Summary
एराबिडोप्सिस थैलियाना में पराग जलयोजन प्रोफाइल को मापने के लिए एक बेहतर विधि यहां वर्णित है। नई विधि उच्च रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती है, गैर-आक्रामक है, और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। प्रोटोकॉल परागण के शुरुआती चरणों को विनियमित करने वाली प्रक्रियाओं के बेहतर विच्छेदन के लिए एक नए उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।
Abstract
फूलों के पौधों में यौन प्रजनन के लिए पराग कण और स्टिग्माटिक सतह के बीच प्रारंभिक बातचीत की आवश्यकता होती है, जहां बातचीत करने वाले भागीदारों के बीच एक आणविक संवाद स्थापित किया जाता है। प्रजातियों की एक श्रृंखला में अध्ययन से पता चला है कि आणविक चौकियों की एक श्रृंखला पराग-कलंक बातचीत को नियंत्रित करती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि केवल संगत, आम तौर पर इंट्रास्पेसिफिक पराग निषेचन को प्रभावित करने में सफल हो। उन प्रजातियों में जिनके पास 'सूखा कलंक' होता है, जैसे कि मॉडल प्लांट एराबिडोप्सिस थैलियाना, पहला पोस्ट-परागण, प्रीजाइगोटिक संगतता चेकपॉइंट पराग जलयोजन की स्थापना है।
परागण के इस चरण को कसकर विनियमित किया जाता है, जिससे पराग कण से संकेत कलंक से पानी की रिहाई प्राप्त करते हैं, इस प्रकार पराग जलयोजन की अनुमति मिलती है। समय के साथ पराग जलयोजन को सटीक रूप से मापने और ट्रैक करने की क्षमता प्रजनन में इस महत्वपूर्ण कदम के विनियमन को समझने के लिए निर्देशित प्रयोगों के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है। प्रकाशित प्रोटोकॉल अक्सर उन फूलों का उपयोग करते हैं जिन्हें मूल पौधे से उत्पादित किया गया है, तरल या ठोस मीडिया पर बनाए रखा गया है, और थोक परागण किया गया है।
यह पेपर विवो परागण बायोसेसे में एक गैर-आक्रामक का वर्णन करता है जो उच्च रिज़ॉल्यूशन पर अलग-अलग ए थैलियाना पराग कणों के मिनट-दर-मिनट हाइड्रेशन ट्रैकिंग की अनुमति देता है। परख अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, पराग जलयोजन प्रोफाइल के बहुत सूक्ष्म रूपों का पता लगाने में सक्षम है, और इस प्रकार उत्परिवर्ती के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है जो परागण को विनियमित करने वाले मार्गों को प्रभावित करते हैं। यद्यपि प्रोटोकॉल थोक परागण के लिए वर्णित लोगों की तुलना में लंबा है, लेकिन इसकी सटीक और प्रजनन क्षमता प्रदान करता है, साथ ही विवो प्रकृति में , इसे परागण फेनोटाइप के विस्तृत विच्छेदन के लिए आदर्श बनाता है।
Introduction
एंजियोस्पर्म में सफल यौन प्रजनन आमतौर पर व्यक्तियों (यानी परागण) के भीतर या उनके बीच एथर से कलंक तक इंट्रास्पेसिफिक पराग कणों के हस्तांतरण पर निर्भर करता है। एक ग्रहणशील फूल में पराग कणों का यह हस्तांतरण आमतौर पर परागणकों या अजैविक कारकों द्वारा मध्यस्थता की जाती है; इस प्रकार, यह अक्सर प्राकृतिक परिस्थितियों में विषम पराग के जमाव में भी परिणाम देता है। कुछ अपवादों के साथ, विषम पराग द्वारा परागण की प्रगति क्रमिक रूप से हानिकारक है, जो खोए हुए संभोग के अवसरों के माध्यम से प्रजनन फिटनेस को कम करती है, जिसके परिणामस्वरूप अधिकांश संकर संतान या तो उचित रूप से विकसित होने में विफल रहती है या बाँझ होतीहै। इस प्रकार, 'असंगत' हेटरोस्पेसिफिक पराग2 द्वारा परागण को अवरुद्ध करने के लिए तंत्र विकसित हुए हैं। इसलिए संगत पराग की तेजी से पहचान यकीनन कई फूलों के पौधों में यौन प्रजनन के शुरुआती चरणों में सबसे महत्वपूर्ण प्रक्रिया है।
ब्रासिकेसी परिवार में, जहां कलंक 'शुष्क' प्रकार के होते हैं, आणविक चौकियों की एक श्रृंखला परागण को विनियमित करने वाली प्रजनन प्रक्रिया में कई चरणों में कार्य करती है, जैसे कि केवल संगत पराग सफल होता है। पराग जलयोजन सबसे महत्वपूर्ण चौकियों में से एक है (चित्रा 1), क्योंकि पराग जो हाइड्रेट करने में विफल रहता है, वह पराग ट्यूब का उत्पादन करने के लिए प्रगति नहीं कर सकता है और बाद में मादा गैमेटोफाइट को शुक्राणु वितरित करता है। अक्सर, असंगत अनाज इस पहले परागण चेकपॉइंट को पार करने में विफल रहते हैं, और इस प्रकार स्टिग्माटिकपानी तक पहुंच प्राप्त नहीं करते हैं। ब्रासिकेसी परिवार के सदस्यों के बीच, पराग की पहचान तेजी से होती है, जिसमें पिस्टिल 4,5 से पराग कण लगाव के मिनटों के भीतर संगतता स्थापित की जाती है। हाल के वर्षों में, बहुत प्रगति हुई है, और अब हम आणविक तंत्र को समझना शुरू कर रहे हैं जो प्रमुख परागण चौकियों को नियंत्रित करते हैं।
चित्रा 1: संगत परागण के दौरान प्रमुख घटनाओं का अवलोकन। ये चरण, जैसे पराग जलयोजन और पराग ट्यूब अंकुरण, परागण 'चेकपॉइंट' भी हैं जिन्हें संगत परागण को प्रभावित करने के लिए सफलतापूर्वक नेविगेट किया जाना चाहिए। आरेख एक 'सूखा' प्रकार के कलंक का प्रतिनिधित्व करता है, जो ब्रासिकेसी परिवार 2,20 की प्रजातियों के लिए विशिष्ट है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
ब्रासिका आत्म-असंगति (एसआई) प्रणाली पर अग्रणी शोध, जहां 'स्वयं' पराग को मान्यता प्राप्त है और अस्वीकार कर दिया गया है, ने ब्रासिकेसी 6,7,8,9,10 में पराग-कलंक मान्यता के लिए प्रतिमान स्थापित किया। ब्रासिका और उसके रिश्तेदारों में एसआई को 'मान्यता' प्रोटीन द्वारा मध्यस्थ किया जाता है जो पराग की सतह पर और स्टिग्माटिक प्लाज्मा झिल्ली पर रहते हैं, जो बातचीत पर, पराग अस्वीकृति का कारण बनते हैं। एसआई पराग अस्वीकृति बेसल पराग-कलंक संगतता प्रणाली के विघटन से संचालित होती है, जो संगत पराग की धारणा से पूरी तरह से सक्रिय होने पर, कलंक द्वारा लक्षित स्राव की ओर ले जाती है, इस प्रकार पराग जलयोजन को बढ़ावा देती है (पराग संगतता तंत्र की समीक्षा के लिए,देखें 11,12)। एसआई के उदाहरण में, पराग-जनित लिगैंड एक छोटा सिस्टीन युक्त प्रोटीन है, एस-लोकस सिस्टीन समृद्ध (एससीआर / एसपी 11), और स्टिग्माटिक रिसेप्टर एस-लोकस रिसेप्टर काइनेज (एसआरके) है।
हाल ही में, एराबिडोप्सिस थैलियाना में, छोटे सिस्टीन-समृद्ध पराग-जनित प्रोटीन का एक और समूह, पराग कोट प्रोटीन वर्ग बीएस (पीसीपी-बीएस में), पराग जलयोजन13 के सक्रियण के माध्यम से पराग स्वीकृति के महत्वपूर्ण नियामक पाए गए हैं। एटीपीसीपी-बी के स्टिग्माटिक रिसेप्टर्स और डाउनस्ट्रीम नियामक मार्ग के पहलुओं को भी हाल ही में14,15 वर्णित किया गया है। दिलचस्प बात यह है कि पराग जलयोजन (पीसीपी-बीएससहित) के संभावित पराग-जनित और स्टिग्माटिक सिग्नलिंग मध्यस्थों को एन्कोडिंग करने वाले जीन के उत्परिवर्तन संबंधी अध्ययन उन पौधों को उत्पन्न करने में विफल रहे हैं जिनके पास पराग जलयोजन चेकपॉइंट के लिए एक पूर्ण ब्लॉक है। यह दृढ़ता से सुझाव देता है कि कई अन्य, अभी तक अनदेखे, कारक पराग जलयोजन के नियमन में भूमिका निभाते हैं। वांग एट अल.13 द्वारा पहली बार वर्णित विधि के आधार पर, यहां हम उम्मीदवार उत्परिवर्ती ए थैलियाना लाइनों में सूक्ष्म पराग जलयोजन दोषों की पहचान के लिए उपयुक्त विवो बायोसेसे में एक बेहतर उच्च-रिज़ॉल्यूशन का वर्णन करते हैं।
Protocol
1. पौधे की वृद्धि और फूलों की तैयारी
- थैलियाना के बीज को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए 0.1% अगारोस या बाँझ पानी में, या -20 डिग्री सेल्सियस पर 16-24 घंटे के लिए सूखे बीज के रूप में रखें (यूएनएएससी, व्यक्तिगत संचार)।
- स्तरीकृत बीजों को खाद के बर्तनों में स्थानांतरित करें और पर्यावरण नियंत्रित विकास कक्ष में रखें। फ्लोरोसेंट ट्यूब (130 μmol m-2 s-1) द्वारा प्रदान की गई 16: 8 घंटे, प्रकाश: अंधेरे फोटोपीरियड के साथ पौधों का प्रचार करें। लगभग 40% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 21 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखें।
- सुनिश्चित करें कि पराग दाता और प्राप्तकर्ता पौधे, किसी भी अन्य उपयुक्त 'नियंत्रण' पौधे लाइनों के साथ, तुल्यकालिक फूल सुनिश्चित करने के लिए एक साथ बोए जाते हैं। लगभग 6 सप्ताह के लिए पौधों का प्रचार करें जब तक कि पुष्पक्रम अच्छी तरह से स्थापित न हो जाएं।
- पराग प्राप्तकर्ता पौधे पर चरण 12 फूल की कलियों का चयन करें,16,17 के लिए बायोसेसे करने से 1 दिन पहले- ये बिना खोले हुए फूल की कलियां हैं जो अगले दिन 18 को फूल खोलने और एथेर डिहिस्सेंस को पूरा करेंगी।
नोट: मुख्य पुष्पक्रम पर उत्पादित पहले तीन फूलों से बचें, क्योंकि ये आमतौर पर असामान्य प्रजनन व्यवहार प्रदर्शित करते हैं। यदि अध्ययन के लिए उपलब्ध और उपयुक्त है, तो एक पुरुष बाँझ पौधे की रेखा का उपयोग करें, जैसे कि ए थैलियाना (परिग्रहण कोल -0) पीए 9-बार्नेस लाइन, जहां एथेर्सपरिपक्व होने में विफल रहते हैं। - पराग प्राप्तकर्ता के फूलों को उत्तेजित करने के लिए, पौधे को उसके बर्तन में, उसके किनारे पर रखें। पौधे के तने को फूलों के करीब के क्षेत्र में टेप करें, जिसे एक ग्लास स्लाइड में रखा जाएगा जो स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत स्थिति में है।
- बारीक पिटे हुए बल की एक जोड़ी का उपयोग करके, सावधानी से फूल की कली को खोलें और सभी फूलों की पंखुड़ियों और एथर को हटा दें। सुनिश्चित करें कि पिस्टिल क्षतिग्रस्त नहीं है और कलंक पराग को दूषित करने से मुक्त है।
नोट: नर बाँझ पौधे लाइनों को अनुकरण की आवश्यकता नहीं होती है। - पौधों को विकास कक्ष में वापस करें और सुनिश्चित करें कि उत्पित फूल अन्य पौधों या विदेशी वस्तुओं के संपर्क में नहीं आते हैं।
2. पराग जलयोजन परख-कच्चे डेटा अधिग्रहण
- अगली सुबह, पौधों को विकास कक्ष से हटा दें। पराग प्राप्तकर्ता पौधे को इसके किनारे रखें और फूल को उल्टे माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) के चरण पर रखें ताकि कलंक को स्पष्ट रूप से चित्रित किया जा सके।
- मास्किंग टेप की स्ट्रिप्स का उपयोग करके स्टेम को ग्लास स्लाइड में स्थिर करके छवि के लिए फूल की स्थिति तय करें। तापमान 18 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस के बीच और सापेक्ष आर्द्रता 60% से नीचे बनाए रखें।
नोट: पीए 9-बार्नेस नर बाँझ पौधे की रेखा के लिए, सुबह में परख करना इष्टतम है जब फूल खुलते हैं और पंखुड़ियां दृश्य के क्षेत्र में बाधा नहीं डालती हैं। - इसके बाद, पराग-दाता पौधे से एक स्वस्थ और ताजा खुले फूल को हटा दें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और कुछ पराग कणों को साफ महीन बल की नोक पर धीरे-धीरे एथर्स को छूकर इकट्ठा करें (चित्रा 3 ए)। एक छोटी छड़ पर टेप किया गया एक चश्मा भी पराग को इकट्ठा करने और स्थानांतरित करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है (चित्रा 3 सी)।
- अतिरिक्त पराग कणों को फूलों की पंखुड़ियों के खिलाफ हल्के से स्पर्श करके बल से हटा दें, जहां से पराग कण ों की कटाई की गई थी, जब तक कि बल की नोक पर पराग कणों का एक मोनोलेयर न बन जाए।
नोट: बारीक-बारीक बल की नोक पर पराग कणों का एक मोनोलेयर बाद के चरणों में एकल अनाज हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करेगा। इस तकनीक (पूरक वीडियो एस 1) द्वारा बल पर एक एकल पराग कण प्राप्त करना भी संभव है। - पराग प्राप्तकर्ता पौधे पर लौटें और, कम शक्ति वाले उद्देश्य लेंस (जैसे, 10x उद्देश्य लेंस) का उपयोग करें; चित्रा 3 बी), परागण किए जाने वाले कलंक पर उल्टे माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें।
- बल की भुजाओं के बीच के छिद्र के साथ बल को पकड़ना (चित्र 4), सावधानीपूर्वक एक अपरागण ('वर्जिन') स्टिग्माटिक पैपिला सेल से संपर्क करें।
नोट: हमने पाया है कि बल को पकड़ने की यह विधि निपुणता में सहायता करती है और हाथ मिलाने के प्रभाव को कम करती है। एक माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग उन उपयोगकर्ताओं के लिए किया जा सकता है जो कम अनुभवी हैं या हाथ से एक पराग कण को ठीक से लागू करने में कठिनाई होती है। - कलंक में स्थानांतरण के लिए बल पर उपयुक्त रूप से स्थित पराग कण का चयन करें। जब तक चयनित पराग कण इसकी सतह के साथ हल्का संपर्क नहीं करता है, तब तक अनपोलिनेटेड स्टिग्माटिक पैपिला सेल से संपर्क करना जारी रखें। धीरे-धीरे बल को वापस लें और पराग लगाव की पुष्टि करें (चित्रा 5)।
नोट: पूरक वीडियो एस 1 और पूरक वीडियो एस 2 बल पर मौजूद एकल और कई पराग कणों के साथ इस कदम को प्रदर्शित करते हैं। - सुनिश्चित करें कि पराग कण इस तरह उन्मुख है कि इसकी भूमध्यरेखीय धुरी स्पष्ट रूप से दिखाई दे और तेज फोकस में हो। तुरंत एक उच्च शक्ति उद्देश्य लेंस (जैसे, 20x) पर स्विच करें और पराग कण की एक छवि कैप्चर करें। यह पहली छवि T = 0 है। कुल 10 मिनट के लिए 1 मिनट के अंतराल पर आगे की छवियों को कैप्चर करना जारी रखें।
- पराग कण या कलंक में छोटे आंदोलनों को समायोजित करने के लिए आवश्यक रूप से फोकस समायोजित करें। प्रयोगात्मक प्रतिकृति के बीच भविष्य की तुलना की अनुमति देने के लिए हर 2 मिनट में कमरे के परिवेश के तापमान और सापेक्ष आर्द्रता को रिकॉर्ड करें।
- एक बार सभी छवियों को कैप्चर करने के बाद, उन्हें एक हानिरहित प्रारूप में सहेजें, जैसे कि निर्माता का मालिकाना प्रारूप या टीआईएफएफ के रूप में।
नोट: प्रति पराग कण नमूना 11 छवियां होंगी (पूरक चित्रा एस 1)। अधिकांश मालिकाना छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में स्वचालित / मैनुअल टाइमलैप्स अधिग्रहण सेटिंग्स प्रत्येक समय-श्रृंखला के संगठन को सुविधाजनक बनाने के लिए उपयोगी विशेषताएं हैं। - अतिरिक्त पराग कणों के लिए चरण 2.4 से 2.9 दोहराएं। नियंत्रण (जंगली प्रकार [डब्ल्यूटी]) और प्रयोगात्मक परागण की लगभग बराबर संख्या के लिए डेटा प्राप्त करें।
चित्रा 2: पराग जलयोजन बायोसेसे के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण सेटअप। इस उदाहरण में, एक पीए 9-बार्नेस नर बाँझ पौधे की रेखा पराग प्राप्तकर्ता थी। पौधे, इसके बर्तन के भीतर, इसके किनारे पर रखा गया था, और स्टेम को माइक्रोस्कोप के चरण पर स्थित एक ग्लास स्लाइड पर टैप किया गया था। यांत्रिक तनाव को कम करने और पौधे की स्थिति में सहायता करने के लिए, पौधे के बर्तन का समर्थन करने के लिए एक समायोज्य मंच का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: पराग-दाता फूल से पराग कणों का संग्रह। चित्र (ए) बारीक-बारीक बल और (सी) पलक के एक टुकड़े का उपयोग दिखाते हैं। पराग (लाल तीर) के झुरमुट को दाता फूलों की पंखुड़ियों के खिलाफ हल्के से स्पर्श करके हटा दिया जाना चाहिए जब तक कि पराग कणों का एक मोनोलेयर प्राप्त न हो जाए (हरा तीर)। (बी) पराग जलयोजन जैवपरख के लिए उपयुक्त विकास चरण तक पहुंच चुके ए. थालियाना (कोल-0) पीए 9-बार्नेस नर बाँझ रेखा कलंक की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि। स्केल बार = 100 μm (B)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: पराग को प्राप्तकर्ता कलंक में स्थानांतरित करते समय बल धारण करने की विधि। (ए) बल धारण करने के लिए गलत अभिविन्यास; (बी) बल धारण करने के लिए सही अभिविन्यास। इस विन्यास में बल को साइडवे में पकड़ना, जैसा कि बल की भुजाओं के बीच अंगूठे की स्थिति से संकेत मिलता है, पराग कणों को बिना परागण वाले स्टिग्माटिक पैपिले में स्थानांतरित करने की सुविधा के लिए अधिक स्थिरता प्रदान करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: एक एकल पराग कण को एक जोड़ी बल की नोक से एक पीए 9-बार्नेस नर बाँझ पौधे के एक अपरागित ('वर्जिन') स्टिग्माटिक पैपिला सेल में स्थानांतरित करना। (ए) पैपिला सेल के प्रति सावधानीपूर्वक दृष्टिकोण। (बी) पैपिला सेल (नारंगी तीर) के लिए उचित रूप से स्थित पराग कण (नीला तीर) का लगाव। (सी) पराग अनुलग्नक (बैंगनी तीर) की बल की वापसी और दृश्य पुष्टि। पैनल ए-सी को 10x ऑब्जेक्टिव लेंस (10.5 मिमी कामकाजी दूरी; 0.25 संख्यात्मक एपर्चर) के साथ चित्रित किया गया था और पूरक वीडियो एस 1 में प्रस्तुत वीडियो क्लिप से प्राप्त स्नैपशॉट हैं। (डी) समय-श्रृंखला में छवि कैप्चर की शुरुआत के लिए 20x उद्देश्य लेंस (2.1 मिमी कामकाजी दूरी; 0.5 संख्यात्मक एपर्चर) में संक्रमण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
3. पराग जलयोजन परख-माप
- पराग जलयोजन की दर को समय के साथ पराग कण (यानी, भूमध्यरेखीय त्रिज्या) के अर्ध-लघु अक्ष (चित्रा 6) की लंबाई में परिवर्तन के रूप में परिभाषित करें और इसे प्रतिशत परिवर्तन (समीकरण [1]) के रूप में प्रस्तुत करें:
(1) - छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, प्रयोगात्मक श्रृंखला में प्रत्येक पराग कण के लिए अर्ध-मामूली अक्ष मान रिकॉर्ड करें।
नोट: इस माप विकल्प का नाम सॉफ्टवेयर-निर्भर है, जैसे 'रोटेटड एलिप्स' या '5-पॉइंट दीर्घवृत्त'। - अन्य सभी पराग कणों को मापने के लिए चरण 3.1-3.2 दोहराएं। स्थिरता के लिए, डेटासेट में सभी मापों के लिए 'पराग सीमा' को परिभाषित करने के लिए डिजिटल ज़ूम की समान डिग्री और एक ही दृष्टिकोण लागू करें।
- एक बार जब सभी माप एक समय-श्रृंखला के लिए पूरे हो जाते हैं, तो प्रत्येक छवि स्टैक के कच्चे अर्ध-मामूली अक्ष मूल्यों को एक स्प्रेडशीट में निर्यात करें और डेटा को प्रति छवि स्टैक कॉलम में प्रस्तुत करें। प्रत्येक प्लांट लाइन (पूरक तालिका एस 1) के विश्लेषण में कम से कम 15 हाइड्रेटेड पराग कणों से डेटा को शामिल करना सुनिश्चित करें।
- पराग कणों की एक छोटी संख्या के लिए अपेक्षा से अधिक धीरे-धीरे हाइड्रेट या हाइड्रेट करने में विफल होना असामान्य नहीं है। ये 'डूड' अनाज अनाज और पैपिला सेल के बीच खराब संपर्क का परिणाम हो सकते हैं या पराग व्यवहार्यता से संबंधित हो सकते हैं। इन्हें डेटासेट से देखें और बाहर करें जब तक कि ये उनके प्रयोगात्मक डिजाइन में आवश्यक न हों।
- प्रति संयंत्र लाइन प्रत्येक टाइमपॉइंट के लिए औसत मूल्यों की गणना करें। प्रत्येक टाइमपॉइंट पर डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती लाइनों से हाइड्रेशन डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अप्रकाशित टी-टेस्ट और वन-वे एनोवा का उपयोग करें। कई टाइमपॉइंट्स पर डब्ल्यूटी और म्यूटेंट लाइनों के बीच साधनों की एक साथ तुलना के लिए कई टी-टेस्ट का उपयोग करें।
नोट: एक्सवाई प्लॉट पौधों की लाइनों के बीच पराग जलयोजन की समग्र प्रवृत्ति की कल्पना करने के लिए भी बहुत उपयोगी हैं।
(1)
चित्र 6: ए थैलियाना (कोल -0; पीए 9-बार्नेस पुरुष बाँझ रेखा) के स्टिग्माटिक पैपिला सेल पर डब्ल्यूटी पराग कण हाइड्रेटिंग । (ए) समय बिंदु शून्य, 0 (0 एमएपी) और (बी) 10 एमएपी। पराग कण के चारों ओर लाल सर्कल "पराग सीमा" है जिसे ऑपरेटर द्वारा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके परिभाषित और खींचा गया है। पराग के अंदर हरी और गहरे लाल रेखाएं क्रमशः अर्ध-प्रमुख और अर्ध-मामूली अक्षों का प्रतिनिधित्व करती हैं। अर्ध-मामूली अक्ष की लंबाई का उपयोग पराग जलयोजन की डिग्री की गणना करने के लिए किया जाता है। इस डेटासेट की एक पूर्णकालिक-श्रृंखला पूरक चित्रा एस 1 में पाया जा सकता है। छवि को 20x ऑब्जेक्टिव लेंस (2.1 मिमी कामकाजी दूरी; 0.5 संख्यात्मक एपर्चर) के साथ लिया गया था। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षिप्त नाम: एमएपी = मिनट-बाद-परागण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Representative Results
यह खंड ए थैलियाना के लिए ऊपर वर्णित उदाहरण पराग जलयोजन डेटा के दो सेट प्रस्तुत करता है। डेटा के पहले सेट में डब्ल्यूटी पौधों के लिए पराग जलयोजन समय-श्रृंखला की तीन प्रतिकृतियां होती हैं, जिनमें से प्रत्येक प्रतिकृति एक अलग दिन पर एकत्र की जाती है। प्रत्येक प्रतिकृति में कम से कम 18 व्यक्तिगत पराग कण मूल्य होते हैं, सभी तीन प्रतिकृतियों में कुल 55 पराग कण होते हैं। प्रतिकृतियों के बीच साधनों के लिए न्यूनतम और अधिकतम मान, सभी समय बिंदुओं के लिए, 3% के भीतर थे (चित्रा 7 और पूरक तालिका एस 1)। डब्ल्यूटी परागण के लिए ये प्रतिनिधि डेटा स्पष्ट रूप से उच्च स्तर की स्थिरता को प्रदर्शित करते हैं जो अपेक्षाकृत कम नमूना संख्या ओं और विभिन्न दिनों में यहां विस्तृत पद्धति का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।
चित्र 7: एक्सवाई प्लॉट 10 मिनट की अवधि में ए थैलियाना जंगली प्रकार के पराग जलयोजन प्रोफाइल की स्थिरता दिखाता है। पराग माता-पिता ए थालियाना का कोल -0 परिग्रहण था और पिस्टिल माता-पिता पीए 9-बार्नेस नर बाँझ ए थैलियाना (कोल -0) लाइन था। डेटा अलग-अलग दिनों में एकत्र किए गए तीन स्वतंत्र डेटासेट का प्रतिनिधित्व करता है और उच्च स्तर की स्थिरता प्रदर्शित करता है। इन डेटासेट के लिए साधनों का एक बॉक्स और मूंछ आरेख और सांख्यिकीय विश्लेषण पूरक चित्रा एस 2 में प्रस्तुत किया गया है। प्रत्येक स्वतंत्र डेटासेट के लिए मापा पराग ('एन') की संख्या आंकड़े पर सिंटैक्स (WT1/WT2/WT3) के बगल में प्रदर्शित होती है। संक्षिप्त नाम: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
डेटा का दूसरा सेट एक प्लांट लाइन के लिए प्राप्त किया गया था, जो एक पराग कोट प्रोटीन-एन्कोडिंग जीन में टी-डीएनए सम्मिलन को रोकता है, जो एक 'वध' उत्परिवर्तन उत्पन्न करता है, जिसे यहां 'केडी उत्परिवर्ती' के रूप में संदर्भित किया गया है। उत्परिवर्ती पराग को हाइड्रेशन प्रोफाइलिंग के लिए पीए 9-बार्नेस नर बाँझ कलंक पर जमा किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है। जैसा कि परिणामी डेटा (चित्रा 8) से देखा जा सकता है, उत्परिवर्ती और डब्ल्यूटी पराग में पहले 5 मिनट में अप्रभेद्य हाइड्रेशन प्रोफाइल थे। हालांकि, परागण (एमएपी) के 5-10 मिनट बाद, उत्परिवर्ती पराग के लिए औसत अर्ध-मामूली अक्ष परिवर्तन डब्ल्यूटी पराग के पीछे गिरने लगा, जिसमें अंतर 10 एमएपी पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हो गया। यह परिणाम न केवल दर्शाता है कि इस पराग कोट प्रोटीन की पराग जलयोजन की मध्यस्थता में भूमिका है, बल्कि पराग जलयोजन को ट्रैक करने के लिए इस उच्च-रिज़ॉल्यूशन, एकल-अनाज बायोसेसे की उपयोगिता को भी अच्छी तरह से दर्शाता है। इस विशेष उदाहरण में, इसकी संवेदनशीलता एक पराग कोट प्रोटीन-एन्कोडिंग जीन के 'वध' के सूक्ष्म प्रभाव का पता लगाने में सक्षम थी।
चित्रा 8: डब्ल्यूटी के लिए पराग हाइड्रेशन प्रोफाइल और एक 'वध' पराग कोट प्रोटीन उत्परिवर्ती रेखा (केडी उत्परिवर्ती)। (ए) डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती पराग के लिए 10 मिनट की समय अवधि में हाइड्रेशन प्रोफाइल। पराग माता-पिता ए थालियाना के कोल -0 परिग्रहण और पराग कोट प्रोटीन केडी उत्परिवर्ती (कोल -0 पृष्ठभूमि में भी) थे। दोनों मामलों में, पिस्टिल माता-पिता पीए 9-बार्नेस पुरुष बाँझ ए थैलियाना (कोल -0) लाइन थी। (बी) डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती पराग डेटासेट के लिए 5 एमएपी और 10 एमएपी पर पराग जलयोजन (अर्ध-लघु अक्ष के प्रतिशत परिवर्तन के संदर्भ में) की सीमा दिखाने वाले बॉक्स और मूंछ भूखंड। मूंछें नमूना न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करती हैं। बॉक्स डेटासेट के निचले चतुर्थक, माध्य और ऊपरी चतुर्थक को दर्शाते हैं। सफेद क्रॉस डेटासेट के माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। अप्रकाशित टी-परीक्षण विश्लेषण से पता चलता है कि पराग जलयोजन का औसत प्रतिशत 10 एमएपी पर दो पौधों की लाइनों के बीच काफी भिन्न है। एक तारांकन चिह्न p < 0.05 (अप्रकाशित t-test) इंगित करता है। संक्षेप: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; केडी = वध; एमएपी = मिनट-बाद-परागण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा एस 1: 10 मिनट के दौरान पीए 9-बार्नेस नर बाँझ पौधे के स्टिग्माटिक पैपिला सेल पर डब्ल्यूटी पराग कण हाइड्रेटिंग हाइड्रेटिंग की एक क्रॉप्ड पराग हाइड्रेशन बायोसेसे समय-श्रृंखला। चित्र 1 मिनट के अंतराल पर लिए गए थे। 0 एमएपी और 10 एमएपी पर छवियों का उपयोग चित्रा 6 (अलग से संलग्न) में किया गया था। स्केल बार = 50 μm। संक्षेप: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; एमएपी = मिनट-बाद-परागण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा एस 2: चित्र 7 में वर्णित तीन डब्ल्यूटी पराग डेटासेट के लिए 10 मिनट की समय अवधि में पराग जलयोजन (अर्ध-मामूली अक्ष के प्रतिशत परिवर्तन के संदर्भ में) की सीमा दिखाने वाला बॉक्स और मूंछ प्लॉट। पिस्टिल माता-पिता पीए 9-बार्नेस नर बाँझ ए थलियाना (कोल -0) लाइन थी। मूंछें नमूना न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करती हैं। बक्से डेटासेट के निचले चतुर्थक (निचला हिंज), मध्य (मध्य हिंज), और ऊपरी चतुर्थक (ऊपरी हिंज) को दर्शाते हैं। अलग-अलग डेटापॉइंट दिखाए जाते हैं। वन-वे एनोवा से पता चलता है कि तीन डेटासेट के बीच पराग जलयोजन मूल्यों का औसत प्रतिशत 10 मिनट की अवधि में एक दूसरे से सांख्यिकीय रूप से काफी भिन्न नहीं था। महत्वपूर्ण सीमा पी < 0.05 (एक तरफा एनोवा) है। संक्षिप्त नाम: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक तालिका एस 1: कच्चे पराग जलयोजन डेटा का उपयोग चित्रा 7 के निर्माण के लिए किया जाता है (पीए 9-बार्नेस नर बाँझ कलंक पर ए थैलियाना डब्ल्यूटी कोल -0 पराग)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक वीडियो एस 1: एक वीडियो जो एक डब्ल्यूटी (कोल -0 परिग्रहण) पराग कण के एक जोड़े की नोक पर एक 'कुंवारी' स्टिग्माटिक पैपिला सेल (पीए 9-बार्नेस पुरुष बाँझ रेखा) में स्थानांतरित करने का प्रदर्शन करता है। वीडियो की पहुंच को सुविधाजनक बनाने के लिए, छवि की गुणवत्ता जानबूझकर कम कर दी गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक वीडियो एस 2: एक वीडियो जो पराग कणों के एक मोनोलेयर से एक डब्ल्यूटी (कोल -0 परिग्रहण) पराग के हस्तांतरण को दर्शाता है, जो बल की एक जोड़ी की नोक पर एक 'कुंवारी' स्टिग्माटिक पैपिला सेल (पीए 9-बार्नेस पुरुष बाँझ रेखा) में स्थानांतरित होता है। वीडियो की पहुंच को सुविधाजनक बनाने के लिए, छवि की गुणवत्ता जानबूझकर कम कर दी गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
फूलों के पौधों के लिए, यौन प्रजनन के बहुत शुरुआती चरण यकीनन सबसे महत्वपूर्ण हैं। पराग-कलंक बातचीत के स्तर पर, आणविक निर्णय किए जाते हैं जो बातचीत करने वाले भागीदारों की 'संगतता' निर्धारित करते हैं। इस तरह के निर्णय, यदि सही ढंग से किए जाते हैं, तो संसाधनों की बर्बादी से बचें जो प्रजनन फिटनेसको प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, निषेचन को प्रभावित करने के लिए केवल संगत पराग की अनुमति देना अच्छी तरह से अनुकूलित जीनोटाइप को बनाए रखने का एक महत्वपूर्ण घटक है, और इस प्रकार प्रजातियों की विकासवादी सफलता। मॉडल प्लांट ए थलियाना के साथ किए गए शोध इस प्रक्रिया की हमारी समझ को गहरा करने में बेहद मूल्यवान रहे हैं। पिछले कुछ दशकों में कई अध्ययनों ने पराग कोट में कारकों की उपस्थिति का खुलासा किया है जो पहले संगतता 'चेकपॉइंट' पर कार्य करते हैं, जहां पराग पराग जलयोजन की अनुमति देने के लिए स्टिग्माटिक पानी तक पहुंच प्राप्तकरता है। पराग-कलंक संगतता को विनियमित करने वाले तंत्र में इन पहली अंतर्दृष्टि के बावजूद, इस प्रक्रिया की हमारी समझ में अभी भी कई अंतराल हैं। आज तक, पराग-जनित लिगेंड या स्टिग्माटिक रिसेप्टर्स का कोई भी उत्परिवर्ती जो पराग जलयोजन को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, संगत परागण को पूरी तरह से अवरुद्ध नहीं कर सकता है, जो अन्य अज्ञात पराग जलयोजन निर्धारकों की उपस्थिति का सुझाव देता है। रुचि के फेनोटाइप का आसानी से निरीक्षण करने में सक्षम होने से, यहां वर्णित पराग हाइड्रेशन बायोसेसे परागण को नियंत्रित करने वाले संभावित उत्परिवर्ती का अध्ययन करने के लिए सबसे सरल तकनीकों में से एक है।
पराग जलयोजन को मापने के लिए मौजूदा पद्धतियां आमतौर पर थोक परागण का उपयोग करती हैं और कम समय बिंदु14,22,23 की रिपोर्ट करती हैं, और इस प्रकार महत्वपूर्ण सूक्ष्म हाइड्रेशन प्रोफाइल फेनोटाइप ्स को याद कर सकती हैं। उदाहरण के लिए, वांग एट अल.13 द्वारा किए गए अध्ययन, हमारी प्रयोगशाला में अन्य पराग कोट प्रोटीन उत्परिवर्ती (अप्रकाशित अवलोकन) पर काम के साथ, उत्परिवर्ती के बीच हाइड्रेशन प्रोफाइल में पेचीदा अंतर का पता चला है। इस तरह के सूक्ष्म अंतर संगत परागण अंतर्निहित नियामक तंत्र के लिए महत्वपूर्ण सुराग रख सकते हैं।
यहां वर्णित विधि उत्परिवर्ती और डब्ल्यूटी पौधों की लाइनों के बीच अपेक्षाकृत कम संख्या में माप के अधिग्रहण पर केंद्रित है, जिसमें डेटासेट के भीतर भिन्नता को कम करने के लिए पद्धतिगत परिशुद्धता पर जोर दिया गया है। जबकि यह विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (जैसा कि चित्र 7 में दिखाया गया है), यह मानते हुए कि तापमान और आर्द्रता पर्याप्त रूप से नियंत्रित हैं, भिन्नता की संभावना को कम करने के लिए उसी दिन लगभग समान संख्या में डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती पराग के लिए हाइड्रेशन डेटा इकट्ठा करना महत्वपूर्ण है। यदि आवश्यक हो तो डेटा को अलग-अलग दिनों में पूल किया जा सकता है। इसके अलावा, हाइड्रेशन परिणामों की सही व्याख्या के लिए उपयुक्त डब्ल्यूटी नियंत्रण पौधों का चयन करना महत्वपूर्ण है। पराग प्राप्तकर्ता के लिए, डब्ल्यूटी नियंत्रण और उत्परिवर्ती पराग कण दोनों प्राप्त करने के लिए एक ही पौधे की लाइन का उपयोग किया जाना चाहिए।
उदाहरण के लिए, हम टी-डीएनए पराग उत्परिवर्ती लाइनों (जैसे चित्रा 8 में वर्णित 'केडी' उत्परिवर्ती) की जांच करते समय डब्ल्यूटी (नियंत्रण) और उत्परिवर्ती (प्रयोगात्मक) पराग दोनों के लिए पराग प्राप्तकर्ता के रूप में पीए 9-बार्नेस नर बाँझ पौधे लाइन का उपयोग करते हैं, जिसे वीडियो प्रोटोकॉल में भी चित्रित किया गया है। इस तरह के पुरुष बाँझ रेखा से डेटा का मिश्रण, जिसे अनुकरण करने की आवश्यकता नहीं है, को मैन्युअल रूप से एमास्कुलेटेड कंट्रोल लाइन से एकत्र करने से बचा जाना चाहिए क्योंकि ये कलंक संभवतः अलग तरह से व्यवहार करेंगे। इसी तरह, जब भी संभव हो, एमस्क्युलेटेड म्यूटेंट लाइनों का उपयोग एक एमस्क्युलेटेड डब्ल्यूटी (नियंत्रण) लाइन के साथ संयोजन के रूप में किया जाना चाहिए। अध्ययन के तहत पौधों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर विचार करते समय भी यही सावधानी बरतनी चाहिए। जबकि सबसे लोकप्रिय टी-डीएनए उत्परिवर्ती संग्रह कोल -0 पृष्ठभूमि में उत्पन्न हुए थे, अन्य, जैसे कि इंस्टीट्यूट नेशनल डे ला रेचरचे एग्रोनोमिक (आईएनआरए) से फ्लैग संग्रह, वासिलेवस्कीजा (डब्ल्यूएस) आनुवंशिक पृष्ठभूमि24,25 में उपलब्ध हैं। ऐसे मामलों में, नियंत्रण के रूप में संबंधित इकोटाइप की डब्ल्यूटी प्लांट लाइनों का उपयोग करना उचित है।
यद्यपि यहां हमने पराग-कलंक बातचीत के पहले 10 मिनट में पराग जलयोजन पर ध्यान केंद्रित किया है, इस विधि को हाइड्रेशन प्रोफाइल को शामिल करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है जो लंबे समय तक कवर करते हैं। प्रोटोकॉल की एक प्रमुख विशेषता यह है कि फूल मूल पौधे से जुड़े रहते हैं-वर्तमान प्रकाशित प्रोटोकॉल को आमतौर पर प्रयोग की अवधि 14,18,26 के लिए ऊतक को बनाए रखने के लिए पिस्टिल के छांटने और मीडिया में प्लेसमेंट की आवश्यकता होती है। यद्यपि यह सुझाव देने के लिए कोई प्रत्यक्ष प्रमाण नहीं है कि इस तरह के एक अर्ध विवो दृष्टिकोण पराग जलयोजन को प्रभावित करता है या वास्तव में इस प्रक्रिया के विवो विनियमन को बदल देता है, यह कल्पनीय है कि मूल पौधे से फूलों का छांटना परागण को प्रभावित कर सकता है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल पराग-कलंक बातचीत के अध्ययन के लिए विवो वातावरण में एक सच प्राप्त करता है, जहां पौधे की संरचनात्मक अखंडता संरक्षित है।
एकल पराग कणों का 'वर्जिन' स्टिग्माटिक पैपिल्ले में स्थानांतरण यकीनन इस प्रोटोकॉल में वर्णित सबसे चुनौतीपूर्ण कार्यों में से एक है। त्रुटि में पराग कणों के समूहों को स्थानांतरित करना असामान्य नहीं है। हालांकि, ऐसा होने की संभावना को यह सुनिश्चित करके बहुत कम किया जा सकता है कि पराग का केवल एक मोनोलेयर बल (चित्रा 3 ए) (या यहां तक कि सिर्फ एक पराग कण) पर मौजूद है; चित्रा 5), और / या पराग कणों का उपयोग करके जो पहले से ही केंद्रित हैं, जैसे कि वे बल की नोक पर दूसरों से 'बाहर निकले' हैं। हमने पाया है कि एक अनुभवी ऑपरेटर लगभग 3 मिनट में एक एकल पराग के हस्तांतरण को सफलतापूर्वक पूरा कर सकता है और 1 घंटे की अवधि में पांच पराग कणों तक डेटा रिकॉर्ड कर सकता है। इस प्रकार, 2-4 दिनों की अवधि में, अध्ययन के तहत संयंत्र लाइनों के सार्थक सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त डेटा जमा किया जा सकता है।
मानव त्रुटि संभावित रूप से इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले अध्ययनों से प्राप्त डेटासेट के विश्लेषण में भिन्नता का सबसे बड़ा स्रोत है। उदाहरण के लिए, छवि विश्लेषण के दौरान 'पराग सीमा' की परिभाषा व्यक्तिगत शोधकर्ता के निर्णय पर आती है। इस प्रकार, यह संभावना है कि विभिन्न शोधकर्ताओं द्वारा किए गए माप, यहां तक कि एक ही डेटासेट पर भी, भिन्नता उत्पन्न कर सकते हैं। जहां भी संभव हो, एक एकल शोधकर्ता को नमूना त्रुटियों को कम करने के लिए माप करना चाहिए। इसके अलावा, एक ही ऑपरेटर द्वारा डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती डेटासेट के विश्लेषण को युग्मित करना 'पराग सीमा' और इंटरऑपरेटर भिन्नता की संभावित व्यक्तिपरक परिभाषा को नकारता है।
अंत में, मॉडल जीव ए थैलियाना में पराग जलयोजन प्रोफाइल को मापने के लिए एक परिष्कृत लेकिन सटीक विधि का वर्णन किया गया है। हमने दिखाया है कि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, ए थैलियाना के लिए अत्यधिक सुसंगत पराग जलयोजन डेटा आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। अलग-अलग दिनों में प्राप्त डब्ल्यूटी परागण के लिए डेटा के तीन स्वतंत्र बैचों ने सभी समय बिंदुओं पर <3% के लगातार छोटे विचलन दिखाए (चित्रा 7 और पूरक तालिका एस 1)। यद्यपि यहां प्रस्तुत बायोसेसे अधिकांश मौजूदा प्रोटोकॉल की तुलना में थोड़ा अधिक जटिल है, उत्पन्न डेटा का रिज़ॉल्यूशन बेहतर है और नए उत्परिवर्ती की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त है जो संगत परागण को विनियमित करने वाले मार्गों को प्रभावित करते हैं।
Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को बाथ विश्वविद्यालय (बाथ विश्वविद्यालय, बाथ, यूके, बीए 2 7एवाई) स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था। और एलडब्ल्यू चित्रा 1 BioRender.com (https://biorender.com/) के साथ बनाया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pA9-barnase line | University of Bath | Courtsey of Prof. Rod Scott | Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0 |
| Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm | Fisher | Dumont 500342 | Tweezer uses for transfer of pollen grain |
| GraphPad Prsim (version 8.0.2) | Dotmatics | Prism | Comprehensive data analysis, graphing and statistics software |
| JMP (version 17) | JMP Statistical Discovery LLC | JMP 17 | Statistical analysis software |
| Levington F2S seed & modular compost (with sand) | Levington | LEV75F2SMS | General-purpose compost for plant growth |
| Micromanipulator | Singer instrument Co. LTD. | Singer Micromanipulator | Micromanipulator to aid transfer of pollen grain |
| Nikon Digit sight DS-U1 | Nikon | DS-U1 | Microscope camera (coupletd to SMZ1500) |
| Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | TE2000-S | Inverted microscope |
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | Stereomicroscope |
| Nikon DS-Fi3 microscope camera | Nikon | DS-Fi3 | Microscope camera (coupletd to TE2000-S) |
| Nikon NIS-Elements Basic Research | Nikon | NIS-Elements BR | Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3) |
| Nikon NIS-Elements F | Nikon | NIS-Elements F | Image accquisition and analysis software (for DS-U1) |
| WT Col-0 plant line | uNASC | N70000 | Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 |
References
- Rieseberg, L. H., Willis, J. H.
- Hiscock, S. J., Allen, A. M. Diverse cell signalling pathways regulate pollen-stigma interactions: the search for consensus. New Phytologist. 179 (2), 286-317 (2008).
- Kandasamy, M. K., Nasrallah, J. B., Nasrallah, M. E. Pollen pistil interactions and developmental regulation of pollen-tube growth in Arabidopsis. Development. 120 (12), 3405-3418 (1994).
- Bosch, M., Wang, L. Pollen-stigma interactions in Brassicaceae: complex communication events regulating pollen hydration. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2465-2468 (2020).
- Rozier, F., et al. Live-cell imaging of early events following pollen perception in self-incompatible Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2513-2526 (2020).
- Dickinson, H. Dry stigmas, water and self-incompatibility in Brassica. Sexual Plant Reproduction. 8, 1-10 (1995).
- Takasaki, T., et al. The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica stigma. Nature. 403 (6772), 913-916 (2000).
- Schopfer, C. R., Nasrallah, M. E., Nasrallah, J. B. The male determinant of self-incompatibility in Brassica. Science. 286 (5445), 1697-1700 (1999).
- Takayama, S., et al. Direct ligand-receptor complex interaction controls Brassica self-incompatibility. Nature. 413 (6855), 534-538 (2001).
- Shiba, H., et al. A pollen coat protein, SP11/SCR, determines the pollen S-specificity in the self-incompatibility of Brassica species. Plant Physiology. 125 (4), 2095-2103 (2001).
- Broz, A. K., Bedinger, P. A. Pollen-pistil interactions as reproductive barriers. Annual Review of Plant Biology. 72 (1), 615-639 (2021).
- Cheung, A. Y., Duan, Q., Li, C., James Liu, M. -C., Wu, H. -M. Pollen-pistil interactions: It takes two to tangle but a molecular cast of many to deliver. Current Opinion in Plant Biology. 69, 102279 (2022).
- Wang, L. D., et al. PCP-B class pollen coat proteins are key regulators of the hydration checkpoint in Arabidopsis thaliana pollen-stigma interactions. New Phytologist. 213 (2), 764-777 (2017).
- Liu, C., et al. Pollen PCP-B peptides unlock a stigma peptide-receptor kinase gating mechanism for pollination. Science. 372 (6538), 171-175 (2021).
- Bordeleau, S. J., Sanchez, L. E. C., Goring, D. R. Finding new Arabidopsis receptor kinases that regulate compatible pollen-pistil interactions. Frontiers in Plant Science. 13, 1022684 (2022).
- Suwabe, K., et al. Double-locking mechanism of self-compatibility in Arabidopsis thaliana: the synergistic effect of transcriptional depression and disruption of coding region in the male specificity gene. Frontiers in Plant Science. 11, 576140 (2020).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Lee, H. K., Macgregor, S., Goring, D. R. A toolkit for teasing apart the early stages of pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. Pollen and Pollen Tube Biology. 2160, 13-28 (2020).
- Dilkes, B. P., et al. The maternally expressed WRKY transcription factor TTG2 controls lethality in interploidy crosses of Arabidopsis. PLoS Biology. 6 (12), 2707-2720 (2008).
- Riglet, L., et al. KATANIN-dependent mechanical properties of the stigmatic cell wall mediate the pollen tube path in Arabidopsis. eLife. 9, e57282 (2020).
- Zhou, L. Z., Dresselhaus, T. Friend or foe: Signaling mechanisms during double fertilization in flowering seed plants. Plant Development and Evolution. 131, 453-496 (2019).
- Gao, X. -Q., et al. The Arabidopsis KINβγ subunit of the SnRK1 complex regulates pollen hydration on the stigma by mediating the level of reactive oxygen species in pollen. PLoS Genetics. 12 (7), e1006228 (2016).
- Lee, H. K., Goring, D. R. Two subgroups of receptor-like kinases promote early compatible pollen responses in the Arabidopsis thaliana pistil. Journal of Experimental Botany. 72 (4), 1198-1211 (2021).
- O'Malley, R. C., Barragan, C. C., Ecker, J. R. A user's guide to the Arabidopsis T-DNA insertion mutant collections. Pollen and Pollen Tube Biology. 1284, 323-342 (2015).
- Samson, F., et al. FLAGdb++: a database for the functional analysis of the Arabidopsis genome. Nucleic Acids Research. 32, D347-D350 (2004).
- Doucet, J., et al. Investigations into a putative role for the novel BRASSIKIN pseudokinases in compatible pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 19 (1), 549 (2019).
