Summary
כאן, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול לכימות אורך הטלומרים באמצעות זיהוי כימילומינסנטי לא רדיואקטיבי, תוך התמקדות באופטימיזציה של פרמטרי ביצועים שונים של ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG, כגון כמויות חיץ וריכוזי בדיקה.
Abstract
טלומרים הם רצפים חוזרים הנמצאים בקצוות הכרומוזומליים; הקיצור שלהם הוא מאפיין אופייני של תאים סומטיים אנושיים. הקיצור מתרחש עקב בעיה בשכפול הסופי והיעדר אנזים הטלומראז, האחראי על שמירת אורך הטלומרים. באופן מעניין, הטלומרים גם מתקצרים בתגובה לתהליכים פיזיולוגיים פנימיים שונים, כמו עקה חמצונית ודלקת, שעלולים להיות מושפעים מגורמים חוץ-תאיים כמו מזהמים, חומרים זיהומיים, חומרי מזון או קרינה. לפיכך, אורך הטלומרים משמש סמן ביולוגי מצוין להזדקנות ולפרמטרים בריאותיים פיזיולוגיים שונים. ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG משמשת לכימות אורכי הטלומרים הממוצעים באמצעות בדיקת מקטע הגבלת הטלומרים (TRF) והיא ניתנת לשחזור ברמה גבוהה. עם זאת, זוהי שיטה יקרה, ובגלל זה, זה לא משמש באופן שגרתי עבור מספרים מדגם גדול. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט למדידה אופטימלית וחסכונית של אורך הטלומרים באמצעות כתמים דרומיים או ניתוח TRF וזיהוי מבוסס כימילומינסנציה לא רדיואקטיבית.
Introduction
טלומרים הם רצפי דנ"א חוזרים הנמצאים בקצה הכרומוזומים. יש להם חזרות דו-צדדיות של TTAGGG והם שומרים על שלמות הגנום על ידי הגנה על הכרומוזום הן מפני שחיקה והן מפני בעיית השכפול הסופית, מה שאומר שחלק מ-3' overhang אינו ניתן לשכפול על ידי DNA פולימראז 1,2. טלומרים קצרים מובילים להפרעות כרומוזומליות בתאים, שבגללן תאים נעצרים לצמיתות בשלב שנקרא הזדקנות משוכפלת3. טלומרים קצרים גורמים גם לשורה של בעיות אחרות, כגון תפקוד לקוי של המיטוכונדריה 4,5 ותפקוד לקוי של התאים.
חזרות טלומריות של דנ"א אובדות כאשר התא מתחלק, עם אובדן ממוצע של 25 עד 200 bp בשנה 6, וכתוצאה מכך הזדקנות התא לאחר מספר מסוים של חלוקות6. הזדקנות קשורה לתדירות גבוהה יותר של תחלואה נלווית, אשר מסומנת על ידי קיצור אורך הטלומרים7. ניתוח מקטע הגבלת טלומר (TRF), כפי שתואר על ידי מנדר, הוא שיטה יקרה מאוד8. בגלל זה, זה לא מיושם בעת כימות אורך הטלומרים ברוב המחקרים.
כיום, רוב המחקרים האפידמיולוגיים משתמשים במדידות כמותיות מבוססות תגובת שרשרת פולימראז (qPCR) של אורך הטלומרים. עם זאת, השיטה מבוססת qPCR היא שיטת מדידה יחסית, שכן היא מודדת את היחס בין טלומרים לבין תוצרי הגברה של גנים בעותק יחיד, ולא אורך טלומרים מוחלט. מדידת אורך הטלומרים באמצעות פרוטוקול TRF היא שיטת תקן הזהב, מכיוון שהיא יכולה למדוד את התפלגות אורך הטלומרים במדגם וניתן לבטא את המדידות בערכים מוחלטים בקילו-בסיסים (kb). עם זאת, השימוש בו מוגבל מכיוון שהוא מסורבל, עתיר עבודה ויקר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי למדידת אורך הטלומרים באמצעות TRF מבוסס כימילומינסנציה.
ניתוח TRF כולל שבעה שלבים עיקריים: 1) תרבית תאים למיצוי DNA גנומי, 2) מיצוי DNA גנומי באמצעות שיטת פנול:כלורופורם:איזואמילאלכוהול (P:C:I), 3) הגבלת עיכול של DNA גנומי, 4) אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, 5) כתם דרומי של מקטע DNA עיכול הגבלה, 6) הכלאה וגילוי באמצעות כימילומינסנציה - בדיקת הטלומרים המשותקת מומחשת על ידי מצע כימילומינסנטי רגיש ביותר עבור פוספטאז אלקליין, דיסודיום 2-כלורו-5-(4-מתוקסיספירו[1,2-דיוקסטאן-3,2′-(5-כלורוטריציקלו[3.3.1.13.7]דקאן])-4-yl]-1-פניל פוספט (CDP-Star)-ו-7) ניתוח לקבלת אורך וטווח טלומרים ממוצע ומידע טווח ממריחות טלומריות אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול להלן. טבלה 1 מגייסת ריאגנטים מתוצרת מעבדה יחד עם נפחים ממוטבים, וטבלה 2 מציגה ריכוזי עבודה של ריאגנטים זמינים מסחרית.
1. תרבית תאים
- לשמור על תאים שאורך הטלומרים שלהם יימדד (שימשו כאן תאי A2780, שהוא קו תאי אדנוקרצינומה שחלתי) בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) שלם בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), סטרפטומיצין, פניצילין ואמפוטריצין B בצלחת פטרי של 6 ס"מ. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בסביבה לחה ומבוקרת המכילה 5% פחמן דו חמצני עד שהתאים יהיו 80%-100% ביחד.
- הסר את המדיה ושטוף עם 5 מ"ל של 1x פוספט-buffered מלוחים (PBS).
- טפל בתאים עם 1 מ"ל של חומצה טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) לניתוק התאים על ידי דגירה ב 37 ° C למשך 3-5 דקות.
- הוסף 2 מ"ל של מדיה מלאה DMEM כדי להשבית את הטריפסין ולאסוף את התאים בצינור צנטריפוגה.
- מטילים את התאים על 2,348 × גרם במשך 5 דקות.
- שטפו את הגלולה עם 1x PBS וצנטריפוגה ב 2,348 × גרם במשך 5 דקות.
- יש לאחסן את הגלולה בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
הערה: ספירת התאים עשויה להשתנות בהתאם לקו התא. השגנו כ 2.5 × 106 תאים במקרה של קו התאים A2780, אשר משמש בשלבים נוספים.
2. בידוד DNA גנומי
- הוסף 500 μL של חיץ ליזיס (10 mM tris-Cl, pH 8.0; 25 mM EDTA, pH 8.0; 100 mM NaCl; 0.5% w/v נתרן דודציל סולפט) לכדורית התא וערבב בעדינות באמצעות קצה חתוך (עם קוטר פתיחה של מינימום 2 מ"מ). מוסיפים 20 מיקרוגרם/מ"ל RNase A טרי מוכן ומערבבים בעדינות על ידי היפוך.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות ומדי פעם להפוך את הצינור במהלך הדגירה.
- מוסיפים פרוטאינאז K לריכוז סופי של 100 מק"ג/מ"ל ומערבבים בעדינות בהיפוך 10 פעמים. לדגור ב 55 ° C במשך 2 שעות. הפוך את הצינור במרווחי זמן קבועים (כל 10 דקות) במהלך הדגירה.
- הוסף 500 μL של פנול:כלורופורם:מגיב אלכוהול איזואמיל (25:24:1) וערבב בעדינות על ידי היפוך 20 פעמים. צנטריפוגה ב 9,391 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (סביב 25 ° C).
הערה: איור 1A מראה את שלוש השכבות המתקבלות לאחר צנטריפוגה. - מוציאים את השכבה המימית העליונה הצמיגה משלוש השכבות הגלויות, מניחים בצינור טרי בעזרת קצה חתוך, ומוסיפים כמות שווה של כלורופורם. מערבבים בהיפוך עדין 20 פעמים.
- צנטריפוגה את הצינורות ב 9,391 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- אספו את השכבה המימית והוסיפו כמות מתאימה של 5 M NaCl כך שהריכוז הסופי של NaCl יהיה 0.2 M.
- הוסף שני כרכים של 100% אתנול. מערבבים בהיפוך עדין 20-25 פעמים. צנטריפוגה ב 15,871 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את supernatant ולהוסיף 500 μL של 70% אתנול לשטוף את הכדור. צנטריפוגה ב 15,871 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- מוציאים את הסופרנטנט, מייבשים את הגלולה באוויר למשך מספר דקות, ומוסיפים 50 מיקרוליטר מים סטריליים ללא נוקלאז. תנו לדנ"א להתייבש למשך 1-2 ימים בטמפרטורת החדר. מערבבים על ידי pipetting, באמצעות קצה החתוך.
- למדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטריה אולטרה סגולה (UV). דללו מחדש את הדגימות, במידת הצורך, באמצעות מים סטריליים נטולי נוקלאז כדי לקבל ריכוז מינימלי של 300-500 ננוגרם/μL.
- בדקו את שלמות הדנ"א על-ידי הרצתו על ג'ל אגרוז 1% (איור 1B).
- אחסנו את הדנ"א המדולל בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש נוסף.
3. עיכול של DNA גנומי
- הכינו תערובת אנזימים של Rsa1 (20 U) ו-Hinf1 (20 U) והוסיפו 2 מיקרוליטר של חיץ הגבלת עיכול לכל תגובה.
- קח נפח מתאים של DNA גנומי כך שהכמות הכוללת של DNA היא 1.5 מיקרוגרם. לפצות את הנפח עם מים סטריליים ללא נוקלאז, כך שהנפח הכולל לאחר הוספת האנזים הוא 20 μL.
- מערבבים היטב על ידי הקשה, ואחריה סיבוב דופק.
- לדגור על התערובת ב 37 ° C במשך 2 שעות.
4. אלקטרופורזה ג'ל אגרוז
- הכינו ג'ל אגרוז בגודל 10 ס"מ × 15% 0.8% בחיץ 1x tris אצטט EDTA (TAE) באמצעות אגרוז באיכות גבוהה.
- הוסף 5 μL של צבע העמסה לכל דגימת DNA גנומי מעוכל, ובכך להפוך את נפח הסופי 25 μL, ולטעון את הדגימות על הג'ל.
- הכינו תערובת סמנים מולקולריים באמצעות 1 μL של סמן מולקולרי (סולם), 3 μL של מים סטריליים ללא נוקלאז, ו 1 μL של צבע העמסה פי 5.
- עומס 5 μL של תערובת סמן מולקולרי משני צידי הדגימות הגנומיות של הדנ"א הגנומי אם יש מספר גבוה יותר של דגימות (~10), או רק בצד אחד אם יש פחות או שווה לחמש דגימות.
- הפעל את הג'ל ב 5 V / cm במשך 6 שעות. לאחר סיום הריצה, עשו חריץ בפינה אחת של הג'ל כדי לסמן את סדר הטעינה.
- יש לטבול את הג'ל ב-0.25M HCl למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
- יש לשטוף את הג'ל פעמיים במים מזוקקים.
- נטרל את הדנ"א על ידי טבילת הג'ל בתמיסה של 0.5 M NaOH ו- 1.5 M NaCl פעמיים למשך 15 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
- יש לשטוף את הג'ל פעמיים במים מזוקקים.
- נטרלו את הדנ"א על ידי טבילת הג'ל בתמיסה של 0.5 M tris-HCl ו-3M NaCl (pH 7.5) פעמיים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
5. כתם דרומי
- חותכים קרום ניילון בגודל 10 ס"מ × 12 ס"מ ויוצרים חריץ באותו מיקום כמו הג'ל.
- הפעל את הממברנה על-ידי טבילה במים מזוקקים ולאחר מכן חיץ 20x נתרן ציטראט (SSC) (ראה טבלה 1).
- הגדר את ההעברה.
- קחו מגש זכוכית נקי והניחו בו מגש נוסף במצב הפוך. צור פתיל באמצעות נייר סינון רגיל כך שהקצוות ייגעו בבסיס המגש החיצוני.
- מניחים את הג'ל על גבי נייר הפילטר. מניחים בעדינות את קרום הניילון הפעיל מעל הג'ל, כשהחריצים חופפים, ומסירים בועות אוויר על ידי גלגול מוט זכוכית.
- הניחו ערימה של 2 ס"מ של נייר סינון תאית בקוטר 9.5 ס"מ × בקוטר 11.5 ס"מ, ולאחר מכן ערימה של נייר סינון רגיל בקוטר 6 ס"מ באותם ממדים. מקם משקל על גבי מערך זה כך שתהיה חלוקת משקל שווה מתחת. מלא את המגש החיצוני במאגר SSC של 20x (ראה איור 2).
- השאר את ההתקנה להעברה למשך הלילה.
- לאחר ההעברה הדרומית, קבע את ה- DNA המועבר על הממברנה על ידי קישור UV על טרנסילמייטור UV או קרוסלינקר UV. השתמש במנורת 302 ננומטר 8 ואט למשך 5 דקות, או במנורת 254 ננומטר 8 ואט למשך 2 דקות, המתאימה לכ- 120 mJ. ודא שצד הממברנה שעליו מועבר הדנ"א פונה אל המנורה.
- שטפו את הממברנה פעמיים עם 25 מ"ל של 2x SSC buffer.
- השהה את הפרוטוקול, במידת הצורך, על ידי ייבוש מלא של הכתם ואחסונו, בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס לאחר עטיפה רופפת בנייר כסף, עד לעיבוד נוסף.
6. הכלאה וזיהוי כימילומינסנציה
- מחממים מראש את מאגר טרום הכלאה ל 42 מעלות צלזיוס.
הערה: השלבים הבאים כוללים נפחים של תמיסות/מאגרים לשימוש לכל 100 ס"מ2 של כתם. - לדגור את הממברנה ב 10 מ"ל של חיץ prehybridization במשך 1 שעה ב 42 ° C עם תסיסה עדינה עבור prehybridization.
- הוסף 0.5 μL של בדיקת טלומרים לכל 5 מ"ל של חיץ טרום הכלאה שחומם מראש כדי ליצור את פתרון ההכלאה.
- לדגור את הכתם ב 10 מ"ל של פתרון הכלאה ב 42 ° C במשך 3 שעות עם תסיסה עדינה.
- שטפו את הכתם עם חיץ 1 מחמיר (טבלה 1) פעמיים במשך 10 דקות (25 מ"ל כל אחת) בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
- חממו מראש חיץ מחמיר 2 (טבלה 1) למשך 30 דקות ב-50°C.
- יש לשטוף את הכתם עם חיץ מחמיר 2 פעמיים למשך 15 דקות (25 מ"ל כל אחת) ב-50°C עם תסיסה עדינה.
- יש לשטוף עם 15 מ"ל של חיץ כביסה במשך 5 דקות עם תסיסה עדינה ב-RT.
- דגרו על הממברנה ב-10 מ"ל של תמיסת חסימה 1x טרייה שהוכנה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
- לדגור על הממברנה ב 10 מ"ל של אנטי digioxigenin מצומד עם תמיסת עבודה phosphatase אלקליין (ראה טבלה 2) במשך 30 דקות ב RT עם תסיסה עדינה.
- יש לשטוף את הכתם פעמיים עם חיץ כביסה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בתסיסה עדינה.
- יש לדגור ב-10 מ"ל של חיץ זיהוי למשך 5 דקות ב-RT עם תסיסה עדינה.
- הסר את מאגר הגילוי העודף ושמור את הממברנה כשהדנ"א פונה כלפי מעלה על שקית הכלאה או יריעת אצטט. הוסף ~ 1-1.5 מ"ל של תמיסת מצע טיפה על הממברנה, מיד להניח יריעה נוספת על זה, לדגור במשך 5 דקות ב RT.
- סחטו את תמיסת המצע העודפת להדמיה.
- צלם את הכתם במשך כ -20 דקות במערכת הדמיה תיעוד ג'ל, איסוף תמונות מרובות בנקודות זמן שונות. בחרו תמונות בלתי רוויות לניתוח נוסף.
הערה: במקרה שהאות חלש, ניתן לבצע הדמיה לפרק זמן ארוך יותר.
7. ניתוח
- לאחר קבלת קבצי התמונה, ייצא אותם לפרסום בפורמט .tif ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית (600 dpi במקרה זה).
- התקן את תוכנת Telotool . לשם כך נדרשת גרסה ספציפית (R2012a) של MATLAB (זמינה באופן חופשי) כדי לפעול.
- פתח את התוכנה ולחץ על טען קובץ תמונה כפתור בפינה השמאלית העליונה.
- לאחר טעינת התמונה, לחץ על הפוך תמונה, כך שרקע התמונה יהיה שחור והמריחות/הפסים יהיו לבנים.
- חתוך את התמונה עם הפינות העליונות החל מהבארות. לאחר ביצוע בחירת החיתוך, לחץ לחיצה ימנית בתוכה ובחר חתוך תמונה.
- לאחר חיתוך התמונה, לחץ על חשב נתיבים ואפשר לזיהוי נתיב להתרחש באופן אוטומטי.
- אם הנתיבים לא זוהו כראוי, לדוגמה, אם נתיבים מסוימים לא זוהו כלל, או אם זוהו נתיבים נוספים או חלקיים, בצע התאמת נתיב כמתואר להלן.
- לחץ על התאמת נתיבים ובחלון הקופץ שנפתח, הוסף ו/או כוונן נתיבים לפי הצורך, ולחץ על החל וסגור.
- לאחר התאמת הנתיבים, יש לוודא כי בכל אחד מהנתיבים נראית נקודה אדומה ולהתאים את הסולמות באמצעות כפתור התאמת סולם , תוך הקפדה על כך שמספר הפסגות בשני נתיבי הסולם נמצא באותו מיקום. הסר פסגות חיצוניות באמצעות הלחצן Delete Extremum .
- לאחר התאמת הסולות, בחר פרופילי נתיב, לחץ על התאמת סולם ובחר התאמה פולינומית.
- לחץ על קו מגמה, בהתאם להמלצת התוכנה ולאחר מכן בחר תוקן באפשרות הבאה.
- לחץ על קבל תוצאות כדי להציג את התוצאות כטבלה, שבה שורת TRF ממוצעת היא מדידת אורך הטלומרים של דגימות הנתיבים בהתאמה.
- לחץ על שמור הכל כדי לאחסן את התוצאות בצורה של גיליון אלקטרוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדנ"א הגנומי שחולץ (gDNA), שהופעל על ג'ל אגרוז 1%, הראה שלמות טובה, כפי שמוצג באיור 1B, מה שמצביע על כך שהדגימה יכולה לשמש לעיבוד נוסף במורד הזרם של TRFs. לאחר מכן בוצעה בדיקת TRF על ידי שינוי נפחי הפתרונות הנדרשים בכל שלב (ראה טבלה 1 וטבלה 2). אות TRF נראה בבירור (איור 3). לכן, על ידי שינוי נפחי התמיסה וריכוזיה, ניתן היה לעבד יותר דגימות ללא כל השפעה שלילית על התוצאות, וניתן היה לקבוע את אורך הטלומרים בהצלחה באמצעות תוכנה זמינה באופן חופשי כגון Telotool10.
איור 1: בידוד ובדיקת איכות של דנ"א גנומי. (A) שלושה שלבי הפרדה נפרדים המתקבלים בצנטריפוגה לאחר הוספת פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול. השכבה המימית העליונה מכילה את gDNA, האינטרפאזה, מכילה את החלבונים, והפאזה התחתונה, האורגנית, מכילה את הרנ"א המפורק, פסולת התא והשומנים. (B) תמונה של ג'ל אגרוז 1% המראה gDNA שלם ולא מעוכל. נתיב 1 מראה סולם של 1 קילובייט ונתיב 2 מראה gDNA לא מעוכל של קו התאים הסרטניים A2780. קיצור: gDNA = DNA גנומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: איור של מערך העברת כתם דרומי. תרשים מייצג המציג את מכלול המערכת להעברת מריחות חוזרות של הטלומרים מהג'ל לקרום הניילון על ידי פעולה נימית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי כימילומינסנציה של TRFs לאחר כתם דרומי והכלאה. כתם המציג טווח של חזרות טלומריות ככתם בנתיב 2. נתיב 1 מראה סמן מולקולרי, עם המשקלים המולקולריים (kb) של הפסים המסומנים בצד שמאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: רשימת ריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה. הטבלה מכילה ריאגנטים שהוכנו במעבדה יחד עם פרטי האחסון שלהם, השימוש המומלץ בריאגנטים של ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG ונפחי השימוש המותאמים שלהם, בהתאם לאופטימיזציה בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: רשימה של ריאגנטים הזמינים מסחרית עם הוראות שימוש ששונו. הטבלה מכילה ריאגנטים זמינים מסחרית יחד עם דילולים שונים, פרטי האחסון שלהם, והשימוש המומלץ בהם על ידי ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG ונפחי שימוש מותאמים, בהתאם לאופטימיזציה בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים הליך מפורט לשיטה לא רדיואקטיבית, מבוססת כימילומינסנציה למדידת אורך הטלומרים באמצעות כתם דרומי. הפרוטוקול נבדק כדי לאפשר שימוש מושכל במספר ריאגנטים ללא פשרות על איכות התוצאות. ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר הפרה-הכלאה וההכלאה עד חמש פעמים. ריכוז האנזימים יכול לנוע בין 10-20 U לכל 1.5-2 מיקרוגרם של DNA גנומי מבלי להשפיע על התוצאות. מספר רכיבי ערכה אחרים, כגון סמן משקל מולקולרי המסומן DIG ובדיקת הכלאה, ניתנים לשימוש בריכוזים נמוכים מהמומלץ. אמצעי האחסון הממוטבים מצוינים בטבלה 2. בדקנו אותם במחצית מהנפחים/ריכוזים המומלצים ומצאנו ביצועים אופטימליים. ביצוע צעדים אלה מפחית את העלות לדגימה באופן משמעותי, ובכך מאפשר לחוקרים למדוד את אורך הטלומרים בשיטה זו בקנה מידה גדול יותר.
ישנם מספר פרוטוקולי TRF שפורסמו. ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול הערכה הזמין מסחרית כדי להפוך אותו לחסכוני. פרוטוקול זה שונה מחלק מהפרוטוקולים שפורסמו מכיוון שהוא אינו משתמש ברדיואקטיביות11,12. זה גם פשוט יחסית, מכיוון שהוא משתמש ברכיבי הערכה במקום להכין ריאגנטים פנימיים, במיוחד בדיקת הטלומרים13.
אם התמונה הסופית מטושטשת, אז הממברנה התייבשה חלקית במהלך הדגירה. כדי לפתור זאת, יש להגדיל את נפח התמיסה או להתסיס במהירות גבוהה יותר. אם אין כתמים גלויים על הכתם, אז אולי הייתה בעיה במהלך ההעברה הדרומית. בנוסף, ייתכן שהייתה בעיה בכמות או באיכות הדנ"א.
ישנן כמה מגבלות לשיטה זו. ראשית, מיצוי וכימות DNA גנומי לוקח למעלה מ -4 ימים בהתבסס על מקור ה- DNA14. לדנ"א בעל משקל מולקולרי גבוה יותר לוקח זמן רב יותר להחזיר נוזלים והומוגניות, מה שמקשה על כימות ופיפטציה מדויקת. שנית, פרוטוקול TRF הוא ארוך (מינימום יומיים) ודורש עובדי מעבדה מיומנים ליישם. זוהי גם שיטה יקרה בשל ריאגנטים ואת הכמויות הנדרשות. פרוטוקול TRF מודד גם את אורך הטלומרים הממוצע בכל דגימה, בניגוד לאורך הטלומרים הקצר ביותר ש-TESLA מודדת או אורך הטלומרים לתא ששיטות מבוססות ציטומטריה מספקות15. מגבלה נוספת של ניתוח TRF באמצעות האנזימים המשמשים כאן היא הערכת יתר של אורך הטלומרים, שכן לאנזימים אלה אין אתר הגבלה באזורים התת-טלומריים15.
עם זאת, למרות המגבלות, ישנן סיבות מדוע שיטה זו עדיין נחשבת לתקן הזהב של מדידת אורך הטלומרים. אורכי הטלומרים מעובדים במדויק בערכים מוחלטים בזוגות קילו-בסיסים (kbp).
שיטה זו יכולה לשמש למדידת אורך הטלומרים הממוצע במגוון סוגי תאים, החל מקווי תאים 16,17 ועד כדורי מעיל באפי 18,19. זה עושה את זה שיטה חזקה לשימוש במספר סוגים של מחקרים. זה יכול לשמש גם במחקרים אפידמיולוגיים בקנה מידה גדול, כמו גם במחקרים שבהם טיפולים מבוססי תאים מפותחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לגב' פראצ'י שאה על שעזרה לנו בתחילה באופטימיזציה של הפרוטוקול. ברצוננו להודות לד"ר מנוג' גארג על אספקת קו תאי סרטן השחלות A2780. EK נתמך על ידי מענק מחקר מהמחלקה לביוטכנולוגיה (No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), המחלקה למדע וטכנולוגיה (ECR/2018/002117), ומענק זרעים NMIMS (IO 401405).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W.
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt's lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat's skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
