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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

用于实时评估金属有机框架毒理学特征的电池-基底传感

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65313
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

Summary

以下研究利用电池-基板阻抗传感（ECIS）评估所选金属有机框架的毒理学特征，这是一种实时，高通量筛选技术。

Abstract

金属-有机骨架（MOFs）是通过金属离子和有机接头在有机溶剂中的配位形成的杂化物。MOFs在生物医学和工业应用中的实施引起了对其安全性的担忧。在此，在暴露于人肺上皮细胞时评估了选定的MOF（沸石咪唑框架）的轮廓。评估平台是一种实时技术（即电池-基板阻抗传感[ECIS]）。本研究确定并讨论了所选MOF对暴露细胞的一些有害影响。此外，这项研究证明了使用实时方法与其他生化测定相比进行全面细胞评估的好处。该研究得出的结论是，观察到的细胞行为变化可能暗示暴露于不同物理化学特征的MOFs以及正在使用的这些框架的剂量时可能引起的毒性。通过了解细胞行为的变化，人们预见了通过专门定制其物理化学特性来改进MOFs用于生物医学应用的安全设计策略的能力。

Introduction

金属-有机骨架（MOF）是通过金属离子和有机接头1,2在有机溶剂中结合而形成的杂化物。由于这种组合的多样性，MOFs具有结构多样性3，可调孔隙率，高热稳定性和高表面积4,5。这些特性使它们在各种应用中具有吸引力的候选者，从气体储存6,7到催化8,9，以及从造影剂10,11到药物输送单元12,13。然而，在此类应用中实施MOF引起了人们对其对用户和环境安全性的担忧。例如，初步研究表明，当细胞暴露于用于MOF合成的金属离子或接头时，细胞功能和生长会发生变化1,14,15。例如，Tamames-Tabar等人证明，ZIF-8 MOF，一种基于Zn的MOF，相对于基于Zr和Fe的MOF，导致人宫颈癌细胞系（HeLa）和小鼠巨噬细胞系（J774）的更多细胞变化。这种效应可能是由于ZIF-8的金属成分（即Zn），它可能在框架崩解和Zn离子释放1时诱导细胞凋亡。同样，Gandara-Loe等人证明，当浓度为10μg/mL或更高时，基于铜的MOF的HKUST-1导致小鼠视网膜母细胞瘤细胞活力的降低最高。这可能是由于在该框架的合成过程中掺入的Cu金属离子，一旦释放，可能会在暴露的细胞中诱导氧化应激15。

此外，分析表明，暴露于具有不同理化特征的MOFs会导致暴露细胞的不同反应。例如，Wagner等人证明，用于永生化人支气管上皮细胞暴露的ZIF-8和MIL-160（一种基于Al的框架）导致细胞反应取决于框架的物理化学性质，即疏水性，大小和结构特征16。作为补充，Chen等人证明，暴露于人正常肝细胞（HL-7702）的浓度为160μg/mL的MIL-100（Fe）导致细胞活力的最大损失，可能是由于该特定框架的金属成分（即Fe17）。

虽然这些研究根据其物理化学特性和暴露浓度对MOFs对细胞系统的有害影响进行分类，从而引发了对框架实施的潜在关注，特别是在生物医学领域，但大多数这些评估都是基于单时间点比色测定。例如，结果表明，当使用（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物）四唑（MTT）和水溶性四唑盐（WST-1）测定时，这些生化试剂在与细胞也暴露于的颗粒相互作用时可能导致假阳性18。四唑盐和中性红试剂在颗粒表面具有很高的吸附或结合亲和力，导致试剂信号干扰19。此外，对于其他类型的测定，例如流式细胞术，以前被证明用于评估暴露于MOFs 20,21的细胞的变化，研究表明，如果要考虑对颗粒的有害影响进行可行的分析，则必须避免主要问题。特别是，必须解决颗粒大小的检测范围，特别是在混合群体中，例如MOF提供的检测范围或细胞变化前用于校准的颗粒参考22。还表明，在细胞标记期间用于此类细胞术测定的染料也可能干扰细胞暴露于23的纳米颗粒。

本研究的目的是使用实时、高通量评估测定来评估暴露于选定 MOF 时细胞行为的变化。实时评估有助于深入了解与曝光窗口相关的时间相关效应16.此外，它们提供了有关细胞 - 底物相互作用，细胞形态和细胞 - 细胞相互作用的变化的信息，以及这些变化如何取决于感兴趣的材料的物理化学性质和暴露时间分别为24,25。

为了证明所提方法的有效性和适用性，使用了人支气管上皮（BEAS-2B）细胞、ZIF-8（沸石咪唑酸盐16的疏水框架）和电池-基底阻抗传感（ECIS）。BEAS-2B细胞代表肺暴露的模型26，以前已用于评估细胞暴露于纳米粘土及其热降解副产物26,27,28时的变化，以及评估纳米材料的毒性，例如单壁碳纳米管（SWCNTs）18。此外，这些细胞已被用作肺上皮功能的模型30多年29。之所以选择ZIF-8，是因为其在催化30中广泛应用，并作为造影剂31用于生物成像和药物递送32，因此在此类应用中具有扩展的肺部暴露潜力。最后，ECIS是一种非侵入性实时技术，以前用于实时评估细胞粘附性、增殖、运动性和形态的变化16,26，这是分析物（材料和药物）与暴露细胞之间各种相互作用的结果16,18,28.ECIS使用交流电（AC）来测量固定在金电极上的电池的阻抗，阻抗变化可以深入了解电池 - 金基板界面处电阻和电容的变化，由细胞 - 细胞相互作用引起的屏障功能以及此类金电极的过电池层覆盖率33,34。使用ECIS允许以非侵入性，实时的方式以纳米级分辨率进行定量测量26,34。

本研究评估并比较了实时评估MOF诱导的细胞行为变化的简单性和易用性与单点测定评估。这样的研究可以进一步外推，以评估细胞谱，以响应暴露于其他感兴趣的颗粒，从而允许安全的设计颗粒测试并随后帮助实施。此外，这项研究可以补充单点评估的遗传和细胞测定。这可能导致对颗粒对细胞群的有害影响的更明智的分析，并可用于以高通量方式筛选此类颗粒的毒性16,35,36。

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Protocol

1. ZIF-8合成

  1. 在本例中，使用1：10：100（金属：接头：溶剂）的质量比来合成ZIF-8。为此，测量出六水合硝酸锌，并记录测量结果。利用示例质量比计算接头、2-甲基咪唑和溶剂（即甲醇）所需的量。
  2. 将六水合硝酸锌和接头放入两个不同的玻璃小瓶中。将计算量的甲醇量的一半加入六水合硝酸锌中，另一半加入接头中。让每种溶液溶解。
  3. 将两种溶液（即分别含有金属和接头的溶液）结合起来。将装有反应组合溶液的容器放在搅拌板上，并在室温（RT）下以700rpm搅拌24小时。

2. ZIF-8系列

  1. 上述反应结束后（即24小时后），将溶液放入50mL离心管中，并以3,075× g 离心5分钟（使用等量并平衡转子）。从离心管中取出任何上清液。
  2. 向离心管中加入甲醇 （5-15 mL） 并重新分散颗粒。
  3. 重复离心和洗涤步骤至少两到四次。最后一次洗涤后，排出上清液。
    注意：洗涤步骤去除任何非沉淀物质。
  4. 取下管子的盖子，将封口膜胶带放在顶部;随后，在封口膜上戳洞。将装有样品的试管置于室温的真空室中干燥24小时。

3. ZIF-8表面形貌（扫描电子显微镜[SEM]）

  1. 将ZIF-8的干粉安装到碳带上，并用金钯溅射120秒，以防止在SEM分析过程中可能发生的任何电荷。
  2. 将显微镜的加速电压设置为15 kV。聚焦粒子并调整放大倍率（使用500x，1,000x，1,500x，4,000x，10,000x，20,000x，30,000x和40,000x的放大倍率）。
  3. 在放大镜下对颗粒进行成像，以便进行清晰的颗粒大小和形态评估（建议考虑 5 μm、10 μm 和 20 μm 颗粒的范围）。
  4. 从至少三个不同的视野收集数据，对于每个视场，考虑不同的放大倍率。

4. ZIF-8元素组成

  1. 按照 SEM 成像的步骤操作。
  2. 使用SEM显微镜的能量色散X射线（EDX）光谱单元，分析样品元素组成。
  3. 确保 SEM 加速电压和放大倍率与 EDX 监视器匹配。关闭 SEM 显微镜上的红外相机。
  4. 在 EDX 监视器上，转到收集 频谱 并输入 200 秒的收集时间。建议这样做以避免可能导致错误评估的粒子充电和分解。
  5. 从至少三个不同的视野收集数据。收集完成后，分析数据并确定感兴趣的元素。

5. 细胞培养

  1. 在补充有5%胎牛血清（FBS）和0.2%青霉素/链霉素的培养基中培养永生化的BEAS-2B细胞。
    注意：应使用5-10之间的传代，以确保先前使用的细胞批次中没有发生表型变化37 （所有试剂均列在 材料表中）。
  2. 取一个 100 mm 细胞培养板，将 10 mL 培养基放在板上。向平板中加入 1 mL BEAS-2B 细胞溶液。
  3. 将板放入培养箱（37°C，5%CO2）中，让细胞生长。
  4. 24小时后检查板以确定细胞是否达到80%汇合度。本文中，80%的汇合度是指被粘附细胞覆盖的表面的百分比。如果没有，请更换培养基并让细胞生长，直到达到 80% 的汇合度水平。

6. 细胞计数

  1. 一旦板上的细胞达到80%的汇合度，从平板上取出培养基。用 5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗板。
  2. 从盘子上取下PBS。向板中加入2mL胰蛋白酶，并将其置于培养箱（37°C，5%CO 2）中2分钟。
  3. 向板中加入 2 mL 培养基，上下移液培养基以从平板中取出细胞。将溶液转移到 15 mL 管中，并以 123 x g 离心 5 分钟。
  4. 从管中取出上清液并加入 2 mL 培养基。上下移液培养基以重新分散细胞。
  5. 使用 1.5 mL 管，加入 20 μL 台盼蓝，然后加入 20 μL 细胞溶液（台盼蓝：细胞溶液的比例为 1：1）。
  6. 将 10 μL 细胞混合物放在载玻片上，然后将其放在自动细胞计数器上。等到屏幕成为焦点，然后选择 捕获。
  7. 屏幕显示活细胞数量和细胞活力。测量范围从 1 x 104-1 x 107 个电池。
  8. 或者，使用血细胞计数器手动计数细胞。
    1. 为此，向血细胞计数器中加入 15-20 μL 台盼蓝处理的细胞溶液。
    2. 使用正置显微镜，对血细胞计数器的网格线进行10倍物镜聚焦。
    3. 计算四个外部方块中的单元格数，然后将数字除以四。然后，乘以 10,000 以获得活细胞计数数。
    4. 要计算细胞活力，请将活细胞计数和死细胞计数相加以获得总细胞计数，然后将活细胞计数除以总细胞计数。

7. ZIF-8剂量制剂

  1. 制作 1 mg/mL 的 ZIF-8 储备溶液。为此，测量ZIF-8的量并向颗粒中加入去离子（DI）水以达到1mg / mL浓度。
  2. 在水浴中以30秒的间隔对ZIF-8储备溶液进行超声处理（将超声仪设置为声波）2分钟。
  3. 使用公式C1 V1 = C 2 V2计算达到所需剂量所需的储备溶液和 Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 的量，为细胞暴露制作不同剂量的 ZIF-8。剂量范围为 0-950 μg/mL。
    注意：在本实验中，选择0μg/mL，1μg/ mL，10μg/ mL，50μg/ mL，100μg/ mL，250μg/ mL，500μg/ mL，750μg/ mL和950μg/ mL的剂量。

8. 半最大抑制浓度 （IC 50）

  1. 细胞计数后，将 BEAS-2B 细胞以 4 x 104 个细胞 /mL 的密度接种在 96 孔板中，体积为 100 μL/孔。
    1. 要达到 4 x 104 个细胞/mL 的密度，请使用 C 1 V1= C 2 V2计算需要与培养基结合的细胞溶液量。
    2. 确保每次剂量保持空白孔;将这些孔留空，直到ZIF-8暴露。
  2. 将96孔板放入37°C和5%CO2 的培养箱中，并使细胞生长至汇合的单层24小时。
  3. 从孔中取出培养基，并将BEAS-2B细胞暴露于0-950μg/ mL的ZIF-8剂量下。将 100 μL ZIF-8 加入各自的空白孔和细胞孔中。
  4. 将96孔板放回培养箱中，暴露时间为48小时。
  5. 暴露后，向每个孔（空白孔和细胞孔）中加入 10 μL 4-[3-（4-碘苯基）-2-（4-硝基苯基）-2H-5-四唑咯基]-1,3-苯二磺酸酯 （WST-1） 并孵育 2 小时。媒体仍然在井里;比例为1：10（试剂：培养基）。
  6. 使用485nm吸光度在读板器上读取吸光度的变化。
  7. 通过软件计算细胞活力以确定IC 50值（参见第10 节）。

9. 电电池基板阻抗传感 （ECIS）

  1. 使用 96 孔板 （96W10idf） 进行 ECIS 分析。该板28 包含指间指指连接电极，覆盖面积约4毫米2。
  2. 首先，测试传感器是否正在读取所有孔。为此，将 96 孔板放在井站上，然后单击 设置 按钮。
  3. 如果井连接正确，将出现绿色;任何未连接的井将被标识为红色。如果出现这种情况，请取出并重新插入孔板，然后再次单击 “设置 ”按钮，直到所有孔都提供可行的绿色读数。
  4. 用每孔 200 μL 培养基将电极稳定 40 分钟，以防止潜在的漂移。向使用的每个孔中加入 200 μL 培养基，然后将 96 孔板放在 ECIS 工作站上。单击 设置/检查 以确保板已正确连接。点击 稳定。
  5. 稳定完成后，从工作站上取下板并从每个孔中取出培养基。
  6. 将密度为 4 x 104 个细胞/mL（每孔体积为 100 μL）的 BEAS-2B 细胞接种到包含细胞的孔中，并将板放在培养箱中的 ECIS 站上。
  7. 在监视器上，单击“ 检查 ”以确定工作站上的传感器是否读取了所有电极。
  8. 通过选择 多个频率/时间 （MFT） 来设置时程度量。该程序将以七个不同的频率测量每个井。
  9. 单击 开始 并让它运行 24 小时，以便细胞可以形成汇合的单层。
  10. 24小时后，含有细胞的孔将在监视器上显示增加的电阻。这是细胞附着在电极上的指标。
  11. 按显示器上的 暂停 以停止数据收集。
  12. 按照上述第 7 节中概述的步骤，使 ZIF-8 剂量等于、高于和低于计算的 IC50 值。
  13. 将ZIF-8纳米颗粒以每孔100μL的体积暴露于各自的空白孔和细胞孔中，并将96孔板放回工作站上。
  14. 单击监视器上的“ 再次检查 ”，以确保传感器读取所有电极。单击 恢复 并允许系统运行 72 小时以监控蜂窝行为和附件。
  15. 数据收集完成后，单击监视器上的 完成 。若要保存文件，请单击 “文件”>“另存为”。将数据另存为电子表格文件。
  16. 要获取 alpha 参数， 请单击模型。在屏幕弹出窗口中，单击“仅媒体井”，然后选择 仅具有媒体的井。
  17. 单击设置 参考。 在显示器上，单击 查找。
  18. 如果系统中显示的孔与所选孔不同，请重复步骤 9.16。
  19. 单击 设置。单击拟 合 T 范围以确定数据收集所需的时间范围。
  20. 在处理过程中，单击 阿尔法。系统完成分析后，单击 保存 RbA 并将其另存为电子表格文件。
    注意：请参阅 ECIS 手册，该手册可在制造商的网站38 上找到。

10. 数据分析

  1. 搜索引擎优化
    1. 打开成像软件以分析SEM图像。单击“ 文件>打开”，然后选择要分析的图像。
    2. 单击 图像>键入 8 位> 将图像转换为灰度以执行阈值操作。
    3. 将像素的距离测量值校准为微米。单击 直线 工具并跟踪要测量的每个粒子的长度。
    4. 单击 分析 ，然后单击 设置比例。已知距离将设置为 SEM 图像上比例尺大小的长度。已知的长度单位将设置为微米。检查 全局 并按 确定。
    5. 单击直线工具并追踪粒子的直径，然后选择分析和测量。记录长度结果。
    6. 对所有收集的图像重复此操作。平均至少60个颗粒的所有直径，以进行适当的统计评估。
  2. EDX
    1. 从所有收集的图像中平均每个元素的所有权重百分比（请参阅上面的EDX部分）。
    2. 使用电子表格，在 x 轴上绘制每个元素的条形图，在 y 轴上绘制其平均元素权重百分比。
  3. 集成电路50
    1. 平均空白孔并平均每个重复的剂量孔。
    2. 通过从剂量空白平均值中减去对照空白平均值来计算调整后的空白。通过从平均剂量值中减去调整后的空白来计算每个剂量的真实细胞值。
    3. 从平均对照值中减去每个剂量的调整空白值。使用以下公式计算每个剂量的细胞活力：细胞活力=（真实细胞值/（对照值 - 调整空白值））x 100。
    4. 对所有其他仿行重复此操作。
    5. 平均每个重复的细胞活力，以获得每个剂量的最终细胞活力。
    6. 在软件中，选择屏幕上的 XY 选项卡。
    7. 在X列中输入浓度（剂量）值，在Y列中输入每个剂量的细胞活力（%）。
    8. 通过单击“ 分析>转换”>“确定”和“转换 X = Log（X）”来转换 X 值。
    9. 通过选择转换后的数据表，单击分析，然后选择归一化来规范化 Y 值。
    10. 选择 变换归一化 数据表，单击 分析，然后选择 非线性回归（曲线拟合）。选择 剂量 -反应-抑制，然后单击 对数（抑制剂）与反应-可变斜率（四个参数）。单击 “确定 ”查看结果。
  4. 欧易斯
    1. 从电子表格中，获取每个重复（空白孔和剂量孔）的电阻（欧姆）列，并从4,000 Hz频率将它们平均在一起。该频率允许细胞间接触评估38。
    2. 通过从每次重复的平均剂量中减去平均空白来计算校正的阻力。平均每个剂量的重复校正阻力。
    3. 对 alpha 值重复相同的步骤以计算平均 alpha 参数。将 x 轴绘制为时间 （h），将 y 轴绘制为每个剂量值的平均阻力/α 值。

11. 统计分析

  1. 搜索引擎优化
    1. 在计算ZIF-8颗粒平均直径的电子表格文件中执行标准偏差。
    2. 利用电子表格中的 STDEV 函数，突出显示 60 个粒子的数据，然后单击 Enter。绘制计算的每个平均直径的标准偏差图表。
  2. EDX
    1. 与SEM（步骤11.1.1-11.1.2）类似，使用电子表格中的 STDEV 函数计算每个平均元素组成的标准偏差。绘制每个平均元素组成的标准偏差。
  3. 集成电路50
    1. 打开用于计算IC50 的软件，然后单击 分组数据表。
    2. 在标有 A 组、B 组等的行中输入 ZIF-8 剂量。输入每个剂量的平均细胞活力，并在与ZIF-8剂量对应的列中重复。
    3. 单击“分析”，然后在“列分析”下，选择单因子方差分析（以及非参数或混合）。
    4. 在“实验性设计”选项卡中，选择“无匹配或配对”。在残差的高斯分布下，选择是使用方差分析。最后，在假设 SD 相等下选择是使用普通方差分析检验。
    5. 在“ 多重比较 ”选项卡下，选择“ 将每列的平均值与控制列的平均值进行比较”。单击 “确定 ”查看结果。

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Representative Results

本研究使用常见的 体外 模型细胞系39 （BEAS-2B），旨在证明ECIS评估暴露于实验室合成的MOF后细胞行为变化的可行性和适用性。这些变化评估通过常规比色测定的分析得到补充。

首先评估框架的物理化学特性，以确保所采用方法的可重复性，获得的结果的有效性以及此类结果的相关讨论。例如，ZIF-8的表面形貌分析是通过SEM进行的;图像显示，这些框架显示出菱形十二面体形态40，平均尺寸为62.87 nm±9.61 nm（图1A）。通过EDX光谱法测定了MOFs的元素组成。结果表明，ZIF-8的主要组成由C、N和Zn组成（即咪唑酯接头和金属离子Zn16的组成）（图1B）。先前的X射线衍射表明，ZIF-8晶相在10.33°，12.8°，14.7°，16.5°和18°处发现了特定的峰，这些峰分别归因于平面（002），（112），（022），（013）和（222）16,41。

对于提出的细胞行为筛选，确定了IC 50（ZIF-8抑制细胞生长50 %的浓度）29。为此，将细胞以0-950μg/ mL的剂量暴露于ZIF-848小时（图2A）。暴露细胞的剂量反应图如图 2B所示，随后记录的IC50 为35.7μg/ mL。此外，分析揭示了暴露于ZIF-8时细胞活力的剂量依赖性趋势。

确定IC50后，进行ECIS分析。简而言之，ECIS被用作暴露于IC50以及低于和高于该浓度的ZIF-8 MOFs的BEAS-2B的实时筛选策略，即分别为15.7 μg/mL （C1）、35.7 μg/mL （C2）、55.7 μg/mL （C3）和75.7 μg/mL （C4），细胞暴露总时间为72小时。ECIS的加入旨在实时确定细胞覆盖率，形态和活力的变化。ECIS结果记录为电阻的变化和细胞-底物相互作用的变化，即α参数42。

电阻趋势在 图3A 中显示为用ZIF-8处理的细胞与对照（黑线）（即未暴露的细胞）相比的曲线变化。具体而言，分析表明，在暴露于C2-C4剂量的金电极上含有细胞的孔在细胞暴露于框架后立即显示出初始电阻略有增加（均相对于对照[即未暴露的细胞]）。这些初始变化随后是记录的电阻急剧下降，这种降低在暴露后6-8小时之间普遍存在（图3A）。从暴露时间开始14-18小时后观察到电阻完全丧失。暴露于低于IC50 值的剂量的细胞显示出电阻，就像带有对照细胞的孔一样，直到暴露后约16-18小时出现电阻损失。此外，在细胞暴露期间，观察到实验中使用的孔信号的连续信号扰动。在分析α参数期间，这些扰动持续存在（图3B），该分析进一步表明，暴露的细胞会改变其细胞 - 底物相互作用，其特征类似于抗性细胞。此外，这种变化取决于暴露的时间和这种暴露中使用的剂量。

Figure 1
图1：SEM图像和ZIF-8颗粒的平均元素组成 。 （A）ZIF-8颗粒的代表性SEM图像。（B） ZIF-8颗粒的平均元素组成（±标准差[SD]条）。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2：细胞活力。 （A）细胞处理示意图（用 Biorender.com 创建）。（B） 暴露于ZIF-8颗粒的BEAS-2B细胞的活力，剂量范围为0-950μg/mL;该分析用于确定IC50（±SD条;***p = 0.0001和****p <相对于对照的0.0001）。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：代表性细胞电阻和细胞附着的变化 。 （A）暴露于低于，在IC 50浓度和高于IC50 浓度的ZIF-8颗粒中的BEAS-2B细胞的代表性细胞抗性。（B）当暴露于低于和高于IC50 浓度的ZIF-8颗粒时，BEAS-2B细胞的细胞附着的变化（即α参数的变化）。 请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

先前的分析表明，ECIS可用于评估暴露于分析物（即碳纳米管35，药物43或纳米粘土16）的细胞的行为。此外，Stuekle等人使用ECIS评估暴露于纳米粘土及其副产物的BEAS-2B细胞的毒性，发现细胞行为和附着取决于此类材料的物理化学特性42。在此，我们提出确定BEAS-2B细胞响应暴露于MOFs的可能变化，从而有助于旨在区分ZIF-8对 体外细胞系统的任何有害影响的知识体系，所有这些都以高通量和实时的方式进行。

该分析首先允许评估框架特性，从而有助于将细胞行为的变化与测试MOF的物理化学特性相关联44。具体来说，当细胞暴露于具有相似元素组成的规则几何形状的MOFs时（见上文结果），分析显示细胞行为的变化，可能是由于框架的摄取及其细胞降解。具体就摄取而言，先前对疏水材料的毒性分析表明，当这些材料暴露于细胞时，它们的摄取对细胞膜的破坏比亲水对应物的摄取更大，可能是因为它们能够从膜的结构双层中去除脂质16， 45在它们的细胞易位过程中导致膜功能障碍或质膜扰动46,47。特别是，脂质去除被证明会导致膜完整性的变化，细胞信号传导48和细胞摄取的增加49，并具有细胞功能效应的缺点。例如，Farcal等人证明，疏水性TiO2纳米材料在暴露的肺泡巨噬细胞50中与其亲水对应物相比具有增加的细胞毒性作用。此外，Wagner等人证明，与亲水性MIL-16016相比，疏水性ZIF-8对BEAS-2B细胞造成更多的破坏。

记录的细胞行为变化可能是由于细胞暴露于所选框架而导致细胞 - 底物相互作用26 和/或细胞活力和增殖16 在电极上的干扰。例如，Wagner等人评估了暴露于纳米粘土的细胞中的类似参数。作者发现，在72小时的实验过程中观察到细胞 - 底物相互作用的完全丧失。此外，作者证明了当BEAS-2B暴露于其选择的纳米粘土26时，对细胞活力和增殖的时间依赖性影响。虽然本文中测试的颗粒是MOF，但与纳米粘土效应的可能扩展关联是可行的，因为这些颗粒的一些物理化学特性（即尺寸，疏水性和组成）与MOFs相似。此外，Stuekle等人还证明了当纳米粘土暴露于永生化的BEAS-2B细胞时，依赖于时间和治疗的细胞行为。其他人已经证明，ZIF-8在100μg/ mL的剂量下，导致BEAS-2B细胞单层和细胞活力完全丧失，可能是由于细胞 - 底物相互作用的变化16。然而，值得注意的是，在此类研究中，ZIF-8颗粒是在不同的合成条件下获得的（即，10分钟与本研究中使用的24小时），这些合成条件随后导致框架的不同形状/形态，从而支持先前的结论。这表明颗粒合成过程中使用的反应时间6，温度2和溶剂44 会影响它们的形状，大小和组成特征，并随后导致暴露细胞中的差异效应和行为。

分析还表明，暴露于低于IC50 值的ZIF-8剂量的细胞表现出与对照相似的抗性，可能是因为这些剂量不足以在这些实验的条件和时间范围内诱导ECIS可观察到的细胞转化。然而，在高于IC50的剂量下，观察到细胞抗性完全丧失，并且仅在暴露后的几个小时内，很可能是由于细胞活力的变化和诱导细胞 - 底物相互作用的可能变化16 （图3A）。这些说法得到了先前研究的支持，这些研究表明，非活细胞会改变其形状并从底物上分离。例如，Verma等人使用实时阻抗传感技术来评估人肺泡上皮细胞系（A549）中纳米粘土的细胞毒性。结果表明，与管状型纳米粘土相比，血小板型纳米粘土导致分离和变形细胞的数量增加51。此外，Xiao等人证明，由于培养基中的水，细胞外离子和细胞毒性化学物质的流入，成纤维细胞V79细胞的细胞骨架在暴露于氯化镉时受到损害。细胞骨架的变化导致细胞-底物相互作用的丧失。此外，当苯扎氯铵暴露于V79细胞时，由于暴露导致细胞膜受损，细胞电阻显着降低52。

此外，抗性的变化可能是由于细胞对ZIF-8的物理化学特性的反应。特别是，ZIF-8是一种疏水框架;先前的分析表明，疏水性可导致毒性增加16。与其他金属（如Zr和Fe1 ）相比，金属离子（如Zn）先前也被证明具有更高程度的毒性，即可能导致更高的细胞死亡。

进一步表明，所有细胞在暴露后立即记录了初始抗性降低，随后增加。Eldawud等人在暴露于BEAS-2B细胞时表现出类似的效果。作者将细胞电阻的增加解释为由于BEAS-2B细胞克服了材料暴露引起的干扰，随后恢复了其完整性18 ，同时消除了电极漂移28，从而确保了数据分析的可重复性（参见ECIS手册）。

尽管这项研究表明，ECIS可能是用于细胞行为筛选的宝贵工具，特别是由于高通量特性，但建议在需要全面了解材料的有害评估时，该技术不要取代单时间点测定。特别是，单点测定可以进一步允许评估其遗传水平的细胞转化45,53，如Eldawud等人所示，例如暴露于纳米金刚石和通过荧光激活细胞分选（FACS）的BEAS-2B细胞45。 Yu等人还使用FACS来评估暴露于透明质酸修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒（HA-MSNs）的人结肠癌细胞（HCT0116）54。

所提出的结果表明，变化的途径取决于MOFs的物理化学特性，以及暴露中使用的此类框架的时间和剂量。本文描述的结果和方法进一步强调了实时测量的重要性及其在理解细胞谱变化方面的优势。这些可以补充额外的生化测定来评估毒性机制，从而导致对细胞行为没有有害影响的MOF的安全设计策略，记录为细胞附着，细胞间相互作用或细胞 - 底物相互作用。

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Disclosures

作者报告这项工作没有利益冲突。

Acknowledgments

这项工作部分由国家普通医学科学研究所（NIGMS）T32计划（T32 GM133369）和国家科学基金会（NSF 1454230）资助。此外，西弗吉尼亚大学共享研究设施和应用生物物理学的援助和支持也得到了认可。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)  Roche 5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25255-056
100 mm plates Corning 430167
1300 Series A2 biofume hood Thermo Scientific 323TS
2510 Branson bath sonicator Process Equipment & Supply, Inc.  251OR-DTH
2-methylimidazole, 97% Alfa Aesar 693-98-1
5 mL sterile microtube Argos Technologies T2076S-CA
50 mL  tubes  Falcon 352098
96W10idf well plates Applied Biophysics  96W10idf PET
96-well plates Fisherbrand FB012931
Biorender Biorender N/A
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess II FL automated cell counter Life Technologies C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater Denton Vacuum N/A
Dimethly sulfoxide  Corning 25-950-CQC
DPBS/Modified Cytiva SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium Corning 10-014-CV
ECIS-ZΘ Applied Biophysics  ABP 1129
Excel Microsoft Version 2301
Falcon tubes (15 mL) Corning 352196
Fetal bovine serum Gibco 16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader BMG LABTECH 413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0) GraphPad Software, LLC Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray  Hitachi High-Technologies Corporation S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells American Type Culture Collection CRL-9609
Isotemp freezer Fisher Scientific 
Methanol, 99% Fisher Chemical 67-56-1
Parafilm sealing film The Lab Depot HS234526A
Penicillin/Steptomycin Gibco 15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge  Thermo Scientific 75004220
Sorvall T 6000B DU PONT  T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS MP Biomedicals, LLC 1691049
Vacuum Chamber Belart 999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure Acros Organic 101-96-18-9

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References

  1. Tamames-Tabar, C., et al. Cytotoxicity of nanoscaled metal-organic frameworks. Journal of Materials Chemistry. B. 2 (3), 262-271 (2014).
  2. Lin, W. X., et al. Low cytotoxic metal-organic frameworks as temperature-responsive drug carriers. ChemPlusChem. 81 (8), 804-810 (2016).
  3. Vasconcelos, I. B., et al. Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF-8. RSC Advances. 2 (25), 9437-9442 (2012).
  4. Yang, B. C., Shen, M., Liu, J. Q., Ren, F. Post-synthetic modification nanoscale metal-organic frameworks for targeted drug delivery in cancer cells. Pharmaceutical Research. 34 (11), 2440-2450 (2017).
  5. Lucena, M. A. M., et al. Application of the metal-organic framework Eu(BTC) as a luminescent marker for gunshot residues: A synthesis, characterization, and toxicity study. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (5), 4684-4691 (2017).
  6. Kayal, S., Sun, B. C., Chakraborty, A. Study of metal-organic framework MIL-101(Cr) for natural gas (methane) storage and compare with other MOFs (metal-organic frameworks). Energy. 91, 772-781 (2015).
  7. Gutov, O. V., et al. Water-stable zirconium-based metal-organic framework material with high-surface area and gas-storage capacities. Chemistry. 20 (39), 12389-12393 (2014).
  8. Ghorbanloo, M., Safarifard, V., Morsali, A. Heterogeneous catalysis with a coordination modulation synthesized MOF: morphology-dependent catalytic activity. New Journal of Chemistry. 41 (10), 3957-3965 (2017).
  9. Valvekens, P., et al. Base catalytic activity of alkaline earth MOFs: a (micro) spectroscopic study of active site formation by the controlled transformation of structural anions. Chemical Science. 5 (11), 4517-4524 (2014).
  10. Taylor, K. M. L., Rieter, W. J., Lin, W. B. Manganese-based nanoscale metal-organic frameworks for magnetic resonance imaging. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14358-14359 (2008).
  11. Taylor-Pashow, K. M. L., Della Rocca, J., Xie, Z. G., Tran, S., Lin, W. B. Postsynthetic modifications of iron-carboxylate nanoscale metal-organic frameworks for imaging and drug delivery. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14261-14263 (2009).
  12. Kundu, T., et al. Mechanical downsizing of a gadolinium(III)-based metal-organic framework for anticancer drug delivery. Chemistry. 20 (33), 10514-10518 (2014).
  13. Orellana-Tavra, C., et al. Drug delivery and controlled release from biocompatible metal-organic frameworks using mechanical amorphization. Journal of Materials Chemistry. B. 4 (47), 7697-7707 (2016).
  14. Su, H. M., et al. A highly porous medical metal-organic framework constructed from bioactive curcumin. Chemical Communications. 51 (26), 5774-5777 (2015).
  15. Gandara-Loe, J., et al. Metal-organic frameworks as drug delivery platforms for ocular therapeutics. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (2), 1924-1931 (2019).
  16. Wagner, A., et al. Toxicity screening of two prevalent metal organic frameworks for therapeutic use in human lung epithelial cells. International Journal of Nanomedicine. 14, 7583-7591 (2019).
  17. Chen, G. S., et al. In vitro toxicity study of a porous iron(III) metal-organic framework. Molecules. 24 (7), 1211 (2019).
  18. Eldawud, R., Wagner, A., Dong, C. B., Rojansakul, Y., Dinu, C. Z. Electronic platform for real-time multi-parametric analysis of cellular behavior post-exposure to single-walled carbon nanotubes. Biosensors & Bioelectronics. 71, 269-277 (2015).
  19. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment: Limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (2), 370-377 (2009).
  20. Lucena, F. R. S., et al. Induction of cancer cell death by apoptosis and slow release of 5-fluoracil from metal-organic frameworks Cu-BTC. Biomedicine & Pharmacotherapy. 67 (8), 707-713 (2013).
  21. Orellana-Tavra, C., et al. Tuning the endocytosis mechanism of Zr-based metal-organic frameworks through linker functionalization. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (41), 35516-35525 (2017).
  22. Zucker, R. M., Ortenzio, J. N. R., Boyes, W. K. Characterization, detection, and counting of metal nanoparticles using flow cytometry. Cytometry. Part A. 89 (2), 169-183 (2016).
  23. Robson, A. L., et al. Advantages and limitations of current imaging techniques for characterizing liposome morphology. Frontiers in Pharmacology. 9, 80 (2018).
  24. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  25. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  26. Wagner, A., et al. Toxicity evaluations of nanoclays and thermally degraded byproducts through spectroscopical and microscopical approaches. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861, 3406-3415 (2017).
  27. Wagner, A., et al. Early assessment and correlations of nanoclay's toxicity to their physical and chemical properties. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (37), 32323-32335 (2017).
  28. Wagner, A., et al. Incineration of nanoclay composites leads to byproducts with reduced cellular reactivity. Scientific Reports. 8 (1), 10709 (2018).
  29. Zhao, F., Klimecki, W. T. Culture conditions profoundly impact phenotype in BEAS-2B, a human pulmonary epithelial model. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 945-951 (2015).
  30. Wu, S. X., Wang, W. H., Fang, Y. Z., Kong, X. J., Liu, J. H. Efficient Friedel-Crafts acylation of anisole over silicotungstic acid modified ZIF-8. Reaction Kinetics Mechanisms and Catalysis. 122, 357-367 (2017).
  31. Shu, F. P., et al. Fabrication of a hyaluronic acid conjugated metal organic framework for targeted drug delivery and magnetic resonance imaging. RSC Advances. 8 (12), 6581-6589 (2018).
  32. Shi, Z. Q., et al. FA-PEG decorated MOF nanoparticles as a targeted drug delivery system for controlled release of an autophagy inhibitor. Biomaterials Science. 6 (10), 2582-2590 (2018).
  33. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).
  34. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  35. Eldawud, R., et al. Carbon nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and fate. Nanoimpact. 9, 72-84 (2018).
  36. An, Y., Jin, T. Y., Zhang, F., He, P. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) for profiling cytotoxicity of cigarette smoke. Journal of Electroanalytical Chemistry. 834, 180-186 (2019).
  37. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  38. Applied Biophysics, Allied Biophysics. , Available from: https://biophysics.com (2023).
  39. Park, Y. H., Kim, D., Dai, J., Zhang, Z. Human bronchial epithelial BEAS-2B cells, an appropriate in vitro model to study heavy metals induced carcinogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 287 (3), 240-245 (2015).
  40. Yang, F., et al. Morphological map of ZIF-8 crystals with five distinctive shapes: Feature of filler in mixed-matrix membranes on C3H6/C3H8 separation. Chemistry of Materials. 30 (10), 3467-3473 (2018).
  41. Rose, O. L., et al. Thin films of metal-organic framework interfaces obtained by laser evaporation. Nanomaterials. 11 (6), 1367 (2021).
  42. Stueckle, T. A., et al. Impacts of organomodified nanoclays and their incinerated byproducts on bronchial cell monolayer integrity. Chemical Research in Toxicology. 32 (12), 2445-2458 (2019).
  43. Eldawud, R., et al. Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1864 (11), 129683 (2020).
  44. Zhuang, J., et al. Optimized metal-organic-framework nanospheres for drug delivery: Evaluation of small-molecule encapsulation. ACS Nano. 8 (3), 2812-2819 (2014).
  45. Eldawud, R., et al. Combinatorial approaches to evaluate nanodiamond uptake and induced cellular fate. Nanotechnology. 27 (8), 085107 (2016).
  46. Houthaeve, G., De Smedt, S. C., Braeckmans, K., De Vos, W. H. The cellular response to plasma membrane disruption for nanomaterial delivery. Nano Convergence. 9 (1), 6 (2022).
  47. Otero-Gonzalez, L., Sierra-Alvarez, R., Boitano, S., Field, J. A. Application and validation of an impedance-based real time cell analyzer to measure the toxicity of nanoparticles impacting human bronchial epithelial cells. Environmental Science & Technology. 46 (18), 10271-10278 (2012).
  48. Ibarguren, M., Lopez, D. J., Escriba, P. V. The effect of natural and synthetic fatty acids on membrane structure, microdomain organization, cellular functions and human health. Biochimica et Biophysica Acta. 1838 (6), 1518-1528 (2014).
  49. Nor, Y. A., et al. Shaping nanoparticles with hydrophilic compositions and hydrophobic properties as nanocarriers for antibiotic delivery. ACS Central Science. 1 (6), 328-334 (2015).
  50. Farcal, L., et al. Comprehensive in vitro toxicity testing of a panel of representative oxide nanomaterials: First steps towards an intelligent testing strategy. PLoS One. 10 (5), e0127174 (2015).
  51. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
  52. Xiao, C. D., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: Concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  53. Coyle, J. P., et al. Carbon nanotube filler enhances incinerated thermoplastics-induced cytotoxicity and metabolic disruption in vitro. Particle and Fibre Toxicology. 17 (1), 40 (2020).
  54. Yu, M. H., et al. Hyaluronic acid modified mesoporous silica nanoparticles for targeted drug delivery to CD44-overexpressing cancer cells. Nanoscale. 5 (1), 178-183 (2013).

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生物工程，第195期，
用于实时评估金属有机框架毒理学特征的电池-基底传感
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Rose, O. L., Arnold, M., Dinu, C. Z. … More

Rose, O. L., Arnold, M., Dinu, C. Z. Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles. J. Vis. Exp. (195), e65313, doi:10.3791/65313 (2023).

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