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Bioengineering

Détection électrique cellule-substrat pour l’évaluation en temps réel des profils toxicologiques des structures organométalliques

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65313
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

Summary

L’étude suivante évalue le profil toxicologique d’un cadre métallo-organique sélectionné à l’aide de la détection d’impédance cellule-substrat électrique (ECIS), une technique de criblage à haut débit en temps réel.

Abstract

Les structures organométalliques (MOF) sont des hybrides formés par la coordination d’ions métalliques et de liants organiques dans des solvants organiques. La mise en œuvre des MOF dans les applications biomédicales et industrielles a suscité des inquiétudes quant à leur sécurité. Ici, le profil d’un MOF sélectionné, un cadre d’imidazole zéolitique, a été évalué lors de l’exposition à des cellules épithéliales pulmonaires humaines. La plate-forme d’évaluation était une technique en temps réel (c’est-à-dire la détection d’impédance cellule-substrat électrique [ECIS]). Cette étude identifie et discute certains des effets délétères du MOF sélectionné sur les cellules exposées. De plus, cette étude démontre les avantages de l’utilisation de la méthode en temps réel par rapport à d’autres tests biochimiques pour des évaluations cellulaires complètes. L’étude conclut que les changements observés dans le comportement cellulaire pourraient faire allusion à une éventuelle toxicité induite lors de l’exposition à des MOF de différentes caractéristiques physico-chimiques et au dosage de ces cadres utilisés. En comprenant les changements dans le comportement des cellules, on entrevoit la possibilité d’améliorer les stratégies de sécurité dès la conception des MOF à utiliser pour des applications biomédicales en adaptant spécifiquement leurs caractéristiques physico-chimiques.

Introduction

Les structures organométalliques (MOF) sont des hybrides formés par la combinaison d’ions métalliques et de liants organiques 1,2 dans des solvants organiques. En raison de la variété de ces combinaisons, les MOF possèdent une diversité structurelle3, une porosité accordable, une stabilité thermique élevée et des surfaces élevées 4,5. De telles caractéristiques en font des candidats attrayants dans une variété d’applications, du stockage de gaz 6,7 à la catalyse8,9, et des agents de contraste 10,11 aux unités d’administration de médicaments12,13. Cependant, la mise en œuvre des MOF dans de telles applications a soulevé des inquiétudes quant à leur sécurité pour les utilisateurs et l’environnement. Des études préliminaires ont montré, par exemple, que la fonction et la croissance cellulaires changent lors de l’exposition des cellules à des ions métalliques ou à des liants utilisés pour la synthèse du MOF 1,14,15. Par exemple, Tamames-Tabar et al. ont démontré que le MOF ZIF-8, un MOF à base de Zn, entraînait davantage de changements cellulaires dans une lignée cellulaire de cancer du col de l’utérus humain (HeLa) et une lignée cellulaire de macrophages de souris (J774) par rapport aux MOF à base de Zr et de Fe. De tels effets étaient vraisemblablement dus au composant métallique de ZIF-8 (c’est-à-dire Zn), qui pourrait potentiellement induire l’apoptose cellulaire lors de la désintégration de la structure et de la libération d’ions Zn1. De même, Gandara-Loe et al. ont démontré que HKUST-1, un MOF à base de Cu, provoquait la plus forte réduction de la viabilité des cellules de rétinoblastome de souris lorsqu’il était utilisé à des concentrations de 10 μg/mL ou plus. Cela était probablement dû à l’ion métallique Cu incorporé lors de la synthèse de cette armature qui, une fois libéré, pouvait induire un stress oxydatif dans les cellules exposées15.

De plus, l’analyse a montré que l’exposition à des MOF ayant des caractéristiques physico-chimiques différentes pouvait entraîner des réponses variables des cellules exposées. Par exemple, Wagner et al. ont démontré que ZIF-8 et MIL-160 (un cadre à base d’Al), utilisés dans l’exposition d’une cellule épithéliale bronchique humaine immortalisée, conduisaient à des réponses cellulaires dépendantes des propriétés physico-chimiques des cadres, à savoir l’hydrophobicité, la taille et les caractéristiques structurelles16. En complément, Chen et al. ont démontré qu’une concentration de 160 μg/mL de MIL-100(Fe) exposée à des cellules hépatiques normales humaines (HL-7702) entraînait la plus grande perte de viabilité cellulaire, probablement en raison de la composante métallique de ce cadre spécifique (c’est-à-dire Fe17).

Bien que ces études classent les effets délétères des MOF sur les systèmes cellulaires en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques et de leurs concentrations d’exposition, soulevant ainsi des préoccupations potentielles quant à la mise en œuvre d’un cadre, en particulier dans les domaines biomédicaux, la plupart de ces évaluations sont basées sur des tests colorimétriques à point temporel unique. Par exemple, il a été démontré que lorsque des dosages de (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromure) tétrazolium (MTT) et de sel de tétrazolium soluble dans l’eau (WST-1) étaient utilisés, ces réactifs biochimiques pouvaient conduire à des faux positifs lors de leurs interactions avec les particules auxquelles les cellules étaient également exposées18. Il a été démontré que le sel de tétrazolium et les réactifs rouges neutres possèdent une forte affinité d’adsorption ou de liaison sur les surfaces des particules, ce qui entraîne une interférence du signal de l’agent19. De plus, pour d’autres types de tests, tels que la cytométrie en flux, qui s’est déjà avérée être utilisée pour évaluer les changements dans les cellules exposées aux MOF20,21, il a été démontré que des problèmes majeurs doivent être contournés si l’on veut envisager une analyse viable des effets délétères des particules. En particulier, les plages de détection de la taille des particules, en particulier dans les populations mixtes comme celles offertes par les MOF ou les références des particules utilisées pour l’étalonnage avant les changements cellulaires, doivent être prises en compte22. Il a également été démontré que le colorant utilisé lors du marquage cellulaire pour de tels tests de cytométrie pouvait également interférer avec les nanoparticules auxquelles les cellules étaient exposées23.

L’objectif de cette étude était d’utiliser un test d’évaluation à haut débit en temps réel pour évaluer les changements de comportement des cellules lors de l’exposition à un MOF sélectionné. Les évaluations en temps réel peuvent aider à fournir des informations sur les effets dépendant du temps, en ce qui concerne les fenêtres d’exposition16. De plus, ils fournissent des informations sur les changements dans les interactions cellule-substrat, la morphologie cellulaire et les interactions cellule-cellule, ainsi que sur la façon dont ces changements dépendent des propriétés physico-chimiques des matériaux d’intérêt et des temps d’exposition24,25 respectivement.

Pour démontrer la validité et l’applicabilité de l’approche proposée, des cellules d’épithélium bronchique humain (BEAS-2B), ZIF-8 (un cadre hydrophobe de l’imidazolate zéolitique16) et la détection d’impédance cellule-substrat électrique (ECIS) ont été utilisées. Les cellules BEAS-2B représentent un modèle d’exposition pulmonaire 26 et ont déjà été utilisées pour évaluer les changements lors de l’exposition des cellules à des nanoargiles et à leurs sous-produits dégradés thermiquement26,27,28, ainsi que pour évaluer la toxicité de nanomatériaux, tels que les nanotubes de carbone à paroi unique (SWCNT)18. De plus, ces cellules sont utilisées depuis plus de 30 ans comme modèle pour la fonction épithéliale pulmonaire29. Le ZIF-8 a été choisi en raison de sa large mise en œuvre dans la catalyse30 et en tant qu’agent de contraste 31 pour la bio-imagerie et l’administration de médicaments32, et donc pour le potentiel accru d’exposition pulmonaire lors de telles applications. Enfin, l’ECIS, la technique non invasive en temps réel, a déjà été utilisée pour évaluer les changements dans l’adhérence, la prolifération, la motilité et la morphologie cellulaires 16,26 à la suite d’une variété d’interactions entre les analytes (matériaux et médicaments) et les cellules exposées en temps réel 16,18,28. ECIS utilise un courant alternatif (AC) pour mesurer l’impédance des cellules immobilisées sur des électrodes en or, les changements d’impédance donnant un aperçu des changements de résistance et de capacité à l’interface cellule-substrat d’or, de la fonction barrière induite par les interactions cellule-cellule et de la couverture de la couche surcellulaire de ces électrodes en or33,34. L’utilisation de l’ECIS permet d’effectuer des mesures quantitatives à l’échelle nanométrique de manière non invasive et en temps réel26,34.

Cette étude évalue et compare la simplicité et la facilité d’évaluation des changements induits par le MOF dans le comportement cellulaire en temps réel avec des évaluations de test en un seul point. Une telle étude pourrait être extrapolée pour évaluer les profils cellulaires en réponse à l’exposition à d’autres particules d’intérêt, permettant ainsi des tests de particules sûrs dès la conception et une aide ultérieure à la mise en œuvre. De plus, cette étude pourrait compléter les tests génétiques et cellulaires qui sont des évaluations en un seul point. Cela pourrait conduire à une analyse plus éclairée des effets délétères des particules sur la population cellulaire et pourrait être utilisé pour cribler la toxicité de ces particules à haut débit16,35,36.

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Protocol

1. Synthèse du ZIF-8

  1. Pour les besoins de cet exemple, utilisez un rapport de masse de 1:10:100 (métal:linker:solvant) pour synthétiser le ZIF-8. Pour cela, mesurez le nitrate de zinc hexahydraté et enregistrez la mesure. Utilisez l’exemple de rapport massique pour calculer la quantité nécessaire pour le linker, le 2-méthylimidazole et le solvant (c’est-à-dire le méthanol).
  2. Placez le nitrate de zinc hexahydraté et le linker dans deux flacons en verre différents. Ajouter la moitié de la quantité calculée de méthanol au nitrate de zinc hexahydraté et l’autre moitié au linker. Laisser chaque solution se dissoudre.
  3. Combinez les deux solutions (c’est-à-dire les solutions contenant respectivement le métal et le liant). Placez le récipient avec la solution combinée pour la réaction sur une plaque d’agitation et remuez à 700 tr/min pendant 24 h à température ambiante (RT).

2. La collection ZIF-8

  1. Une fois la réaction ci-dessus terminée (c’est-à-dire après 24 h), placez la solution dans des tubes à centrifuger de 50 ml et centrifugez à 3 075 x g pendant 5 min (utilisez des quantités égales et équilibrez le rotor). Retirez tous les surnageants des tubes centrifugés.
  2. Ajouter du méthanol (5 à 15 ml) dans les tubes à centrifuger et redisperser les particules.
  3. Répétez les étapes de centrifugation et de lavage au moins deux à quatre fois de plus. Après le dernier lavage, déchargez le surnageant.
    REMARQUE: Les étapes de lavage éliminent toutes les espèces non précipitées.
  4. Retirez les couvercles des tubes et placez du ruban parafilm sur le dessus; Par la suite, percez des trous dans le parafilm. Placez le(s) tube(s) contenant l’échantillon dans une chambre à vide à RT pour qu’il sèche pendant 24 h.

3. Morphologie de surface ZIF-8 (microscopie électronique à balayage [MEB])

  1. Montez les poudres sèches de ZIF-8 sur du ruban de carbone et pulvérisez pendant 120 s avec de l’or-palladium pour éviter toute charge qui pourrait se produire pendant l’analyse MEB.
  2. Réglez la tension d’accélération du microscope sur 15 kV. Faites la mise au point sur les particules et ajustez le grossissement (des grossissements de 500x, 1 000x, 1 500x, 4 000x, 10 000x, 20 000x, 30 000x et 40 000x ont été utilisés).
  3. Imagez les particules sous le grossissement qui permet à la fois une évaluation claire de la taille des particules et de la morphologie (il est recommandé de prendre en compte des plages pour les particules de 5 μm, 10 μm et 20 μm).
  4. Collectez des données à partir d’au moins trois champs de vision différents et, pour chacun d’eux, tenez compte de différents grossissements.

4. Composition élémentaire du ZIF-8

  1. Suivez les étapes de l’imagerie SEM.
  2. À l’aide de l’unité de spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (EDX) du microscope SEM, analysez la composition élémentaire de l’échantillon.
  3. Assurez-vous que la tension d’accélération et le grossissement du MEB correspondent au moniteur EDX. Éteignez la caméra infrarouge du microscope MEB.
  4. Sur le moniteur EDX, accédez à Collect Spectrum (Collecter le spectre ) et saisissez un temps de collecte de 200 s. Ceci est recommandé pour éviter la charge et la désintégration des particules qui pourraient conduire à de fausses évaluations.
  5. Collectez des données à partir d’au moins trois champs de vision différents. Une fois la collecte terminée, analysez les données et identifiez les éléments d’intérêt.

5. Culture cellulaire

  1. Culture de cellules BEAS-2B immortalisées dans des milieux supplémentés avec 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 0,2 % de pénicilline/streptomycine.
    REMARQUE : Les passages entre 5 et 10 doivent être utilisés pour s’assurer qu’aucun changement phénotypique n’a déjà eu lieu dans le lot de cellules utilisé37 (tous les réactifs sont répertoriés dans le tableau des matériaux).
  2. Prenez une plaque de culture cellulaire de 100 mm et placez 10 ml de milieu sur la plaque. Ajouter 1 mL de la solution cellulaire BEAS-2B dans la plaque.
  3. Placez la plaque dans un incubateur (37 °C, 5 % de CO2) et laissez les cellules se développer.
  4. Vérifiez la plaque après 24 h pour déterminer si les cellules ont atteint 80 % de confluence. Ici, la confluence de 80 % fait référence au pourcentage de la surface couverte par les cellules adhérentes. Si ce n’est pas le cas, changez le milieu et laissez les cellules se développer jusqu’à ce que le niveau de confluence de 80 % soit atteint.

6. Comptage cellulaire

  1. Une fois que les cellules de la plaque ont atteint une confluence de 80 %, retirez le milieu de la plaque. Lavez l’assiette avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  2. Retirez le PBS de l’assiette. Ajouter 2 mL de trypsine dans l’assiette et la placer dans l’incubateur (37 °C, 5% CO 2) pendant2 min.
  3. Ajouter 2 mL de milieu dans la plaque et pipeter le milieu de haut en bas pour retirer les cellules de la plaque. Transférer la solution dans un tube de 15 mL et centrifuger à 123 x g pendant 5 min.
  4. Retirer le surnageant du tube et ajouter 2 mL de milieu. Pipeter le milieu de haut en bas pour redisperser les cellules.
  5. À l’aide d’un tube de 1,5 mL, ajouter 20 μL de bleu de trypan, puis 20 μL de solution cellulaire (rapport 1:1 de bleu de trypan/solution cellulaire).
  6. Placez 10 μL du mélange cellulaire sur une lame de verre et placez-la sur un compteur automatique de cellules. Attendez que l’écran soit net, puis sélectionnez Capturer.
  7. L’écran affiche le nombre de cellules actives et la viabilité des cellules. La plage de mesure s’étend de 1 x 104 à 1 x 107 cellules.
  8. Vous pouvez également compter les cellules manuellement à l’aide d’un hémocytomètre.
    1. Pour cela, ajoutez 15 à 20 μL de la solution cellulaire traitée au bleu de trypan dans l’hémocytomètre.
    2. Utilisez un microscope droit avec une mise au point objective 10x sur les lignes de grille de l’hémocytomètre.
    3. Comptez le nombre de cellules dans les quatre carrés extérieurs et divisez le nombre par quatre. Ensuite, multipliez par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules vivantes.
    4. Pour calculer la viabilité des cellules, additionnez le nombre de cellules vivantes et mortes pour obtenir le nombre total de cellules, puis divisez le nombre de cellules vivantes par le nombre total de cellules.

7. Préparation de la dose ZIF-8

  1. Préparez une solution mère ZIF-8 de 1 mg/mL. Pour cela, mesurez la quantité de ZIF-8 et ajoutez de l’eau déminéralisée (DI) aux particules pour atteindre une concentration de 1 mg/mL.
  2. Soniser (régler le sonicateur sur soniques) la solution mère ZIF-8 pendant 2 min à 30 s d’intervalle dans un bain-marie.
  3. Administrer différentes doses de ZIF-8 pour les expositions cellulaires en calculant la quantité de solution mère et de milieu aigle modifié de Dulbecco (DMEM) nécessaire pour atteindre les doses souhaitées à l’aide de l’équation C 1 V1= C 2 V2. Les doses varieront de 0 à 950 μg/mL.
    REMARQUE : Dans cette expérience, des doses de 0 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL et 950 μg/mL ont été sélectionnées.

8. Concentration inhibitrice demi-maximale (IC 50)

  1. Après le comptage des cellules, ensemencer les cellules BEAS-2B à une densité de 4 x 104 cellules/mL dans une plaque à 96 puits, avec un volume de 100 μL/puits.
    1. Pour atteindre une densité de 4 x 104 cellules/mL, utilisez C 1 V1= C 2 V2pour calculer la quantité de solution cellulaire à combiner avec le milieu.
    2. Assurez-vous de maintenir des puits vides pour chaque dose; laisser ces puits vides jusqu’à l’exposition ZIF-8.
  2. Placez la plaque à 96 puits dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 et laissez les cellules se développer en une monocouche confluente pendant 24 h.
  3. Retirer le milieu des puits et exposer les cellules BEAS-2B à des doses de ZIF-8 allant de 0 à 950 μg/mL. Ajouter 100 μL de ZIF-8 dans leurs puits blancs et cellulaires respectifs.
  4. Replacez les plaques de 96 puits dans l’incubateur pour un temps d’exposition de 48 h.
  5. Après l’exposition, ajouter 10 μL de 4-[3-(4-idophényl)-2-(4-nitrophényl)-2H-5-tétrazolio]-1,3-benzène disulfonate (WST-1) dans chaque puits (puits à blanc et puits cellulaire) et incuber pendant 2 h. Les médias restent dans les puits; Le rapport est de 1:10 (réactif:milieu).
  6. Lisez les changements d’absorbance sur un lecteur de plaques à l’aide d’une absorbance de 485 nm.
  7. Calculez la viabilité de la cellule à l’aide du logiciel pour déterminer la valeur IC 50 (voir section10 ).

9. Détection d’impédance de cellule-substrat électrique (ECIS)

  1. Utilisez une plaque à 96 puits (96W10idf) pour effectuer une analyse ECIS. La plaque28 contient des électrodes de connexion à doigts interdigitées couvrant une surface d’environ 4 mm2.
  2. Tout d’abord, vérifiez que tous les puits sont lus par les capteurs. Pour cela, placez la plaque à 96 puits sur la station de puits et cliquez sur le bouton Configuration .
  3. Si les puits sont correctement connectés, le vert apparaîtra; Tous les puits non raccordés seront identifiés comme étant rouges. Si un tel cas se présente, retirez et réinsérez la plaque du puits et cliquez à nouveau sur le bouton Configuration , jusqu’à ce que tous les puits offrent des lectures vertes viables.
  4. Stabiliser les électrodes pendant 40 min avec 200 μL de média par puits pour éviter toute dérive potentielle. Ajoutez 200 μL de média à chaque puits utilisé, puis placez la plaque à 96 puits sur la station ECIS. Cliquez sur Configuration/Vérification pour vous assurer que la plaque est correctement connectée. Cliquez sur Stabiliser.
  5. Une fois la stabilisation terminée, retirez la plaque de la station et retirez le média de chaque puits.
  6. Ensemencer les cellules BEAS-2B à une densité de 4 x 104 cellules/mL, avec un volume de 100 μL par puits, dans les puits contenant les cellules et placer la plaque sur la station ECIS dans l’incubateur.
  7. Sur le moniteur, cliquez sur Vérifier pour déterminer que toutes les électrodes sont lues par les capteurs de la station.
  8. Configurez la mesure de l’évolution du temps en sélectionnant Fréquence multiple/Temps (MFT). Le programme mesurera chaque puits à sept fréquences différentes.
  9. Cliquez sur Démarrer et laissez-le fonctionner pendant 24 h pour que les cellules puissent former une monocouche confluente.
  10. Après 24 h, les puits contenant des cellules montreront une résistance accrue sur le moniteur. Il s’agit d’un indicateur que les cellules se sont attachées aux électrodes.
  11. Appuyez sur Pause sur l’écran pour arrêter la collecte de données.
  12. Faire en sorte que les doses de ZIF-8 soient égales, supérieures et inférieures à la valeur IC50 calculée en suivant les étapes décrites à la section 7 ci-dessus.
  13. Exposez les nanoparticules ZIF-8 à leurs puits blancs et cellulaires respectifs à un volume de 100 μL par puits et replacez la plaque à 96 puits sur la station.
  14. Cliquez à nouveau sur Vérifier sur le moniteur pour vous assurer que les capteurs lisent toutes les électrodes. Cliquez sur Reprendre et laissez le système fonctionner pendant 72 h pour surveiller le comportement cellulaire et l’attachement.
  15. Une fois la collecte de données terminée, cliquez sur Terminer sur le moniteur. Pour enregistrer le fichier, cliquez sur Fichier > Enregistrer sous. Enregistrez les données sous forme de feuille de calcul.
  16. Pour obtenir les paramètres alpha, cliquez sur Modèle. Dans la fenêtre contextuelle de l’écran, cliquez sur Puits de média uniquement, puis sélectionnez le puits qui ne contient que des médias.
  17. Cliquez sur Définir la réf. Sur l’écran, cliquez sur Rechercher.
  18. Si le puits affiché dans le système n’est pas le même que celui choisi, répétez l’étape 9.16.
  19. Cliquez sur Définir. Cliquez sur Ajuster la plage en T pour déterminer l’intervalle de temps souhaité pour la collecte des données.
  20. Pendant le traitement, cliquez sur Alpha. Lorsque le système a terminé l’analyse, cliquez sur Enregistrer RbA et enregistrez-le sous forme de tableur.
    REMARQUE: Reportez-vous au manuel ECIS, qui se trouve sur le site Web du fabricant38.

10. Analyse des données

  1. SEM
    1. Ouvrez le logiciel d’imagerie pour analyser les images SEM. Cliquez sur Fichier > Ouvrir, puis sélectionnez l’image à analyser.
    2. Cliquez sur Image > Tapez > 8 bits pour convertir l’image en niveaux de gris afin d’effectuer l’opération de seuil.
    3. Calibrer la mesure de distance des pixels en microns. Cliquez sur l’outil Ligne droite et tracez la longueur de chaque particule à mesurer.
    4. Cliquez sur Analyser , puis sur Définir l’échelle. La distance connue est définie sur la longueur de la taille de la barre d’échelle sur l’image SEM. L’unité de longueur connue sera définie sur les microns. Cochez Global et appuyez sur OK.
    5. Cliquez sur l’outil Ligne droite et tracez le diamètre de la particule, puis sélectionnez Analyser et mesurer. Enregistrez le résultat de la longueur.
    6. Répétez l’opération pour toutes les images collectées. Faites la moyenne de tous les diamètres d’au moins 60 particules pour une évaluation statistique appropriée.
  2. EDX (Anglais seulement)
    1. Faites la moyenne de tous les pourcentages de pondération de chaque élément à partir de toutes les images collectées (voir la section EDX ci-dessus).
    2. À l’aide d’une feuille de calcul, tracez un graphique à barres de chaque élément sur l’axe des abscisses et de leur pourcentage de poids élémentaire moyen sur l’axe des ordonnées.
  3. IC50
    1. Faites la moyenne des puits à blanc et la moyenne des puits de dose pour chaque répétition.
    2. Calculer le blanc ajusté en soustrayant la moyenne du blanc de contrôle de la moyenne du blanc de dose. Calculez la valeur réelle de la cellule pour chaque dose en soustrayant le blanc ajusté de la valeur moyenne de la dose.
    3. Soustrayez la valeur du blanc ajustée pour chaque dose de la valeur de contrôle moyenne. Calculez la viabilité cellulaire de chaque dose à l’aide de l’équation : viabilité cellulaire = (valeur vraie de la cellule/(valeur de contrôle - valeur à blanc ajustée)) x 100.
    4. Répétez cette opération pour toutes les autres répétitions.
    5. Faites la moyenne de la viabilité cellulaire de chaque répétition afin d’obtenir la viabilité cellulaire finale pour chaque dose.
    6. Dans le logiciel, choisissez l’onglet XY à l’écran.
    7. Entrez les valeurs de concentration (dose) dans la colonne X et la viabilité cellulaire (%) de chaque dose dans la colonne Y.
    8. Transformez les valeurs X en cliquant sur Analyser > Transformer > Ok, puis sur Transformer X = Log(X).
    9. Normalisez les valeurs Y en sélectionnant la feuille de données transformées , en cliquant sur Analyser, puis en sélectionnant Normaliser.
    10. Sélectionnez la feuille de données Normaliser la transformation , cliquez sur Analyser, puis sélectionnez Régression non linéaire (ajustement de la courbe). Sélectionnez Dose-Réponse-Inhibition et cliquez sur Log( Inhibiteur) Vs. Response-Variable Slope (Quatre paramètres). Cliquez sur OK pour afficher les résultats.
  4. L’ECIS
    1. À partir de la feuille de calcul, prenez les colonnes de résistance (ohm) pour chaque répétition (puits vierges et puits de dose) et faites-en la moyenne ensemble à partir de la fréquence de 4 000 Hz. Cette fréquence permet l’évaluation du contact cellule-cellule38.
    2. Calculez la résistance corrigée en soustrayant le blanc moyen de la dose moyenne pour chaque répétition. Faire la moyenne de la résistance corrigée pour les répétitions pour chaque dose.
    3. Répétez les mêmes étapes pour les valeurs alpha afin de calculer le paramètre alpha moyen. Tracez l’axe des abscisses sous la forme du temps (h) et l’axe des ordonnées sous la forme des valeurs moyennes de résistance/alpha pour chaque valeur de dose.

11. Analyse statistique

  1. SEM
    1. Effectuez un écart-type dans le fichier de feuille de calcul où les diamètres moyens des particules ZIF-8 ont été calculés.
    2. À l’aide de la fonction STDEV de la feuille de calcul, mettez en surbrillance les données des 60 particules et cliquez sur Entrée. Représenter graphiquement l’écart-type pour chaque diamètre moyen calculé.
  2. EDX (Anglais seulement)
    1. Comme pour le MEB (étapes 11.1.1 à 11.1.2), calculez l’écart-type pour chaque composition élémentaire moyenne à l’aide de la fonction STDEV de la feuille de calcul. Représenter graphiquement les écarts-types pour chaque composition élémentaire moyenne.
  3. IC50
    1. Ouvrez le logiciel utilisé pour calculer l’IC50 et cliquez sur Fiche technique groupée.
    2. Inscrivez les doses de ZIF-8 dans les rangées intitulées Groupe A, Groupe B, etc. Entrez la viabilité cellulaire moyenne pour chaque dose et répliquez-la dans la colonne correspondant à la dose de ZIF-8.
    3. Cliquez sur Analyser, puis sous Analyses de colonnes, sélectionnez ANOVA unidirectionnelle (et non paramétrique ou mixte).
    4. Dans l’onglet Plan expérimental , sélectionnez Pas de correspondance ou d’appariement. Sous Distribution gaussienne des résidus, sélectionnez Oui utiliser l’ANOVA. Enfin, sélectionnez Oui Utiliser le test ANOVA ordinaire sous Supposer des écarts-types égaux.
    5. Sous l’onglet Comparaisons multiples , sélectionnez Comparer la moyenne de chaque colonne avec la moyenne d’une colonne de contrôle. Cliquez sur OK pour afficher les résultats.

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Representative Results

À l’aide d’une lignée cellulaire modèle in vitro commune39 (BEAS-2B), cette étude visait à démontrer la faisabilité et l’applicabilité de l’ECIS pour évaluer les changements de comportement cellulaire lors de l’exposition à un MOF synthétisé en laboratoire. L’évaluation de ces changements a été complétée par une analyse à l’aide de tests colorimétriques conventionnels.

Les caractéristiques physico-chimiques du cadre ont d’abord été évaluées afin de s’assurer de la reproductibilité des méthodes employées, de la validité des résultats obtenus et des discussions pertinentes de ces résultats. L’analyse de la morphologie de surface de ZIF-8, par exemple, a été réalisée par MEB ; Les images ont montré que les armatures présentaient une morphologie de dodécaèdre rhombique40 et avaient une taille moyenne de 62,87 nm ± 9,61 nm (Figure 1A). La composition élémentaire des MOF a été déterminée parspectroscopie EDX. Les résultats ont montré que la composition principale du ZIF-8 était constituée de C, N et Zn (c’est-à-dire la composition du liant imidazolate et de l’ion métal, Zn16) (Figure 1B). La diffraction des rayons X précédente a montré que les phases cristallines ZIF-8 ont identifié des pics spécifiques à 10,33°, 12,8°, 14,7°, 16,5° et 18°, ces pics étant attribués aux plans (002), (112), (022), (013) et (222), respectivement, 16,41.

Pour le criblage du comportement cellulaire proposé, l’IC 50 (concentration où ZIF-8 inhibe la croissance cellulaire de50 %) a été déterminée29. Pour cela, les cellules ont été exposées au ZIF-8 pendant 48 h à des doses allant de 0 à 950 μg/mL (Figure 2A). Le graphique dose-réponse des cellules exposées est illustré à la figure 2B, avec la CI50 enregistrée ultérieurement de 35,7 μg/mL. De plus, l’analyse a révélé une tendance dose-dépendante de la viabilité des cellules lors de l’exposition au ZIF-8.

Lors de la détermination de l’IC50, une analyse ECIS a été effectuée. Brièvement, l’ECIS a été utilisée comme stratégie de dépistage en temps réel de BEAS-2B exposé à des MOF ZIF-8 à IC50, ainsi qu’en dessous et au-dessus de cette concentration, à savoir 15,7 μg/mL (C1), 35,7 μg/mL (C2), 55,7 μg/mL (C3) et 75,7 μg/mL (C4) respectivement, les cellules étant exposées pendant une période totale de 72 h. L’inclusion de l’ECIS a été envisagée pour permettre de déterminer les changements dans la couverture, la morphologie et la viabilité des cellules, le tout en temps réel. Les résultats de l’ECIS ont été enregistrés sous forme de changements dans la résistance et de changements dans les interactions cellule-substrat, à savoir le paramètre alpha42.

Les tendances de résistance sont illustrées à la figure 3A sous forme de changements dans les profils des cellules traitées par ZIF-8 par rapport au témoin (ligne noire) (c’est-à-dire les cellules non exposées). Plus précisément, l’analyse a montré que les puits contenant des cellules sur les électrodes d’or exposées à des doses de C2-C4 présentaient une légère augmentation initiale de la résistance immédiatement après l’exposition des cellules aux cadres (tout cela par rapport au témoin [c’est-à-dire les cellules non exposées]). Ces changements initiaux ont ensuite été suivis d’une forte diminution des résistances enregistrées, ces diminutions étant fréquentes entre 6 et 8 h après l’exposition (figure 3A). Une perte complète de résistance a été observée après 14 à 18 h à compter du temps d’exposition. Les cellules exposées à des doses inférieures à la valeur de CI50 ont montré des résistances, comme les puits avec des cellules témoins, jusqu’à environ 16-18 h après l’exposition lorsque des pertes de résistance apparaissent. De plus, lors de l’exposition cellulaire, une perturbation continue du signal des puits utilisés dans les expériences a été observée. Ces perturbations ont persisté lors de l’analyse du paramètre alpha (Figure 3B), cette analyse montrant en outre que les cellules exposées modifient leurs interactions cellule-substrat avec des profils similaires à ceux de résistance. De plus, ces changements dépendaient du temps écoulé depuis l’exposition et de la dose utilisée lors de cette exposition.

Figure 1
Figure 1 : Image MEB et composition élémentaire moyenne des particules ZIF-8. (A) Image MEB représentative des particules ZIF-8. (B) Composition élémentaire moyenne des particules ZIF-8 (± barres d’écart-type [ET]). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Viabilité cellulaire. (A) Schéma de traitement cellulaire (créé avec Biorender.com). B) Viabilité des cellules BEAS-2B exposées à des particules ZIF-8 à des doses comprises entre 0 et 950 μg/mL; cette analyse a été utilisée pour déterminer l’IC50 (± barres SD; ***p = 0,0001 et **** p < 0,0001 par rapport au témoin). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résistance cellulaire représentative et changements dans l’attachement cellulaire. (A) Résistance cellulaire représentative des cellules BEAS-2B exposées à des particules ZIF-8 inférieures, égales et supérieures à la concentration IC50. (B) Modifications de l’attachement cellulaire (c’est-à-dire des modifications du paramètre alpha) des cellules BEAS-2B lorsqu’elles sont exposées à des particules ZIF-8 inférieures et supérieures à la concentration IC50. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Des analyses antérieures ont montré que l’ECIS pouvait être utilisée pour évaluer le comportement des cellules exposées à des analytes (c’est-à-dire des nanotubes de carbone35, des médicaments43 ou des nanoargiles16). De plus, Stueckle et al. ont utilisé l’ECIS pour évaluer la toxicité des cellules BEAS-2B exposées à des nanoargiles et à leurs sous-produits et ont constaté que le comportement cellulaire et l’attachement dépendaient des caractéristiques physico-chimiques de ces matériaux42. Dans ce cadre, nous avons proposé de déterminer les changements possibles des cellules BEAS-2B en réponse à l’exposition aux MOF, afin de contribuer ainsi à l’ensemble des connaissances visant à différencier les effets délétères du ZIF-8 sur les systèmes cellulaires in vitro, le tout à haut débit et en temps réel.

L’analyse a d’abord permis d’évaluer les propriétés du cadre afin d’aider à corréler les changements de comportement cellulaire aux propriétés physico-chimiques des MOF testés44. Plus précisément, lors de l’exposition cellulaire à des MOF avec des géométries régulières de composition élémentaire similaire (voir les résultats ci-dessus), l’analyse a montré des changements dans le comportement cellulaire, résultant vraisemblablement de l’adoption des cadres et de leur dégradation cellulaire de profil. En ce qui concerne spécifiquement l’absorption, des analyses antérieures de toxicité sur des matériaux hydrophobes, telles que ce cadre, ont montré que lorsque ces matériaux sont exposés à des cellules, leur absorption est plus perturbatrice pour une membrane cellulaire que l’absorption de leurs homologues hydrophiles, probablement en raison de leur capacité à éliminer les lipides de labicouche structurelle de la membrane. 45 lors de leur translocation cellulaire, conduisant ainsi à des dysfonctionnements membranaires ou à des perturbations de la membrane plasmique46,47. En particulier, il a été démontré que l’élimination des lipides entraînait des changements dans l’intégrité membranaire, la signalisation cellulaire48 et une augmentation de l’absorption cellulaire49, avec un inconvénient des effets sur la fonction cellulaire. Par exemple, Farcal et al. ont démontré qu’un nanomatériau hydrophobe TiO2 avait un effet cytotoxique accru par rapport à son homologue hydrophile dans les macrophages alvéolaires exposés50. De plus, Wagner et al., ont démontré que le ZIF-8 hydrophobe causait plus de perturbations aux cellules BEAS-2B par rapport au MIL-160 hydrophile16.

Les changements enregistrés dans le comportement des cellules sont vraisemblablement dus à des perturbations dans les interactions cellule-substrat26 et/ou à la viabilité et à la prolifération cellulaires16 sur les électrodes à la suite de l’exposition des cellules à la structure sélectionnée. Par exemple, Wagner et al. ont évalué des paramètres similaires dans des cellules exposées à des nanoargiles. Les auteurs ont constaté qu’une perte complète de l’interaction cellule-substrat a été observée au cours des expériences de 72 h. De plus, les auteurs ont démontré un effet dépendant du temps sur la viabilité et la prolifération cellulaires lorsque les BEAS-2B ont été exposés à leurs nanoargiles sélectionnées26. Bien que les particules testées ici soient des MOF, l’association étendue possible avec les effets observés pour les nanoargiles est possible, car certaines des caractéristiques physico-chimiques de ces particules (à savoir la taille, l’hydrophobicité et la composition) sont similaires à celles des MOF. De plus, Stueckle et al. ont également démontré un comportement cellulaire dépendant du temps et du traitement lorsque des nanoargiles ont été exposées à des cellules BEAS-2B immortalisées. D’autres ont démontré que le ZIF-8, à une dose de 100 μg/mL, provoque une perte complète de la monocouche cellulaire et de la viabilité cellulaire des cellules BEAS-2B, probablement en raison de changements dans les interactions cellule-substrat16. Il est toutefois à noter que dans de telles études, les particules ZIF-8 ont été obtenues dans des conditions de synthèse différentes (c’est-à-dire 10 min contre 24 h utilisées dans cette étude), ces conditions de synthèse ayant par la suite donné lieu à des formes/morphologies différentes des cadres pour soutenir ainsi les conclusions précédentes. Cela montre que le temps de réaction6, la température2 et le solvant44 utilisés lors de la synthèse des particules influencent leurs profils de forme, de taille et de composition, et conduisent par la suite à des effets et des comportements différentiels dans les cellules exposées.

L’analyse a également montré que les cellules exposées à des doses de ZIF-8 inférieures à la valeur IC50 présentaient des résistances similaires à celles des témoins, probablement parce que ces doses n’étaient pas suffisamment significatives pour induire une transformation cellulaire observable par ECIS dans les conditions et le délai dans lesquels ces expériences ont été entreprises. Cependant, à des doses supérieures àIC 50, une perte complète de résistance cellulaire a été observée et seulement quelques heures après l’exposition, très probablement en raison de changements dans la viabilité cellulaire et de changements possibles induits dans les interactions cellule-substrat16 (Figure 3A). Ces affirmations sont étayées par des études antérieures qui ont montré que les cellules non viables changent de forme et se détachent des substrats. Par exemple, Verma et al. ont utilisé une technique de détection d’impédance en temps réel pour évaluer la cytotoxicité des nanoargiles dans une lignée de cellules épithéliales alvéolaires humaines (A549). Il a été démontré que les nanoargiles de type plaquettaire provoquaient une augmentation du nombre de cellules détachées et déformées par rapport aux nanoargiles de type tubulaire51. De plus, Xiao et al. ont démontré que le cytosquelette des cellules fibroblastiques V79 était compromis lorsqu’elles étaient exposées au chlorure de cadmium, en raison d’un afflux d’eau, d’ions extracellulaires et de produits chimiques cytotoxiques provenant du milieu de culture. Les changements dans le cytosquelette cellulaire ont conduit à la perte des interactions cellule-substrat. De plus, lorsque le chlorure de benzalkonium a été exposé à des cellules V79, il y a eu une diminution significative de la résistance cellulaire, en raison des dommages à la membrane cellulaire que l’exposition a causés52.

En outre, les changements de résistance peuvent être dus aux réactions cellulaires aux caractéristiques physico-chimiques du ZIF-8. En particulier, le ZIF-8 est un cadre hydrophobe ; Des analyses antérieures ont montré que l’hydrophobicité peut entraîner une augmentation de la toxicité16. Il a également été démontré que les ions métalliques, tels que le Zn, induisent un degré de toxicité plus élevé par rapport à d’autres métaux comme le Zr et le Fe1 , contribuant peut-être à une mort cellulaire plus élevée.

Il a également été démontré que toutes les cellules enregistraient une diminution initiale de la résistance juste après l’exposition, suivie d’une augmentation ultérieure. Eldawud et al. ont démontré des effets similaires lorsque les SWCNT ont été exposés à des cellules BEAS-2B. Les auteurs ont interprété l’augmentation de la résistance cellulaire comme étant due au fait que les cellules BEAS-2B ont surmonté les perturbations causées par l’exposition des matériaux et ont ensuite retrouvé leur intégrité18 tout en éliminant la dérive des électrodes28, afin d’assurer la reproductibilité de l’analyse des données (voir manuel ECIS).

Même si cette étude a montré que l’ECIS pourrait être un outil précieux à utiliser dans le dépistage du comportement cellulaire, en particulier en raison de la fonction à haut débit, il est recommandé que la technique ne remplace pas les tests ponctuels lorsqu’une image complète de l’évaluation délétère d’un matériau est souhaitée. En particulier, le test en un seul point pourrait permettre d’évaluer la transformation cellulaire à leur niveau génétique 45,53, comme l’ont montré Eldawud et al., par exemple pour les cellules BEAS-2B exposées à des nanodiamants et par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)45.   Yu et al., ont également utilisé FACS pour évaluer les cellules cancéreuses du côlon humain (HCT0116) exposées à des nanoparticules de silice mésoporeuse modifiées à l’acide hyaluronique (HA-MSNs)54.

Les résultats présentés suggèrent que la voie de changement dépend des caractéristiques physico-chimiques des MOF, ainsi que du temps et du dosage de ces cadres utilisés dans les expositions. Les résultats et les méthodes décrits ici soulignent l’importance des mesures en temps réel et leurs avantages dans la compréhension des changements dans les profils cellulaires. Ceux-ci peuvent potentiellement être complétés par des tests biochimiques supplémentaires pour évaluer le mécanisme de toxicité, conduisant ainsi à des stratégies sûres de conception des MOF qui n’ont pas d’effets délétères sur le comportement cellulaire, enregistrés sous forme d’attachement cellulaire, d’interactions cellule-cellule ou d’interactions cellule-substrat.

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Disclosures

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts dans ce travail.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés en partie par le programme T32 (T32 GM133369) de l’Institut national des sciences médicales générales (NIGMS) et la National Science Foundation (NSF 1454230). De plus, l’aide et le soutien des installations de recherche partagées de la WVU et de la biophysique appliquée sont reconnus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)  Roche 5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25255-056
100 mm plates Corning 430167
1300 Series A2 biofume hood Thermo Scientific 323TS
2510 Branson bath sonicator Process Equipment & Supply, Inc.  251OR-DTH
2-methylimidazole, 97% Alfa Aesar 693-98-1
5 mL sterile microtube Argos Technologies T2076S-CA
50 mL  tubes  Falcon 352098
96W10idf well plates Applied Biophysics  96W10idf PET
96-well plates Fisherbrand FB012931
Biorender Biorender N/A
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess II FL automated cell counter Life Technologies C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater Denton Vacuum N/A
Dimethly sulfoxide  Corning 25-950-CQC
DPBS/Modified Cytiva SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium Corning 10-014-CV
ECIS-ZΘ Applied Biophysics  ABP 1129
Excel Microsoft Version 2301
Falcon tubes (15 mL) Corning 352196
Fetal bovine serum Gibco 16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader BMG LABTECH 413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0) GraphPad Software, LLC Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray  Hitachi High-Technologies Corporation S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells American Type Culture Collection CRL-9609
Isotemp freezer Fisher Scientific 
Methanol, 99% Fisher Chemical 67-56-1
Parafilm sealing film The Lab Depot HS234526A
Penicillin/Steptomycin Gibco 15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge  Thermo Scientific 75004220
Sorvall T 6000B DU PONT  T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS MP Biomedicals, LLC 1691049
Vacuum Chamber Belart 999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure Acros Organic 101-96-18-9

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Bio-ingénierie Numéro 195
Détection électrique cellule-substrat pour l’évaluation en temps réel des profils toxicologiques des structures organométalliques
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Rose, O. L., Arnold, M., Dinu, C. Z. Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles. J. Vis. Exp. (195), e65313, doi:10.3791/65313 (2023).

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