Summary
Her beskriver vi detaljeret protokollen til kvantificering af telomerlængde ved hjælp af ikke-radioaktiv kemiluminescensdetektion med fokus på optimering af forskellige ydelsesparametre for TAGGG telomerlængdeanalysesættet, såsom buffermængder og sondekoncentrationer.
Abstract
Telomerer er gentagne sekvenser, der er til stede i kromosomale ender; Deres forkortelse er et karakteristisk træk ved humane somatiske celler. Forkortelse opstår på grund af et problem med endereplikation og fraværet af telomeraseenzymet, som er ansvarlig for at opretholde telomerlængden. Interessant nok forkortes telomerer også som reaktion på forskellige interne fysiologiske processer, som oxidativ stress og betændelse, som kan blive påvirket på grund af ekstracellulære midler som forurenende stoffer, infektiøse stoffer, næringsstoffer eller stråling. Således tjener telomerlængden som en fremragende biomarkør for aldring og forskellige fysiologiske sundhedsparametre. TAGGG telomerlængdeanalysesættet bruges til at kvantificere gennemsnitlige telomerlængder ved hjælp af telomerrestriktionsfragmentet (TRF) assay og er meget reproducerbart. Det er dog en dyr metode, og på grund af dette anvendes den ikke rutinemæssigt til store stikprøvenumre. Her beskriver vi en detaljeret protokol for en optimeret og omkostningseffektiv måling af telomerlængde ved hjælp af Southern blots eller TRF-analyse og ikke-radioaktiv kemiluminescensbaseret detektion.
Introduction
Telomerer er de gentagne DNA-sekvenser, der er til stede i slutningen af kromosomer. De har tandemgentagelser af TTAGGG og opretholder genomintegritet ved at beskytte kromosomet mod både flossning og slutreplikationsproblemet, hvilket betyder, at en del af 3'-udhænget ikke kan replikeres af DNA-polymerase 1,2. Korte telomerer fører til kromosomale abnormiteter i celler, på grund af hvilke celler bliver permanent arresteret i et stadium kaldet replikativ ældning3. Korte telomerer forårsager også en lang række andre problemer, såsom mitokondrier dysfunktion 4,5 og celledysfunktion.
DNA-telomeriske gentagelser går tabt, når og når cellen deler sig, med et gennemsnitligt tab på 25 til 200 bp pr. år 6, hvilket resulterer i cellulær ældning efter et vist antal divisioner6. Aldring er forbundet med en højere frekvens af comorbiditeter, hvilket er præget af en forkortelse i telomerlængde7. Telomerrestriktionsfragment (TRF) analyse, som beskrevet af Mender, er en meget dyr metode8. På grund af dette implementeres det ikke, mens telomerlængden kvantificeres i de fleste undersøgelser.
I øjeblikket anvender de fleste epidemiologiske undersøgelser kvantitative polymerasekædereaktionsbaserede (qPCR) -baserede målinger af telomerlængde. Den qPCR-baserede metode er imidlertid en relativ målemetode, da den måler forholdet mellem telomerer og enkeltkopi-genamplifikationsprodukter og ikke absolut telomerlængde. Telomerlængdemåling ved hjælp af TRF-protokollen er guldstandardmetoden, da den kan måle telomerlængdefordeling i prøven, og målinger kan udtrykkes i absolutte værdier i kilobaser (kb). Imidlertid er brugen begrænset, fordi det er besværligt, arbejdskrævende og dyrt. Her præsenterer vi en optimeret protokol til telomerlængdemåling ved hjælp af kemiluminescensbaserede TRF'er.
TRF-analyse inkluderer syv hovedtrin: 1) dyrkning af celler til genomisk DNA-ekstraktion, 2) genomisk DNA-ekstraktion ved hjælp af phenol: chloroform: isoamylalkohol (P: C: I) -metoden, 3) restriktionsfordøjelse af genomisk DNA, 4) agarosegelelektroforese, 5) Southern blotting af restriktionsfordøjelses-DNA-fragmentet, 6) hybridisering og detektion via Chemiluminescens-Den immobiliserede telomersonde visualiseres af et meget følsomt kemiluminescerende substrat til alkalisk phosphatase, dinatrium-2-chlor-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2′-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]decan])-4-yl]-1-phenylphosphat (CDP-Star)-og 7) analyse for at opnå gennemsnitlig telomerlængde og rækkeviddeinformation fra disse telomeriske udstrygninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer om alle reagenser, der anvendes i protokollen nedenfor. Tabel 1 anvender laboratoriefremstillede reagenser sammen med optimerede volumener, og tabel 2 viser arbejdskoncentrationer af kommercielt tilgængelige reagenser.
1. Cellekultur
- Oprethold celler, hvis telomerlængde skal måles (her brugt var A2780-celler, som er en ovarieadenokarcinomcellelinje) i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) komplette medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), streptomycin, penicillin og amphotericin B i en 6 cm petriskål. Der inkuberes ved 37 °C i et befugtet og kontrolleret miljø, der indeholder 5% kuldioxid, indtil cellerne er 80%-100% sammenflydende.
- Fjern mediet og vask med 5 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS).
- Cellerne behandles med 1 ml trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) til løsrivelse af cellerne ved inkubation ved 37 °C i 3-5 minutter.
- Tilsæt 2 ml DMEM komplette medier for at inaktivere trypsin og opsamle cellerne i et centrifugeringsrør.
- Pillecellerne ved 2.348 × g i 5 min.
- Pellet vaskes med 1x PBS og centrifugeres ved 2.348 × g i 5 min.
- Opbevar pillen ved -80 °C indtil yderligere brug.
BEMÆRK: Celletallet kan variere afhængigt af cellelinjen. Vi opnåede ca. 2,5 × 106 celler i tilfælde af A2780-cellelinjen, som bruges i yderligere trin.
2. Genomisk DNA-isolering
- Der tilsættes 500 μL lysisbuffer (10 mM tris-Cl, pH 8,0; 25 mM EDTA, pH 8,0; 100 mM NaCl; 0,5% w/v natriumdodecylsulfat) til cellepelleten, og blandingen forsigtigt med en skåret spids (med en åbningsdiameter på mindst 2 mm). Der tilsættes 20 μg/ml frisklavet RNase A og blandes forsigtigt ved invertering.
- Der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter, og vend lejlighedsvis glasset på hovedet under inkubationen.
- Der tilsættes proteinase K til en slutkoncentration på 100 μg/ml og blandes forsigtigt ved invertering 10 gange. Der inkuberes ved 55 °C i 2 timer. Vend røret med jævne mellemrum (hvert 10. minut) under inkubation.
- Der tilsættes 500 μL phenol:chloroform:isoamylalkoholreagens (25:24:1) og blandes forsigtigt ved invertering 20 gange. Der centrifugeres ved 9.391 × g i 15 minutter ved stuetemperatur (ca. 25 °C).
BEMÆRK: Figur 1A viser de tre lag, der er opnået efter centrifugering. - Fjern det tyktflydende øvre vandige lag ud af de tre synlige lag, læg det i et frisk rør ved hjælp af en skåret spids, og tilsæt en lige så stor mængde chloroform. Bland ved blid invertering 20 gange.
- Centrifuger glassene ved 9.391 × g i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Det vandige lag opsamles, og der tilsættes en passende mængde 5 M NaCl, således at den endelige koncentration af NaCl er 0,2 M.
- Tilsæt to volumener 100% ethanol. Bland ved blid inversion 20-25 gange. Der centrifugeres ved 15.871 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 500 μL 70% ethanol for at vaske pelletsen. Der centrifugeres ved 15.871 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, pelletpen lufttørres i nogle minutter, og der tilsættes 50 μL sterilt nukleasefrit vand. Lad DNA'et rehydrere i 1-2 dage ved stuetemperatur. Bland ved pipettering ved hjælp af den afskårne spids.
- Mål koncentrationen af DNA ved hjælp af ultraviolet (UV)-spektrofotometri. Fortynd prøverne om nødvendigt med sterilt nukleasefrit vand for at opnå en minimumskoncentration på 300-500 ng/μL.
- Kontroller DNA'ets integritet ved at køre det på en 1% agarosegel (figur 1B).
- Det fortyndede DNA opbevares ved -20 °C indtil yderligere anvendelse.
3. Fordøjelse af genomisk DNA
- Der fremstilles en enzymblanding af Rsa1 (20 E) og Hinf1 (20 E), og der tilsættes 2 μL restriktionsfordøjelsesbuffer pr. reaktion.
- Der udtages et passende volumen genomisk DNA, således at den samlede mængde DNA er 1,5 μg. Der fyldes op med sterilt nukleasefrit vand, således at det totale volumen efter enzymtilsætningen er 20 μL.
- Bland godt ved at banke, efterfulgt af et pulsspin.
- Blandingen inkuberes ved 37 °C i 2 timer.
4. Agarosegelelektroforese
- Forbered en 10 cm × 15 cm 0,8% agarosegel i 1x trisacetat EDTA (TAE) buffer ved hjælp af højkvalitets agarose.
- Tilsæt 5 μL fyldigt farvestof til hver fordøjet genomisk DNA-prøve, hvorved det endelige volumen bliver 25 μL, og læg prøverne på gelen.
- Forbered en molekylær markørblanding ved hjælp af 1 μL molekylær markør (stige), 3 μL sterilt nukleasefrit vand og 1 μL 5x belastningsfarvestof.
- Fyld 5 μL molekylær markørblanding på begge sider af de genomiske DNA-fordøjede prøver, hvis der er et højere antal prøver (~ 10), eller kun på den ene side, hvis der er mindre end eller lig med fem prøver.
- Kør gelen ved 5 V/cm i 6 timer. Når løbet er afsluttet, skal du lave et hak på det ene hjørne af gelen for at markere lasteordren.
- Nedsænk gelen i 0,25 M HCl i 10 min ved stuetemperatur med forsigtig omrøring.
- Skyl gelen to gange med destilleret vand.
- DNA'et denatureres ved at nedsænke gelen i en opløsning på 0,5 M NaOH og 1,5 M NaCl to gange i 15 minutter hver ved stuetemperatur under forsigtig omrøring.
- Skyl gelen to gange med destilleret vand.
- Neutralisere DNA'et ved at nedsænke gelen i en opløsning af 0,5 M tris-HCl og 3 M NaCl (pH 7,5) to gange i 15 minutter ved stuetemperatur med forsigtig omrøring.
5. Southern blotting
- Skær en nylonmembran på 10 cm × 12 cm i størrelse og lav et hak i samme position som gelen.
- Membranen aktiveres ved at dyppe i destilleret vand efterfulgt af 20x natriumsaltvandcitrat (SSC) buffer (se tabel 1).
- Konfigurer overførslen.
- Tag en ren glasbakke og læg en anden bakke i den i omvendt position. Opret en væge ved hjælp af almindeligt filterpapir, så enderne rører bunden af den ydre bakke.
- Placer gelen oven på filterpapiret. Placer forsigtigt den aktiverede nylonmembran over gelen, med hakene overlappende, og fjern eventuelle luftbobler ved at rulle over en glasstang.
- Anbring en 2 cm bunke 9,5 cm × 11,5 cm cellulosefilterpapir efterfulgt af en 6 cm bunke almindeligt filterpapir med samme dimensioner. Placer en vægt oven på denne opsætning, så der er samme vægtfordeling nedenfor. Fyld den ydre bakke med 20x SSC-buffer (se figur 2).
- Forlad opsætningen til overførsel natten over.
- Efter den sydlige overførsel fastgøres det overførte DNA på membranen ved UV-tværbinding på en UV-transilluminator eller UV-tværbinding. Brug en 302 nm 8 W lampe i 5 min, eller en 254 nm 8 W lampe i 2 min, hvilket svarer til ca. 120 mJ. Sørg for, at membransiden, hvorpå DNA'et overføres, vender mod lampen.
- Vask membranen to gange med 25 ml 2x SSC-buffer.
- Protokollen sættes om nødvendigt på pause ved fuldstændig tørring af blottet og opbevaring ved 2-8 °C efter løst indpakning i folie indtil videre behandling.
6. Hybridisering og kemiluminescensdetektion
- Forvarm præhybridiseringsbufferen til 42 °C.
BEMÆRK: Følgende trin omfatter mængder opløsninger/buffere, der skal anvendes pr. 100 cm2 blot. - Inkuber membranen i 10 ml præhybridiseringsbuffer i 1 time ved 42 °C med mild omrøring til præhybridisering.
- Tilsæt 0,5 μL telomersonde pr. 5 ml forvarmet præhybridiseringsbuffer for at fremstille hybridiseringsopløsningen.
- Blottet inkuberes i 10 ml hybridiseringsopløsning ved 42 °C i 3 timer under forsigtig omrøring.
- Blottet vaskes med streng buffer 1 (tabel 1) to gange i 10 minutter (25 ml hver) ved stuetemperatur under forsigtig omrøring.
- Forvarm streng buffer 2 (tabel 1) i 30 minutter ved 50 °C.
- Blottet vaskes med streng buffer 2 to gange i 15 minutter (25 ml hver) ved 50 °C under forsigtig omrøring.
- Skyl med 15 ml vaskebuffer i 5 min med let omrøring ved RT.
- Inkuber membranen i 10 ml frisklavet 1x blokeringsopløsning i 30 minutter ved stuetemperatur med let omrøring.
- Inkuber membranen i 10 ml anti-digioxigenin konjugeret med alkalisk fosfatasearbejdsopløsning (se tabel 2) i 30 minutter ved RT med let omrystning.
- Vask blottet to gange med vaskebuffer ved stuetemperatur i 15 min under forsigtig omrøring.
- Der inkuberes i 10 ml detektionsbuffer i 5 minutter ved RT med forsigtig omrøring.
- Fjern overskydende detektionsbufferen, og hold membranen med DNA'et opad på en hybridiseringspose eller acetatark. Tilsæt ~ 1-1,5 ml substratopløsning dråbevis på membranen, læg straks et andet ark på det og inkuber i 5 minutter ved RT.
- Klem den overskydende substratopløsning ud til billeddannelse.
- Afbild blottet i ca. 20 minutter i et billeddannelsessystem til geldokumentation, hvor du indsamler flere billeder på forskellige tidspunkter. Vælg umættede billeder til yderligere analyse.
BEMÆRK: Hvis signalet er svagt, kan billeddannelse udføres i længere tid.
7. Bedømmelse
- Når du har hentet billedfilerne, skal du eksportere dem til offentliggørelse i .tif format med den højest mulige opløsning (600 dpi i dette tilfælde).
- Installer Telotool-software . Dette kræver en specifik version (R2012a) af MATLAB (frit tilgængelig) for at køre.
- Åbn softwaren, og klik på knappen Indlæs billedfil øverst til højre.
- Når billedet er indlæst, skal du klikke på Inverter billede, så billedets baggrund er sort, og udtværingerne/båndene er hvide.
- Beskær billedet med de øverste hjørner startende fra brøndene. Når beskæringsvalget er foretaget, skal du højreklikke inde i det og vælge Beskær billede.
- Når billedet er blevet beskåret, skal du klikke på Beregn baner og tillade, at vognbaneregistrering sker automatisk.
- Hvis vognbanerne ikke er registreret korrekt, f.eks. hvis visse vognbaner slet ikke er blevet registreret, eller hvis der er registreret ekstra eller delvise vognbaner, skal du udføre vognbanejustering som beskrevet nedenfor.
- Klik på Juster baner og i pop op-vinduet, der åbnes, tilføj og / eller juster baner efter behov, og klik på Anvend og luk.
- Når du har justeret banerne, skal du sørge for, at der ses en rød prik på hver af banerne og justere stigerne ved hjælp af knappen Stigetilpasning , og sørg for, at antallet af toppe i begge stigebaner er i samme position. Fjern eventuelle fremmede toppe ved hjælp af knappen Slet ekstrem .
- Når stigerne er justeret, skal du vælge Vognbaneprofiler, klikke på Stigetilpasning og vælge Polynomisk pasform.
- Klik på Trendline, som anbefalet af softwaren, og vælg derefter Korrigeret i den næste mulighed.
- Klik på Hent resultater for at få vist resultaterne som en tabel, hvor rækken Gennemsnitlig TRF er telomerlængdemålingen af de respektive baneprøver.
- Klik på Gem alle for at gemme resultaterne i form af et regneark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det ekstraherede genomiske DNA (gDNA), som blev kørt på en 1% agarosegel, viste god integritet, som vist i figur 1B, hvilket indikerer, at prøven kunne bruges til yderligere downstream-behandling af TRF'er. TRF-analysen blev derefter udført ved at ændre de mængder opløsninger, der kræves på hvert trin (se tabel 1 og tabel 2). TRF-signalet var tydeligt synligt (figur 3). Ved at ændre opløsningsvolumenerne og koncentrationerne kunne flere prøver således behandles uden nogen negativ effekt på resultaterne, og telomerlængden kunne bestemmes med succes ved hjælp af frit tilgængelig software som Telotool10.
Figur 1: Isolering og kvalitetskontrol af genomisk DNA. (A) Tre forskellige separationsfaser opnået ved centrifugering efter tilsætning af phenol:chloroform:isoamylalkohol. Det øvre vandige lag indeholder gDNA, interfasen indeholder proteinerne, og den nedre, organiske fase indeholder det nedbrudte RNA, celleaffald og lipider. (B) Et billede af en 1% agarosegel, der viser intakt ufordøjet gDNA. Bane 1 viser en 1 kb stige og bane 2 viser ufordøjet gDNA fra kræftcellelinjen A2780. Forkortelse: gDNA = genomisk DNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Illustration af opsætning af Southern blotting-overførsel. Repræsentativt diagram, der viser systemenheden til overførsel af telomergentagelsesudtværinger fra gelen til nylonmembranen ved kapillær virkning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Påvisning af kemiluminescens af TRF'er efter sydlig blotting og hybridisering. Blot, der viser en række telomeriske gentagelser som en udtværing i bane 2. Bane 1 viser en molekylmarkør med molekylvægten (kb) af bånd angivet på venstre side. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Liste over reagenser, der anvendes i denne protokol. Tabellen indeholder reagenser, der er fremstillet i laboratoriet sammen med deres opbevaringsdetaljer, den anbefalede brug af TAGGG telomerlængdeassaysætreagenser og deres modificerede brugsmængder i henhold til optimeringen i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Liste over kommercielt tilgængelige reagenser med ændret brugsanvisning. Tabellen indeholder kommercielt tilgængelige reagenser sammen med forskellige fortyndinger, deres opbevaringsoplysninger og deres anbefalede brug af TAGGG telomerlængdeanalysesættet og modificerede brugsmængder i henhold til optimeringen i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en detaljeret procedure for en ikke-radioaktiv, kemiluminescensbaseret metode til telomerlængdemåling ved hjælp af Southern blotting. Protokollen er blevet testet for at tillade fornuftig brug af flere reagenser uden at gå på kompromis med kvaliteten af resultaterne. Prehybridiserings- og hybridiseringsbufferen kan genbruges op til fem gange. Enzymkoncentrationen kan variere mellem 10-20 U pr. 1,5-2 μg genomisk DNA uden at påvirke resultaterne. Flere andre kitkomponenter, såsom den DIG-mærkede molekylvægtmarkør og hybridiseringssonde, kan anvendes i lavere koncentrationer end anbefalet. De optimerede volumener er angivet i tabel 2. Vi har testet dem ved halvdelen af de anbefalede volumener/koncentrationer og fundet optimal ydeevne. Ved at følge disse trin reduceres omkostningerne pr. prøve enormt, hvilket gør det muligt for forskere at måle telomerlængden ved hjælp af denne metode i større skala.
Der er flere offentliggjorte TRF-protokoller. Vi har optimeret den kommercielt tilgængelige kitprotokol for at gøre den omkostningseffektiv. Denne protokol adskiller sig fra nogle af de offentliggjorte protokoller, da den ikke bruger radioaktivitet11,12. Det er også relativt enkelt, da det bruger kitkomponenterne i stedet for at forberede interne reagenser, især telomersonden13.
Hvis det endelige billede er ujævnt, er membranen delvist tørret under inkubation. For at løse dette skal man enten øge opløsningsvolumenet eller omrøre med en højere hastighed. Hvis der ikke er synlige udtværinger på blottet, kan der have været et problem under den sydlige overførsel. Derudover kunne der have været et problem i DNA-mængden eller kvaliteten.
Der er nogle begrænsninger for denne metode. For det første tager genomisk DNA-ekstraktion og kvantificering op til 4 dage baseret på kilden til DNA'et14. DNA med højere molekylvægt tager længere tid at rehydrere og homogenisere, hvilket gør kvantificering og nøjagtig pipettering vanskelig. For det andet er TRF-protokollen lang (mindst 2 dage) og kræver dygtige laboratoriearbejdere at implementere. Det er også en dyr metode på grund af reagenserne og de krævede mængder. TRF-protokollen måler også den gennemsnitlige telomerlængde i hver prøve i modsætning til den korteste telomerlængde, som TESLA måler, eller telomerlængden pr. celle, som flowcytometribaserede metoder giver15. En anden begrænsning af TRF-analyse ved hjælp af de enzymer, der anvendes her, er en overvurdering af telomerlængden, da disse enzymer ikke har et restriktionssted i de subtelomeriske regioner15.
På trods af begrænsningerne er der imidlertid grunde til, at denne metode stadig betragtes som guldstandarden for telomerlængdemåling. Telomerlængder gengives nøjagtigt i absolutte værdier - i kilobasepar (kbp).
Denne metode kan bruges til at måle den gennemsnitlige telomerlængde i en række celletyper, fra cellelinjer 16,17 til buffy coat-pellets 18,19. Dette gør det til en robust metode til brug i flere typer forskningsundersøgelser. Det kan også bruges i store epidemiologiske undersøgelser såvel som i undersøgelser, hvor cellebaserede lægemidler udvikles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke fru Prachi Shah for at hjælpe os i første omgang med protokoloptimeringen. Vi vil gerne takke Dr. Manoj Garg for at levere A2780 ovariecancercellelinjen. EK er støttet af en forskningsbevilling fra Institut for Bioteknologi (nr. BT/RLF/Re-entry/06/2015), Institut for Naturvidenskab og Teknologi (ECR/2018/002117) og NMIMS Seed Grant (IO 401405).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W.
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt's lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat's skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
