Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Электрическое зондирование ячейки-подложки для оценки токсикологических профилей металлоорганического каркаса в режиме реального времени

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65313
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

Summary

В следующем исследовании оценивается токсикологический профиль выбранного металлоорганического каркаса с использованием датчика импеданса электрического элемента с субстратом (ECIS), высокопроизводительного метода скрининга в режиме реального времени.

Abstract

Металлоорганические каркасы (MOFs) представляют собой гибриды, образующиеся в результате координации ионов металлов и органических линкеров в органических растворителях. Внедрение MOFs в биомедицинские и промышленные приложения вызвало опасения по поводу их безопасности. В данной работе профиль выбранного MOF, цеолитового имидазолового каркаса, оценивался при воздействии эпителиальных клеток легких человека. Платформой для оценки послужил метод реального времени (т.е. измерение импеданса электрического элемента с подложкой [ECIS]). В этом исследовании выявлены и обсуждены некоторые из вредных эффектов выбранного MOF на подвергшиеся воздействию клетки. Кроме того, это исследование демонстрирует преимущества использования метода в реальном времени по сравнению с другими биохимическими анализами для комплексной оценки клеток. В исследовании сделан вывод о том, что наблюдаемые изменения в поведении клеток могут указывать на возможную токсичность, индуцированную воздействием MOFs с различными физико-химическими характеристиками и дозировкой используемых структур. Понимая изменения в поведении клеток, можно предвидеть возможность улучшения безопасных стратегий MOFs, которые будут использоваться в биомедицинских приложениях, путем специфической адаптации их физико-химических характеристик.

Introduction

Металлоорганические каркасы (МОФ) представляют собой гибриды, образующиеся в результате комбинации ионов металлов и органических линкеров 1,2 в органических растворителях. Благодаря разнообразию таких комбинаций MOF обладают структурным разнообразием3, настраиваемой пористостью, высокой термической стабильностью и большой площадью поверхности 4,5. Такие характеристики делают их привлекательными кандидатами в различных областях применения, от хранения газов6,7 до катализа8,9 и от контрастных веществ 10,11 до устройств доставки лекарств 12,13. Тем не менее, внедрение MOF в такие приложения вызвало опасения по поводу их безопасности как для пользователей, так и для окружающей среды. Предварительные исследования показали, например, что клеточная функция и рост изменяются при воздействии на клетки ионов металлов или линкеров, используемых для синтеза MOF 1,14,15. Например, Tamames-Tabar et al. продемонстрировали, что ZIF-8 MOF, MOF на основе Zn, приводит к большему количеству клеточных изменений в клеточной линии рака шейки матки человека (HeLa) и клеточной линии макрофагов мыши (J774) по сравнению с MOFs на основе Zr и Fe. Такие эффекты, по-видимому, были обусловлены металлическим компонентом ZIF-8 (т.е. Zn), который потенциально мог индуцировать апоптоз клеток при распаде каркаса и высвобождении иона Zn1. Аналогичным образом, Gandara-Loe et al. продемонстрировали, что HKUST-1, MOF на основе Cu, вызывает наибольшее снижение жизнеспособности клеток ретинобластомы мышей при использовании в концентрациях 10 мкг/мл или выше. По-видимому, это было связано с ионом металла Cu, включенным во время синтеза этого каркаса, который, будучи высвобожденным, мог индуцировать окислительный стресс в подвергшихся воздействию клетках15.

Более того, анализ показал, что воздействие MOFs с различными физико-химическими характеристиками может приводить к различным реакциям облученных клеток. Например, Wagner et al. продемонстрировали, что ZIF-8 и MIL-160 (каркас на основе Al), используемые при экспонировании иммортализированной эпителиальной клетки бронхов человека, приводят к клеточным реакциям, зависящим от физико-химических свойств каркасов, а именно гидрофобности, размера и структурных характеристик16. Кроме того, Chen et al. продемонстрировали, что концентрация 160 мкг/мл MIL-100(Fe) при воздействии на нормальные клетки печени человека (HL-7702) вызывает наибольшую потерю клеточной жизнеспособности, предположительно из-за металлического компонента этого специфического каркаса (т.е. Fe17).

Несмотря на то, что эти исследования классифицируют вредное воздействие MOFs на клеточные системы на основе их физико-химических характеристик и концентраций воздействия, что вызывает потенциальные опасения по поводу внедрения рамок, особенно в биомедицинских областях, большинство этих оценок основаны на колориметрическом анализе в одной временной точке. Например, было показано, что при использовании анализов (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) и водорастворимой соли тетразолия (WST-1) эти биохимические реагенты могут приводить к ложноположительным результатам при их взаимодействии с частицами, которым клетки также подвергались18. Показано, что соль тетразолия и нейтральные красные реагенты обладают высоким адсорбционным или связывающим сродством к поверхности частиц, что приводит к интерференции сигнала агента19. Более того, для других типов анализов, таких как проточная цитометрия, которая, как было показано ранее, используется для оценки изменений в клетках, подвергшихся воздействиюMOFs 20,21, было показано, что основные проблемы должны быть обойдены, если мы хотим рассмотреть жизнеспособный анализ вредного воздействия частиц. В частности, необходимо учитывать диапазоны обнаружения размеров частиц, особенно в смешанных популяциях, таких как те, которые предлагаются MOFs или эталонами частиц, используемых для калибровки до клеточныхизменений22. Также было показано, что краситель, используемый во время мечения клеток для таких цитометрических анализов, может также взаимодействовать с наночастицами, воздействию которых подвергалиськлетки.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы использовать высокопроизводительный оценочный анализ в режиме реального времени для оценки изменений в поведении клеток при воздействии выбранного MOF. Оценки в режиме реального времени могут помочь получить представление об эффектах, зависящих от времени, связанных с окнами экспозиций16. Кроме того, они предоставляют информацию об изменениях в межклеточно-субстратных взаимодействиях, морфологии клеток и межклеточных взаимодействиях, а также о том, как такие изменения зависят от физико-химических свойств интересующих материалов и времени экспозиции24,25 соответственно.

Для демонстрации валидности и применимости предложенного подхода использовали клетки бронхиального эпителия человека (BEAS-2B), ZIF-8 (гидрофобный каркас цеолитового имидазолата16) и зондирование импеданса электрических клеток-субстратов (ECIS). Клетки BEAS-2B представляют собой модель воздействия на легкие 26 и ранее использовались для оценки изменений при воздействии на клетки наноглин и их термически разлагаемых побочных продуктов26,27,28, а также для оценки токсичности наноматериалов, таких как одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ)18. Кроме того, такие клетки используются уже более 30 лет в качестве модели функции легочного эпителия29. ZIF-8 был выбран из-за его широкого применения в катализе30 и в качестве контрастных агентов31 для биовизуализации и доставки лекарств32 и, таким образом, из-за расширенного потенциала воздействия на легкие во время таких применений. Наконец, ECIS, неинвазивный метод в режиме реального времени, ранее использовался для оценки изменений в адгезии, пролиферации, подвижности и морфологии клеток в результате различных взаимодействий между аналитами (как материалами, так и лекарственными препаратами) и подвергшимися воздействию клеткамив режиме реального времени16,18,28. ECIS использует переменный ток (AC) для измерения импеданса ячеек, иммобилизованных на золотых электродах, при этом изменения импеданса дают представление об изменениях сопротивления и емкости на границе раздела клетка-золотая подложка, барьерной функции, индуцированной межклеточными взаимодействиями, и покрытии таких золотых электродов надклеточным слоем33,34. Использование ECIS позволяет проводить количественные измерения с наноразмерным разрешением неинвазивным способом в режиме реального времени26,34.

В этом исследовании оценивается и сравнивается простота и легкость оценки индуцированных MOF изменений в клеточном поведении в режиме реального времени с одноточечными оценками анализа. Такое исследование может быть экстраполировано для оценки клеточных профилей в ответ на воздействие других частиц, представляющих интерес, что позволит провести безопасное тестирование частиц и последующее помощь в реализации. Кроме того, это исследование может дополнить генетические и клеточные анализы, которые представляют собой одноточечную оценку. Это может привести к более обоснованному анализу вредного воздействия частиц на клеточную популяцию и может быть использовано для скрининга токсичности таких частиц высокопроизводительным способом16,35,36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Синтез ЗИФ-8

  1. Для целей этого примера используйте массовое соотношение 1:10:100 (металл:линкер:растворитель) для синтеза ZIF-8. Для этого отмерьте гексагидрат нитрата цинка и запишите измерение. Используйте пример соотношения масс, чтобы рассчитать количество, необходимое для линкера, 2-метилимидазола и растворителя (т. е. метанола).
  2. Поместите гексагидрат нитрата цинка и линкер в две разные стеклянные пробирки. Добавьте половину рассчитанного количества метанола к гексагидрату нитрата цинка, а другую половину — к линкеру. Дайте каждому раствору раствориться.
  3. Комбинируйте два раствора (т.е. растворы, содержащие металл и линкер соответственно). Поместите емкость с комбинированным раствором для реакции на перемешивающую пластину и перемешивайте при 700 об/мин в течение 24 ч при комнатной температуре (RT).

2. Коллекция ЗИФ-8

  1. После завершения вышеуказанной реакции (т. е. через 24 ч) поместите раствор в центрифужные пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте при 3,075 x g в течение 5 мин (используйте равные количества и сбалансируйте ротор). Удалите все надосадочные жидкости из центрифугированных пробирок.
  2. Добавьте метанол (5-15 мл) в центрифужные пробирки и повторно диспергируйте частицы.
  3. Повторите этапы центрифугирования и промывки еще не менее двух-четырех раз. После последней стирки выпустите надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этапах промывки удаляются все неосажденные частицы.
  4. Снимите крышки тюбиков и наклейте сверху парапленочную ленту; Впоследствии проделайте отверстия в парапленке. Поместите пробирку (пробирки) с образцом в вакуумную камеру при RT для высыхания в течение 24 часов.

3. Морфология поверхности ZIF-8 (сканирующая электронная микроскопия [SEM])

  1. Сухие порошки ЗИФ-8 устанавливают на углеродную ленту и распыляют в течение 120 с золото-палладием, чтобы предотвратить любое зарядение, которое может произойти во время СЭМ-анализа.
  2. Установите ускоряющее напряжение микроскопа на 15 кВ. Сфокусируйте частицы и отрегулируйте увеличение (использовались увеличения 500x, 1 000x, 1 500x, 4 000x, 10 000x, 20 000x, 30 000x и 40 000x).
  3. Изображение частиц под увеличением, которое позволяет четко оценить размер частиц и морфологию (рекомендуется учитывать диапазоны для частиц 5 мкм, 10 мкм и 20 мкм).
  4. Соберите данные по крайней мере из трех различных полей зрения и рассмотрите для каждого из них разное увеличение.

4. Элементный состав ЗИФ-8

  1. Следуйте инструкциям для получения СЭМ-изображений.
  2. С помощью энергодисперсионного рентгеновского спектроскопии (EDX) микроскопа СЭМ проводят анализ элементного состава образца.
  3. Убедитесь, что ускоряющее напряжение и увеличение SEM соответствуют монитору EDX. Выключите инфракрасную камеру на СЭМ-микроскопе.
  4. На мониторе EDX перейдите в раздел Collect Spectrum (Сбор спектра ) и введите время сбора 200 с. Это рекомендуется для того, чтобы избежать заряда частиц и распада, которые могут привести к ложным оценкам.
  5. Собирайте данные как минимум из трех разных полей зрения. После завершения сбора проанализируйте данные и определите интересующие элементы.

5. Клеточная культура

  1. Культура иммортализировала клетки BEAS-2B в среде, дополненной 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 0,2% пенициллином/стрептомицином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пассажи между 5-10 следует использовать для того, чтобы убедиться в том, что в используемой партии клеток ранее не происходило фенотипических изменений37 (все реагенты перечислены в таблице материалов).
  2. Возьмите планшет для клеточной культуры диаметром 100 мм и поместите на него 10 мл среды. Добавьте в планшет 1 мл клеточного раствора BEAS-2B.
  3. Поместите планшет в инкубатор (37 °C, 5%CO2) и дайте клеткам расти.
  4. Проверьте пластину через 24 часа, чтобы определить, достигли ли ячейки 80% слияния. При этом 80%-ное слияние относится к проценту поверхности, покрытой слипшимися клетками. Если нет, смените среду и дайте клеткам расти до тех пор, пока не будет достигнут уровень слияния 80%.

6. Подсчет клеток

  1. После того, как ячейки на пластине достигнут слияния 80%, удалите фильтрующий материал из пластины. Вымойте планшет 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
  2. Снимите PBS с пластины. Добавьте 2 мл трипсина в планшет и поместите его в инкубатор (37 °C, 5% CO 2) на2 минуты.
  3. Добавьте 2 мл среды в планшет и протрите его вверх и вниз, чтобы удалить ячейки с планшета. Перелейте раствор в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при концентрации 123 x g в течение 5 минут.
  4. Извлеките надосадочную жидкость из пробирки и добавьте 2 мл среды. Пропитывайте фильтрующий материал вверх и вниз, чтобы повторно диспергировать клетки.
  5. Используя пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 20 мкл трипанового синего, а затем 20 мкл клеточного раствора (соотношение трипанового синего к клеточному раствору 1:1).
  6. Поместите 10 мкл клеточной смеси на предметное стекло и поместите его на автоматический счетчик клеток. Подождите, пока экран не станет в фокусе, затем выберите Съемка.
  7. На экране отображаются номера ячеек в реальном времени и их жизнеспособность. Диапазон измерений простирается от 1 x 104-1 x 10до 7 ячеек.
  8. В качестве альтернативы можно подсчитать количество клеток вручную с помощью гемоцитометра.
    1. Для этого добавьте в гемоцитометр 15-20 мкл клеточного раствора, обработанного трипановым синим.
    2. Используйте вертикальный микроскоп с 10-кратной фокусировкой объектива на линиях сетки гемоцитометра.
    3. Подсчитайте количество клеток в четырех крайних квадратах и разделите число на четыре. Затем умножьте на 10 000, чтобы получить число живых клеток.
    4. Чтобы рассчитать жизнеспособность клеток, сложите количество живых и мертвых клеток, чтобы получить общее количество клеток, а затем разделите количество живых клеток на общее количество клеток.

7. Приготовление дозы ЗИФ-8

  1. Приготовьте исходный раствор ЗИФ-8 в концентрации 1 мг/мл. Для этого измерьте количество ZIF-8 и добавьте деионизированную (DI) воду к частицам до достижения концентрации 1 мг/мл.
  2. Прокачайте (установите ультразвуковой прибор в положение sonics) исходный раствор ZIF-8 в течение 2 мин с интервалом 30 с на водяной бане.
  3. Приготовьте различные дозы ZIF-8 для клеточного воздействия, рассчитав количество исходного раствора и модифицированной орлиной среды (DMEM) Дульбекко, необходимой для достижения желаемых доз, используя уравнениеC 1 V1 = C 2 V2. Дозы будут варьироваться от 0 до 950 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте были выбраны дозы 0 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 250 мкг/мл, 500 мкг/мл, 750 мкг/мл и 950 мкг/мл.

8. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC 50)

  1. После подсчета клеток засейте клетки BEAS-2B плотностью 4 x 104 кл/мл в 96-луночный планшет объемом 100 мкл/лунку.
    1. Для достижения плотности 4 x 104 клеток/мл используйте C 1 V1= C 2 V2для расчета количества клеточного раствора, необходимого для соединения со средой.
    2. Следите за тем, чтобы для каждой дозы оставались пустые лунки; оставить эти скважины пустыми до экспозиции ЗИФ-8.
  2. Поместите 96-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 и дайте клеткам вырасти до сливающегося монослоя в течение 24 часов.
  3. Извлеките среду из лунок и подвергните клетки BEAS-2B дозам ZIF-8 в диапазоне от 0 до 950 мкг/мл. Добавьте 100 мкл ZIF-8 в соответствующие лунки для заготовок и ячеек.
  4. Поместите 96-луночные планшеты обратно в инкубатор на выдержку 48 часов.
  5. После выдержки добавляют 10 мкл 4-[3-(4-идофенил)-2-(4-нитрофенил)-2Н-5-тетразолио]-1,3-бензолдисульфоната (WST-1) в каждую лунку (пустые и ячеечные) и инкубируют в течение 2 ч. Среда остается в колодцах; Соотношение 1:10 (реагент:среда).
  6. Считывание изменений поглощения на пластинчатом ридере с длиной волны 485 нм.
  7. Рассчитайте жизнеспособность ячейки с помощью программного обеспечения для определения значения IC 50 (см. раздел10 ).

9. Измерение импеданса электрической ячейки-подложки (ECIS)

  1. Используйте 96-луночный планшет (96W10idf) для выполнения ECIS-анализа. Пластина28 содержит межпальцевые соединительные электроды площадью около 4мм2.
  2. Во-первых, убедитесь, что все скважины считываются датчиками. Для этого поместите 96-луночную пластину на скважинную станцию и нажмите кнопку Setup .
  3. Если скважины подключены правильно, появится зеленый цвет; Все неподключенные скважины будут выделены красным цветом. Если возникнет такой случай, снимите и снова вставьте луночную пластину и снова нажимайте кнопку «Настройка» до тех пор, пока все скважины не будут показывать приемлемые « зеленые» показания.
  4. Стабилизируйте электроды в течение 40 минут с 200 мкл среды на лунку, чтобы предотвратить дрейф потенциала. Добавьте 200 мкл среды в каждую используемую лунку, а затем поместите 96-луночную пластину на станцию ECIS. Нажмите « Настройка/Проверка », чтобы убедиться, что пластина правильно подключена. Нажмите « Стабилизировать».
  5. После завершения стабилизации снимите пластину со станции и удалите среду из каждой лунки.
  6. Засейте клетки BEAS-2B плотностью 4 x 104 клетки/мл, объемом 100 мкл на лунку, в лунки, содержащие клетки, и поместите планшет на станцию ECIS в инкубаторе.
  7. На мониторе нажмите « Проверить », чтобы определить, что все электроды считываются датчиками на станции.
  8. Настройте измерение хода времени, выбрав Multiple Freq/Time (MFT). Программа будет измерять каждую скважину на семи различных частотах.
  9. Нажмите кнопку «Пуск» и подождите 24 часа, чтобы клетки могли образовать сливающийся монослой.
  10. Через 24 ч лунки, содержащие клетки, будут проявлять повышенное сопротивление на мониторе. Это показатель того, что клетки прикрепились к электродам.
  11. Нажмите кнопку Пауза на мониторе, чтобы остановить сбор данных.
  12. Установите дозы ZIF-8 на уровне, выше и ниже расчетного значения IC50 , выполнив действия, описанные в разделе 7 выше.
  13. Подвергните наночастицы ZIF-8 соответствующим пустым и ячеистым лункам объемом 100 мкл на лунку и поместите 96-луночную пластину обратно на станцию.
  14. Нажмите « Проверить » еще раз на мониторе, чтобы убедиться, что датчики считывают показания всех электродов. Нажмите « Возобновить » и дайте системе поработать в течение 72 часов, чтобы отслеживать поведение и привязанность клетки.
  15. После завершения сбора данных нажмите « Готово » на мониторе. Чтобы сохранить файл, нажмите «Файл» > «Сохранить как». Сохраните данные в виде файла электронной таблицы.
  16. Чтобы получить альфа-параметры, нажмите на Model. Во всплывающем окне нажмите «Колодец только для мультимедиа», затем выберите колодец, в котором есть только мультимедиа.
  17. Нажмите на Set Ref. На мониторе нажмите « Найти».
  18. Если скважина, показанная в системе, не совпадает с той, что была выбрана, повторите шаг 9.16.
  19. Нажмите « Установить». Нажмите на Fit T-Range , чтобы определить диапазон времени, необходимый для сбора данных.
  20. Пока он обрабатывается, нажмите на Alpha. Когда система завершит анализ, нажмите « Сохранить RbA » и сохраните его как файл электронной таблицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству ECIS, которое можно найти на веб-сайте производителя38.

10. Анализ данных

  1. СЭМ
    1. Откройте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы проанализировать изображения РЭМ. Нажмите кнопку Файл > открыть, а затем выберите изображение для анализа.
    2. Нажмите на Image > Введите > 8 бит, чтобы преобразовать изображение в оттенки серого для выполнения пороговой операции.
    3. Откалибруйте измерение расстояния от пикселей до микрон. Щёлкните по инструменту «Прямая линия » и обведите длину каждой частицы, которую нужно измерить.
    4. Нажмите кнопку «Анализ», а затем «Задать масштаб». Известное расстояние будет установлено равным длине масштабной линейки на изображении SEM. Известная единица длины будет задана в микронах. Установите флажок «Глобальный» и нажмите «ОК».
    5. Нажмите на инструмент « Прямая линия » и обведите диаметр частицы, затем выберите «Анализ и измерение». Запишите результат длины.
    6. Повторите то же самое для всех собранных изображений. Усредните все диаметры, по крайней мере, от 60 частиц для подходящей статистической оценки.
  2. ЭДХ
    1. Усредните все весовые проценты каждого элемента вместе со всеми собранными изображениями (см. раздел EDX выше).
    2. С помощью электронной таблицы постройте гистограмму каждого элемента по оси X и их средний процентный вес элемента по оси y.
  3. ИК50
    1. Усредните пустые лунки и усредните дозовые лунки для каждой репликации.
    2. Рассчитайте скорректированную пустоту, вычитая контрольное пустое среднее значение из среднего значения пустой дозы. Рассчитайте истинное значение ячейки для каждой дозы, вычитая скорректированную пустоту из среднего значения дозы.
    3. Вычтите скорректированное пустое значение для каждой дозы из среднего контрольного значения. Рассчитайте жизнеспособность клеток каждой дозы, используя уравнение: жизнеспособность клеток = (истинное значение клеток/(контрольное значение - скорректированное пустое значение)) x 100.
    4. Повторите это для всех остальных репликаций.
    5. Усредните жизнеспособность клеток для каждой репликации, чтобы получить окончательную жизнеспособность клеток для каждой дозы.
    6. В программном обеспечении выберите вкладку XY на экране.
    7. Введите значения концентрации (дозы) в столбец X и жизнеспособность клеток (%) от каждой дозы в столбец Y.
    8. Преобразуйте значения X , нажав кнопку Анализ > Преобразовать > ОК и Преобразовать X = Log(X)).
    9. Нормализуйте значения Y, выбрав лист « Преобразованные данные », щелкнув « Анализ», а затем выбрав «Нормализовать».
    10. Выберите таблицу данных Normalize of Transform (Нормализация преобразования ), щелкните Analyze ( Analyze) и выберите Nonlinear Regression (Curve Fit)). Выберите Dose-Response-Inhibition (Доза-реакция-ингибирование ) и нажмите Log(Inhibitor) Vs. Response-Variable Slope (четыре параметра)). Нажмите кнопку ОК , чтобы просмотреть результаты.
  4. ECIS
    1. Возьмите из электронной таблицы столбцы сопротивления (Ом) для каждой репликации (пустые лунки и дозовые лунки) и усредните их вместе с частотой 4 000 Гц. Эта частота позволяет оценить межклеточный контакт38.
    2. Рассчитайте скорректированное сопротивление, вычитая усредненный бланк из усредненной дозы для каждого повтора. Усредните скорректированную резистентность для репликаторов для каждой дозы.
    3. Повторите те же шаги для альфа-значений, чтобы вычислить средний альфа-параметр. Постройте график по оси X как время (h), а по оси Y — как средние значения сопротивления/альфа для каждого значения дозы.

11. Статистический анализ

  1. СЭМ
    1. Выполните стандартное отклонение в файле электронной таблицы, где были рассчитаны средние диаметры частиц ZIF-8.
    2. Используя функцию STDEV в электронной таблице, выделите данные 60 частиц и нажмите Enter. Постройте график стандартного отклонения для каждого вычисленного среднего диаметра.
  2. ЭДХ
    1. Аналогично SEM (шаги 11.1.1-11.1.2), рассчитайте стандартное отклонение для каждого среднего элементного состава с помощью функции СТАНДОТКЛОН в электронной таблице. Постройте график стандартных отклонений для каждого среднего элементного состава.
  3. ИК50
    1. Откройте программное обеспечение, используемое для расчета IC50 , и нажмите « Сгруппированный технический паспорт».
    2. Введите дозы ZIF-8 в строки, помеченные как Группа А, Группа В и т. д. Введите среднюю жизнеспособность клеток для каждой дозы и реплицируйте в столбце, соответствующем дозе ZIF-8.
    3. Нажмите « Анализ» и в разделе «Анализ столбцов» выберите «Односторонний ANOVA (а также непараметрический или смешанный)».
    4. На вкладке «Экспериментальный дизайн» выберите «Без сопоставления» или «Сопряжение». В разделе Gaussian Distribution Of Residuals (Распределение невязок по Гауссу) выберите Yes use ANOVA. Наконец, выберите «Да использовать обычный тест ANOVA» в разделе «Предполагать равные SD».
    5. На вкладке « Множественные сравнения» выберите «Сравнить среднее значение каждого столбца со средним значением контрольного столбца». Нажмите кнопку ОК , чтобы просмотреть результаты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя обычную in vitro модельную клеточную линию39 (BEAS-2B), это исследование было направлено на то, чтобы продемонстрировать осуществимость и применимость ECIS для оценки изменений в поведении клеток при воздействии лабораторно синтезированного MOF. Оценка этих изменений была дополнена анализом с помощью традиционных колориметрических анализов.

Сначала были оценены физико-химические характеристики системы для обеспечения воспроизводимости используемых методов, валидности полученных результатов и соответствующего обсуждения этих результатов. Например, анализ морфологии поверхности ZIF-8 проводился с помощью СЭМ; Изображения показали, что каркасы имеют морфологию ромбического додекаэдра40 и средний размер 62,87 нм ± 9,61 нм (рис. 1A). Элементный состав МОФ определяли методомEDX-спектроскопии. Результаты показали, что основной состав ZIF-8 состоит из C, N и Zn (т.е. состава имидазолатного линкера и иона металла, Zn16) (рис. 1B). Предыдущая рентгеновская дифракция показала, что кристаллические фазы ZIF-8 идентифицировали специфические пики на 10,33°, 12,8°, 14,7°, 16,5° и 18°, причем такие пики были отнесены к плоскостям (002), (112), (022), (013) и (222) соответственно 16,41.

Для предлагаемого скрининга поведения клеток определяли IC 50 (концентрация, в которой ZIF-8 ингибирует рост клеток на50 %)29. Для этого клетки подвергали воздействию ZIF-8 в течение 48 ч в дозах от 0 до 950 мкг/мл (рис. 2A). График «доза-реакция» облученных клеток показан на рисунке 2B, с последующим зарегистрированным IC50 35,7 мкг/мл. Кроме того, анализ выявил дозозависимую тенденцию жизнеспособности клеток при воздействии ZIF-8.

После определения IC50 был проведен ECIS-анализ. Вкратце, ECIS использовался в качестве стратегии скрининга в реальном времени BEAS-2B, подвергшегося воздействию ZIF-8 MOFs в IC50, а также ниже и выше этой концентрации, а именно 15,7 мкг/мл (C1), 35,7 мкг/мл (C2), 55,7 мкг/мл (C3) и 75,7 мкг/мл (C4) соответственно, при этом клетки подвергались воздействию в течение общего периода 72 ч. Предполагалось, что включение ECIS позволит в режиме реального времени определять изменения в покрытии клеток, морфологии и жизнеспособности. Результаты ECIS регистрировались в виде изменений резистентности и изменений в межклеточно-субстратных взаимодействиях, а именно альфа-параметра42.

Тренды резистентности показаны на рисунке 3А в виде изменений профилей клеток, обработанных ZIF-8, по сравнению с контрольной группой (черная линия) (т.е. неэкспонированных клеток). В частности, анализ показал, что лунки, содержащие клетки на золотых электродах, подвергшихся воздействию доз С2-С4, показали первоначальное небольшое увеличение сопротивления сразу после воздействия клеток на каркасы (все относительно контрольных [т.е. необлученных клеток]). За этими первоначальными изменениями впоследствии последовало резкое снижение зарегистрированных резистенций, причем такое снижение преобладало в период между 6-8 часами после воздействия (рис. 3А). Полная потеря резистентности наблюдалась через 14-18 ч от времени экспозиции. Ячейки, подвергшиеся воздействию доз ниже значения IC50 , демонстрировали сопротивления, как и лунки с контрольными ячейками, примерно до 16-18 ч после воздействия, когда появляются потери сопротивления. Также при клеточном воздействии наблюдалось непрерывное возмущение сигнала скважин, используемых в экспериментах. Эти пертурнаменты сохранялись при анализе альфа-параметра (рис. 3B), и этот анализ также показал, что облученные клетки изменяют свои клеточно-субстратные взаимодействия с профилями, аналогичными резистентным. Более того, такие изменения зависели от времени воздействия и дозы, использованной при таком воздействии.

Figure 1
Рисунок 1: Изображение РЭМ и средний элементный состав частиц ZIF-8. (A) Репрезентативное изображение частиц ZIF-8. (B) Средний элементный состав частиц ZIF-8 (± столбцов стандартного отклонения [SD]). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Жизнеспособность клеток. (A) Схема клеточной обработки (создана с помощью Biorender.com). (B) жизнеспособность клеток BEAS-2B, подвергшихся воздействию частиц ZIF-8 в дозах от 0 до 950 мкг/мл; этот анализ был использован для определения IC50 (± SD баров; ***p = 0,0001 и **** p < 0,0001 относительно контроля). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативная клеточная резистентность и изменения клеточного прикрепления. (A) Репрезентативная клеточная резистентность клеток BEAS-2B, подвергшихся воздействию частиц ZIF-8 ниже, при и выше концентрации IC50. (B) Изменения клеточного прикрепления (т.е. изменения альфа-параметра) клеток BEAS-2B при воздействии частиц ZIF-8 ниже и выше концентрации IC50. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Предыдущий анализ показал, что ECIS может быть использован для оценки поведения клеток, подвергшихся воздействию аналитов (т.е. углеродных нанотрубок35, лекарств43 или наноглин16). Кроме того, Stueckle et al. использовали ECIS для оценки токсичности клеток BEAS-2B, подвергшихся воздействию наноглины и их побочных продуктов, и обнаружили, что клеточное поведение и прикрепление зависели от физико-химических характеристиктаких материалов. В данной работе мы предложили определить возможные изменения клеток BEAS-2B в ответ на воздействие MOF, чтобы, таким образом, внести свой вклад в объем знаний, направленных на дифференциацию любых вредных эффектов ZIF-8 на клеточные системы in vitro, и все это с высокой пропускной способностью и в режиме реального времени.

Анализ впервые позволил оценить свойства каркаса, чтобы, таким образом, помочь соотнести изменения в клеточном поведении с физико-химическими свойствами испытуемыхMOFs 44. В частности, при клеточном воздействии MOFs с регулярной геометрией аналогичного элементного состава (см. результаты выше) анализ показал изменения в клеточном поведении, предположительно в результате поглощения каркасов и клеточной деградации их профиля. В частности, с точки зрения поглощения, предыдущий анализ токсичности гидрофобных материалов, таких как этот фреймворк, показал, что когда такие материалы подвергаются воздействию клеток, их поглощение более разрушительно для клеточной мембраны, чем поглощение их гидрофильных аналогов, предположительно из-за их способности удалять липиды из структурного бислоя мембраны16. 45 во время их клеточной транслокации, что приводит к мембранным дисфункциям или нарушениям плазматической мембраны46,47. В частности, было показано, что удаление липидов приводит к изменениям целостности мембраны, клеточной сигнализации48 и увеличению клеточного поглощения49, с обратной стороной эффектов функции клеток. Например, Farcal et al. продемонстрировали, что гидрофобный наноматериал TiO2 обладает повышенным цитотоксическим эффектом по сравнению со своим гидрофильным аналогом в открытых альвеолярных макрофагах50. Кроме того, Wagner et al. продемонстрировали, что гидрофобный ZIF-8 вызывает большее разрушение клеток BEAS-2B по сравнению с гидрофильным MIL-16016.

Зарегистрированные изменения в поведении клеток, по-видимому, обусловлены нарушениями взаимодействия клетки с субстратом26 и/или жизнеспособности клетки и пролиферации16 на электроды в результате воздействия на клетку выбранного каркаса. Например, Wagner et al. оценили аналогичные параметры в клетках, подвергшихся воздействию наноглины. Авторы обнаружили, что в течение 72-часовых экспериментов наблюдалась полная потеря взаимодействия клетки с субстратом. Кроме того, авторы продемонстрировали нестационарный эффект на жизнеспособность и пролиферацию клеток, когда BEAS-2B подвергались воздействию выбранных ими наноглин26. Несмотря на то, что тестируемые здесь частицы являются MOF, возможная расширенная связь с эффектами, наблюдаемыми для наноглин, возможна, поскольку некоторые физико-химические характеристики этих частиц (а именно размер, гидрофобность и состав) аналогичны таковым у MOFs. Кроме того, Stueckle et al. также продемонстрировали зависящее от времени и лечения клеточное поведение, когда наноглины подвергались воздействию иммортализованных клеток BEAS-2B. Другие исследователи продемонстрировали, что ZIF-8 в дозе 100 мкг/мл приводит к полной потере клеток BEAS-2B в клеточном монослое и жизнеспособности клеток, предположительно из-за изменений в межклеточно-субстратных взаимодействиях16. Однако отмечается, что в таких исследованиях частицы ZIF-8 были получены в различных условиях синтеза (т.е. 10 мин против 24 ч, использованных в этом исследовании), причем такие условия синтеза впоследствии приводили к различным формам/морфологиям каркасов, что подтверждало предыдущие выводы. Это показывает, что время реакции6, температура2 и растворитель44 , используемые во время синтеза частиц, влияют на их форму, размер и профили состава, а затем приводят к дифференциальным эффектам и поведению в подвергшихся воздействию клетках.

Анализ также показал, что клетки, подвергшиеся воздействию доз ZIF-8 ниже значения IC50, демонстрировали резистентность, аналогичную той, что наблюдалась в контрольной группе, по-видимому, потому, что такие дозы не были достаточно значительными, чтобы индуцировать наблюдаемую ECIS трансформацию клеток в условиях и временных рамках, в которых проводились эти эксперименты. Однако при дозах выше IC50 наблюдалась полная потеря клеточной резистентности и только в течение нескольких часов после воздействия, скорее всего, из-за изменений жизнеспособности клеток и индуцированных возможных изменений в клеточно-субстратных взаимодействиях16 (рис. 3А). Эти утверждения подтверждаются предыдущими исследованиями, которые показали, что нежизнеспособные клетки изменяют свою форму и отделяются от субстратов. Например, Verma et al. использовали метод измерения импеданса в реальном времени для оценки цитотоксичности наноглин в клеточной линии альвеолярного эпителия человека (A549). Показано, что наноглины тромбоцитарного типа вызывают увеличение количества отслоившихся и деформированных клеток по сравнению с наноглинами трубчатого типа51. Кроме того, Xiao et al. продемонстрировали, что цитоскелет фибробластических клеток V79 был скомпрометирован при воздействии хлорида кадмия из-за притока воды, внеклеточных ионов и цитотоксических химических веществ из питательной среды. Изменения в цитоскелете клетки приводили к потере межклеточно-субстратных взаимодействий. Кроме того, при воздействии хлорида бензалкония на клетки V79 наблюдалось значительное снижение клеточной резистентности из-за повреждения клеточной мембраны, вызванного воздействием.

Также изменения резистентности могут быть обусловлены клеточными реакциями на физико-химические характеристики ZIF-8. В частности, ЗИФ-8 является гидрофобным каркасом; Предыдущий анализ показал, что гидрофобность может вызвать повышение токсичности16. Ранее также было показано, что ионы металлов, такие как Zn, вызывают более высокую степень токсичности по сравнению с другими металлами, такими как Zr иFe1 , а именно, возможно, способствуя более высокой гибели клеток.

Далее было показано, что во всех клетках регистрировалось первоначальное снижение резистентности сразу после воздействия, за которым последовало последующее повышение. Eldawud et al. продемонстрировали аналогичные эффекты, когда одностенные углеродные нанотрубки подвергались воздействию клеток BEAS-2B. Авторы интерпретировали увеличение клеточного сопротивления как обусловленное тем, что ячейки BEAS-2B преодолевают возмущения, вызванные воздействием материалов, и впоследствии восстанавливают свою целостность18 , устраняя при этом дрейф электродов28, что, таким образом, обеспечивает воспроизводимость анализа данных (см. справочник ECIS).

Несмотря на то, что это исследование показало, что ECIS может быть ценным инструментом для использования в скрининге поведения клеток, особенно из-за высокой производительности, рекомендуется, чтобы этот метод не заменял анализы в один момент времени, когда требуется полная картина вредной оценки материала. В частности, одноточечный анализ может в дальнейшем позволить оценить трансформацию клеток на их генетическом уровне 45,53, как показано Eldawud et al., например, для клеток BEAS-2B, подвергшихся воздействию наноалмазов и через флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS)45.   Yu et al., также использовали FACS для оценки клеток рака толстой кишки человека (HCT0116), подвергшихся воздействию модифицированных гиалуроновой кислотой мезопористых наночастиц кремнезема (HA-MSN)54.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что путь изменения зависит от физико-химических характеристик MOF, а также от времени и дозирования таких структур, используемых при воздействии. Результаты и методы, описанные в настоящем документе, еще раз подчеркивают важность измерений в режиме реального времени и их преимущества для понимания изменений клеточных профилей. Они потенциально могут быть дополнены дополнительными биохимическими анализами для оценки механизма токсичности, что приведет к безопасным по дизайну стратегиям MOFs, которые не оказывают вредного воздействия на поведение клеток, регистрируемых как клеточное прикрепление, межклеточные взаимодействия или межклеточные взаимодействия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в данной работе.

Acknowledgments

Эта работа была частично профинансирована программой T32 Национального института общих медицинских наук (NIGMS) (T32 GM133369) и Национальным научным фондом (NSF 1454230). Кроме того, выражается признательность за помощь и поддержку со стороны WVU Shared Research Facilities и Applied Biophysics.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)  Roche 5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25255-056
100 mm plates Corning 430167
1300 Series A2 biofume hood Thermo Scientific 323TS
2510 Branson bath sonicator Process Equipment & Supply, Inc.  251OR-DTH
2-methylimidazole, 97% Alfa Aesar 693-98-1
5 mL sterile microtube Argos Technologies T2076S-CA
50 mL  tubes  Falcon 352098
96W10idf well plates Applied Biophysics  96W10idf PET
96-well plates Fisherbrand FB012931
Biorender Biorender N/A
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess II FL automated cell counter Life Technologies C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater Denton Vacuum N/A
Dimethly sulfoxide  Corning 25-950-CQC
DPBS/Modified Cytiva SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium Corning 10-014-CV
ECIS-ZΘ Applied Biophysics  ABP 1129
Excel Microsoft Version 2301
Falcon tubes (15 mL) Corning 352196
Fetal bovine serum Gibco 16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader BMG LABTECH 413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0) GraphPad Software, LLC Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray  Hitachi High-Technologies Corporation S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells American Type Culture Collection CRL-9609
Isotemp freezer Fisher Scientific 
Methanol, 99% Fisher Chemical 67-56-1
Parafilm sealing film The Lab Depot HS234526A
Penicillin/Steptomycin Gibco 15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge  Thermo Scientific 75004220
Sorvall T 6000B DU PONT  T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS MP Biomedicals, LLC 1691049
Vacuum Chamber Belart 999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure Acros Organic 101-96-18-9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tamames-Tabar, C., et al. Cytotoxicity of nanoscaled metal-organic frameworks. Journal of Materials Chemistry. B. 2 (3), 262-271 (2014).
  2. Lin, W. X., et al. Low cytotoxic metal-organic frameworks as temperature-responsive drug carriers. ChemPlusChem. 81 (8), 804-810 (2016).
  3. Vasconcelos, I. B., et al. Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF-8. RSC Advances. 2 (25), 9437-9442 (2012).
  4. Yang, B. C., Shen, M., Liu, J. Q., Ren, F. Post-synthetic modification nanoscale metal-organic frameworks for targeted drug delivery in cancer cells. Pharmaceutical Research. 34 (11), 2440-2450 (2017).
  5. Lucena, M. A. M., et al. Application of the metal-organic framework Eu(BTC) as a luminescent marker for gunshot residues: A synthesis, characterization, and toxicity study. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (5), 4684-4691 (2017).
  6. Kayal, S., Sun, B. C., Chakraborty, A. Study of metal-organic framework MIL-101(Cr) for natural gas (methane) storage and compare with other MOFs (metal-organic frameworks). Energy. 91, 772-781 (2015).
  7. Gutov, O. V., et al. Water-stable zirconium-based metal-organic framework material with high-surface area and gas-storage capacities. Chemistry. 20 (39), 12389-12393 (2014).
  8. Ghorbanloo, M., Safarifard, V., Morsali, A. Heterogeneous catalysis with a coordination modulation synthesized MOF: morphology-dependent catalytic activity. New Journal of Chemistry. 41 (10), 3957-3965 (2017).
  9. Valvekens, P., et al. Base catalytic activity of alkaline earth MOFs: a (micro) spectroscopic study of active site formation by the controlled transformation of structural anions. Chemical Science. 5 (11), 4517-4524 (2014).
  10. Taylor, K. M. L., Rieter, W. J., Lin, W. B. Manganese-based nanoscale metal-organic frameworks for magnetic resonance imaging. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14358-14359 (2008).
  11. Taylor-Pashow, K. M. L., Della Rocca, J., Xie, Z. G., Tran, S., Lin, W. B. Postsynthetic modifications of iron-carboxylate nanoscale metal-organic frameworks for imaging and drug delivery. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14261-14263 (2009).
  12. Kundu, T., et al. Mechanical downsizing of a gadolinium(III)-based metal-organic framework for anticancer drug delivery. Chemistry. 20 (33), 10514-10518 (2014).
  13. Orellana-Tavra, C., et al. Drug delivery and controlled release from biocompatible metal-organic frameworks using mechanical amorphization. Journal of Materials Chemistry. B. 4 (47), 7697-7707 (2016).
  14. Su, H. M., et al. A highly porous medical metal-organic framework constructed from bioactive curcumin. Chemical Communications. 51 (26), 5774-5777 (2015).
  15. Gandara-Loe, J., et al. Metal-organic frameworks as drug delivery platforms for ocular therapeutics. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (2), 1924-1931 (2019).
  16. Wagner, A., et al. Toxicity screening of two prevalent metal organic frameworks for therapeutic use in human lung epithelial cells. International Journal of Nanomedicine. 14, 7583-7591 (2019).
  17. Chen, G. S., et al. In vitro toxicity study of a porous iron(III) metal-organic framework. Molecules. 24 (7), 1211 (2019).
  18. Eldawud, R., Wagner, A., Dong, C. B., Rojansakul, Y., Dinu, C. Z. Electronic platform for real-time multi-parametric analysis of cellular behavior post-exposure to single-walled carbon nanotubes. Biosensors & Bioelectronics. 71, 269-277 (2015).
  19. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment: Limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (2), 370-377 (2009).
  20. Lucena, F. R. S., et al. Induction of cancer cell death by apoptosis and slow release of 5-fluoracil from metal-organic frameworks Cu-BTC. Biomedicine & Pharmacotherapy. 67 (8), 707-713 (2013).
  21. Orellana-Tavra, C., et al. Tuning the endocytosis mechanism of Zr-based metal-organic frameworks through linker functionalization. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (41), 35516-35525 (2017).
  22. Zucker, R. M., Ortenzio, J. N. R., Boyes, W. K. Characterization, detection, and counting of metal nanoparticles using flow cytometry. Cytometry. Part A. 89 (2), 169-183 (2016).
  23. Robson, A. L., et al. Advantages and limitations of current imaging techniques for characterizing liposome morphology. Frontiers in Pharmacology. 9, 80 (2018).
  24. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  25. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  26. Wagner, A., et al. Toxicity evaluations of nanoclays and thermally degraded byproducts through spectroscopical and microscopical approaches. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861, 3406-3415 (2017).
  27. Wagner, A., et al. Early assessment and correlations of nanoclay's toxicity to their physical and chemical properties. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (37), 32323-32335 (2017).
  28. Wagner, A., et al. Incineration of nanoclay composites leads to byproducts with reduced cellular reactivity. Scientific Reports. 8 (1), 10709 (2018).
  29. Zhao, F., Klimecki, W. T. Culture conditions profoundly impact phenotype in BEAS-2B, a human pulmonary epithelial model. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 945-951 (2015).
  30. Wu, S. X., Wang, W. H., Fang, Y. Z., Kong, X. J., Liu, J. H. Efficient Friedel-Crafts acylation of anisole over silicotungstic acid modified ZIF-8. Reaction Kinetics Mechanisms and Catalysis. 122, 357-367 (2017).
  31. Shu, F. P., et al. Fabrication of a hyaluronic acid conjugated metal organic framework for targeted drug delivery and magnetic resonance imaging. RSC Advances. 8 (12), 6581-6589 (2018).
  32. Shi, Z. Q., et al. FA-PEG decorated MOF nanoparticles as a targeted drug delivery system for controlled release of an autophagy inhibitor. Biomaterials Science. 6 (10), 2582-2590 (2018).
  33. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).
  34. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  35. Eldawud, R., et al. Carbon nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and fate. Nanoimpact. 9, 72-84 (2018).
  36. An, Y., Jin, T. Y., Zhang, F., He, P. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) for profiling cytotoxicity of cigarette smoke. Journal of Electroanalytical Chemistry. 834, 180-186 (2019).
  37. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  38. Applied Biophysics, Allied Biophysics. , Available from: https://biophysics.com (2023).
  39. Park, Y. H., Kim, D., Dai, J., Zhang, Z. Human bronchial epithelial BEAS-2B cells, an appropriate in vitro model to study heavy metals induced carcinogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 287 (3), 240-245 (2015).
  40. Yang, F., et al. Morphological map of ZIF-8 crystals with five distinctive shapes: Feature of filler in mixed-matrix membranes on C3H6/C3H8 separation. Chemistry of Materials. 30 (10), 3467-3473 (2018).
  41. Rose, O. L., et al. Thin films of metal-organic framework interfaces obtained by laser evaporation. Nanomaterials. 11 (6), 1367 (2021).
  42. Stueckle, T. A., et al. Impacts of organomodified nanoclays and their incinerated byproducts on bronchial cell monolayer integrity. Chemical Research in Toxicology. 32 (12), 2445-2458 (2019).
  43. Eldawud, R., et al. Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1864 (11), 129683 (2020).
  44. Zhuang, J., et al. Optimized metal-organic-framework nanospheres for drug delivery: Evaluation of small-molecule encapsulation. ACS Nano. 8 (3), 2812-2819 (2014).
  45. Eldawud, R., et al. Combinatorial approaches to evaluate nanodiamond uptake and induced cellular fate. Nanotechnology. 27 (8), 085107 (2016).
  46. Houthaeve, G., De Smedt, S. C., Braeckmans, K., De Vos, W. H. The cellular response to plasma membrane disruption for nanomaterial delivery. Nano Convergence. 9 (1), 6 (2022).
  47. Otero-Gonzalez, L., Sierra-Alvarez, R., Boitano, S., Field, J. A. Application and validation of an impedance-based real time cell analyzer to measure the toxicity of nanoparticles impacting human bronchial epithelial cells. Environmental Science & Technology. 46 (18), 10271-10278 (2012).
  48. Ibarguren, M., Lopez, D. J., Escriba, P. V. The effect of natural and synthetic fatty acids on membrane structure, microdomain organization, cellular functions and human health. Biochimica et Biophysica Acta. 1838 (6), 1518-1528 (2014).
  49. Nor, Y. A., et al. Shaping nanoparticles with hydrophilic compositions and hydrophobic properties as nanocarriers for antibiotic delivery. ACS Central Science. 1 (6), 328-334 (2015).
  50. Farcal, L., et al. Comprehensive in vitro toxicity testing of a panel of representative oxide nanomaterials: First steps towards an intelligent testing strategy. PLoS One. 10 (5), e0127174 (2015).
  51. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
  52. Xiao, C. D., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: Concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  53. Coyle, J. P., et al. Carbon nanotube filler enhances incinerated thermoplastics-induced cytotoxicity and metabolic disruption in vitro. Particle and Fibre Toxicology. 17 (1), 40 (2020).
  54. Yu, M. H., et al. Hyaluronic acid modified mesoporous silica nanoparticles for targeted drug delivery to CD44-overexpressing cancer cells. Nanoscale. 5 (1), 178-183 (2013).

Tags

Биоинженерия выпуск 195
Электрическое зондирование ячейки-подложки для оценки токсикологических профилей металлоорганического каркаса в режиме реального времени
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, O. L., Arnold, M., Dinu, C. Z. … More

Rose, O. L., Arnold, M., Dinu, C. Z. Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles. J. Vis. Exp. (195), e65313, doi:10.3791/65313 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter