere tanken og radiatoren mekanisk, eller de kan plasseres på et eget bord i nærheten. Kjøletrinnet kan bli et oppvarmingstrinn ved å reversere den elektriske tilkoblingen til Peltier.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Noah Joseph (Northeastern Bioengineering Department) for kobberplatebearbeiding.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
| 8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
| bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
| copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
| copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
| digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
| isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
| multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
| Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
| packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
| pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
| radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
| sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
| thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
| tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |
References
- Wearne, S. L., et al. New techniques for imaging, digitization and analysis of three-dimensional neural morphology on multiple scales. Neuroscience. 136 (3), 661-680 (2005).
- Zhou, Z., Sorensen, S., Zeng, H., Hawrylycz, M., Peng, H. Adaptive image enhancement for tracing 3D morphologies of neurons and brain vasculatures. Neuroinformatics. 13 (2), 153-166 (2015).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Optical techniques for imaging membrane topography. Cell Biochemistry and Biophysics. 41 (3), 391-414 (2004).
- Chan, C. Y., Faragalla, Y., Wu, L. -G. Illuminating membrane structural dynamics of fusion and endocytosis with advanced light imaging techniques. Biochemical Society Transactions. 50 (4), 1157-1167 (2022).
- Chen, Y., Periasamy, A. Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 72-80 (2004).
- Chen, Y., Mills, J. D., Periasamy, A. Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM. Differentiation. 71 (9-10), 528-541 (2003).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 311-318 (2012).
- Brenner, S.
- Hobert, O., Loria, P.
- Emmons, S. W., Yemini, E., Zimmer, M. Methods for analyzing neuronal structure and activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 218 (4), (2021).
- Chung, S. H., et al. Novel DLK-independent neuronal regeneration in Caenorhabditis elegans shares links with activity-dependent ectopic outgrowth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), E2852-E2860 (2016).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A.
- Pintard, L., Bowerman, B. Mitotic cell division in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (1), 35-73 (2019).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Chung, K. H., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nature Communications. 2, 271 (2011).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Wang, Y. L., Grooms, N. W. F., Jaklitsch, E. L., Schulting, L. G., Chung, S. H. High-throughput submicron-resolution microscopy of Caenorhabditis elegans populations under strong immobilization by cooling cultivation plates. iScience. 26 (2), 105999 (2023).
- Zhao, D., Tan, G. A review of thermoelectric cooling: Materials, modeling and applications. Applied Thermal Engineering. 66 (1-2), 15-24 (2014).
