Summary
En forbedret metode til måling af pollenhydreringsprofiler i Arabidopsis thaliana er beskrevet her. Den nye metode tilbyder højere opløsning, er ikke-invasiv og er meget reproducerbar. Protokollen repræsenterer et nyt værktøj til en finere dissektion af de processer, der regulerer de tidlige stadier af bestøvning.
Abstract
Seksuel reproduktion i blomstrende planter kræver indledende interaktion mellem pollenkornet og den stigmatiske overflade, hvor der etableres en molekylær dialog mellem de interaktive partnere. Undersøgelser på tværs af en række arter har afsløret, at en række molekylære kontrolpunkter regulerer pollen-stigma-interaktionen for at sikre, at kun kompatibel, generelt intraspecifik pollen har succes med at påvirke befrugtning. I arter, der har et 'tørt stigma', såsom modelplanten Arabidopsis thaliana, er det første kontrolpunkt efter bestøvning, præzygotisk kompatibilitet, etablering af pollenhydrering.
Denne bestøvningsfase er stramt reguleret, hvorved signaler fra pollenkornet fremkalder frigivelse af vand fra stigmatiseringen, hvilket tillader pollenhydrering. Evnen til nøjagtigt at måle og spore pollenhydrering over tid er nøglen til design af eksperimenter rettet mod at forstå reguleringen af dette kritiske trin i reproduktion. Offentliggjorte protokoller bruger ofte blomster, der er blevet udskåret fra moderplanten, vedligeholdt på flydende eller faste medier og bulkbestøvet.
Dette papir beskriver et ikke-invasivt, in vivo bestøvningsbioassay, der tillader minut-for-minut hydreringssporing af individuelle A. thaliana pollenkorn i høj opløsning. Assayet er meget reproducerbart, i stand til at detektere meget subtile variationer af pollenhydratiseringsprofiler og er således velegnet til analyse af mutanter, der påvirker veje, der regulerer bestøvning. Selvom protokollen er længere end dem, der er beskrevet for bulkbestøvninger, gør den præcision og reproducerbarhed, den giver, sammen med dens in vivo-natur , den ideel til detaljeret dissektion af bestøvningsfænotyper.
Introduction
Vellykket seksuel reproduktion i angiospermer er typisk afhængig af overførsel af intraspecifikke pollenkorn fra anther til stigma, enten inden for eller mellem individer (dvs. bestøvning). Denne overførsel af pollenkorn til en modtagelig blomst medieres normalt af bestøvere eller abiotiske faktorer; Som sådan resulterer dette også ofte i aflejring af heterospecifik pollen under naturlige forhold. Med nogle få undtagelser er progressionen af bestøvning med heterospecifik pollen evolutionært ufordelagtig, hvilket reducerer reproduktionsegnetheden gennem tabte parringsmuligheder, hvor de fleste resulterende hybridafkom enten ikke udvikler sig hensigtsmæssigt eller er sterile1. Således har der udviklet sig mekanismer til at blokere bestøvning af 'inkompatibel' heterospecifik pollen2. Hurtig genkendelse af kompatibel pollen er derfor uden tvivl den vigtigste proces i de tidlige stadier af seksuel reproduktion i mange blomstrende planter.
I familien Brassicaceae, hvor stigmatiseringer er af den 'tørre' type, virker en række molekylære kontrolpunkter på flere stadier i reproduktionsprocessen, der regulerer bestøvning, således at kun kompatibel pollen er vellykket. Pollenhydrering er et af de vigtigste kontrolpunkter (figur 1), da pollen, der ikke hydrerer, ikke kan udvikle sig til at producere et pollenrør og derefter levere sæd til den kvindelige gametofyt. Ofte undlader uforenelige korn at passere dette første bestøvningskontrolpunkt og får derfor ikke adgang til stigmatisk vand3. Blandt medlemmer af familien Brassicaceae sker genkendelsen af pollen hurtigt, idet kompatibiliteten etableres inden for få minutter efter pollenkornets fastgørelse til støvlen 4,5. I de senere år er der gjort store fremskridt, og vi begynder nu at forstå de molekylære mekanismer, der regulerer vigtige bestøvningskontrolpunkter.
Figur 1: Oversigt over vigtige hændelser under kompatibel bestøvning. Disse stadier, såsom pollenhydrering og pollenrørspiring, er også bestøvningskontrolpunkter, der skal navigeres med succes for at opnå kompatibel bestøvning. Diagrammet repræsenterer en 'tør' type stigma, som er typisk for arter fra Brassicaceae-familien 2,20. Klik her for at se en større version af denne figur.
Banebrydende forskning i Brassica selvinkompatibilitet (SI) system, hvor 'selv' pollen anerkendes og afvises, etablerede paradigmet for pollen-stigma anerkendelse i Brassicaceae 6,7,8,9,10. SI i Brassica og dets slægtninge medieres af 'genkendelsesproteiner', der befinder sig på overfladen af pollen og ved den stigmatiske plasmamembran, der ved interaktion fører til pollenafstødning. SI-pollenafvisning fungerer ved forstyrrelse af det basale pollen-stigma-kompatibilitetssystem, som, når det aktiveres fuldt ud af opfattelsen af kompatibelt pollen, fører til målrettet sekretion af stigmatiseringen og dermed driver pollenhydrering (for anmeldelser af pollenkompatibilitetsmekanismen, se11,12). I eksemplet med SI er den pollenbårne ligand et lille cysteinrigt protein, S-locus cystein rig (SCR / SP11), og den stigmatiske receptor er S-locus receptorkinase (SRK).
For nylig, i Arabidopsis thaliana, en anden gruppe af små cystein-rige pollen-bårne proteiner, pollen coat protein klasse Bs (VedPCP-Bs), har vist sig at være vigtige regulatorer af pollen accept gennem aktivering af pollen hydrering13. Stigmatiske receptorer af AtPCP-Bs og aspekter af nedstrøms reguleringsvejen er også for nylig blevet beskrevet14,15. Interessant nok har mutationsundersøgelser af gener, der koder for potentielle pollenbårne og stigmatiske signalmediatorer af pollenhydrering (herunder vedPCP-Bs) undladt at generere planter, der har en komplet blok til pollenhydreringskontrolpunktet. Dette tyder stærkt på, at flere andre, men uopdagede, faktorer spiller en rolle i reguleringen af pollenhydrering. Med udgangspunkt i den metode, der først blev beskrevet af Wang et al.13, beskriver vi her et forbedret in vivo-bioassay med høj opløsning, der er egnet til identifikation af subtile pollenhydratiseringsdefekter i kandidatmutante A. thaliana-linjer.
Protocol
1. Plantevækst og forberedelse af blomster
- Stratificere A. thaliana frø i 0,1% agarose eller sterilt vand i 3 dage ved 4 ° C eller som tørre frø i 16-24 timer ved -20 ° C (uNASC, personlig kommunikation).
- Overfør de stratificerede frø til potter kompost og læg dem i et miljøkontrolleret vækstkammer. Formere planter med en 16: 8 timer, lys: mørk fotoperiode leveret af lysstofrør (130 μmol m-2 s-1). Hold temperaturen på 21 ± 2 °C med ca. 40% relativ luftfugtighed.
- Sørg for, at pollendonor- og recipientplanter sammen med eventuelle andre passende "kontrolplantelinjer" sås sammen for at sikre synkron blomstring. Formere planterne i ca. 6 uger, indtil blomsterstandene er veletablerede.
- Vælg fase 12 blomsterknopper på pollenmodtagerplanten 1 dag før bioassay for emasculation 16,17 - disse er uåbnede blomsterknopper, der vil fuldføre blomsteråbning og anther dehiscens den følgende dag18.
BEMÆRK: Undgå de første tre blomster produceret på hovedblomsten, da disse typisk udviser usædvanlig reproduktiv adfærd. Hvis det er tilgængeligt og passende til undersøgelsen, skal du bruge en mandlig steril plantelinje, såsom A. thaliana (tiltrædelse Col-0) pA9-barnase-linje, hvor støvknapper ikke modnes19. - For at emasculere blomster af pollenmodtageren skal du placere planten i sin gryde på sin side. Tape plantestammen i regionen tæt på blomsterne, der vil blive emaskuleret, til et glasglas, der er på plads under et stereodissekerende mikroskop.
- Brug et par finspidsede tang til forsigtigt at åbne blomsterknoppen og fjerne alle blomsterblade og støvknapper. Sørg for, at støvlen er ubeskadiget, og at stigmatiseringen er fri for forurenende pollen.
BEMÆRK: Mandlige sterile plantelinjer kræver ikke emasculation. - Sæt planterne tilbage i vækstkammeret og sørg for, at de emaskulerede blomster ikke kommer i kontakt med andre planter eller fremmedlegemer.
2. Pollenhydreringsanalyse-rå dataindsamling
- Den følgende morgen fjernes planterne fra vækstkammeret. Læg pollenmodtagerplanten på sin side og placer blomsten på scenen af et omvendt mikroskop (figur 2), så stigmatiseringen kan afbildes tydeligt.
- Fastgør placeringen af blomsten, der skal afbildes, ved at immobilisere stammen til et glasglas ved hjælp af strimler af maskeringstape. Hold temperaturen mellem 18 °C og 25 °C og relativ luftfugtighed under 60 %.
BEMÆRK: For pA9-barnase mandlige sterile plantelinje er det optimalt at udføre analysen om morgenen, når blomsterne åbner og kronbladene ikke hindrer synsfeltet. - Fjern derefter en sund og nyåbnet blomst fra pollendonorplanten. Anbring under et dissekerende mikroskop og saml et par pollenkorn på spidsen af rene finspidsede tang ved forsigtigt at røre støvknapperne (figur 3A). En øjenvipper tapet til en kort stang er også et effektivt værktøj til indsamling og overførsel af pollen (figur 3C).
- Fjern overskydende pollen fra tangen ved let at røre dem mod blomsternes kronblade, hvorfra pollenkornene blev høstet, indtil der dannes et monolag pollenkorn ved spidsen af tangen.
BEMÆRK: Et monolag af pollenkorn på spidsen af finspidsede tang vil betydeligt lette overførsel af enkeltkorn i efterfølgende trin. Det er også muligt at opnå et enkelt pollenkorn på tangen ved denne teknik (supplerende video S1). - Gå tilbage til pollenrecipientplanten og brug en objektivlinse med lav effekt (f.eks. 10x objektivlinse; Figur 3B), fokuser det omvendte mikroskop på stigmatiseringen, der skal bestøves.
- Hold tangen langs åbningen mellem tangens arme (figur 4), og nærm dig forsigtigt en ubestøvet ('jomfru') stigmatisk papillacelle.
BEMÆRK: Vi har fundet ud af, at denne metode til at holde tangen hjælper fingerfærdighed og reducerer virkningen af rystende hænder. En mikromanipulator kan bruges til brugere, der er mindre erfarne eller har svært ved præcist at anvende et enkelt pollenkorn i hånden. - Vælg et passende placeret pollenkorn på tangen til overførsel til stigmaet. Fortsæt med at nærme sig den ubestøvede stigmatiske papillacelle, indtil det valgte pollenkorn får let kontakt med overfladen. Træk langsomt tangen ud og bekræft pollenvedhæftningen (figur 5).
BEMÆRK: Supplerende video S1 og supplerende video S2 demonstrerer dette trin med både enkelte og flere pollenkorn til stede på tangen. - Sørg for, at pollenkornet er orienteret således, at dets ækvatoriale akse er tydeligt synlig og i skarpt fokus. Skift straks til en objektivlinse med højere effekt (f.eks. 20x), og tag et billede af pollenkornet. Dette første billede er T = 0. Fortsæt med at tage yderligere billeder med 1 min intervaller i alt 10 min.
- Juster fokus efter behov for at imødekomme små bevægelser i pollenkornet eller stigmaet. Registrer omgivelsestemperaturen og den relative luftfugtighed i rummet hvert 2. minut for at muliggøre fremtidige sammenligninger mellem eksperimentelle replikater.
- Når alle billederne er taget, skal du gemme dem i et tabsfrit format, såsom producentens proprietære format eller som TIFF'er.
BEMÆRK: Der vil være 11 billeder pr. pollenkorn, der udtages prøver af (supplerende figur S1). De automatiserede/manuelle indstillinger for timelapse-anskaffelse i de fleste proprietære billedoptagelsessoftware er nyttige funktioner til at lette organiseringen af hver tidsserie. - Gentag trin 2.4 til 2.9 for yderligere pollenkorn. Indhente data for næsten ækvivalente antal bekæmpelser (vildtype [WT]) og eksperimentelle bestøvninger.
Figur 2: Udstyrsopsætning anvendt til pollenhydreringsbioassay. I dette eksempel var en pA9-barnase mandlig steril plantelinje pollenmodtageren. Planten, inden for sin gryde, blev placeret på sin side, og stammen tapet til et glasglas placeret på mikroskopets stadium. For at reducere mekanisk belastning og hjælpe positionering af planten blev der brugt en justerbar platform til at understøtte plantepotten. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Opsamling af pollenkorn fra pollendonorblomsten. Billeder viser brugen af (A) finspidsede pincet og (C) et stykke øjenvipper. Klumper af pollen (rød pil) skal fjernes ved let at røre dem mod kronblade af donorblomsterne, indtil der opnås et monolag pollenkorn (grøn pil). (B) Højopløsningsbillede af en ubestøvet A. thaliana (Col-0) pA9-barnase mandlig steril linjestigma, der har nået det passende udviklingsstadium for pollenhydreringsbioassayet. Skalabjælke = 100 μm (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Metode til at holde tang ved overførsel af pollen til modtagerstigmaet. (A) Forkert orientering for fastholdelse af tangen; (B) korrekt retning for at holde pincetten. At holde tangen sidelæns i denne konfiguration, som betegnet ved tommelfingerens position mellem tangens arme, giver større stabilitet for at lette overførslen af pollenkorn til ubestøvede stigmatiske papiller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Overførsel af et enkelt pollenkorn fra spidsen af en pincet til en ubestøvet ('jomfru') stigmatisk papillacelle fra en pA9-barnase mandlig steril plante. (A) Forsigtig tilgang til papillacellen. (B) Fastgørelse af et passende placeret pollenkorn (blå pil) til papillacellen (orange pil). (C) Udtagning af tang og visuel bekræftelse af pollenvedhæftning (lilla pil). Panelerne A-C blev afbildet med et 10x objektivobjektiv (10,5 mm arbejdsafstand; 0,25 numerisk blænde) og er snapshots afledt af videoklippet præsenteret i supplerende video S1. (D) Overgang til et 20x objektivobjektiv (2,1 mm arbejdsafstand; 0,5 numerisk blænde) til initiering af billedoptagelse i en tidsserie. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Pollen hydrering assay-målinger
- Definer hastigheden af pollenhydrering som ændringen i længden af pollenkornets halv-mindre akse (figur 6) (dvs. ækvatorialradius) over tid og præsenter det som procentvis ændring (ligning [1]):
(1) - Ved hjælp af billedanalysesoftware registreres halv-mindre akseværdier for hvert pollenkorn i forsøgsserien.
BEMÆRK: Navnet på denne målingsindstilling er softwareafhængigt, f.eks. "Roteret ellipse" eller "5-punkts ellipse". - Gentag trin 3.1-3.2 for alle andre pollenkorn, der skal måles. For at opnå konsistens skal du anvende den samme grad af digital zoom og den samme tilgang til at definere 'pollengrænsen' for alle målinger i datasættene.
- Når alle målingerne er fuldført for en tidsserie, skal du eksportere de rå semi-minor-akseværdier for hver billedstak til et regneark og præsentere dataene i kolonner pr. billedstak. Sørg for, at data fra mindst 15 hydratiserede pollenkorn medtages i analysen for hver plantelinje (supplerende tabel S1).
- Det er ikke usædvanligt, at et lille antal pollenkorn ikke hydrerer eller hydrerer betydeligt langsommere end forventet. Disse 'dud' korn kan være resultatet af dårlig kontakt mellem korn og papilla celle eller relateret til pollen levedygtighed. Se efter og udelad disse fra datasættet, medmindre disse kræves i deres eksperimentelle design.
- Beregn middelværdierne for hvert tidspunkt pr. plantelinje. Brug uparrede t-tests og envejs ANOVA til statistisk analyse af hydreringsdata fra WT og mutantlinjer på hvert tidspunkt. Brug en multipel t-test til samtidig sammenligning af middelværdien mellem WT og mutantlinjer på tværs af flere tidspunkter.
BEMÆRK: XY-plots er også meget nyttige til at visualisere den overordnede tendens til pollenhydrering mellem plantelinjerne, der sammenlignes.
(1)
Figur 6: WT pollenkorn hydrerende på en stigmatisk papilla celle af A. thaliana (Col-0; pA9-barnase mandlige sterile linje). (A) Tidspunkt nul, 0 (0 KORT) og (B) 10 KORT. Den røde cirkel omkring pollenkornet er "pollengrænsen", der er defineret og tegnet af operatøren ved hjælp af billedanalysesoftware. De grønne og mørkerøde linjer inde i pollen repræsenterer henholdsvis semi-major og semi-minor akser. Længden af den halve akse bruges til at beregne graden af pollenhydrering. En fuld tidsserie af dette datasæt findes i supplerende figur S1. Billedet blev taget med et 20x objektivobjektiv (2,1 mm arbejdsafstand; 0,5 numerisk blænde). Skalastænger = 50 μm. Forkortelse: MAP = min-efter-bestøvning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Representative Results
Dette afsnit præsenterer to sæt eksempler på pollenhydreringsdata, indsamlet som beskrevet ovenfor, for A. thaliana. Det første datasæt består af tre replikater af en pollenhydreringstidsserie for WT-planter, hvor hver replikat indsamles på en anden dag. Hver replikat indeholder ikke mindre end 18 individuelle pollenkornværdier, i alt 55 pollenkorn på tværs af alle tre replikater. Minimums- og maksimumsværdierne for middelværdierne mellem replikater for alle tidspunkter lå inden for 3 % (figur 7 og supplerende tabel S1). Disse repræsentative data for WT-bestøvninger viser tydeligt den høje grad af konsistens, der kan opnås ved hjælp af den her beskrevne metode til relativt lave prøveantal og på tværs af forskellige dage.
Figur 7: XY-plot, der viser konsistensen af A. thaliana vildtype pollenhydreringsprofiler over en periode på 10 minutter. Pollenforælderen var Col-0-tiltrædelsen af A. thaliana og pistilforælderen var pA9-barnase-mandens sterile A. thaliana (Col-0) linje. Dataene repræsenterer tre uafhængige datasæt indsamlet på forskellige dage og viser en høj grad af konsistens. Et boks- og halediagram og statistisk analyse af midlerne til disse datasæt er præsenteret i supplerende figur S2. Antallet af målte pollen ('n') for hvert uafhængigt datasæt vises ved siden af syntaksen (WT1/WT2/WT3) på figuren. Forkortelse: WT = vildtype. Klik her for at se en større version af denne figur.
Det andet datasæt blev opnået for en plantelinje, der huser en T-DNA-indsættelse i et pollencoatproteinkodende gen, der genererer en 'knockdown'-mutation, heri benævnt 'KD-mutant'. Mutant pollen blev deponeret på pA9-barnase mandlige sterile stigmas til hydreringsprofilering, som beskrevet i protokollen. Som det fremgår af de resulterende data (figur 8), havde mutant og WT pollen ikke skelnelige hydreringsprofiler i løbet af de første 5 minutter. 5-10 minutter efter bestøvning (MAP) begyndte den gennemsnitlige semi-mindre akseændring for mutant pollen imidlertid at falde bag WT-pollen, idet forskellen blev statistisk signifikant ved 10 MAP. Dette resultat viser ikke kun, at dette pollencoatprotein har en rolle i formidling af pollenhydrering, men illustrerer også pænt nytten af dette højopløselige, enkeltkornede bioassay til sporing af pollenhydrering. I dette særlige eksempel var dets følsomhed i stand til at detektere den subtile effekt af en 'knockdown' af et pollencoatproteinkodende gen.
Figur 8: Pollenhydreringsprofiler for WT og en 'knockdown' pollencoatproteinmutantlinje (KD-mutant). (A) Hydreringsprofiler over en periode på 10 minutter for WT og mutant pollen. Pollenforældrene var Col-0-tiltrædelsen af A. thaliana og pollenpelsproteinet KD-mutant (også i Col-0-baggrunden). I begge tilfælde var pistilforælderen pA9-barnase-mandlig steril A. thaliana (Col-0) linje. (B) Boks- og whisker-plots, der viser omfanget af pollenhydrering (udtrykt i procentvis ændring af halvmol-aksen) ved 5 MAP og 10 MAP for WT og mutante pollendatasæt. Whiskers repræsenterer prøve minimum og maksimum værdier. Bokse viser datasættets nedre kvartil, median og øvre kvartil. Hvide kryds repræsenterer gennemsnittet af datasættet. Uparret t-testanalyse viser, at den gennemsnitlige procentdel af pollenhydrering er signifikant forskellig mellem de to plantelinjer ved 10 MAP. En stjerne angiver p < 0,05 (uparret t-test). Forkortelser: WT = vildtype; KD = knockdown; MAP = min-efter-bestøvning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: En beskåret pollenhydreringsbioassay tidsserie af et WT-pollenkorn, der hydrerer på en stigmatisk papillacelle af en pA9-barnase mandlig steril plante i løbet af 10 min. Billeder blev taget med 1 minuts mellemrum. Billederne ved 0 MAP og 10 MAP blev brugt i figur 6 (separat vedhæftet). Skalabjælke = 50 μm. Forkortelser: WT = vildtype; MAP = min-efter-bestøvning. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Boks- og whiskerplot, der viser omfanget af pollenhydrering (udtrykt i procentvis ændring af semi-mol-aksen) over en periode på 10 minutter for de tre WT-pollendatasæt, der er beskrevet i figur 7. Pistilforælderen var pA9-barnase mandlige sterile A. thaliana (Col-0) linje. Whiskers repræsenterer prøve minimum og maksimum værdier. Bokse viser datasættets nedre kvartil (nedre hængsel), median (midterste hængsel) og øvre kvartil (øvre hængsel). Der vises individuelle datapunkter. Envejs ANOVA viser, at den gennemsnitlige procentdel af pollenhydratiseringsværdier mellem de tre datasæt ikke var statistisk signifikant forskellige fra hinanden i hele 10 minutters tidsperioden. Den signifikante tærskel er p < 0,05 (envejs ANOVA). Forkortelse: WT = vildtype. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S1: Rå pollenhydreringsdata anvendt til at konstruere figur 7 (A. thaliana WT Col-0 pollen på pA9-barnase mandlig steril stigma). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende video S1: En video, der viser overførslen af et enkelt WT (Col-0 tiltrædelse) pollenkorn på spidsen af et par tang til en 'jomfru' stigmatisk papillacelle (pA9-barnase mandlig steril linje). For at lette tilgængeligheden af videoen blev billedkvaliteten med vilje sænket. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende video S2: En video, der demonstrerer overførslen af en enkelt WT (Col-0 tiltrædelse) pollen fra et monolag af pollenkorn i spidsen af et par tang til en 'jomfru' stigmatisk papillacelle (pA9-barnase mandlig steril linje). For at lette tilgængeligheden af videoen blev billedkvaliteten med vilje sænket. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
For blomstrende planter er de meget tidlige stadier af seksuel reproduktion uden tvivl de vigtigste. På niveau med pollen-stigma-interaktionen træffes molekylære beslutninger, der bestemmer de interaktive partneres 'kompatibilitet'. Sådanne beslutninger skal, hvis de træffes korrekt, undgå spild af ressourcer, der kan påvirke reproduktionsevnen21. At tillade kun kompatibel pollen at udføre befrugtning er således en vigtig komponent i opretholdelsen af veltilpassede genotyper og dermed arternes evolutionære succes. Forskning udført med modelplanten A. thaliana har været yderst værdifuld for at uddybe vores forståelse af denne proces. En række undersøgelser i løbet af de sidste par årtier har afsløret tilstedeværelsen af faktorer i pollenpelsen, der virker ved det første kompatibilitetskontrolpunkt, hvor pollen får adgang til stigmatisk vand for at tillade pollenhydrering13. På trods af disse første indsigter i de mekanismer, der regulerer pollen-stigma-kompatibilitet, er der stadig mange huller i vores forståelse af denne proces. Til dato kan ingen mutanter af pollenbårne ligander eller stigmatiske receptorer, der vides at påvirke pollenhydrering, fuldstændigt blokere kompatibel bestøvning, hvilket tyder på tilstedeværelsen af andre uopdagede pollenhydreringsdeterminanter. Ved let at kunne observere fænotypen af interesse er pollenhydreringsbioassayet, der er beskrevet her, en af de mest ligetil teknikker til at studere potentielle mutanter, der regulerer bestøvning.
Eksisterende metoder til måling af pollenhydrering bruger almindeligvis bulkbestøvninger og rapporterer færre tidspunkter 14,22,23 og kan således gå glip af vigtige subtile hydreringsprofilfænotyper. For eksempel har undersøgelsen af Wang et al.13 sammen med arbejde med andre pollencoatproteinmutanter i vores laboratorium (upublicerede observationer) afsløret spændende forskelle i hydreringsprofiler mellem mutanter. Sådanne subtile forskelle kan indeholde vigtige fingerpeg om de reguleringsmekanismer, der ligger til grund for kompatibel bestøvning.
Metoden beskrevet her fokuserer på erhvervelse af relativt små antal målinger mellem mutant- og WT-plantelinjer med vægt på metodologisk præcision for at reducere variationen inden for datasættene. Selvom denne metode er meget reproducerbar (som vist i figur 7), forudsat at temperatur og fugtighed kontrolleres tilstrækkeligt, er det vigtigt at indsamle hydreringsdata for næsten lige mange WT og mutant pollen på samme dag for yderligere at reducere potentialet for variation. Data kan derefter samles på tværs af forskellige dage, hvis det er nødvendigt. Derudover er valg af passende WT-kontrolanlæg afgørende for korrekt fortolkning af hydreringsresultaterne. For pollenmodtageren skal den samme plantelinje bruges til at modtage både WT-kontrol og mutante pollenkorn.
For eksempel bruger vi pA9-barnase mandlige sterile plantelinje, som også er omtalt i videoprotokollen, som pollenmodtager for både WT (kontrol) og mutant (eksperimentel) pollen, når vi undersøger T-DNA pollenmutantlinjer (såsom 'KD' mutanten beskrevet i figur 8). Blanding af data fra en sådan mandlig steril linje, som ikke behøver at blive emaskuleret, med data indsamlet fra en manuelt emaskuleret kontrollinje bør undgås, da disse stigmas sandsynligvis vil opføre sig anderledes. Ligeledes bør emaskulerede mutantlinjer anvendes sammen med en emaskuleret WT (kontrol) linje, når det er muligt. Den samme forsigtighed bør også anvendes, når man overvejer den genetiske baggrund for de undersøgte planter. Mens de mest populære T-DNA-mutantsamlinger blev genereret i Col-0-baggrunden, er andre, såsom FLAG-samlingen fra Institut national de la Recherche Agronomique (INRA), tilgængelige i Wassilewskija (WS) genetiske baggrund24,25. I sådanne tilfælde anbefales det at anvende den respektive økotypes WT-anlægslinjer som kontrol.
Selvom vi her har fokuseret på pollenhydrering i løbet af de første 10 minutter af pollen-stigma-interaktionen, kan denne metode også tilpasses til at omfatte hydreringsprofiler, der dækker en længere periode. Et centralt træk ved protokollen er, at blomster forbliver knyttet til moderplantestrømmen, offentliggjorte protokoller kræver typisk udskæring af støvlen og placering i medier for at opretholde vævet i løbet af eksperimentet14,18,26. Selvom der ikke er noget direkte bevis for, at en sådan semi in vivo-tilgang påvirker pollenhydrering eller faktisk ændrer in vivo-reguleringen af denne proces, er det tænkeligt, at udskæring af blomsterne fra moderplanten kan påvirke bestøvningen. Således opnår denne protokol et ægte in vivo-miljø til undersøgelse af pollen-stigma-interaktionen, hvor plantens strukturelle integritet bevares.
Overførslen af enkelte pollenkorn til 'jomfruelige' stigmatiske papiller er uden tvivl en af de mest udfordrende operationer, der er beskrevet i denne protokol. Det er ikke ualmindeligt at overføre klynger af pollenkorn ved en fejl. Imidlertid kan chancen for, at dette sker, reduceres kraftigt ved at sikre, at kun et monolag pollen er til stede på tangen (figur 3A) (eller endda bare et enkelt pollenkorn; Figur 5), og/eller ved at udnytte pollenkorn, der allerede er orienteret, således at de 'stikker ud' fra andre på spidsen af tangen. Vi har fundet ud af, at en erfaren operatør med succes kan gennemføre overførslen af en enkelt pollen til en stigmatisk papillacelle på cirka 3 minutter og registrere data for op til fem pollenkorn over en periode på 1 time. Således kan der over en periode på 2-4 dage akkumuleres tilstrækkelige data til meningsfuld statistisk analyse af de undersøgte plantelinjer.
Menneskelige fejl er potentielt den største kilde til variation i analysen af datasæt afledt af undersøgelser, der anvender denne protokol. For eksempel kommer definitionen af 'pollengrænsen' under billedanalyse ned til den enkelte forskers vurdering. Der er således potentiale for, at målinger foretaget af forskellige forskere, selv på det samme datasæt, kan generere variation. Hvor det er muligt, bør en enkelt forsker udføre målingerne for at minimere prøveudtagningsfejl. Desuden ophæver koblingen af analysen af WT og mutante datasæt foretaget af den samme operatør den potentielt subjektive definition af »pollengrænsen« og variationen mellem operatørerne.
Afslutningsvis beskrives en sofistikeret, men præcis metode til måling af pollenhydratiseringsprofiler i modelorganismen A. thaliana. Vi har vist, at ved at udnytte denne protokol, meget konsistente pollen hydrering data for A. thaliana let kan erhverves. Tre uafhængige batcher af data for WT-bestøvninger indsamlet på forskellige dage viste konsistente små afvigelser på <3% på tværs af alle tidspunkter (figur 7 og supplerende tabel S1). Selvom bioassayet, der præsenteres her, er lidt mere komplekst end de fleste eksisterende protokoller, er opløsningen af de genererede data overlegen og egnet til identifikation og karakterisering af nye mutanter, der påvirker veje, der regulerer kompatibel bestøvning.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af University of Bath (University of Bath, Bath, UK, BA2 7AY) postgraduate stipendier til Y.-L.L. og L.W. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com (https://biorender.com/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pA9-barnase line | University of Bath | Courtsey of Prof. Rod Scott | Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0 |
| Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm | Fisher | Dumont 500342 | Tweezer uses for transfer of pollen grain |
| GraphPad Prsim (version 8.0.2) | Dotmatics | Prism | Comprehensive data analysis, graphing and statistics software |
| JMP (version 17) | JMP Statistical Discovery LLC | JMP 17 | Statistical analysis software |
| Levington F2S seed & modular compost (with sand) | Levington | LEV75F2SMS | General-purpose compost for plant growth |
| Micromanipulator | Singer instrument Co. LTD. | Singer Micromanipulator | Micromanipulator to aid transfer of pollen grain |
| Nikon Digit sight DS-U1 | Nikon | DS-U1 | Microscope camera (coupletd to SMZ1500) |
| Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | TE2000-S | Inverted microscope |
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | Stereomicroscope |
| Nikon DS-Fi3 microscope camera | Nikon | DS-Fi3 | Microscope camera (coupletd to TE2000-S) |
| Nikon NIS-Elements Basic Research | Nikon | NIS-Elements BR | Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3) |
| Nikon NIS-Elements F | Nikon | NIS-Elements F | Image accquisition and analysis software (for DS-U1) |
| WT Col-0 plant line | uNASC | N70000 | Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 |
References
- Rieseberg, L. H., Willis, J. H.
- Hiscock, S. J., Allen, A. M. Diverse cell signalling pathways regulate pollen-stigma interactions: the search for consensus. New Phytologist. 179 (2), 286-317 (2008).
- Kandasamy, M. K., Nasrallah, J. B., Nasrallah, M. E. Pollen pistil interactions and developmental regulation of pollen-tube growth in Arabidopsis. Development. 120 (12), 3405-3418 (1994).
- Bosch, M., Wang, L. Pollen-stigma interactions in Brassicaceae: complex communication events regulating pollen hydration. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2465-2468 (2020).
- Rozier, F., et al. Live-cell imaging of early events following pollen perception in self-incompatible Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2513-2526 (2020).
- Dickinson, H. Dry stigmas, water and self-incompatibility in Brassica. Sexual Plant Reproduction. 8, 1-10 (1995).
- Takasaki, T., et al. The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica stigma. Nature. 403 (6772), 913-916 (2000).
- Schopfer, C. R., Nasrallah, M. E., Nasrallah, J. B. The male determinant of self-incompatibility in Brassica. Science. 286 (5445), 1697-1700 (1999).
- Takayama, S., et al. Direct ligand-receptor complex interaction controls Brassica self-incompatibility. Nature. 413 (6855), 534-538 (2001).
- Shiba, H., et al. A pollen coat protein, SP11/SCR, determines the pollen S-specificity in the self-incompatibility of Brassica species. Plant Physiology. 125 (4), 2095-2103 (2001).
- Broz, A. K., Bedinger, P. A. Pollen-pistil interactions as reproductive barriers. Annual Review of Plant Biology. 72 (1), 615-639 (2021).
- Cheung, A. Y., Duan, Q., Li, C., James Liu, M. -C., Wu, H. -M. Pollen-pistil interactions: It takes two to tangle but a molecular cast of many to deliver. Current Opinion in Plant Biology. 69, 102279 (2022).
- Wang, L. D., et al. PCP-B class pollen coat proteins are key regulators of the hydration checkpoint in Arabidopsis thaliana pollen-stigma interactions. New Phytologist. 213 (2), 764-777 (2017).
- Liu, C., et al. Pollen PCP-B peptides unlock a stigma peptide-receptor kinase gating mechanism for pollination. Science. 372 (6538), 171-175 (2021).
- Bordeleau, S. J., Sanchez, L. E. C., Goring, D. R. Finding new Arabidopsis receptor kinases that regulate compatible pollen-pistil interactions. Frontiers in Plant Science. 13, 1022684 (2022).
- Suwabe, K., et al. Double-locking mechanism of self-compatibility in Arabidopsis thaliana: the synergistic effect of transcriptional depression and disruption of coding region in the male specificity gene. Frontiers in Plant Science. 11, 576140 (2020).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Lee, H. K., Macgregor, S., Goring, D. R. A toolkit for teasing apart the early stages of pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. Pollen and Pollen Tube Biology. 2160, 13-28 (2020).
- Dilkes, B. P., et al. The maternally expressed WRKY transcription factor TTG2 controls lethality in interploidy crosses of Arabidopsis. PLoS Biology. 6 (12), 2707-2720 (2008).
- Riglet, L., et al. KATANIN-dependent mechanical properties of the stigmatic cell wall mediate the pollen tube path in Arabidopsis. eLife. 9, e57282 (2020).
- Zhou, L. Z., Dresselhaus, T. Friend or foe: Signaling mechanisms during double fertilization in flowering seed plants. Plant Development and Evolution. 131, 453-496 (2019).
- Gao, X. -Q., et al. The Arabidopsis KINβγ subunit of the SnRK1 complex regulates pollen hydration on the stigma by mediating the level of reactive oxygen species in pollen. PLoS Genetics. 12 (7), e1006228 (2016).
- Lee, H. K., Goring, D. R. Two subgroups of receptor-like kinases promote early compatible pollen responses in the Arabidopsis thaliana pistil. Journal of Experimental Botany. 72 (4), 1198-1211 (2021).
- O'Malley, R. C., Barragan, C. C., Ecker, J. R. A user's guide to the Arabidopsis T-DNA insertion mutant collections. Pollen and Pollen Tube Biology. 1284, 323-342 (2015).
- Samson, F., et al. FLAGdb++: a database for the functional analysis of the Arabidopsis genome. Nucleic Acids Research. 32, D347-D350 (2004).
- Doucet, J., et al. Investigations into a putative role for the novel BRASSIKIN pseudokinases in compatible pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 19 (1), 549 (2019).
