Detección eléctrica de sustratos de células para la evaluación en tiempo real de perfiles toxicológicos de estructuras metal-orgánicas
Summary
El siguiente estudio evalúa el perfil toxicológico de un marco metal-orgánico seleccionado utilizando la detección eléctrica de impedancia de sustrato de celda (ECIS), una técnica de detección de alto rendimiento en tiempo real.
Abstract
Los marcos metal-orgánicos (MOF) son híbridos formados a través de la coordinación de iones metálicos y enlazadores orgánicos en disolventes orgánicos. La implementación de MOF en aplicaciones biomédicas e industriales ha generado preocupaciones con respecto a su seguridad. En este trabajo, se evaluó el perfil de un MOF seleccionado, un marco de imidazol zeolítico, tras la exposición a células epiteliales pulmonares humanas. La plataforma para la evaluación fue una técnica en tiempo real (es decir, detección de impedancia eléctrica de sustrato de célula [ECIS]). Este estudio identifica y discute algunos de los efectos nocivos del MOF seleccionado en las células expuestas. Además, este estudio demuestra los beneficios de utilizar el método en tiempo real frente a otros ensayos bioquímicos para evaluaciones celulares completas. El estudio concluye que los cambios observados en el comportamiento celular podrían insinuar una posible toxicidad inducida por la exposición a MOF de diferentes características fisicoquímicas y la dosis de esos marcos que se utilizan. Al comprender los cambios en el comportamiento celular, se prevé la capacidad de mejorar las estrategias de seguridad por diseño de los MOF que se utilizarán para aplicaciones biomédicas mediante la adaptación específica de sus características fisicoquímicas.
Introduction
Las estructuras metal-orgánicas (MOF) son híbridos formados a través de la combinación de iones metálicos y enlazadores orgánicos 1,2 en disolventes orgánicos. Debido a la variedad de tales combinaciones, los MOF poseen diversidad estructural3, porosidad sintonizable, alta estabilidad térmica y altas áreas superficiales 4,5. Tales características los hacen candidatos atractivos en una variedad de aplicaciones, desde el almacenamiento de gas 6,7 hasta la catálisis8,9, y desde los agentes de contraste 10,11 hasta las unidades de administración de fármacos 12,13. Sin embargo, la aplicación de los MOF en esas aplicaciones ha suscitado preocupaciones en relación con su seguridad tanto para los usuarios como para el medio ambiente. Estudios preliminares han demostrado, por ejemplo, que la función celular y el crecimiento cambian tras la exposición de las células a iones metálicos o enlazadores utilizados para la síntesis de MOF 1,14,15. Por ejemplo, Tamames-Tabar et al. demostraron que ZIF-8 MOF, un MOF basado en Zn, estaba provocando más cambios celulares en una línea celular de cáncer de cuello uterino humano (HeLa) y una línea celular de macrófagos de ratón (J774) en relación con los MOF basados en Zr y Fe. Tales efectos se debieron presumiblemente al componente metálico de ZIF-8 (es decir, Zn), que podría inducir la apoptosis celular tras la desintegración del marco y la liberación del ion Zn1. De manera similar, Gandara-Loe et al. demostraron que HKUST-1, un MOF basado en Cu, causó la mayor reducción en la viabilidad de las células de retinoblastoma de ratón cuando se usó en concentraciones de 10 μg/mL o más. Esto se debió presumiblemente al ion metal Cu incorporado durante la síntesis de este marco, el cual, una vez liberado, podría inducir estrés oxidativo en las células expuestas15.
Además, el análisis mostró que la exposición a MOF con diferentes características fisicoquímicas podría dar lugar a respuestas variables de las células expuestas. Por ejemplo, Wagner et al. demostraron que ZIF-8 y MIL-160 (un marco basado en Al), utilizados en la exposición de una célula epitelial bronquial humana inmortalizada, condujeron a respuestas celulares dependientes de las propiedades fisicoquímicas de los marcos, a saber, hidrofobicidad, tamaño y características estructurales16. Complementariamente, Chen et al. demostraron que una concentración de 160 μg/mL de MIL-100(Fe) expuesta a células hepáticas humanas normales (HL-7702) causó la mayor pérdida de viabilidad celular, presumiblemente debido al componente metálico de este marco específico (es decir, Fe17).
Si bien estos estudios clasifican los efectos nocivos de los MOF en los sistemas celulares en función de sus características fisicoquímicas y concentraciones de exposición, lo que plantea posibles preocupaciones con la implementación del marco, especialmente en los campos biomédicos, la mayoría de estas evaluaciones se basan en ensayos colorimétricos de un solo punto de tiempo. Por ejemplo, se demostró que cuando se utilizaron ensayos de bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) tetrazolio (MTT) y sal de tetrazolio soluble en agua (WST-1), estos reactivos bioquímicos podían dar lugar a falsos positivos en sus interacciones con las partículas a las que también estaban expuestas las células18. Se demostró que la sal de tetrazolio y los reactivos rojos neutros poseen una alta afinidad de adsorción o unión a las superficies de las partículas, lo que resulta en interferencia de la señal del agente19. Además, para otros tipos de ensayos, como la citometría de flujo, que anteriormente se había demostrado que se utilizaba para evaluar los cambios en las células expuestas a los MOF20,21, se demostró que los principales problemas deben evitarse si se quiere considerar un análisis viable de los efectos nocivos de las partículas. En particular, deben abordarse los rangos de detección de los tamaños de las partículas, especialmente en poblaciones mixtas como las que ofrecen los MOF o las referencias de las partículas utilizadas para la calibración antes de los cambios celulares22. También se demostró que el colorante utilizado durante el marcaje celular para tales ensayos de citometría también podría interferir con las nanopartículas a las que las células fueron expuestas23.
El objetivo de este estudio era utilizar un ensayo de evaluación de alto rendimiento en tiempo real para evaluar los cambios en el comportamiento celular tras la exposición a un MOF seleccionado. Las evaluaciones en tiempo real pueden ayudar a proporcionar información sobre los efectos dependientes del tiempo, en relación con las ventanas de exposición16. Además, proporcionan información sobre los cambios en las interacciones célula-sustrato, la morfología celular y las interacciones célula-célula, así como la forma en que dichos cambios dependen de las propiedades fisicoquímicas de los materiales de interés y de los tiempos de exposición24,25 respectivamente.
Para demostrar la validez y aplicabilidad del enfoque propuesto, se utilizaron células epiteliales bronquiales humanas (BEAS-2B), ZIF-8 (un marco hidrofóbico de imidazolatozeolítico 16) y detección de impedancia eléctrica de sustrato celular (ECIS). Las células BEAS-2B representan un modelo de exposición pulmonar 26 y se han utilizado previamente para evaluar los cambios en la exposición de las células a nanoarcillas y sus subproductos degradados térmicamente26,27,28, así como para evaluar la toxicidad de los nanomateriales, como los nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT)18. Además, estas células se han utilizado durante más de 30 años como modelo para la función epitelial pulmonar29. Se eligió ZIF-8 debido a su amplia implementación en catálisis30 y como agentes de contraste31 para la bioimagen y la administración de fármacos32 y, por lo tanto, por el potencial extendido de exposición pulmonar durante tales aplicaciones. Por último, ECIS, la técnica no invasiva en tiempo real, se utilizó previamente para evaluar los cambios en la adherencia, proliferación, motilidad y morfología celular 16,26 como resultado de una variedad de interacciones entre analitos (tanto materiales como fármacos) y células expuestas en tiempo real16,18,28. ECIS utiliza una corriente alterna (CA) para medir la impedancia de las celdas inmovilizadas en electrodos de oro, y los cambios de impedancia brindan información sobre los cambios en la resistencia y la capacitancia en la interfaz célula-sustrato de oro, la función de barrera inducida por las interacciones célula-celda y la cobertura de la capa sobre celda de dichos electrodos de oro33,34. El uso de ECIS permite realizar mediciones cuantitativas a una resolución a nanoescala de forma no invasiva y en tiempo real26,34.
Este estudio evalúa y compara la simplicidad y facilidad de evaluación de los cambios inducidos por MOF en el comportamiento celular en tiempo real con las evaluaciones de ensayos de un solo punto. Un estudio de este tipo podría extrapolarse aún más para evaluar los perfiles celulares en respuesta a la exposición a otras partículas de interés, lo que permitiría realizar pruebas de partículas seguras por diseño y ayudar posteriormente a la implementación. Además, este estudio podría complementar los ensayos genéticos y celulares que son evaluaciones de un solo punto. Esto podría conducir a un análisis más informado de los efectos nocivos de las partículas en la población celular y podría utilizarse para detectar la toxicidad de dichas partículas de una manera de alto rendimiento16,35,36.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un análisis anterior mostró que ECIS podría usarse para evaluar el comportamiento de las células expuestas a analitos (es decir, nanotubos de carbono35, fármacos43 o nanoarcillas16). Además, Stueckle et al. utilizaron ECIS para evaluar la toxicidad de las células BEAS-2B expuestas a nanoarcillas y sus subproductos y encontraron que el comportamiento celular y la unión dependían de las características fisicoquímicas de dichos materiales<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por el programa T32 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS, por sus siglas en inglés) (T32 GM133369) y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF 1454230 por sus siglas en inglés). Además, se agradece la asistencia y el apoyo de las Instalaciones de Investigación Compartidas de WVU y la Biofísica Aplicada.
Materials
| 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay) | Roche | 5015944001 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25255-056 | |
| 100 mm plates | Corning | 430167 | |
| 1300 Series A2 biofume hood | Thermo Scientific | 323TS | |
| 2510 Branson bath sonicator | Process Equipment & Supply, Inc. | 251OR-DTH | |
| 2-methylimidazole, 97% | Alfa Aesar | 693-98-1 | |
| 5 mL sterile microtube | Argos Technologies | T2076S-CA | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| 96W10idf well plates | Applied Biophysics | 96W10idf PET | |
| 96-well plates | Fisherbrand | FB012931 | |
| Biorender | Biorender | N/A | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess II FL automated cell counter | Life Technologies | C0916-186A-0303 | |
| Denton Desk V sputter and carbon coater | Denton Vacuum | N/A | |
| Dimethly sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| DPBS/Modified | Cytiva | SH30028.02 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium | Corning | 10-014-CV | |
| ECIS-ZΘ | Applied Biophysics | ABP 1129 | |
| Excel | Microsoft | Version 2301 | |
| Falcon tubes (15 mL) | Corning | 352196 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16140-071 | |
| FLUOstar OPTIMA plate reader | BMG LABTECH | 413-2132 | |
| GraphPad Prism Software (9.0.0) | GraphPad Software, LLC | Version 9.0.0 | |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116047 | |
| Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray | Hitachi High-Technologies Corporation | S4700 and EDAX TEAM analysis software | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
| Immortalized human bronchial epithelial cells | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Isotemp freezer | Fisher Scientific | ||
| Methanol, 99% | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Parafilm sealing film | The Lab Depot | HS234526A | |
| Penicillin/Steptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004220 | |
| Sorvall T 6000B | DU PONT | T6000B | |
| Trypan blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals, LLC | 1691049 | |
| Vacuum Chamber | Belart | 999320237 | |
| Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure | Acros Organic | 101-96-18-9 |
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