Summary
Burada, tampon miktarları ve prob konsantrasyonları gibi TAGGG telomer uzunluğu tahlil kitinin çeşitli performans parametrelerinin optimizasyonuna odaklanarak, radyoaktif olmayan kemilüminesan tespiti kullanarak telomer uzunluğunu ölçme protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Abstract
Telomerler, kromozomal uçlarda bulunan tekrarlayan dizilerdir; Kısalmaları, insan somatik hücrelerinin karakteristik bir özelliğidir. Kısalma, son replikasyon ile ilgili bir sorun ve telomer uzunluğunun korunmasından sorumlu olan telomeraz enziminin yokluğu nedeniyle oluşur. İlginç bir şekilde, telomerler, kirleticiler, enfeksiyöz ajanlar, besinler veya radyasyon gibi hücre dışı ajanlar nedeniyle etkilenebilecek oksidatif stres ve inflamasyon gibi çeşitli iç fizyolojik süreçlere yanıt olarak da kısalır. Bu nedenle, telomer uzunluğu yaşlanmanın ve çeşitli fizyolojik sağlık parametrelerinin mükemmel bir biyobelirteci olarak hizmet eder. TAGGG telomer uzunluk tahlil kiti, telomer kısıtlama fragmanı (TRF) testini kullanarak ortalama telomer uzunluklarını ölçmek için kullanılır ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Bununla birlikte, pahalı bir yöntemdir ve bu nedenle, büyük örneklem sayıları için rutin olarak kullanılmaz. Burada, Güney lekeleri veya TRF analizi ve radyoaktif olmayan kemilüminesans bazlı algılama kullanılarak telomer uzunluğunun optimize edilmiş ve uygun maliyetli bir ölçümü için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.
Introduction
Telomerler, kromozomların sonunda bulunan tekrarlayan DNA dizileridir. TTAGGG'nin tandem tekrarlarına sahiptirler ve kromozomu hem yıpranmadan hem de son replikasyon probleminden koruyarak genom bütünlüğünü korurlar, bu da 3' çıkıntısının bir kısmının DNA polimeraz 1,2 tarafından kopyalanamayacağı anlamına gelir. Kısa telomerler, hücrelerde kromozomal anormalliklere yol açar, çünkü hücreler replikatif yaşlanma3 adı verilen bir aşamada kalıcı olarak tutuklanır. Kısa telomerler ayrıca mitokondri disfonksiyonu 4,5 ve hücre disfonksiyonu gibi bir dizi başka soruna da neden olur.
DNA telomerik tekrarları, hücre bölündüğünde ve bölündüğünde kaybolur, yılda ortalama 25 ila 200 bp kaybı6 ile sonuçlanır, bu da belirli sayıda bölünmeden sonra hücresel yaşlanma ile sonuçlanır6. Yaşlanma, telomer uzunluğu7'de kısalma ile işaretlenen daha yüksek bir komorbidite sıklığı ile ilişkilidir. Telomer kısıtlama fragmanı (TRF) analizi, Mender tarafından tanımlandığı gibi, çok pahalı bir yöntemdir8. Bu nedenle, çoğu çalışmada telomer uzunluğunu ölçerken uygulanmaz.
Günümüzde epidemiyolojik çalışmaların çoğunda telomer uzunluğunun kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) bazlı ölçümleri kullanılmaktadır. Bununla birlikte, qPCR tabanlı yöntem, telomerler ve tek kopyalı gen amplifikasyon ürünleri arasındaki oranı ölçtüğü ve mutlak telomer uzunluğunu ölçmediği için göreceli bir ölçüm yöntemidir. TRF protokolünü kullanarak telomer uzunluğu ölçümü altın standart yöntemdir, çünkü numunedeki telomer uzunluk dağılımını ölçebilir ve ölçümler kilobaz (kb) cinsinden mutlak değerlerle ifade edilebilir. Bununla birlikte, kullanımı sınırlıdır çünkü hantal, emek yoğun ve maliyetlidir. Burada, kemilüminesans bazlı TRF'leri kullanarak telomer uzunluğu ölçümü için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.
TRF analizi yedi ana adımı içerir: 1) genomik DNA ekstraksiyonu için hücrelerin kültürlenmesi, 2) fenol: kloroform: izoamilalkol (P: C: I) yöntemi kullanılarak genomik DNA ekstraksiyonu, 3) genomik DNA'nın kısıtlama sindirimi, 4) agaroz jeli elektroforezi, 5) kısıtlama sindirim DNA fragmanının güney lekelenmesi, 6) hibridizasyon ve tespit yoluyla Kemilüminesans-İmmobilize telomer probu, alkali fosfataz, disodyum 2-kloro-5-(4-metoksispiro[1,2-dioksetan-3,2′-(5-klorotrisiklo [3.3.1.13.7]dekan])-4-yl]-1-fenil fosfat (CDP-Star)-ve 7) analizi için oldukça hassas bir kemilüminesan substrat ile görselleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aşağıdaki protokolde kullanılan tüm reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Tablo 1 , laboratuvar yapımı reaktifleri optimize edilmiş hacimlerle birlikte listeler ve Tablo 2 , ticari olarak temin edilebilen reaktiflerin çalışma konsantrasyonlarını gösterir.
1. Hücre kültürü
- Telomer uzunluğu ölçülecek hücreleri (burada bir yumurtalık adenokarsinom hücre hattı olan A2780 hücreleri vardı), Dulbecco'nun modifiye kartal besiyeri (DMEM) tam ortamında, 6 cm'lik bir Petri kabında% 10 fetal sığır serumu (FBS), streptomisin, penisilin ve amfoterisin B ile desteklenmiş olarak koruyun. 37 °C'de, hücreler %80-%100 birleşene kadar %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş ve kontrollü bir ortamda inkübe edin.
- Ortamı çıkarın ve 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- Hücreleri 3-5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe ederek hücreleri ayırmak için 1 mL tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile tedavi edin.
- Tripsini inaktive etmek ve hücreleri bir santrifüjleme tüpünde toplamak için 2 mL DMEM komple ortamı ekleyin.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 2.348 × g'da pelet yapın.
- Peletleri 1x PBS ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 2.348 × g'da santrifüj yapın.
- Pelet bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
NOT: Hücre sayısı, hücre satırına bağlı olarak değişebilir. Daha sonraki adımlarda kullanılan A2780 hücre hattında yaklaşık 2.5 × 106 hücre elde ettik.
2. Genomik DNA izolasyonu
- Hücre peletine 500 μL lizis tamponu (10 mM tris-Cl, pH 8.0; 25 mM EDTA, pH 8.0; 100 mM NaCl; %0.5 w/v sodyum dodesil sülfat) ekleyin ve bir kesme ucu (en az 2 mm açıklık çapı ile) kullanarak hafifçe karıştırın. 20 μg/mL taze hazırlanmış RNase A ekleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın.
- 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve bazen inkübasyon sırasında tüpü ters çevirin.
- Proteinaz K'yı 100 μg / mL'lik bir son konsantrasyona ekleyin ve 10 kez ters çevirerek yavaşça karıştırın. 2 saat boyunca 55 ° C'de inkübe edin. İnkübasyon sırasında tüpü düzenli aralıklarla (her 10 dakikada bir) ters çevirin.
- 500 μL fenol:kloroform:izoamil alkol reaktifi (25:24:1) ekleyin ve 20 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında (yaklaşık 25 ° C) 15 dakika boyunca 9.391 × g'da santrifüj.
NOT: Şekil 1A , santrifüjlemeden sonra elde edilen üç katmanı göstermektedir. - Viskoz üst sulu tabakayı görünür üç katmandan çıkarın, kesilmiş bir uç kullanarak taze bir tüpe yerleştirin ve eşit miktarda kloroform ekleyin. 20 kez nazik ters çevirme ile karıştırın.
- Tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 9.391 × g'da santrifüj edin.
- Sulu tabakayı toplayın ve uygun miktarda 5 M NaCl ekleyin, böylece NaCl'nin nihai konsantrasyonu 0.2 M'dir.
- İki hacim% 100 etanol ekleyin. 20-25 kez hafifçe ters çevirerek karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 15.871 × g'da santrifüj.
- Süpernatantı çıkarın ve peleti yıkamak için 500 μL% 70 etanol ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 15.871 × g'da santrifüj.
- Süpernatanı çıkarın, peleti birkaç dakika hava ile kurutun ve 50 μL steril nükleaz içermeyen su ekleyin. DNA'nın oda sıcaklığında 1-2 gün boyunca rehidratasyonuna izin verin. Kesme ucunu kullanarak pipetleme ile karıştırın.
- Ultraviyole (UV)-spektrofotometri kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. Gerekirse, minimum 300-500 ng / μL konsantrasyon elde etmek için steril nükleaz içermeyen su kullanarak numuneleri yeniden seyreltin.
- DNA'nın bütünlüğünü% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırarak kontrol edin (Şekil 1B).
- Seyreltilmiş DNA'yı bir sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
3. Genomik DNA'nın sindirimi
- Rsa1 (20 U) ve Hinf1 (20 U) enzim karışımı hazırlayın ve reaksiyon başına 2 μL kısıtlama sindirim tamponu ekleyin.
- Toplam DNA miktarı 1.5 μg olacak şekilde uygun bir genomik DNA hacmi alın. Hacmi steril nükleaz içermeyen suyla telafi edin, böylece enzim ilavesinden sonraki toplam hacim 20 μL'dir.
- Dokunarak iyice karıştırın, ardından bir nabız dönüşü yapın.
- Karışımı 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. Agaroz jel elektroforezi
- Yüksek dereceli agaroz kullanarak 1x tris asetat EDTA (TAE) tamponunda 10 cm × 15 cm% 0.8 agaroz jeli hazırlayın.
- Her sindirilmiş genomik DNA örneğine 5 μL yükleme boyası ekleyin, böylece son hacmi 25 μL yapın ve numuneleri jel üzerine yükleyin.
- 1 μL moleküler belirteç (merdiven), 3 μL steril nükleaz içermeyen su ve 1 μL 5x yükleme boyası kullanarak moleküler bir belirteç karışımı hazırlayın.
- Daha fazla sayıda örnek varsa (~ 10) genomik DNA sindirilmiş numunelerin her iki tarafına 5 μL moleküler belirteç karışımı veya beşten az veya beşe eşit ise sadece bir tarafa yükleyin.
- Jeli 6 saat boyunca 5 V / cm'de çalıştırın. Koşu tamamlandıktan sonra, yükleme sırasını işaretlemek için jelin bir köşesinde bir çentik yapın.
- Jeli oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0.25 M HCl'ye hafifçe çalkalama ile batırın.
- Jeli damıtılmış suyla iki kez durulayın.
- Jeli, yumuşak ajitasyonla oda sıcaklığında her biri 15 dakika boyunca iki kez 0.5 M NaOH ve 1.5 M NaCl'lik bir çözeltiye batırarak DNA'yı denatüre edin.
- Jeli damıtılmış suyla iki kez durulayın.
- Jeli, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca iki kez 0.5 M tris-HCl ve 3 M NaCl (pH 7.5) çözeltisine batırarak DNA'yı nötralize edin.
5. Güney lekelenmesi
- 10 cm × 12 cm boyutunda bir naylon membran kesin ve jel ile aynı pozisyonda bir çentik yapın.
- Damıtılmış suya daldırarak membranı aktive edin ve ardından 20x sodyum salin sitrat (SSC) tamponu uygulayın (bkz. Tablo 1).
- Aktarımı ayarlayın.
- Temiz bir cam tepsi alın ve içine ters konumda başka bir tepsi yerleştirin. Normal filtre kağıdı kullanarak, uçları dış tepsinin tabanına dokunacak şekilde bir fitil oluşturun.
- Jeli filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Aktif naylon zarı, çentikler üst üste binecek şekilde jelin üzerine yavaşça yerleştirin ve bir cam çubuk üzerinde yuvarlayarak hava kabarcıklarını çıkarın.
- 2 cm'lik 9,5 cm'lik bir yığın × 11,5 cm'lik selüloz filtre kağıdı ve ardından aynı boyutlarda 6 cm'lik bir normal filtre kağıdı yığını yerleştirin. Bu kurulumun üstüne, aşağıda eşit ağırlık dağılımı olacak şekilde bir ağırlık yerleştirin. Dış tepsiyi 20x SSC arabelleği ile doldurun (bkz. Şekil 2).
- Gece aktarımı için kurulumu bırakın.
- Güney transferinden sonra, aktarılan DNA'yı bir UV transilluminatör veya UV çapraz bağlayıcı üzerinde UV çapraz bağlama ile membrana sabitleyin. Yaklaşık 120 mJ'ye karşılık gelen 5 dakika boyunca 302 nm 8 W lamba veya 2 dakika boyunca 254 nm 8 W lamba kullanın. DNA'nın aktarıldığı zar tarafının lambaya baktığından emin olun.
- Membranı 25 mL 2x SSC tamponu ile iki kez yıkayın.
- Gerekirse, lekeyi tamamen kurutarak ve folyoya gevşek bir şekilde sardıktan sonra 2-8 ° C'de saklayarak protokolü duraklatın.
6. Hibridizasyon ve kemilüminesans tespiti
- Prehibridizasyon tamponunu önceden 42 °C'ye ısıtın.
NOT: Aşağıdaki adımlar, 100cm2 leke başına kullanılacak çözelti/tampon hacimlerini içerir. - Membranı, prehibridizasyon için nazik ajitasyonla 42 ° C'de 1 saat boyunca 10 mL prehibridizasyon tamponunda inkübe edin.
- Hibridizasyon çözeltisini yapmak için 5 mL önceden ısıtılmış prehibridizasyon tamponu başına 0,5 μL telomer probu ekleyin.
- Lekeyi 10 mL'lik hibridizasyon çözeltisinde 42 ° C'de 3 saat boyunca nazik ajitasyonla inkübe edin.
- Lekeyi sıkı tampon 1 (Tablo 1) ile oda sıcaklığında 10 dakika (her biri 25 mL) boyunca iki kez hafif çalkalama ile yıkayın.
- Sıkı tampon 2'yi (Tablo 1) 50 ° C'de 30 dakika önceden ısıtın.
- Lekeyi sıkı tampon 2 ile 50 ° C'de 50 ° C'de 15 dakika (her biri 25 mL) boyunca iki kez yıkayın.
- RT'de hafif çalkalama ile 15 mL yıkama tamponu ile 5 dakika durulayın.
- Membranı, 10 mL'lik taze hazırlanmış 1x bloke edici çözelti içinde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nazik ajitasyonla inkübe edin.
- Membranı, alkalen fosfataz çalışma çözeltisi ile konjuge edilmiş 10 mL anti-digioxigenin içinde (bakınız Tablo 2) RT'de 30 dakika boyunca nazik ajitasyonla inkübe edin.
- Lekeyi iki kez oda sıcaklığında yıkama tamponu ile 15 dakika boyunca nazik bir ajitasyonla yıkayın.
- RT'de 5 dakika boyunca 10 mL algılama tamponunda hafif ajitasyonla inkübe edin.
- Fazla algılama tamponunu çıkarın ve membranı, DNA yukarı bakacak şekilde bir hibridizasyon torbası veya asetat tabakası üzerinde tutun. Membran üzerine damla damla ~ 1-1.5 mL substrat çözeltisi ekleyin, hemen üzerine başka bir tabaka yerleştirin ve RT'de 5 dakika inkübe edin.
- Görüntüleme için fazla substrat çözeltisini sıkın.
- Lekeyi bir jel dokümantasyon görüntüleme sisteminde yaklaşık 20 dakika boyunca görüntüleyin ve farklı zaman noktalarında birden fazla görüntü toplayın. Daha fazla analiz için doymamış görüntüleri seçin.
NOT: Sinyalin zayıf olması durumunda, görüntüleme daha uzun bir süre için gerçekleştirilebilir.
7. Analiz
- Görüntü dosyalarını aldıktan sonra, mümkün olan en yüksek çözünürlükte (bu durumda 600 dpi) .tif formatta yayınlanmak üzere dışa aktarın.
- Telotool yazılımını yükleyin. Bu, çalıştırmak için MATLAB'ın belirli bir sürümünü (R2012a) gerektirir (serbestçe kullanılabilir).
- Yazılımı açın ve sağ üstteki Görüntü Dosyası Yükle düğmesine tıklayın.
- Görüntü yüklendikten sonra, görüntü arka planının siyah ve lekelerin/bantların beyaz olması için Görüntüyü Tersine Çevir'i tıklatın.
- Görüntüyü kuyulardan başlayarak üst köşelerle kırpın. Kırpma seçimi yapıldıktan sonra, içine sağ tıklayın ve Görüntüyü Kırp'ı seçin.
- Görüntü kırpıldıktan sonra, Şeritleri Hesapla'ya tıklayın ve şerit algılamanın otomatik olarak gerçekleşmesine izin verin.
- Şeritler düzgün algılanmamışsa, örneğin belirli şeritler hiç algılanmamışsa veya fazladan veya kısmi şeritler algılanmışsa, şerit ayarlamasını aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
- Şeritleri Ayarla'ya tıklayın ve açılan açılır pencerede, şeritleri gerektiği gibi ekleyin ve / veya ayarlayın ve Uygula ve Kapat'a tıklayın.
- Şeritleri ayarladıktan sonra, şeritlerin her birinde kırmızı bir nokta göründüğünden emin olun ve her iki merdiven şeridindeki tepe sayısının aynı konumda olduğundan emin olarak Merdivene Sığ düğmesini kullanarak merdivenleri ayarlayın. Extremum'u Sil düğmesini kullanarak yabancı pikleri kaldırın.
- Merdivenler ayarlandıktan sonra, Şerit Profilleri'ni seçin, Merdiven Uyumu'na tıklayın ve Polinom Uyumu'nu seçin.
- Yazılım tarafından önerildiği gibi Trendline'a tıklayın ve ardından bir sonraki seçenekte Düzeltildi'yi seçin.
- Sonuçları, Ortalama TRF satırının ilgili şerit örneklerinin telomer uzunluğu ölçümü olduğu bir tablo olarak görüntülemek için Sonuçları Al'a tıklayın.
- Sonuçları elektronik tablo biçiminde saklamak için Tümünü kaydet'i tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırılan ekstrakte edilmiş genomik DNA (gDNA), Şekil 1B'de gösterildiği gibi, numunenin TRF'lerin daha aşağı akış işlenmesi için kullanılabileceğini gösteren iyi bir bütünlük göstermiştir. TRF testi daha sonra her adımda gerekli olan çözelti hacimlerinin değiştirilmesiyle gerçekleştirilmiştir (bakınız Tablo 1 ve Tablo 2). TRF sinyali açıkça görülebiliyordu (Şekil 3). Böylece, çözelti hacimlerini ve konsantrasyonlarını değiştirerek, sonuçlar üzerinde herhangi bir olumsuz etki yaratmadan daha fazla numune işlenebilir ve telomer uzunluğu, Telotool10 gibi serbestçe kullanılabilen yazılımlar kullanılarak başarıyla belirlenebilir.
Şekil 1: Genomik DNA'nın izolasyonu ve kalite kontrolü. (A) Fenol: kloroform: izoamil alkol eklendikten sonra santrifüjleme üzerine elde edilen üç ayrı ayırma fazı. Üst sulu tabaka gDNA'yı, interfaz proteinleri içerir ve alt, organik faz bozulmuş RNA'yı, hücre kalıntılarını ve lipitleri içerir. (B) Bozulmamış sindirilmemiş gDNA'yı gösteren% 1'lik bir agaroz jelinin görüntüsü. Şerit 1, 1 kb'lik bir merdiveni gösterir ve şerit 2, kanser hücre hattı A2780'in sindirilmemiş gDNA'sını gösterir. Kısaltma: gDNA = genomik DNA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Güney lekeleme transfer kurulumunun çizimi. Telomer tekrar yaymalarının jelden naylon membrana kılcal etki ile aktarılması için sistem düzeneğini gösteren temsili diyagram. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Güney lekelenmesi ve hibridizasyon sonrası TRF'lerin kemilüminesans tespiti. Şerit 2'de bir yayma olarak bir dizi telomerik tekrarı gösteren leke. Şerit 1, sol tarafta belirtilen bantların moleküler ağırlıkları (kb) ile moleküler bir belirteç gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan reaktiflerin listesi. Tablo, laboratuvarda hazırlanan reaktifleri, depolama ayrıntıları, TAGGG telomer uzunluk tahlil kiti reaktiflerinin önerilen kullanımı ve bu protokoldeki optimizasyona göre değiştirilmiş kullanım hacimleri ile birlikte içerir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Değiştirilmiş kullanım talimatlarına sahip ticari olarak temin edilebilen reaktiflerin listesi. Tablo, ticari olarak temin edilebilen reaktiflerin yanı sıra farklı seyreltmeleri, depolama ayrıntılarını ve bu protokoldeki optimizasyona göre TAGGG telomer uzunluk tahlil kiti ve değiştirilmiş kullanım hacimleri tarafından önerilen kullanımlarını içerir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Güney lekelemesi kullanarak telomer uzunluğu ölçümü için radyoaktif olmayan, kemilüminesans bazlı bir yöntem için ayrıntılı bir prosedür tarif ediyoruz. Protokol, sonuçların kalitesinden ödün vermeden birkaç reaktifin akıllıca kullanılmasına izin verecek şekilde test edilmiştir. Prehibridizasyon ve hibridizasyon tamponu beş defaya kadar tekrar kullanılabilir. Enzim konsantrasyonu, sonuçları etkilemeden 1.5-2 μg genomik DNA başına 10-20 U arasında değişebilir. DIG etiketli moleküler ağırlık belirteci ve hibridizasyon probu gibi diğer birçok kit bileşeni, önerilenden daha düşük konsantrasyonlarda kullanılabilir. En iyi duruma getirilmiş birimler Tablo 2'de gösterilmiştir. Bunları önerilen hacimlerin/konsantrasyonların yarısında test ettik ve optimum performans bulduk. Bu adımları takip etmek, numune başına maliyeti büyük ölçüde azaltır, böylece araştırmacıların bu yöntemi kullanarak telomer uzunluğunu daha büyük ölçekte ölçmelerini sağlar.
Yayınlanmış birkaç TRF protokolü vardır. Ticari olarak temin edilebilen kit protokolünü uygun maliyetli hale getirmek için optimize ettik. Bu protokol, radyoaktivite kullanmadığı için yayınlanan protokollerin bazılarından farklıdır11,12. Ayrıca, şirket içi reaktifleri, özellikle de telomer probu13'ü hazırlamak yerine kit bileşenlerini kullandığı için nispeten basittir.
Son görüntü yamalı ise, inkübasyon sırasında zar kısmen kurumuştur. Bunu çözmek için, ya çözelti hacmini arttırmalı ya da daha yüksek bir hızda çalkalama yapmalıdır. Leke üzerinde görünür bir leke yoksa, Güney transferi sırasında bir sorun olmuş olabilir. Ek olarak, DNA miktarında veya kalitesinde bir sorun olabilirdi.
Bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, genomik DNA ekstraksiyonu ve nicelleştirilmesi, DNA14'ün kaynağına bağlı olarak 4 güne kadar sürer. Daha yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın yeniden sulandırılması ve homojenize edilmesi daha uzun zaman alır, bu da nicelemeyi ve doğru pipetlemeyi zorlaştırır. İkincisi, TRF protokolü uzundur (en az 2 gün) ve uygulanması için yetenekli laboratuvar çalışanları gerektirir. Aynı zamanda reaktifler ve gerekli miktarlar nedeniyle pahalı bir yöntemdir. TRF protokolü ayrıca, TESLA'nın ölçtüğü en kısa telomer uzunluğunun veya sitometri tabanlı yöntemlerin15 sağladığı hücre başına telomer uzunluğunun aksine, her numunedeki ortalama telomer uzunluğunu da ölçer. Burada kullanılan enzimleri kullanarak TRF analizinin bir başka sınırlaması, telomer uzunluğunun abartılmasıdır, çünkü bu enzimlerin alt telomerik bölgelerde bir kısıtlama bölgesi yoktur15.
Bununla birlikte, sınırlamalara rağmen, bu yöntemin hala telomer uzunluğu ölçümünün altın standardı olarak kabul edilmesinin nedenleri vardır. Telomer uzunlukları, kilobaz çiftleri (kbp) cinsinden mutlak değerlerde doğru bir şekilde işlenir.
Bu yöntem, hücre hatları 16,17'den kabarık ceket peletleri 18,19'a kadar çeşitli hücre tiplerinde ortalama telomer uzunluğunu ölçmek için kullanılabilir. Bu, çeşitli araştırma çalışmalarında kullanmak için sağlam bir yöntem haline getirir. Ayrıca büyük ölçekli epidemiyolojik çalışmalarda ve hücre bazlı terapötiklerin geliştirildiği çalışmalarda da kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bayan Prachi Shah'a başlangıçta protokol optimizasyonunda bize yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Dr. Manoj Garg'a A2780 yumurtalık kanseri hücre hattını sağladığı için teşekkür ederiz. EK, Biyoteknoloji Bölümü'nden (No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), Bilim ve Teknoloji Bölümü (ECR/2018/002117) ve NMIMS Tohum Hibesi (IO 401405) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W.
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt's lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat's skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
