Summary
Här beskriver vi i detalj protokollet för kvantifiering av telomerlängd med hjälp av icke-radioaktiv kemiluminescerande detektion, med fokus på optimering av olika prestandaparametrar för TAGGG-telomerlängdanalyssatsen, såsom buffertkvantiteter och sondkoncentrationer.
Abstract
Telomerer är repetitiva sekvenser som är närvarande vid kromosomala ändar; Deras förkortning är ett karakteristiskt drag hos humana somatiska celler. Förkortning uppstår på grund av ett problem med slutreplikation och frånvaron av telomerasenzymet, som är ansvarigt för att upprätthålla telomerlängden. Intressant nog förkortas telomerer också som svar på olika interna fysiologiska processer, som oxidativ stress och inflammation, som kan påverkas på grund av extracellulära medel som föroreningar, smittämnen, näringsämnen eller strålning. Således tjänar telomerlängden som en utmärkt biomarkör för åldrande och olika fysiologiska hälsoparametrar. TAGGG-telomerlängdanalyssatsen används för att kvantifiera genomsnittliga telomerlängder med hjälp av telomerbegränsningsfragmentet (TRF) och är mycket reproducerbar. Det är dock en dyr metod, och på grund av detta används den inte rutinmässigt för stora provnummer. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för en optimerad och kostnadseffektiv mätning av telomerlängd med hjälp av Southern blots eller TRF-analys och icke-radioaktiv kemiluminiscensbaserad detektion.
Introduction
Telomerer är de repetitiva DNA-sekvenserna som finns i slutet av kromosomerna. De har tandemupprepningar av TTAGGG och upprätthåller genomets integritet genom att skydda kromosomen från både slitage och slutreplikationsproblemet, vilket innebär att en del av 3'-överhänget inte kan replikeras av DNA-polymeras 1,2. Korta telomerer leder till kromosomavvikelser i celler, på grund av vilka celler blir permanent arresterade i ett stadium som kallas replikativ åldrande3. Korta telomerer orsakar också en mängd andra problem, såsom mitokondrier dysfunktion 4,5 och celldysfunktion.
DNA-telomerupprepningar förloras när och när cellen delar sig, med en genomsnittlig förlust på 25 till 200 bp per år 6, vilket resulterar i cellulär åldrande efter ett visst antal divisioner6. Åldrande är förknippat med en högre frekvens av comorbiditeter, vilket markeras av en förkortning av telomerlängden7. Telomerrestriktionsfragmentanalys (TRF), som beskrivs av Mender, är en mycket dyr metod8. På grund av detta, Det genomförs inte samtidigt kvantifiera telomerlängd i de flesta studier.
För närvarande använder majoriteten av epidemiologiska studier kvantitativa polymeraskedjereaktionsbaserade (qPCR) -baserade mätningar av telomerlängd. Den qPCR-baserade metoden är dock en relativ mätmetod, eftersom den mäter förhållandet mellan telomerer och genamplifieringsprodukter med en kopia, och inte absolut telomerlängd. Telomerlängdmätning med TRF-protokollet är guldstandardmetoden, eftersom den kan mäta telomerlängdfördelningen i provet och mätningar kan uttryckas i absoluta värden i kilobaser (kb). Användningen är dock begränsad eftersom den är besvärlig, arbetsintensiv och kostsam. Här presenterar vi ett optimerat protokoll för telomerlängdmätning med kemiluminiscensbaserade TRF.
TRF-analys omfattar sju huvudsteg: 1) odling av celler för genomisk DNA-extraktion, 2) genomisk DNA-extraktion med användning av fenol: kloroform: isoamylalkohol (P: C: I) -metoden, 3) restriktionssmältning av genomiskt DNA, 4) agarosgelelektrofores, 5) Southern blotting av restriktionsdigestion DNA-fragmentet, 6) hybridisering och detektion via Kemiluminescens-den immobiliserade telomersonden visualiseras av ett mycket känsligt kemiluminescerande substrat för alkaliskt fosfatas, dinatrium-2-klor-5-(4-metoxispiro[1,2-dioxetan-3,2′-(5-klortricyklo[3.3.1.13.7]dekan])-4-yl]-1-fenylfosfat (CDP-Star)-och 7) analys för att erhålla genomsnittlig telomerlängd och intervallinformation från dessa telomerutstryk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se materialtabellen för detaljer om alla reagenser som används i protokollet nedan. Tabell 1 listar laboratorietillverkade reagens tillsammans med optimerade volymer och tabell 2 visar arbetskoncentrationer av kommersiellt tillgängliga reagens.
1. Cellodling
- Underhålla celler vars telomerlängd ska mätas (används här var A2780-celler, som är en ovariell adenokarcinomcellinje) i Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) kompletta medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), streptomycin, penicillin och amfotericin B i en 6 cm petriskål. Inkubera vid 37 °C i en fuktad och kontrollerad miljö som innehåller 5 % koldioxid tills cellerna är 80–100 % sammanflytande.
- Ta bort mediet och tvätta med 5 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Behandla cellerna med 1 ml trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för att lossa cellerna genom att inkubera vid 37 °C i 3-5 minuter.
- Tillsätt 2 ml DMEM komplett media för att inaktivera trypsinet och samla cellerna i ett centrifugeringsrör.
- Pellet cellerna vid 2,348 × g i 5 min.
- Tvätta pelleten med 1x PBS och centrifugera vid 2 348 × g i 5 minuter.
- Förvara pelleten vid -80 °C tills den används igen.
OBS: Antalet celler kan variera beroende på cellinjen. Vi erhöll cirka 2,5 × 106 celler i fallet med A2780-cellinjen, som används i ytterligare steg.
2. Genomisk DNA-isolering
- Tillsätt 500 μL lysbuffert (10 mM tris-Cl, pH 8,0; 25 mM EDTA, pH 8,0; 100 mM NaCl; 0,5% w/v natriumdodecylsulfat) till cellpelleten och blanda försiktigt med en skuren spets (med en öppningsdiameter på minst 2 mm). Tillsätt 20 μg/ml nyberedd RNas A och blanda försiktigt genom invertering.
- Inkubera vid 37 °C i 30 minuter och vänd ibland upp och ned röret under inkubationen.
- Tillsätt proteinas K till en slutlig koncentration på 100 μg/ml och blanda försiktigt genom inversion 10 gånger. Inkubera vid 55 °C i 2 timmar. Vänd röret med jämna mellanrum (var 10: e minut) under inkubation.
- Tillsätt 500 μL fenol:kloroform:isoamylalkoholreagens (25:24:1) och blanda försiktigt genom inversion 20 gånger. Centrifugera vid 9,391 × g i 15 minuter vid rumstemperatur (cirka 25 °C).
Anmärkning: Figur 1A visar de tre skikt som erhållits efter centrifugering. - Ta bort det viskösa övre vattenhaltiga skiktet ur de tre synliga skikten, placera i ett nytt rör med en skuren spets och tillsätt en lika stor mängd kloroform. Blanda med försiktig inversion 20 gånger.
- Centrifugera rören vid 9,391 × g i 15 min vid rumstemperatur.
- Samla upp vattenskiktet och tillsätt en lämplig mängd 5 M NaCl så att den slutliga koncentrationen av NaCl är 0,2 M.
- Tillsätt två volymer 100% etanol. Blanda med mild inversion 20-25 gånger. Centrifugera vid 15 871 × g i 5 min vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 500 μL 70% etanol för att tvätta pelleten. Centrifugera vid 15 871 × g i 5 min vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten, lufttorka pelleten i några minuter och tillsätt 50 μL sterilt nukleasfritt vatten. Låt DNA rehydrera i 1-2 dagar vid rumstemperatur. Blanda genom pipettering med hjälp av den skurna spetsen.
- Mät koncentrationen av DNA med ultraviolett (UV) -spektrofotometri. Späd proverna vid behov igen med sterilt nukleasfritt vatten för att få en minsta koncentration på 300-500 ng / μl.
- Kontrollera DNA: s integritet genom att köra den på en 1% agarosgel (figur 1B).
- Förvara det utspädda DNA:t vid -20 °C tills vidare användning.
3. Matsmältning av genomiskt DNA
- Bered en enzymblandning av Rsa1 (20 U) och Hinf1 (20 E) och tillsätt 2 μL restriktionsdigestionsbuffert per reaktion.
- Ta en lämplig volym genomiskt DNA så att den totala mängden DNA är 1,5 μg. Fyll på sterilt nukleasfritt vatten så att den totala volymen efter enzymtillsatsen är 20 μl.
- Blanda väl genom att knacka, följt av en pulssnurrning.
- Inkubera blandningen vid 37 °C i 2 timmar.
4. Agarosgelelektrofores
- Förbered en 10 cm × 15 cm 0,8% agarosgel i 1x trisacetat EDTA (TAE) buffert med högkvalitativ agaros.
- Tillsätt 5 μL laddningsfärgämne till varje smält genomiskt DNA-prov, vilket gör den slutliga volymen 25 μL, och ladda proverna på gelén.
- Bered en molekylär markörblandning med hjälp av 1 μL molekylmarkör (stege), 3 μL sterilt nukleasfritt vatten och 1 μL 5x laddningsfärgämne.
- Fyll 5 μL molekylär markörblandning på båda sidor av de genomiska DNA-smälta proverna om det finns ett högre antal prover (~ 10), eller endast på en sida om det finns mindre än eller lika med fem prover.
- Kör gelen på 5 V/cm i 6 timmar. När körningen är klar, gör ett hack på ett hörn av gelén för att markera laddningsordningen.
- Sänk ner gelén i 0,25 M HCl i 10 minuter vid rumstemperatur med mild omrörning.
- Skölj gelén två gånger med destillerat vatten.
- Denaturera DNA genom att sänka ner gelén i en lösning av 0,5 M NaOH och 1,5 M NaCl två gånger i 15 minuter vardera vid rumstemperatur med mild omrörning.
- Skölj gelén två gånger med destillerat vatten.
- Neutralisera DNA genom att sänka ner gelen i en lösning av 0,5 M tris-HCl och 3 M NaCl (pH 7,5) två gånger i 15 minuter vid rumstemperatur med mild omrörning.
5. Södra blotting
- Skär ett nylonmembran på 10 cm × 12 cm i storlek och gör ett hack i samma position som gelén.
- Aktivera membranet genom att doppa i destillerat vatten följt av 20x natriumsaltlösningscitrat (SSC) buffert (se tabell 1).
- Ställ in överföringen.
- Ta en ren glasbricka och placera en annan bricka i den i inverterat läge. Skapa en veke med vanligt filterpapper så att ändarna vidrör ytterfackets botten.
- Placera gelén ovanpå filterpapperet. Placera försiktigt det aktiverade nylonmembranet över gelén, med skårorna överlappande, och ta bort eventuella luftbubblor genom att rulla över en glasstake.
- Placera en 2 cm hög med 9,5 cm × 11,5 cm cellulosafilterpapper, följt av en 6 cm hög med vanligt filterpapper med samma dimensioner. Placera en vikt ovanpå denna inställning så att det finns lika viktfördelning nedan. Fyll det yttre facket med 20x SSC-buffert (se figur 2).
- Lämna inställningen för överföring över natten.
- Efter den södra överföringen, fixera det överförda DNA på membranet genom UV-tvärbindning på en UV-transilluminator eller UV-tvärbindare. Använd en 302 nm 8 W lampa i 5 min, eller en 254 nm 8 W lampa i 2 min, vilket motsvarar ca 120 mJ. Se till att membransidan på vilken DNA överförs vetter mot lampan.
- Tvätta membranet två gånger med 25 ml 2x SSC-buffert.
- Pausa protokollet vid behov genom att helt torka fläcken och förvara den vid 2–8 °C efter löst inslagning i folie tills vidare bearbetning.
6. Hybridisering och kemiluminiscensdetektering
- Förvärm förhybridiseringsbufferten till 42 °C.
OBS: Följande steg inkluderar volymer av lösningar/buffertar som ska användas per 100 cm2 blot. - Inkubera membranet i 10 ml prehybridiseringsbuffert i 1 timme vid 42 °C med försiktig omrörning för prehybridisering.
- Tillsätt 0,5 μL telomersond per 5 ml förvärmd förhybridiseringsbuffert för att göra hybridiseringslösningen.
- Inkubera blottan i 10 ml hybridiseringslösning vid 42 °C i 3 timmar under försiktig omrörning.
- Tvätta fläcken med sträng buffert 1 (tabell 1) två gånger i 10 minuter (25 ml vardera) vid rumstemperatur med mild omrörning.
- Förvärm sträng buffert 2 (tabell 1) i 30 min vid 50 °C.
- Tvätta fläcken med kraftig buffert 2 gånger i 15 minuter (25 ml vardera) vid 50 °C med försiktig omrörning.
- Skölj med 15 ml tvättbuffert i 5 min med mild omrörning vid RT.
- Inkubera membranet i 10 ml nyberedd 1x blockerande lösning i 30 minuter vid rumstemperatur med mild omrörning.
- Inkubera membranet i 10 ml anti-digioxigenin konjugerat med alkalisk fosfatasarbetslösning (se tabell 2) i 30 minuter vid rumstemperatur under försiktig omrörning.
- Tvätta fläcken två gånger med tvättbuffert vid rumstemperatur i 15 min med mild omrörning.
- Inkubera i 10 ml detektionsbuffert i 5 minuter vid rumstemperatur med försiktig omrörning.
- Ta bort överflödig detektionsbuffert och håll membranet med DNA uppåt på en hybridiseringspåse eller acetatark. Tillsätt ~ 1-1,5 ml substratlösning droppvis på membranet, placera omedelbart ett annat ark på det och inkubera i 5 minuter vid RT.
- Pressa ut överflödig substratlösning för avbildning.
- Avbilda blottningen i cirka 20 minuter i ett bildsystem för geldokumentation och samla in flera bilder vid olika tidpunkter. Välj omättade bilder för vidare analys.
OBS: Om signalen är svag kan avbildning utföras under en längre tid.
7. Bedömning
- När du har fått bildfilerna, exportera dem för publicering i .tif format med högsta möjliga upplösning (600 dpi i det här fallet).
- Installera Telotool programvara. Detta kräver en specifik version (R2012a) av MATLAB (fritt tillgänglig) för att köras.
- Öppna programvaran och klicka på knappen Ladda bildfil längst upp till höger.
- När bilden har lästs in klickar du på Invertera bild så att bildens bakgrund är svart och utstryken/banden är vita.
- Beskär bilden med de övre hörnen från brunnarna. När beskärningsvalet har gjorts högerklickar du inuti det och väljer Beskär bild.
- När bilden har beskurits klickar du på Beräkna körfält och låter körfältsdetektering ske automatiskt.
- Om körfälten inte har detekterats korrekt, till exempel om vissa körfält inte har detekterats alls, eller om extra eller partiella körfält har upptäckts, utför körfältsjustering enligt beskrivningen nedan.
- Klicka på Justera körfält och i popup-fönstret som öppnas, lägg till och / eller justera körfält efter behov och klicka på Apply and Close.
- När du har justerat körfälten, se till att en röd prick syns på var och en av banorna och justera stegarna med knappen Ladder Fit , se till att antalet toppar i båda stegbanorna är i samma position. Ta bort eventuella främmande toppar med knappen Ta bort Extremum .
- När stegarna har justerats väljer du Körfältsprofiler, klickar på Stegpassning och Polynompassning.
- Klicka på Trendline, som rekommenderas av programvaran, och välj sedan Korrigerad i nästa alternativ.
- Klicka på Hämta resultat för att visa resultaten som en tabell, där raden Genomsnittlig TRF är telomerlängdmätningen för respektive körfältprover.
- Klicka på Spara alla för att lagra resultaten i form av ett kalkylblad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det extraherade genomiska DNA (gDNA), som kördes på en 1% agarosgel, visade god integritet, som visas i figur 1B, vilket indikerar att provet kan användas för vidare nedströms bearbetning av TRF. TRF-analysen utfördes sedan genom att ändra de volymer av lösningar som krävdes vid varje steg (se tabell 1 och tabell 2). TRF-signalen var tydligt synlig (figur 3). Således, genom att modifiera lösningsvolymerna och koncentrationerna, kunde fler prover bearbetas utan någon negativ effekt på resultaten, och telomerlängden kunde bestämmas framgångsrikt med hjälp av fritt tillgänglig programvara som Telotool10.
Figur 1: Isolering och kvalitetskontroll av genomiskt DNA. (A) Tre distinkta separationsfaser erhållna vid centrifugering efter tillsats av fenol:kloroform:isoamylalkohol. Det övre vattenhaltiga skiktet innehåller gDNA, interfasen innehåller proteinerna och den nedre, organiska fasen innehåller nedbrutet RNA, cellskräp och lipider. (B) En bild av en 1% agarosgel som visar intakt osmält gDNA. Lane 1 visar en stege på 1 kb och bana 2 visar osmält gDNA från cancercellinjen A2780. Förkortning: gDNA = genomiskt DNA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Illustration av Southern blotting transfer setup. Representativt diagram som visar systemenheten för överföring av telomerupprepningsutstryk från gelén till nylonmembranet genom kapillärverkan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kemiluminiscensdetektion av TRF efter sydlig blotting och hybridisering. Blot visar en rad telomerupprepningar som ett utstryk i körfält 2. Lane 1 visar en molekylär markör, med molekylvikterna (kb) för band som anges på vänster sida. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Förteckning över reagenser som används i detta protokoll. Tabellen innehåller reagens som beretts i labbet tillsammans med deras lagringsinformation, den rekommenderade användningen av TAGGG-telomerlängdsanalyssatsreagenserna och deras modifierade användningsvolymer, enligt optimeringen i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Förteckning över kommersiellt tillgängliga reagenser med modifierade bruksanvisningar. Tabellen innehåller kommersiellt tillgängliga reagens tillsammans med olika utspädningar, deras lagringsdetaljer och deras rekommenderade användning av TAGGG-telomerlängdanalyssatsen och modifierade användningsvolymer, enligt optimeringen i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en detaljerad procedur för en icke-radioaktiv, kemiluminiscensbaserad metod för telomerlängdmätning med Southern blotting. Protokollet har testats för att tillåta förnuftig användning av flera reagens utan att kompromissa med resultatens kvalitet. Prehybridiserings- och hybridiseringsbufferten kan återanvändas upp till fem gånger. Enzymkoncentrationen kan variera mellan 10-20 U per 1,5-2 μg genomiskt DNA utan att påverka resultaten. Flera andra kitkomponenter, såsom den DIG-märkta molekylviktmarkören och hybridiseringssonden, kan användas vid lägre koncentrationer än rekommenderat. De optimerade volymerna anges i tabell 2. Vi har testat dem vid hälften av de rekommenderade volymerna/koncentrationerna och funnit optimal prestanda. Att följa dessa steg minskar kostnaden per prov enormt, vilket gör det möjligt för forskare att mäta telomerlängden med hjälp av denna metod i större skala.
Det finns flera publicerade TRF-protokoll. Vi har optimerat det kommersiellt tillgängliga kitprotokollet för att göra det kostnadseffektivt. Detta protokoll skiljer sig från några av de publicerade protokollen eftersom det inte använder radioaktivitet11,12. Det är också relativt enkelt, eftersom det använder kitkomponenterna snarare än att förbereda interna reagens, särskilt telomersonden13.
Om den slutliga bilden är fläckig har membranet delvis torkat under inkubation. För att lösa detta bör man antingen öka lösningsvolymen eller agitera med högre hastighet. Om det inte finns några utstryk synliga på fläcken kan det ha varit ett problem under södra överföringen. Dessutom kan det ha varit ett problem i DNA-kvantiteten eller kvaliteten.
Det finns vissa begränsningar för den här metoden. För det första tar genomisk DNA-extraktion och kvantifiering uppåt 4 dagar baserat på källan till DNA14. DNA med högre molekylvikt tar längre tid att rehydrera och homogenisera, vilket gör kvantifiering och noggrann pipettering svår. För det andra är TRF-protokollet långt (minst 2 dagar) och kräver skickliga laboratoriearbetare att implementera. Det är också en dyr metod på grund av reagenserna och de kvantiteter som krävs. TRF-protokollet mäter också den genomsnittliga telomerlängden i varje prov, i motsats till den kortaste telomerlängden som TESLA mäter eller telomerlängden per cell som flödescytometribaserade metoder ger15. En annan begränsning av TRF-analys med hjälp av enzymerna som används här är en överskattning av telomerlängden, eftersom dessa enzymer inte har ett restriktionsställe i de subtelomera regionerna15.
Trots begränsningarna finns det skäl till varför denna metod fortfarande anses vara guldstandarden för telomerlängdmätning. Telomerlängder återges korrekt i absoluta värden i kilobaspar (kbp).
Denna metod kan användas för att mäta den genomsnittliga telomerlängden i en mängd olika celltyper, från cellinjer 16,17 till buffy coat pellets 18,19. Detta gör det till en robust metod att använda i flera typer av forskningsstudier. Det kan också användas i storskaliga epidemiologiska studier samt i studier där cellbaserade terapier utvecklas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Prachi Shah för att hon hjälpte oss initialt med protokolloptimeringen. Vi vill tacka Dr. Manoj Garg för att tillhandahålla A2780 äggstockscancer cellinje. EK stöds av ett forskningsanslag från Institutionen för bioteknik (No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), Institutionen för teknik och naturvetenskap (ECR/2018/002117) och NMIMS Seed Grant (IO 401405).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W.
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt's lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat's skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
