Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Elektrische Zell-Substrat-Sensorik zur Echtzeit-Bewertung von toxikologischen Profilen metallorganischer Gerüstverbindungen

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65313
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

Summary

Die folgende Studie evaluiert das toxikologische Profil eines ausgewählten metallorganischen Gerüsts unter Verwendung der elektrischen Zellsubstrat-Impedanzmessung (ECIS), einer Echtzeit-Hochdurchsatz-Screening-Technik.

Abstract

Metallorganische Gerüstverbindungen (MOFs) sind Hybride, die durch die Koordination von Metallionen und organischen Linkern in organischen Lösungsmitteln gebildet werden. Die Implementierung von MOFs in biomedizinischen und industriellen Anwendungen hat zu Bedenken hinsichtlich ihrer Sicherheit geführt. In dieser Arbeit wurde das Profil eines ausgewählten MOF, eines zeolithischen Imidazol-Gerüsts, bei Exposition bei menschlichen Lungenepithelzellen untersucht. Die Plattform für die Evaluierung war eine Echtzeittechnik (d. h. elektrische Zell-Substrat-Impedanzmessung [ECIS]). Diese Studie identifiziert und diskutiert einige der schädlichen Wirkungen des ausgewählten MOFs auf die exponierten Zellen. Darüber hinaus zeigt diese Studie die Vorteile der Verwendung der Echtzeitmethode gegenüber anderen biochemischen Assays für umfassende Zellbewertungen. Die Studie kommt zu dem Schluss, dass beobachtete Veränderungen im Zellverhalten auf eine mögliche Toxizität hindeuten könnten, die durch die Exposition gegenüber MOFs mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften und die Dosierung dieser verwendeten Gerüste induziert wird. Durch das Verständnis von Veränderungen im Zellverhalten sieht man die Möglichkeit, Safe-by-Design-Strategien von MOFs für biomedizinische Anwendungen zu verbessern, indem ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften spezifisch angepasst werden.

Introduction

Metallorganische Gerüstverbindungen (MOFs) sind Hybride, die durch die Kombination von Metallionen und organischen Linkern 1,2 in organischen Lösungsmitteln gebildet werden. Aufgrund der Vielfalt solcher Kombinationen besitzen MOFs eine strukturelle Vielfalt3, eine einstellbare Porosität, eine hohe thermische Stabilität und große Oberflächen 4,5. Diese Eigenschaften machen sie zu attraktiven Kandidaten für eine Vielzahl von Anwendungen, von der Gasspeicherung 6,7 bis zur Katalyse8,9 und von Kontrastmitteln 10,11 bis hin zu Wirkstoffabgabeeinheiten 12,13. Die Implementierung von MOFs in solche Anwendungen hat jedoch Bedenken hinsichtlich ihrer Sicherheit sowohl für die Benutzer als auch für die Umwelt aufgeworfen. Vorläufige Studien haben beispielsweise gezeigt, dass sich die Zellfunktion und das Zellwachstum ändern, wenn Zellen Metallionen oder Linkern ausgesetzt werden, die für die MOF-Synthese verwendet werden 1,14,15. Tamames-Tabar et al. zeigten beispielsweise, dass ZIF-8 MOF, ein Zn-basiertes MOF, im Vergleich zu Zr- und Fe-basierten MOFs zu mehr zellulären Veränderungen in einer menschlichen Gebärmutterhalskrebs-Zelllinie (HeLa) und einer Maus-Makrophagen-Zelllinie (J774) führte. Solche Effekte waren vermutlich auf die Metallkomponente von ZIF-8 (d.h. Zn) zurückzuführen, die möglicherweise die Apoptose von Zellen nach dem Zerfall des Gerüsts und der Freisetzung von Zn-Ionen1 induzieren könnte. In ähnlicher Weise zeigten Gandara-Loe et al., dass HKUST-1, ein Cu-basiertes MOF, die höchste Verringerung der Lebensfähigkeit von Maus-Retinoblastomzellen verursachte, wenn es in Konzentrationen von 10 μg/ml oder mehr verwendet wurde. Dies war vermutlich auf das Cu-Metallion zurückzuführen, das während der Synthese dieses Gerüsts eingebaut wurde und das, sobald es freigesetzt wurde, oxidativen Stress in den exponierten Zellen induzieren konnte15.

Darüber hinaus zeigte die Analyse, dass die Exposition bei MOFs mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften zu unterschiedlichen Reaktionen der exponierten Zellen führen könnte. Wagner et al. zeigten beispielsweise, dass ZIF-8 und MIL-160 (ein Al-basiertes Gerüst), das bei der Exposition einer immortalisierten menschlichen Bronchialepithelzelle verwendet wurde, zu zellulären Reaktionen führten, die von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Gerüste abhingen, nämlich Hydrophobie, Größe und strukturelle Merkmale16. Komplementär dazu zeigten Chen et al., dass eine Konzentration von 160 μg/ml MIL-100(Fe), die menschlichen normalen Leberzellen ausgesetzt war (HL-7702), den größten Verlust an zellulärer Lebensfähigkeit verursachte, vermutlich aufgrund der Metallkomponente dieses spezifischen Gerüsts (d. h. Fe17).

Während diese Studien die schädlichen Auswirkungen von MOFs auf zelluläre Systeme auf der Grundlage ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften und Expositionskonzentrationen kategorisieren, was potenzielle Bedenken hinsichtlich der Implementierung von Rahmenbedingungen aufwirft, insbesondere in biomedizinischen Bereichen, basieren die meisten dieser Bewertungen auf kolorimetrischen Assays zu einem einzigen Zeitpunkt. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass diese biochemischen Reagenzien bei der Verwendung von (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) tetrazolium (MTT) und wasserlöslichem Tetrazoliumsalz (WST-1)-Assays zu falsch positiven Ergebnissen führen konnten, wenn sie mit den Partikeln interagierten, denen die Zellen ebenfalls ausgesetzt waren18. Es wurde gezeigt, dass das Tetrazoliumsalz und die neutralen roten Reagenzien eine hohe Adsorptions- oder Bindungsaffinität an den Oberflächen der Partikel besitzen, was zu einer Signalinterferenz des Mittelsführt 19. Darüber hinaus wurde für andere Arten von Assays, wie z. B. die Durchflusszytometrie, die zuvor zur Beurteilung von Veränderungen in Zellen, die MOFs ausgesetzt waren,20,21 verwendet wurde, gezeigt, dass wichtige Probleme umgangen werden müssen, wenn eine praktikable Analyse der schädlichen Auswirkungen von Partikeln in Betracht gezogen werden soll. Insbesondere müssen die Detektionsbereiche der Partikelgrößen, insbesondere in gemischten Populationen, wie sie von MOFs angeboten werden, oder Referenzen der Partikel, die für die Kalibrierung vor zellulären Veränderungen verwendet werden, berücksichtigt werden22. Es wurde auch gezeigt, dass der Farbstoff, der bei der Zellmarkierung für solche Zytometrie-Assays verwendet wird, auch die Nanopartikel stören kann, denen die Zellen ausgesetzt waren23.

Das Ziel dieser Studie war es, einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Evaluierungsassay zu verwenden, um Veränderungen im Zellverhalten bei Exposition gegenüber einem ausgewählten MOF zu bewerten. Echtzeit-Auswertungen können helfen, Einblicke in zeitabhängige Effekte zu geben, die sich auf die Expositionsfenster beziehen16. Darüber hinaus liefern sie Informationen über Veränderungen der Zell-Substrat-Interaktionen, der Zellmorphologie und der Zell-Zell-Interaktionen sowie darüber, wie solche Veränderungen von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der interessierenden Materialien bzw. den Expositionszeiten abhängen24,25.

Um die Validität und Anwendbarkeit des vorgeschlagenen Ansatzes zu demonstrieren, wurden humane Bronchialepithelzellen (BEAS-2B), ZIF-8 (ein hydrophobes Gerüst aus zeolithischem Imidazolat16) und elektrische Zellsubstrat-Impedanzmessung (ECIS) verwendet. BEAS-2B-Zellen stellen ein Modell für die Lungenexpositiondar 26 und wurden zuvor verwendet, um Veränderungen bei der Exposition von Zellen gegenüber Nanotonerden und ihren thermisch abgebauten Nebenprodukten26,27,28 sowie die Toxizität von Nanomaterialien, wie z. B. einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs)18, zu bewerten. Darüber hinaus werden solche Zellen seit mehr als 30 Jahren als Modell für die Lungenepithelfunktion verwendet29. ZIF-8 wurde aufgrund seiner breiten Implementierung in der Katalyse30 und als Kontrastmittel 31 für die Biobildgebung und die Verabreichung von Medikamenten32 und damit wegen des erweiterten Potenzials für die Lungenexposition während solcher Anwendungen ausgewählt. Schließlich wurde ECIS, die nicht-invasive Echtzeit-Technik, zuvor verwendet, um Veränderungen der Zelladhärenz, Proliferation, Motilität und Morphologie 16,26 als Ergebnis einer Vielzahl von Wechselwirkungen zwischen Analyten (sowohl Materialien als auch Medikamente) und exponierten Zellen in Echtzeit zu bewerten 16,18,28. ECIS verwendet einen Wechselstrom (AC), um die Impedanz von Zellen zu messen, die auf Goldelektroden immobilisiert sind, wobei die Impedanzänderungen Einblicke in Änderungen des Widerstands und der Kapazität an der Zell-Gold-Substrat-Grenzfläche, der Barrierefunktion, wie sie durch Zell-Zell-Wechselwirkungen induziert wird, und der Überdeckung der Zellschicht solcher Goldelektroden geben33,34. Die Verwendung von ECIS ermöglicht quantitative Messungen mit einer Auflösung im Nanobereich auf nicht-invasive Weise in Echtzeit26,34.

Diese Studie bewertet und vergleicht die Einfachheit und Leichtigkeit der Auswertung von MOF-induzierten Veränderungen des zellulären Verhaltens in Echtzeit mit Einzelpunkt-Assay-Auswertungen. Eine solche Studie könnte weiter extrapoliert werden, um Zellprofile als Reaktion auf die Exposition gegenüber anderen Partikeln von Interesse zu bewerten, was eine sichere Partikelprüfung und anschließende Unterstützung bei der Implementierung ermöglicht. Darüber hinaus könnte diese Studie genetische und zelluläre Assays ergänzen, bei denen es sich um Einzelpunktbewertungen handelt. Dies könnte zu einer fundierteren Analyse der schädlichen Auswirkungen von Partikeln auf die Zellpopulation führen und für das Screening der Toxizität solcher Partikel im Hochdurchsatz verwendet werden16,35,36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ZIF-8-Synthese

  1. Verwenden Sie für dieses Beispiel ein Massenverhältnis von 1:10:100 (Metall:Linker:Lösungsmittel), um das ZIF-8 zu synthetisieren. Messen Sie dazu Zinknitrat-Hexahydrat ab und notieren Sie die Messung. Verwenden Sie das Beispielmassenverhältnis, um die Menge zu berechnen, die für den Linker, 2-Methylimidazol und das Lösungsmittel (d. h. Methanol) benötigt wird.
  2. Zinknitrat-Hexahydrat und Linker in zwei verschiedene Glasfläschchen geben. Die Hälfte der berechneten Menge Methanol wird zum Zinknitrat-Hexahydrat und die andere Hälfte zum Linker gegeben. Lassen Sie jede Lösung auflösen.
  3. Kombinieren Sie die beiden Lösungen (d. h. Lösungen, die das Metall bzw. den Linker enthalten). Den Behälter mit der kombinierten Lösung für die Reaktion auf eine Rührplatte stellen und bei 700 U/min 24 h bei Raumtemperatur (RT) rühren.

2. Sammlung ZIF-8

  1. Sobald die obige Reaktion abgeschlossen ist (d. h. nach 24 Stunden), wird die Lösung in 50-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und 5 Minuten lang bei 3.075 x g zentrifugiert (gleiche Mengen verwenden und den Rotor ausbalancieren). Entfernen Sie alle Überstände aus den Zentrifugenröhrchen.
  2. Methanol (5-15 ml) in die Zentrifugenröhrchen geben und die Partikel redispergieren.
  3. Wiederholen Sie die Zentrifugations- und Waschschritte mindestens zwei bis vier weitere Male. Nach der letzten Wäsche den Überstand entleeren.
    HINWEIS: Bei den Waschschritten werden alle nicht gefällten Arten entfernt.
  4. Entfernen Sie die Deckel der Röhrchen und legen Sie Parafilmband darüber; Stechen Sie anschließend Löcher in den Parafilm. Das/die Röhrchen, das/die die Probe enthält/werden, wird 24 h lang in eine Vakuumkammer bei RT gestellt.

3. ZIF-8 Oberflächenmorphologie (Rasterelektronenmikroskopie [REM])

  1. Montieren Sie die trockenen Pulver von ZIF-8 auf Kohleband und spritzen Sie sie 120 s lang mit Gold-Palladium, um eine Aufladung zu verhindern, die während der REM-Analyse auftreten könnte.
  2. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung des Mikroskops auf 15 kV ein. Bringen Sie die Partikel in den Fokus, und passen Sie die Vergrößerung an (es wurden Vergrößerungen von 500x, 1.000x, 1.500x, 4.000x, 10.000x, 20.000x, 30.000x und 40.000x verwendet).
  3. Bilden Sie die Partikel unter der Vergrößerung ab, die sowohl eine klare Beurteilung der Partikelgröße als auch der Morphologie ermöglicht (es wird empfohlen, Bereiche für Partikel von 5 μm, 10 μm und 20 μm zu berücksichtigen).
  4. Sammeln Sie Daten aus mindestens drei verschiedenen Sichtfeldern, und berücksichtigen Sie für jedes Feld unterschiedliche Vergrößerungen.

4. ZIF-8 elementare Zusammensetzung

  1. Befolgen Sie die Schritte für die REM-Bildgebung.
  2. Analysieren Sie mit der energiedispersiven Röntgenspektroskopie (EDX) des REM-Mikroskops die Elementzusammensetzung der Probe.
  3. Stellen Sie sicher, dass die SEM-Beschleunigungsspannung und die Vergrößerung mit dem EDX-Monitor übereinstimmen. Schalten Sie die Infrarotkamera am REM-Mikroskop aus.
  4. Gehen Sie auf dem EDX-Monitor zu Spektrum erfassen und geben Sie eine Erfassungszeit von 200 s ein. Dies wird empfohlen, um eine Aufladung und Zersetzung von Partikeln zu vermeiden, die zu Fehlbewertungen führen könnten.
  5. Sammeln Sie Daten aus mindestens drei verschiedenen Sichtfeldern. Sobald die Erfassung abgeschlossen ist, analysieren Sie die Daten und identifizieren Sie die Elemente, die von Interesse sind.

5. Zellkultur

  1. Die Kultur immortalisierte BEAS-2B-Zellen in Medien, die mit 5 % fötalem Kälberserum (FBS) und 0,2 % Penicillin/Streptomycin ergänzt wurden.
    HINWEIS: Es sollten Passagen zwischen 5 und 10 verwendet werden, um sicherzustellen, dass zuvor keine phänotypischen Veränderungen in der verwendeten Zellcharge stattgefunden haben37 (alle Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt).
  2. Nehmen Sie eine 100-mm-Zellkulturplatte und geben Sie 10 ml des Mediums auf die Platte. Geben Sie 1 ml der BEAS-2B-Zelllösung auf die Platte.
  3. Legen Sie die Platte in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO2) und lassen Sie die Zellen wachsen.
  4. Überprüfen Sie die Platte nach 24 Stunden, um festzustellen, ob die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben. Dabei bezieht sich die 80%ige Konfluenz auf den Prozentsatz der Oberfläche, der von anhaftenden Zellen bedeckt ist. Ist dies nicht der Fall, wechseln Sie das Medium und lassen Sie die Zellen wachsen, bis der Konfluenzgrad von 80 % erreicht ist.

6. Zählung der Zellen

  1. Sobald die Zellen auf der Platte eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, entfernen Sie das Medium von der Platte. Waschen Sie die Platte mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  2. Entfernen Sie das PBS von der Platte. 2 ml Trypsin auf die Platte geben und für 2 Minuten in den Inkubator (37 °C, 5 % CO2) geben.
  3. Geben Sie 2 ml Medien auf die Platte und pipepieren Sie das Medium auf und ab, um die Zellen von der Platte zu entfernen. Die Lösung wird in ein 15-ml-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 123 x g zentrifugiert.
  4. Entfernen Sie den Überstand aus dem Röhrchen und fügen Sie 2 ml Medien hinzu. Pirätieren Sie das Medium nach oben und unten, um die Zellen neu zu dispergieren.
  5. Geben Sie in einem 1,5-ml-Röhrchen 20 μl Trypanblau und dann 20 μl der Zelllösung hinzu (1:1-Verhältnis von Trypanblau zu Zelllösung).
  6. Geben Sie 10 μl der Zellmischung auf einen Objektträger und legen Sie ihn auf einen automatischen Zellzähler. Warten Sie, bis der Bildschirm scharf gestellt wird, und wählen Sie dann Aufnahme aus.
  7. Auf dem Bildschirm werden die Anzahl der lebenden Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen angezeigt. Der Messbereich erstreckt sich von 1 x 104-1 x 107 Zellen.
  8. Alternativ können Sie die Zellen manuell mit einem Hämozytometer zählen.
    1. Dazu geben Sie 15-20 μl der mit Trypanblau behandelten Zelllösung in das Hämozytometer.
    2. Verwenden Sie ein aufrechtes Mikroskop mit einem 10-fachen Objektivfokus auf die Gitterlinien des Hämozytometers.
    3. Zähle die Anzahl der Zellen in den vier äußeren Quadraten und teile die Zahl durch vier. Multiplizieren Sie dann mit 10.000, um die Zahl der lebenden Zellen zu erhalten.
    4. Um die Zellviabilität zu berechnen, addieren Sie die Anzahl der lebenden und toten Zellen, um die Gesamtzahl der Zellen zu erhalten, und dividieren Sie anschließend die Anzahl der lebenden Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen.

7. ZIF-8 Dosis-Präparat

  1. Stellen Sie eine ZIF-8-Stammlösung von 1 mg/ml her. Messen Sie dazu die Menge an ZIF-8 und fügen Sie den Partikeln deionisiertes (DI) Wasser hinzu, um eine Konzentration von 1 mg/ml zu erreichen.
  2. Beschallen Sie die ZIF-8-Stammlösung für 2 Minuten in 30-s-Intervallen in einem Wasserbad (stellen Sie den Beschaller auf Schall).
  3. Stellen Sie verschiedene Dosen von ZIF-8 für zelluläre Expositionen her, indem Sie die Menge der Stammlösung und des modifizierten Adlermediums (DMEM) von Dulbecco berechnen, die benötigt wird, um die gewünschten Dosen zu erreichen, indem Sie die Gleichung C 1 V1= C 2 V2verwenden. Die Dosen liegen zwischen 0 und 950 μg/ml.
    HINWEIS: In diesem Experiment wurden Dosen von 0 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml und 950 μg/ml ausgewählt.

8. Halbmaximale Hemmkonzentration (IC 50)

  1. Nach der Zellzählung werden die BEAS-2B-Zellen mit einer Dichte von 4 x 104 Zellen/ml in einer 96-Well-Platte mit einem Volumen von 100 μl/Well ausgesät.
    1. Um eine Dichte von 4 x 104 Zellen/ml zu erreichen, verwenden Sie C 1 V1= C 2 V2, um dieMenge der Zelllösung zu berechnen, die mit dem Medium kombiniert werden muss.
    2. Stellen Sie sicher, dass für jede Dosis Blindvertiefungen beibehalten werden. Lassen Sie diese Vertiefungen bis zur ZIF-8-Exposition leer.
  2. Legen Sie die 96-Well-Platte bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator und lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang zu einer konfluenten Monoschicht wachsen.
  3. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und setzen Sie die BEAS-2B-Zellen ZIF-8-Dosen im Bereich von 0-950 μg/ml aus. Geben Sie 100 μl ZIF-8 in die jeweiligen Blind- und Zellvertiefungen.
  4. Legen Sie die 96-Well-Platten für eine Einwirkzeit von 48 Stunden zurück in den Inkubator.
  5. Nach der Exposition werden 10 μl 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzoldisulfonat (WST-1) in jede Vertiefung (Blind- und Zellvertiefungen) gegeben und 2 h lang inkubiert. Die Medien bleiben in den Brunnen; Das Verhältnis beträgt 1:10 (Reagenz:Medium).
  6. Lesen Sie die Änderungen der Absorption auf einem Plattenleser mit einer Absorption von 485 nm ab.
  7. Berechnen Sie die Zellviabilität mit Hilfe der Software, um den IC 50-Wert zu bestimmen (siehe Abschnitt10 ).

9. Elektrische Zell-Substrat-Impedanzmessung (ECIS)

  1. Verwenden Sie eine 96-Well-Platte (96W10idf), um eine ECIS-Analyse durchzuführen. Die Platte28 enthält interdigitalisierte Fingerverbindungselektroden, die einen Bereich von etwa 4mm2 abdecken.
  2. Testen Sie zunächst, ob alle Wells von den Sensoren gelesen werden. Legen Sie dazu die 96-Well-Platte auf die Well-Station und klicken Sie auf die Schaltfläche Setup .
  3. Wenn die Vertiefungen richtig angeschlossen sind, erscheint grün; Alle nicht verbundenen Vertiefungen werden rot gekennzeichnet. Wenn ein solcher Fall auftritt, entfernen Sie die Well-Platte, setzen Sie sie wieder ein und klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Setup , bis alle Wells brauchbare grüne Messwerte anzeigen.
  4. Stabilisieren Sie die Elektroden 40 Minuten lang mit 200 μl Medien pro Well, um eine mögliche Drift zu vermeiden. Geben Sie 200 μl Medien in jede Vertiefung, die verwendet wird, und legen Sie dann die 96-Well-Platte auf die ECIS-Station. Klicken Sie auf Setup/Check, um sicherzustellen, dass die Platte richtig angeschlossen ist. Klicken Sie auf Stabilisieren.
  5. Sobald die Stabilisierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus der Station und entfernen Sie die Medien aus jeder Vertiefung.
  6. Säen Sie die BEAS-2B-Zellen mit einer Dichte von 4 x 104 Zellen/ml mit einem Volumen von 100 μl pro Vertiefung in die Vertiefungen, die die Zellen enthalten, und legen Sie die Platte auf die ECIS-Station im Inkubator.
  7. Klicken Sie auf dem Monitor auf Überprüfen , um festzustellen, ob alle Elektroden von den Sensoren an der Station gelesen werden.
  8. Richten Sie die Zeitverlaufsmessung ein, indem Sie Multiple Freq/Time (MFT) auswählen. Das Programm misst jeden Brunnen mit sieben verschiedenen Frequenzen.
  9. Klicken Sie auf Start und lassen Sie es 24 Stunden lang laufen, damit die Zellen eine konfluente Monoschicht bilden können.
  10. Nach 24 Stunden zeigen die Vertiefungen mit den Zellen auf dem Monitor einen erhöhten Widerstand. Dies ist ein Indikator dafür, dass sich Zellen an den Elektroden festgesetzt haben.
  11. Drücken Sie auf Pause auf dem Monitor, um die Datenerfassung zu beenden.
  12. Stellen Sie die ZIF-8-Dosen bei, über und unter dem berechneten IC50-Wert ein, indem Sie die in Abschnitt 7 oben beschriebenen Schritte ausführen.
  13. Belichten Sie die ZIF-8-Nanopartikel mit einem Volumen von 100 μl pro Well in ihren jeweiligen Blind- und Zellvertiefungen und legen Sie die 96-Well-Platte wieder auf die Station.
  14. Klicken Sie auf dem Monitor erneut auf Prüfen , um sicherzustellen, dass die Sensoren alle Elektroden lesen. Klicken Sie auf Fortsetzen und lassen Sie das System 72 Stunden lang laufen, um das Verhalten und die Bindung des Mobilfunks zu überwachen.
  15. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, klicken Sie auf dem Monitor auf Fertig stellen . Um die Datei zu speichern, klicken Sie auf Datei > Speichern unter. Speichern Sie die Daten als Tabellenkalkulationsdatei.
  16. Um die Alpha-Parameter zu erhalten, klicken Sie auf Modell. Klicken Sie im Pop-up-Fenster auf " Nur Medien" und wählen Sie dann das Feld aus, in dem sich nur Medien befinden.
  17. Klicken Sie auf Set Ref. Klicken Sie auf dem Monitor auf Suchen.
  18. Wenn die im System angezeigte Bohrung nicht mit der ausgewählten übereinstimmt, wiederholen Sie Schritt 9.16.
  19. Klicken Sie auf Festlegen. Klicken Sie auf T-Range anpassen , um den gewünschten Zeitraum für die Datenerfassung festzulegen.
  20. Klicken Sie während der Verarbeitung auf Alpha. Wenn das System die Analyse abgeschlossen hat, klicken Sie auf RbA speichern und speichern Sie es als Tabellenkalkulationsdatei.
    HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie im ECIS-Handbuch, das auf der Website des Herstellers38 zu finden ist.

10. Datenanalyse

  1. SEM
    1. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware, um die REM-Bilder zu analysieren. Klicken Sie auf Datei > Öffnen, und wählen Sie dann das zu analysierende Bild aus.
    2. Klicken Sie auf Bild > geben Sie > 8 Bit ein, um das Bild in Graustufen umzuwandeln und den Schwellenwert auszuführen.
    3. Kalibrieren Sie die Abstandsmessung von Pixeln auf Mikrometer. Klicken Sie auf das Werkzeug Geradlinig und verfolgen Sie die Länge jedes Partikels, das gemessen werden soll.
    4. Klicken Sie auf " Analysieren " und dann auf "Skalierung festlegen". Die bekannte Entfernung wird auf die Länge der Größe der Maßstabsleiste auf dem REM-Bild festgelegt. Die bekannte Längeneinheit wird auf Mikrometer festgelegt. Aktivieren Sie Global und drücken Sie OK.
    5. Klicken Sie auf das Werkzeug Geradlinige Linie , zeichnen Sie den Durchmesser des Partikels nach und wählen Sie dann Analysieren und Messen. Notieren Sie das Längenergebnis.
    6. Wiederholen Sie den Vorgang für alle gesammelten Bilder. Mittelwert aller Durchmesser von mindestens 60 Partikeln für eine geeignete statistische Auswertung.
  2. EDX
    1. Berechnen Sie den Durchschnitt aller Gewichtsprozentsätze der einzelnen Elemente aus allen gesammelten Bildern (siehe EDX-Abschnitt oben).
    2. Zeichnen Sie mithilfe einer Tabelle ein Balkendiagramm für jedes Element auf der x-Achse und seinen durchschnittlichen Elementgewichtsprozentsatz auf der y-Achse.
  3. IC50
    1. Berechnen Sie den Mittelwert der Blindvertiefungen und den Mittelwert der Dosisvertiefungen für jedes Replikat.
    2. Berechnen Sie den angepassten Blindwert, indem Sie den Durchschnitt des Kontrollblindwerts vom Durchschnitt des Blindwerts subtrahieren. Berechnen Sie den wahren Zellwert für jede Dosis, indem Sie den angepassten Blindwert vom durchschnittlichen Dosiswert subtrahieren.
    3. Subtrahieren Sie den eingestellten Blindwert für jede Dosis vom durchschnittlichen Kontrollwert. Berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit jeder Dosis mit der folgenden Gleichung: Zelllebensfähigkeit = (wahrer Zellwert/(Kontrollwert - angepasster Blindwert)) x 100.
    4. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle anderen Replikationen.
    5. Bilden Sie den Mittelwert der Zelllebensfähigkeit für jedes Replikat, um die endgültige Zelllebensfähigkeit für jede Dosis zu erhalten.
    6. Wählen Sie in der Software die Registerkarte XY auf dem Bildschirm.
    7. Geben Sie die Konzentrationswerte (Dosis) in die Spalte X und die Zellviabilität (%) jeder Dosis in die Spalte Y ein.
    8. Transformieren Sie die X-Werte, indem Sie auf Analysieren > Transformieren > OK und auf X = Log(X) transformieren klicken.
    9. Normalisieren Sie die Y-Werte, indem Sie das Blatt " Transformierte Daten " auswählen, auf " Analysieren" klicken und dann "Normalisieren" auswählen.
    10. Wählen Sie das Datenblatt Normalisieren der Transformation aus, klicken Sie auf Analysieren, und wählen Sie Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) aus. Wählen Sie Dosis-Wirkungs-Hemmung aus, und klicken Sie auf Log(Inhibitor) vs. Response-Variable Slope (Four Parameters). Klicken Sie auf OK , um die Ergebnisse anzuzeigen.
  4. ECIS
    1. Entnehmen Sie aus der Tabelle die Widerstandsspalten (Ohm) für jedes Replikat (Blindvertiefungen und Dosisvertiefungen) und mitteln Sie sie aus der Frequenz von 4.000 Hz. Diese Frequenz ermöglicht die Auswertung des Zell-Zell-Kontakts38.
    2. Berechnen Sie den korrigierten Widerstand, indem Sie den gemittelten Blindwert von der gemittelten Dosis für jede Wiederholung subtrahieren. Mittelwert der korrigierten Resistenz für die Replikate für jede Dosis.
    3. Wiederholen Sie die gleichen Schritte für die Alphawerte, um den durchschnittlichen Alphaparameter zu berechnen. Zeichnen Sie die x-Achse als Zeit (h) und die y-Achse als die durchschnittlichen Widerstands-/Alphawerte für jeden Dosiswert auf.

11. Statistische Analyse

  1. SEM
    1. Führen Sie eine Standardabweichung in der Tabellenkalkulationsdatei durch, in der die durchschnittlichen Durchmesser der ZIF-8-Partikel berechnet wurden.
    2. Markieren Sie mithilfe der STABW-Funktion in der Tabelle die Daten der 60 Partikel und drücken Sie die Eingabetaste. Grafische Darstellung der Standardabweichung für jeden berechneten durchschnittlichen Durchmesser.
  2. EDX
    1. Ähnlich wie beim SEM (Schritte 11.1.1-11.1.2) berechnen Sie die Standardabweichung für jede durchschnittliche Elementzusammensetzung mit der Funktion STABW in der Tabelle. Stellen Sie die Standardabweichungen für jede durchschnittliche Elementzusammensetzung grafisch dar.
  3. IC50
    1. Öffnen Sie die Software zur Berechnung des IC50 und klicken Sie auf Gruppiertes Datenblatt.
    2. Geben Sie die ZIF-8-Dosen in die mit Gruppe A, Gruppe B usw. beschrifteten Zeilen ein. Geben Sie die durchschnittliche Zelllebensfähigkeit für jede Dosis ein und replizieren Sie sie in der Spalte, die der ZIF-8-Dosis entspricht.
    3. Klicken Sie auf " Analysieren" und wählen Sie unter " Spaltenanalysen" die Option "Unidirektionale ANOVA" (und nicht parametrisch oder gemischt) aus.
    4. Wählen Sie auf der Registerkarte " Versuchsplanung " die Option " Kein Abgleich oder Kopplung" aus. Wählen Sie unter Gaußsche Verteilung der Residuen die Option Ja verwenden, ANOVA verwenden. Wählen Sie abschließend Ja Gewöhnlichen ANOVA-Test verwenden unter Gleiche SDs annehmen aus.
    5. Wählen Sie auf der Registerkarte " Mehrfachvergleiche " die Option "Mittelwert jeder Spalte mit dem Mittelwert einer Kontrollspalte vergleichen" aus. Klicken Sie auf OK , um die Ergebnisse anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Unter Verwendung einer gemeinsamen In-vitro-Modellzelllinie39 (BEAS-2B) zielte diese Studie darauf ab, die Machbarkeit und Anwendbarkeit von ECIS zur Beurteilung von Veränderungen des Zellverhaltens bei Exposition gegenüber einem im Labor synthetisierten MOF zu demonstrieren. Diese Bewertung der Veränderungen wurde durch Analysen mittels konventioneller kolorimetrischer Assays ergänzt.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Gerüsts wurden zunächst bewertet, um die Reproduzierbarkeit der verwendeten Methoden, die Validität der erzielten Ergebnisse und die entsprechende Diskussion dieser Ergebnisse sicherzustellen. Die Analyse der Oberflächenmorphologie von ZIF-8 wurde beispielsweise mittels REM durchgeführt; Die Bilder zeigten, dass die Gerüste eine rhombische Dodekaeder-Morphologie40 aufwiesen und eine durchschnittliche Größe von 62,87 nm ± 9,61 nm aufwiesen (Abbildung 1A). Die elementare Zusammensetzung der MOFs wurde mittelsEDX-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Hauptzusammensetzung von ZIF-8 aus C, N und Zn (d. h. der Zusammensetzung des Imidazolat-Linkers und des Metallions Zn16) bestand (Abbildung 1B). Frühere Röntgenbeugungen zeigten, dass die kristallinen Phasen von ZIF-8 spezifische Peaks bei 10,33°, 12,8°, 14,7°, 16,5° und 18° identifiziert haben, wobei diese Peaks den Ebenen (002), (112), (022), (013) und (222) 16,41 zugeordnet wurden.

Für das vorgeschlagene Zellverhaltens-Screening wurde der IC 50 (Konzentration, in der ZIF-8 das Zellwachstum um50 % hemmt) bestimmt29. Dazu wurden die Zellen 48 Stunden lang ZIF-8 in Dosen von 0-950 μg/ml ausgesetzt (Abbildung 2A). Das Dosis-Wirkungs-Diagramm der exponierten Zellen ist in Abbildung 2B dargestellt, mit dem anschließend aufgezeichneten IC50 von 35,7 μg/ml. Darüber hinaus ergab die Analyse einen dosisabhängigen Trend in der Lebensfähigkeit von Zellen bei Exposition gegenüber dem ZIF-8.

Nach der Bestimmung des IC50 wurde eine ECIS-Analyse durchgeführt. Kurz gesagt, ECIS wurde als Echtzeit-Screening-Strategie von BEAS-2B verwendet, das ZIF-8-MOFs bei IC50 sowie unter und über dieser Konzentration ausgesetzt wurde, nämlich 15,7 μg/ml (C1), 35,7 μg/ml (C2), 55,7 μg/ml (C3) bzw. 75,7 μg/ml (C4), wobei die Zellen für einen Gesamtzeitraum von 72 Stunden exponiert wurden. Die Einbeziehung von ECIS sollte einen Einblick in die Bestimmung von Veränderungen der Zellabdeckung, Morphologie und Lebensfähigkeit in Echtzeit ermöglichen. Die ECIS-Ergebnisse wurden als Änderungen der Resistenz und Veränderungen der Zell-Substrat-Interaktionen, nämlich des Alpha-Parameters42, aufgezeichnet.

Die Resistenztrends sind in Abbildung 3A als Veränderungen in den Profilen der mit ZIF-8 behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle (schwarze Linie) (d.h. nicht exponierte Zellen) dargestellt. Insbesondere zeigte die Analyse, dass die Wells, die Zellen auf den Goldelektroden enthielten, die C2-C4-Dosen ausgesetzt waren, unmittelbar nach der Zellexposition gegenüber den Gerüsten einen anfänglichen leichten Anstieg des Widerstands zeigten (alle relativ zur Kontrolle [d.h. nicht exponierte Zellen]). Auf diese anfänglichen Veränderungen folgte in der Folge eine starke Abnahme der aufgezeichneten Widerstände, wobei solche Abnahmen zwischen 6 und 8 Stunden nach der Exposition vorherrschten (Abbildung 3A). Ein vollständiger Widerstandsverlust wurde nach 14-18 h nach der Expositionszeit beobachtet. Zellen, die Dosen unterhalb des IC50-Wertes ausgesetzt waren, zeigten Resistenzen, wie die Wells mit Kontrollzellen, bis etwa 16-18 Stunden nach der Exposition, wenn Widerstandsverluste auftraten. Auch während der zellulären Exposition wurde eine kontinuierliche Signalstörung des Signals der in den Experimenten verwendeten Vertiefungen beobachtet. Diese Perurbanzen blieben während der Analyse des Alpha-Parameters bestehen (Abbildung 3B), wobei diese Analyse weiter zeigte, dass exponierte Zellen ihre Zell-Substrat-Interaktionen mit Profilen ändern, die denen der Resistenz ähneln. Darüber hinaus waren solche Veränderungen abhängig von der Zeit ab der Exposition und der bei dieser Exposition verwendeten Dosis.

Figure 1
Abbildung 1: REM-Bild und durchschnittliche Elementzusammensetzung der ZIF-8-Partikel. (A) Repräsentatives REM-Bild der ZIF-8-Partikel. (B) Durchschnittliche Elementzusammensetzung der ZIF-8-Partikel (± Standardabweichung [SD]-Balken). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Lebensfähigkeit der Zellen. (A) Schematische Darstellung der Zellbehandlung (erstellt mit Biorender.com). (B) Lebensfähigkeit von BEAS-2B-Zellen, die ZIF-8-Partikeln in Dosen von 0 bis 950 μg/ml ausgesetzt wurden; Diese Analyse wurde verwendet, um den IC50 (± SD-Balken; ***p = 0,0001 und **** p < 0,0001 relativ zur Kontrolle) zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentativer zellulärer Widerstand und Veränderungen der zellulären Bindung. (A) Repräsentative zelluläre Resistenz von BEAS-2B-Zellen, die ZIF-8-Partikeln unter, bei und über der IC50-Konzentration ausgesetzt waren. (B) Veränderungen in der zellulären Bindung (d. h. Änderungen des Alpha-Parameters) von BEAS-2B-Zellen bei Exposition gegenüber ZIF-8-Partikeln unterhalb und oberhalb der IC50-Konzentration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Frühere Analysen zeigten, dass ECIS verwendet werden kann, um das Verhalten von Zellen zu bewerten, die Analyten ausgesetzt sind (d. h. Kohlenstoffnanoröhren35, Medikamente43 oder Nanotonerde16). Darüber hinaus verwendeten Stueckle et al. ECIS, um die Toxizität von BEAS-2B-Zellen zu bewerten, die Nanotonerden und ihren Nebenprodukten ausgesetzt waren, und stellten fest, dass das zelluläre Verhalten und die Anheftung von den physikalisch-chemischen Eigenschaften solcher Materialien abhingen42. In dieser Arbeit schlugen wir vor, die möglichen Veränderungen von BEAS-2B-Zellen als Reaktion auf die Exposition gegenüber MOFs zu bestimmen, um so zum Wissensstand beizutragen, der darauf abzielt, schädliche Wirkungen von ZIF-8 auf zelluläre Systeme in vitro zu differenzieren, und das alles in einer Hochdurchsatz- und Echtzeit-Weise.

Die Analyse ermöglichte zunächst die Bewertung von Gerüsteigenschaften, um so die Änderungen des zellulären Verhaltens mit den physikalisch-chemischen Eigenschaften der getesteten MOFs44 zu korrelieren. Insbesondere bei zellulärer Exposition gegenüber MOFs mit regelmäßigen Geometrien ähnlicher elementarer Zusammensetzung (siehe Ergebnisse oben) zeigte die Analyse Veränderungen im zellulären Verhalten, die vermutlich auf die Aufnahme der Gerüste und deren zellulären Profilabbau zurückzuführen sind. Insbesondere in Bezug auf die Aufnahme zeigten frühere Analysen der Toxizität an hydrophoben Materialien, wie z. B. diesem Rahmen, dass die Aufnahme solcher Materialien, wenn sie Zellen ausgesetzt sind, eine zelluläre Membran stärker stört als die Aufnahme ihrer hydrophilen Gegenstücke, vermutlich aufgrund ihrer Fähigkeit, Lipide aus der strukturellen Doppelschicht der Membran zu entfernen16, 45 während ihrer zellulären Translokation, was zu Membrandysfunktionen oder Plasmamembranstörungen 46,47 führt. Insbesondere wurde gezeigt, dass die Lipidentfernung zu Veränderungen der Membranintegrität, der Zellsignalisierung48 und einer Erhöhung der zellulären Aufnahme49 führt, mit einer Kehrseite der Zellfunktionseffekte. Zum Beispiel zeigten Farcal et al., dass ein hydrophobesTiO2-Nanomaterial im Vergleich zu seinem hydrophilen Gegenstück in exponierten Alveolarmakrophagen eine erhöhte zytotoxische Wirkung hatte50. Darüber hinaus zeigten Wagner et al., dass hydrophobes ZIF-8 im Vergleich zu hydrophilem MIL-16016 mehr Störungen an BEAS-2B-Zellen verursachte.

Die aufgezeichneten Veränderungen im Zellverhalten sind vermutlich auf Störungen der Zell-Substrat-Wechselwirkungen26 und/oder der Zelllebensfähigkeit und -proliferation16 auf die Elektroden als Ergebnis der Zellexposition gegenüber dem ausgewählten Gerüst zurückzuführen. Zum Beispiel untersuchten Wagner et al. ähnliche Parameter in Zellen, die Nanoclays ausgesetzt waren. Die Autoren stellten fest, dass im Verlauf der 72-Stunden-Experimente ein vollständiger Verlust der Zell-Substrat-Interaktion beobachtet wurde. Darüber hinaus zeigten die Autoren einen zeitabhängigen Effekt auf die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen, wenn die BEAS-2Bs den von ihnen ausgewählten Nanotonen ausgesetzt wurden26. Während es sich bei den Partikeln, die hier getestet werden, um MOFs handelt, ist die mögliche erweiterte Assoziation mit den Effekten, die für Nanoclays beobachtet werden, möglich, da einige der physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Partikel (nämlich Größe, Hydrophobizität und Zusammensetzung) denen der MOFs ähneln. Darüber hinaus zeigten Stueckle et al. auch zeit- und behandlungsabhängiges zelluläres Verhalten, wenn Nanotonerde immortalisierten BEAS-2B-Zellen ausgesetzt wurden. Andere haben gezeigt, dass ZIF-8 in einer Dosis von 100 μg/ml dazu führt, dass BEAS-2B-Zellen einen vollständigen Verlust der Zellmonoschicht und der Zelllebensfähigkeit aufweisen, was vermutlich auf Veränderungen der Zell-Substrat-Wechselwirkungen zurückzuführenist 16. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass in solchen Studien die ZIF-8-Partikel unter verschiedenen Synthesebedingungen (d. h. 10 min gegenüber 24 h, die in dieser Studie verwendet wurden) erhalten wurden, wobei diese Synthesebedingungen in der Folge zu unterschiedlichen Formen/Morphologien der Gerüste führten, um so frühere Schlussfolgerungen zu unterstützen. Dies zeigt, dass die Reaktionszeit6, die Temperatur2 und das Lösungsmittel44 , die während der Partikelsynthese verwendet werden, ihre Form, Größe und Zusammensetzungsprofile beeinflussen und in der Folge zu unterschiedlichen Effekten und Verhaltensweisen in exponierten Zellen führen.

Die Analyse zeigte auch, dass Zellen, die ZIF-8-Dosen unterhalb des IC50-Wertes ausgesetzt waren, ähnliche Resistenzen wie die Kontrollen aufwiesen, vermutlich weil solche Dosen nicht signifikant genug waren, um eine ECIS-beobachtbare Zelltransformation unter den Bedingungen und im Zeitrahmen zu induzieren, unter denen diese Experimente durchgeführt wurden. Bei Dosen über IC50 wurde jedoch ein vollständiger Verlust der zellulären Resistenz beobachtet, und zwar nur innerhalb weniger Stunden nach der Exposition, höchstwahrscheinlich aufgrund von Veränderungen der Zelllebensfähigkeit und induzierten möglichen Veränderungen der Zell-Substrat-Interaktionen16 (Abbildung 3A). Diese Behauptungen werden durch frühere Studien gestützt, die zeigten, dass nicht lebensfähige Zellen ihre Form ändern und sich von den Substraten lösen. Zum Beispiel verwendeten Verma et al. eine Echtzeit-Impedanzsensortechnik, um die Zytotoxizität von Nanoclays in einer menschlichen Alveolarepithelzelllinie zu bewerten (A549). Es wurde gezeigt, dass die Nanotonerde vom Plättchentyp eine Erhöhung der Anzahl der abgelösten und deformierten Zellen im Vergleich zu den Nanotonen des röhrenförmigen Typs51 verursachten. Darüber hinaus zeigten Xiao et al., dass das Zytoskelett von fibroblastischen V79-Zellen beeinträchtigt wurde, wenn sie Cadmiumchlorid ausgesetzt waren, was auf einen Einstrom von Wasser, extrazellulären Ionen und zytotoxischen Chemikalien aus dem Kulturmedium zurückzuführen war. Die Veränderungen im Zellzytoskelett führten zum Verlust von Zell-Substrat-Interaktionen. Darüber hinaus gab es, wenn Benzalkoniumchlorid V79-Zellen ausgesetzt wurde, eine signifikante Abnahme des zellulären Widerstands aufgrund einer Schädigung der Zellmembran, die die Exposition verursachte52.

Veränderungen der Resistenz können auch auf die Zellreaktionen auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften von ZIF-8 zurückzuführen sein. Insbesondere ZIF-8 ist ein hydrophobes Gerüst; Frühere Analysen haben gezeigt, dass Hydrophobie zu einer Erhöhung der Toxizität führen kann16. Es wurde auch bereits gezeigt, dass Metallionen wie Zn im Vergleich zu anderen Metallen wie Zr undFe1 einen höheren Grad an Toxizität induzieren, was möglicherweise zu einem höheren Zelltod beiträgt.

Es wurde weiterhin gezeigt, dass alle Zellen direkt nach der Exposition eine anfängliche Abnahme der Resistenz verzeichneten, gefolgt von einem anschließenden Anstieg. Eldawud et al. zeigten ähnliche Effekte, wenn SWCNTs BEAS-2B-Zellen ausgesetzt wurden. Die Autoren interpretierten den Anstieg des zellulären Widerstands als darauf zurückzuführen, dass die BEAS-2B-Zellen die durch die Materialexposition verursachten Störungen überwunden und anschließend ihre Integrität wiedererlangthaben 18 , während die Elektrodendrift28 eliminiert wurde, um so die Reproduzierbarkeit der Datenanalyse zu gewährleisten (siehe ECIS-Handbuch).

Auch wenn diese Studie gezeigt hat, dass ECIS ein wertvolles Werkzeug für das Zellverhaltens-Screening sein könnte, insbesondere aufgrund der Hochdurchsatzfunktion, wird empfohlen, dass die Technik keine Single-Point-Assays ersetzt, wenn ein vollständiges Bild der schädlichen Bewertung eines Materials gewünscht wird. Insbesondere könnte der Single-Point-Assay die Bewertung der Zelltransformation auf ihrer genetischen Ebene 45,53 ermöglichen, wie von Eldawud et al. gezeigt, z. B. für BEAS-2B-Zellen, die Nanodiamanten ausgesetzt sind, und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)45.   Yu et al. verwendeten FACS auch, um menschliche Darmkrebszellen (HCT0116) zu bewerten, die Hyaluronsäure-modifizierten mesoporösen Siliziumdioxid-Nanopartikeln (HA-MSNs) ausgesetzt waren54.

Die vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Weg der Veränderung von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der MOFs sowie von der Zeit und Dosierung solcher Gerüste abhängt, die in Expositionen verwendet werden. Die hier beschriebenen Ergebnisse und Methoden unterstreichen die Bedeutung von Echtzeitmessungen und ihre Vorteile für das Verständnis der Veränderungen in zellulären Profilen. Diese können möglicherweise durch zusätzliche biochemische Assays ergänzt werden, um den Mechanismus der Toxizität zu bewerten, was zu Safe-by-Design-Strategien von MOFs führt, die keine schädlichen Auswirkungen auf das Zellverhalten haben, aufgezeichnet als Zellanhaftung, Zell-Zell-Interaktionen oder Zell-Substrat-Interaktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren berichten über keine Interessenkonflikte in dieser Arbeit.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise vom T32-Programm des National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (T32 GM133369) und der National Science Foundation (NSF 1454230) finanziert. Darüber hinaus werden die WVU Shared Research Facilities und die Applied Biophysics Unterstützung und Unterstützung gewürdigt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)  Roche 5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25255-056
100 mm plates Corning 430167
1300 Series A2 biofume hood Thermo Scientific 323TS
2510 Branson bath sonicator Process Equipment & Supply, Inc.  251OR-DTH
2-methylimidazole, 97% Alfa Aesar 693-98-1
5 mL sterile microtube Argos Technologies T2076S-CA
50 mL  tubes  Falcon 352098
96W10idf well plates Applied Biophysics  96W10idf PET
96-well plates Fisherbrand FB012931
Biorender Biorender N/A
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess II FL automated cell counter Life Technologies C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater Denton Vacuum N/A
Dimethly sulfoxide  Corning 25-950-CQC
DPBS/Modified Cytiva SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium Corning 10-014-CV
ECIS-ZΘ Applied Biophysics  ABP 1129
Excel Microsoft Version 2301
Falcon tubes (15 mL) Corning 352196
Fetal bovine serum Gibco 16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader BMG LABTECH 413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0) GraphPad Software, LLC Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray  Hitachi High-Technologies Corporation S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells American Type Culture Collection CRL-9609
Isotemp freezer Fisher Scientific 
Methanol, 99% Fisher Chemical 67-56-1
Parafilm sealing film The Lab Depot HS234526A
Penicillin/Steptomycin Gibco 15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge  Thermo Scientific 75004220
Sorvall T 6000B DU PONT  T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS MP Biomedicals, LLC 1691049
Vacuum Chamber Belart 999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure Acros Organic 101-96-18-9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tamames-Tabar, C., et al. Cytotoxicity of nanoscaled metal-organic frameworks. Journal of Materials Chemistry. B. 2 (3), 262-271 (2014).
  2. Lin, W. X., et al. Low cytotoxic metal-organic frameworks as temperature-responsive drug carriers. ChemPlusChem. 81 (8), 804-810 (2016).
  3. Vasconcelos, I. B., et al. Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF-8. RSC Advances. 2 (25), 9437-9442 (2012).
  4. Yang, B. C., Shen, M., Liu, J. Q., Ren, F. Post-synthetic modification nanoscale metal-organic frameworks for targeted drug delivery in cancer cells. Pharmaceutical Research. 34 (11), 2440-2450 (2017).
  5. Lucena, M. A. M., et al. Application of the metal-organic framework Eu(BTC) as a luminescent marker for gunshot residues: A synthesis, characterization, and toxicity study. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (5), 4684-4691 (2017).
  6. Kayal, S., Sun, B. C., Chakraborty, A. Study of metal-organic framework MIL-101(Cr) for natural gas (methane) storage and compare with other MOFs (metal-organic frameworks). Energy. 91, 772-781 (2015).
  7. Gutov, O. V., et al. Water-stable zirconium-based metal-organic framework material with high-surface area and gas-storage capacities. Chemistry. 20 (39), 12389-12393 (2014).
  8. Ghorbanloo, M., Safarifard, V., Morsali, A. Heterogeneous catalysis with a coordination modulation synthesized MOF: morphology-dependent catalytic activity. New Journal of Chemistry. 41 (10), 3957-3965 (2017).
  9. Valvekens, P., et al. Base catalytic activity of alkaline earth MOFs: a (micro) spectroscopic study of active site formation by the controlled transformation of structural anions. Chemical Science. 5 (11), 4517-4524 (2014).
  10. Taylor, K. M. L., Rieter, W. J., Lin, W. B. Manganese-based nanoscale metal-organic frameworks for magnetic resonance imaging. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14358-14359 (2008).
  11. Taylor-Pashow, K. M. L., Della Rocca, J., Xie, Z. G., Tran, S., Lin, W. B. Postsynthetic modifications of iron-carboxylate nanoscale metal-organic frameworks for imaging and drug delivery. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14261-14263 (2009).
  12. Kundu, T., et al. Mechanical downsizing of a gadolinium(III)-based metal-organic framework for anticancer drug delivery. Chemistry. 20 (33), 10514-10518 (2014).
  13. Orellana-Tavra, C., et al. Drug delivery and controlled release from biocompatible metal-organic frameworks using mechanical amorphization. Journal of Materials Chemistry. B. 4 (47), 7697-7707 (2016).
  14. Su, H. M., et al. A highly porous medical metal-organic framework constructed from bioactive curcumin. Chemical Communications. 51 (26), 5774-5777 (2015).
  15. Gandara-Loe, J., et al. Metal-organic frameworks as drug delivery platforms for ocular therapeutics. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (2), 1924-1931 (2019).
  16. Wagner, A., et al. Toxicity screening of two prevalent metal organic frameworks for therapeutic use in human lung epithelial cells. International Journal of Nanomedicine. 14, 7583-7591 (2019).
  17. Chen, G. S., et al. In vitro toxicity study of a porous iron(III) metal-organic framework. Molecules. 24 (7), 1211 (2019).
  18. Eldawud, R., Wagner, A., Dong, C. B., Rojansakul, Y., Dinu, C. Z. Electronic platform for real-time multi-parametric analysis of cellular behavior post-exposure to single-walled carbon nanotubes. Biosensors & Bioelectronics. 71, 269-277 (2015).
  19. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment: Limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (2), 370-377 (2009).
  20. Lucena, F. R. S., et al. Induction of cancer cell death by apoptosis and slow release of 5-fluoracil from metal-organic frameworks Cu-BTC. Biomedicine & Pharmacotherapy. 67 (8), 707-713 (2013).
  21. Orellana-Tavra, C., et al. Tuning the endocytosis mechanism of Zr-based metal-organic frameworks through linker functionalization. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (41), 35516-35525 (2017).
  22. Zucker, R. M., Ortenzio, J. N. R., Boyes, W. K. Characterization, detection, and counting of metal nanoparticles using flow cytometry. Cytometry. Part A. 89 (2), 169-183 (2016).
  23. Robson, A. L., et al. Advantages and limitations of current imaging techniques for characterizing liposome morphology. Frontiers in Pharmacology. 9, 80 (2018).
  24. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  25. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  26. Wagner, A., et al. Toxicity evaluations of nanoclays and thermally degraded byproducts through spectroscopical and microscopical approaches. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861, 3406-3415 (2017).
  27. Wagner, A., et al. Early assessment and correlations of nanoclay's toxicity to their physical and chemical properties. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (37), 32323-32335 (2017).
  28. Wagner, A., et al. Incineration of nanoclay composites leads to byproducts with reduced cellular reactivity. Scientific Reports. 8 (1), 10709 (2018).
  29. Zhao, F., Klimecki, W. T. Culture conditions profoundly impact phenotype in BEAS-2B, a human pulmonary epithelial model. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 945-951 (2015).
  30. Wu, S. X., Wang, W. H., Fang, Y. Z., Kong, X. J., Liu, J. H. Efficient Friedel-Crafts acylation of anisole over silicotungstic acid modified ZIF-8. Reaction Kinetics Mechanisms and Catalysis. 122, 357-367 (2017).
  31. Shu, F. P., et al. Fabrication of a hyaluronic acid conjugated metal organic framework for targeted drug delivery and magnetic resonance imaging. RSC Advances. 8 (12), 6581-6589 (2018).
  32. Shi, Z. Q., et al. FA-PEG decorated MOF nanoparticles as a targeted drug delivery system for controlled release of an autophagy inhibitor. Biomaterials Science. 6 (10), 2582-2590 (2018).
  33. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).
  34. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  35. Eldawud, R., et al. Carbon nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and fate. Nanoimpact. 9, 72-84 (2018).
  36. An, Y., Jin, T. Y., Zhang, F., He, P. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) for profiling cytotoxicity of cigarette smoke. Journal of Electroanalytical Chemistry. 834, 180-186 (2019).
  37. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  38. Applied Biophysics, Allied Biophysics. , Available from: https://biophysics.com (2023).
  39. Park, Y. H., Kim, D., Dai, J., Zhang, Z. Human bronchial epithelial BEAS-2B cells, an appropriate in vitro model to study heavy metals induced carcinogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 287 (3), 240-245 (2015).
  40. Yang, F., et al. Morphological map of ZIF-8 crystals with five distinctive shapes: Feature of filler in mixed-matrix membranes on C3H6/C3H8 separation. Chemistry of Materials. 30 (10), 3467-3473 (2018).
  41. Rose, O. L., et al. Thin films of metal-organic framework interfaces obtained by laser evaporation. Nanomaterials. 11 (6), 1367 (2021).
  42. Stueckle, T. A., et al. Impacts of organomodified nanoclays and their incinerated byproducts on bronchial cell monolayer integrity. Chemical Research in Toxicology. 32 (12), 2445-2458 (2019).
  43. Eldawud, R., et al. Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1864 (11), 129683 (2020).
  44. Zhuang, J., et al. Optimized metal-organic-framework nanospheres for drug delivery: Evaluation of small-molecule encapsulation. ACS Nano. 8 (3), 2812-2819 (2014).
  45. Eldawud, R., et al. Combinatorial approaches to evaluate nanodiamond uptake and induced cellular fate. Nanotechnology. 27 (8), 085107 (2016).
  46. Houthaeve, G., De Smedt, S. C., Braeckmans, K., De Vos, W. H. The cellular response to plasma membrane disruption for nanomaterial delivery. Nano Convergence. 9 (1), 6 (2022).
  47. Otero-Gonzalez, L., Sierra-Alvarez, R., Boitano, S., Field, J. A. Application and validation of an impedance-based real time cell analyzer to measure the toxicity of nanoparticles impacting human bronchial epithelial cells. Environmental Science & Technology. 46 (18), 10271-10278 (2012).
  48. Ibarguren, M., Lopez, D. J., Escriba, P. V. The effect of natural and synthetic fatty acids on membrane structure, microdomain organization, cellular functions and human health. Biochimica et Biophysica Acta. 1838 (6), 1518-1528 (2014).
  49. Nor, Y. A., et al. Shaping nanoparticles with hydrophilic compositions and hydrophobic properties as nanocarriers for antibiotic delivery. ACS Central Science. 1 (6), 328-334 (2015).
  50. Farcal, L., et al. Comprehensive in vitro toxicity testing of a panel of representative oxide nanomaterials: First steps towards an intelligent testing strategy. PLoS One. 10 (5), e0127174 (2015).
  51. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
  52. Xiao, C. D., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: Concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  53. Coyle, J. P., et al. Carbon nanotube filler enhances incinerated thermoplastics-induced cytotoxicity and metabolic disruption in vitro. Particle and Fibre Toxicology. 17 (1), 40 (2020).
  54. Yu, M. H., et al. Hyaluronic acid modified mesoporous silica nanoparticles for targeted drug delivery to CD44-overexpressing cancer cells. Nanoscale. 5 (1), 178-183 (2013).

Tags

Bioengineering Heft 195
Elektrische Zell-Substrat-Sensorik zur Echtzeit-Bewertung von toxikologischen Profilen metallorganischer Gerüstverbindungen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, O. L., Arnold, M., Dinu, C. Z. … More

Rose, O. L., Arnold, M., Dinu, C. Z. Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles. J. Vis. Exp. (195), e65313, doi:10.3791/65313 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter