Optimisation des paramètres de performance du test de longueur des télomères TAGGG
Summary
Ici, nous décrivons en détail le protocole de quantification de la longueur des télomères à l’aide de la détection chimiluminescente non radioactive, en mettant l’accent sur l’optimisation de divers paramètres de performance du kit de dosage de longueur des télomères TAGGG, tels que les quantités tampons et les concentrations de sonde.
Abstract
Les télomères sont des séquences répétitives qui sont présentes aux extrémités chromosomiques; Leur raccourcissement est une caractéristique des cellules somatiques humaines. Le raccourcissement se produit en raison d’un problème de réplication terminale et de l’absence de l’enzyme télomérase, responsable du maintien de la longueur des télomères. Fait intéressant, les télomères raccourcissent également en réponse à divers processus physiologiques internes, tels que le stress oxydatif et l’inflammation, qui peuvent être affectés par des agents extracellulaires tels que les polluants, les agents infectieux, les nutriments ou les radiations. Ainsi, la longueur des télomères sert d’excellent biomarqueur du vieillissement et de divers paramètres physiologiques de santé. Le kit de dosage de longueur des télomères TAGGG est utilisé pour quantifier les longueurs moyennes des télomères à l’aide du test du fragment de restriction des télomères (TRF) et est hautement reproductible. Cependant, il s’agit d’une méthode coûteuse et, pour cette raison, elle n’est pas utilisée systématiquement pour les grands nombres d’échantillons. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour une mesure optimisée et rentable de la longueur des télomères à l’aide de transferts de Southern ou d’analyse TRF et d’une détection non radioactive basée sur la chimiluminescence.
Introduction
Les télomères sont les séquences d’ADN répétitives présentes à l’extrémité des chromosomes. Ils ont des répétitions en tandem de TTAGGG et maintiennent l’intégrité du génome en protégeant le chromosome à la fois de l’effilochage et du problème de réplication finale, ce qui signifie qu’une partie du surplomb 3′ est incapable d’être répliquée par l’ADN polymérase 1,2. Les télomères courts entraînent des anomalies chromosomiques dans les cellules, en raison desquelles les cellules sont arrêtées de façon permanente dans un stade appelé sénescenceréplicative 3. Les télomères courts causent également une foule d’autres problèmes, tels que le dysfonctionnement des mitochondries 4,5 et le dysfonctionnement cellulaire.
Les répétitions télomériques de l’ADN sont perdues au fur et à mesure que la cellule se divise, avec une perte moyenne de 25 à 200 pb par an 6, entraînant une sénescence cellulaire après un certain nombre de divisions6. Le vieillissement est associé à une fréquence plus élevée de comorbidités, marquée par un raccourcissement de la longueur des télomères7. L’analyse des fragments de restriction des télomères (TRF), telle que décrite par Mender, est une méthode très coûteuse8. Pour cette raison, il n’est pas mis en œuvre lors de la quantification de la longueur des télomères dans la plupart des études.
À l’heure actuelle, la majorité des études épidémiologiques utilisent des mesures quantitatives de la longueur des télomères basées sur la réaction en chaîne par polymérase (qPCR). Cependant, la méthode basée sur la qPCR est une méthode de mesure relative, car elle mesure le rapport entre les télomères et les produits d’amplification génique à copie unique, et non la longueur absolue des télomères. La mesure de la longueur des télomères à l’aide du protocole TRF est la méthode de référence, car elle peut mesurer la distribution de la longueur des télomères dans l’échantillon et les mesures peuvent être exprimées en valeurs absolues en kilobases (kb). Cependant, son utilisation est limitée car elle est encombrante, à forte intensité de main-d’œuvre et coûteuse. Nous présentons ici un protocole optimisé pour la mesure de la longueur des télomères à l’aide de TRF basés sur la chimiluminescence.
L’analyse TRF comprend sept étapes principales: 1) culture de cellules pour l’extraction d’ADN génomique, 2) extraction d’ADN génomique à l’aide de la méthode phénol:chloroforme:isoamylalcool (P:C:I), 3) digestion de restriction de l’ADN génomique, 4) électrophorèse sur gel d’agarose, 5) transfert de Southern du fragment d’ADN de digestion de restriction, 6) hybridation et détection via la sonde télomère immobilisée est visualisée par un substrat chimioluminescent très sensible pour la phosphatase alcaline, la 2-chloro-5-(4-méthoxyspiro[1,2-dioxétane-3,2′-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]décan])-4-yl]-1-phényl phosphate (CDP-Star) – et 7) pour obtenir des informations sur la longueur moyenne des télomères et la gamme de ces frottis télomères.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons une procédure détaillée pour une méthode non radioactive, basée sur la chimiluminescence, pour la mesure de la longueur des télomères par transfert de Southern. Le protocole a été testé pour permettre l’utilisation judicieuse de plusieurs réactifs sans compromis sur la qualité des résultats. Le tampon de préhybridation et d’hybridation peut être réutilisé jusqu’à cinq fois. La concentration enzymatique peut varier entre 10 et 20 U par 1,5 à 2 μg d’ADN génomique sans affecter l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Mme Prachi Shah de nous avoir aidés au départ dans l’optimisation du protocole. Nous tenons à remercier le Dr Manoj Garg d’avoir fourni la lignée cellulaire de cancer de l’ovaire A2780. EK est soutenu par une subvention de recherche du Département de biotechnologie (No. BT / RLF / Re-entry / 06/2015), du Département de la science et de la technologie (ECR / 2018 / 002117) et NMIMS Seed Grant (IO 401405).
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
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