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Bioengineering

금속-유기 프레임워크 독성 프로파일의 실시간 평가를 위한 전기 전지-기질 감지

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65313
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

Summary

다음 연구는 실시간 고처리량 스크리닝 기술인 전기 전지-기질 임피던스 감지(ECIS)를 활용하여 선택된 금속-유기 프레임워크의 독성학적 프로파일을 평가합니다.

Abstract

금속-유기 프레임워크(MOF)는 유기 용매에서 금속 이온과 유기 링커의 배위를 통해 형성된 하이브리드입니다. 생물 의학 및 산업 응용 분야에서 MOF의 구현은 안전성에 대한 우려를 불러일으켰습니다. 본원에서, 선택된 MOF, 제올라이트 이미다졸 프레임워크의 프로파일을 인간 폐 상피 세포에의 노출시에 평가하였다. 평가를 위한 플랫폼은 실시간 기술(즉, 전기 전지-기판 임피던스 감지[ECIS])이었습니다. 이 연구는 노출된 세포에 대한 선택된 MOF의 유해한 영향 중 일부를 식별하고 논의합니다. 또한, 이 연구는 포괄적인 세포 평가를 위해 다른 생화학적 분석에 비해 실시간 방법을 사용하는 이점을 보여줍니다. 이 연구는 관찰된 세포 행동의 변화가 다양한 물리화학적 특성의 MOF에 노출될 때 유발될 수 있는 독성과 사용되는 프레임워크의 용량을 암시할 수 있다고 결론지었습니다. 세포 행동의 변화를 이해함으로써 물리화학적 특성을 구체적으로 조정하여 생물 의학 응용 분야에 사용되는 MOF의 안전한 설계 전략을 개선할 수 있는 능력을 예측할 수 있습니다.

Introduction

금속-유기 프레임워크(MOF)는 유기 용매에서 금속 이온과 유기 링커 1,2의 조합을 통해 형성된 하이브리드입니다. 이러한 조합의 다양성으로 인해, MOF는 구조적 다양성3, 조정 가능한 다공성, 높은 열 안정성 및 높은 표면적4,5을 갖는다. 이러한 특성은 가스 저장(6,7)에서 촉매(8,9)까지, 그리고 조영제(10,11)에서 약물 전달 유닛(12,13)까지 다양한 응용에서 매력적인 후보가 된다. 그러나 이러한 응용 분야에 MOF를 구현하면 사용자와 환경 모두에 대한 안전에 대한 우려가 제기되었습니다. 예를 들어, 예비 연구들은 MOF 합성에 사용되는 금속 이온 또는 링커에 세포가 노출될 때 세포 기능과 성장이 변화한다는 것을 보여주었다 1,14,15. 예를 들어, Tamames-Tabar et al. Zn 기반 MOF인 ZIF-8 MOF가 Zr 기반 및 Fe 기반 MOF에 비해 인간 자궁경부암 세포주(HeLa) 및 마우스 대식세포 세포주(J774)에서 더 많은 세포 변화를 일으키고 있음을 입증했습니다. 이러한 효과는 아마도 ZIF-8의 금속 성분(즉, Zn)에 기인하는 것으로 추정되며, 이는 프레임워크 붕괴 및 Zn 이온 방출1시 잠재적으로 세포 사멸을 유도할 수 있습니다. 유사하게, Gandara-Loe et al. Cu 기반 MOF인 HKUST-1이 10μg/mL 이상의 농도에서 사용될 때 마우스 망막모세포종 세포 생존율이 가장 높음을 입증했습니다. 이것은 아마도 이 프레임워크의 합성 동안 통합된 Cu 금속 이온 때문이었을 것이며, 일단 방출되면 노출된 세포(15)에서 산화 스트레스를 유도할 수 있습니다.

또한, 분석에 따르면 다른 물리 화학적 특성을 가진 MOF에 노출되면 노출 된 세포의 다양한 반응이 발생할 수 있습니다. 예를 들어, Wagner et al. 불멸화된 인간 기관지 상피 세포의 노출에 사용되는 ZIF-8 및 MIL-160(Al 기반 프레임워크)이 프레임워크의 물리화학적 특성, 즉 소수성, 크기 및 구조적 특성에 따라 세포 반응을 유도한다는 것을 입증했습니다16. 보완적으로, Chen et al. 인간의 정상 간 세포(HL-7702)에 노출된 160μg/mL MIL-100(Fe) 농도가 세포 생존력에 가장 큰 손실을 일으켰으며, 이는 아마도 이 특정 프레임워크의 금속 성분(즉, Fe17)으로 인한 것입니다.

이러한 연구는 물리화학적 특성과 노출 농도에 따라 세포 시스템에 대한 MOF의 유해한 영향을 분류하여 특히 생물 의학 분야에서 프레임워크 구현에 대한 잠재적인 우려를 제기하지만 이러한 평가의 대부분은 단일 시점 비색 분석을 기반으로 합니다. 예를 들어, (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 테트라졸륨(MTT) 및 수용성 테트라졸륨염(WST-1) 분석을 사용했을 때, 이러한 생화학적 시약은 세포가 또한 노출된 입자와의 상호 작용에 대해 위양성을 유발할 수 있는 것으로 나타났습니다18. 테트라졸륨 염 및 중성 적색 시약은 입자 표면에 높은 흡착 또는 결합 친화력을 갖는 것으로 나타났으며, 그 결과 작용제 신호 간섭이 발생하였다19. 또한, 이전에 MOFs20,21에 노출된 세포의 변화를 평가하는 데 사용되는 것으로 나타났던 유세포 분석과 같은 다른 유형의 분석의 경우, 입자의 유해한 영향에 대한 실행 가능한 분석을 고려하려면 주요 문제를 우회해야 하는 것으로 나타났습니다. 특히, 입자 크기의 검출 범위, 특히 MOF에서 제공하는 것과 같은 혼합 집단 또는 세포 변화 전 보정에 사용된 입자의 기준은 해결해야 한다22. 또한 이러한 세포 분석 분석을 위해 세포 표지 중에 사용 된 염료는 세포가 노출 된 나노 입자를 방해 할 수 있음이 밝혀졌습니다23.

이 연구의 목표는 실시간 고처리량 평가 분석을 사용하여 선별된 MOF에 노출되었을 때 세포 행동의 변화를 평가하는 것이었습니다. 실시간 평가는 노출 기간과 관련된 시간 의존적 효과에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이 될 수 있다16. 또한, 세포 - 기질 상호 작용, 세포 형태 및 세포 - 세포 상호 작용의 변화뿐만 아니라 이러한 변화가 관심 물질의 물리 화학적 특성 및 노출 시간24,25에 어떻게 의존하는지에 대한 정보를 제공합니다.

제안된 접근법의 타당성과 적용 가능성을 입증하기 위해 인간 기관지 상피(BEAS-2B) 세포, ZIF-8(제올라이트 이미다졸레이트16의 소수성 프레임워크) 및 전기 세포-기질 임피던스 감지(ECIS)를 사용했습니다. BEAS-2B 세포는 폐 노출에 대한 모델이며(26) 이전에 나노클레이 및 열적으로 분해된 부산물(26,27,28)에 대한 세포 노출 시 변화를 평가하고 단일벽 탄소 나노튜브(SWCNT)18와 같은 나노 물질의 독성을 평가하는 데 사용되었습니다. 또한, 이러한 세포는 폐 상피 기능의 모델로 30년 이상 사용되어 왔다29. ZIF-8은 촉매 작용(catalysis)(30)에서의 광범위한 구현과 바이오이미징 및 약물 전달(32)을 위한 조영제(contrast agent)(31)로서 선택되었으며, 따라서 이러한 적용 동안 폐 노출에 대한 확장된 가능성을 위해 선택되었다. 마지막으로, 비침습적 실시간 기술인 ECIS는 분석물(재료 및 약물 모두)과 노출된 세포 간의 다양한 상호 작용의 결과로 세포 부착, 증식, 운동성 및 형태학의 변화를 실시간으로 평가하는 데 사용되었습니다16,26,28. ECIS는 교류(AC)를 사용하여 금 전극에 고정된 셀의 임피던스를 측정하며, 임피던스 변화는 셀-금 기판 계면의 저항 및 커패시턴스 변화, 셀-셀 상호 작용에 의해 유도된 장벽 기능 및 이러한 금 전극의 과세포 층 커버리지에 대한 통찰력을 제공합니다(33,34). ECIS를 사용하면 비침습적 실시간 방식으로 나노 스케일 분해능으로 정량적 측정이 가능합니다26,34.

이 연구는 단일 지점 분석 평가와 실시간으로 MOF로 인한 세포 행동 변화의 단순성과 평가 용이성을 평가하고 비교합니다. 이러한 연구는 다른 관심 입자에 대한 노출에 대한 반응으로 세포 프로파일을 평가하기 위해 추가로 외삽될 수 있으므로 안전한 설계 입자 테스트를 허용하고 후속 구현을 지원할 수 있습니다. 또한, 이 연구는 단일 지점 평가인 유전 및 세포 분석을 보완할 수 있습니다. 이것은 세포 집단에 대한 입자의 유해한 영향에 대한 보다 정보에 입각한 분석으로 이어질 수 있으며 이러한 입자의 독성을 고처리량 방식으로 스크리닝하는 데 사용될 수 있습니다(16,35,36).

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Protocol

1. ZIF-8 합성

  1. 이 예에서는 1:10:100(금속:링커:용매) 질량비를 사용하여 ZIF-8을 합성합니다. 이를 위해 질산 아연 육수화물을 측정하고 측정을 기록합니다. 링커, 2-메틸이미다졸 및 용매(즉, 메탄올)에 필요한 양을 계산하기 위해 예시 질량비를 활용한다.
  2. 질산아연 육수화물과 링커를 두 개의 다른 유리 바이알에 넣습니다. 계산 된 메탄올 양의 절반을 질산 아연 6 수화물에 첨가하고 나머지 절반을 링커에 첨가한다. 각 용액이 용해되도록 합니다.
  3. 두 용액(즉, 각각 금속과 링커를 포함하는 용액)을 결합합니다. 반응을 위해 결합된 용액이 담긴 용기를 교반 플레이트에 놓고 실온(RT)에서 24시간 동안 700rpm으로 교반합니다.

2. ZIF-8 컬렉션

  1. 위의 반응이 종결되면(즉, 24시간 후) 용액을 50mL 원심분리기 튜브에 넣고 3,075 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다(동일한 양을 사용하고 로터의 균형을 맞춥니다). 원심분리된 튜브에서 상층액을 제거합니다.
  2. 메탄올(5-15mL)을 원심분리기 튜브에 넣고 입자를 재분산시킵니다.
  3. 원심분리 및 세척 단계를 최소 2-4회 더 반복합니다. 마지막 세척 후 상청액을 배출하십시오.
    알림: 세척 단계는 침전되지 않은 종을 제거합니다.
  4. 튜브의 뚜껑을 제거하고 상단에 파라필름 테이프를 붙입니다. 그런 다음 파라 필름에 구멍을 뚫습니다. s가 들어 있는 튜브를 RT의 진공 챔버에 넣어 24시간 동안 건조시킵니다.

3. ZIF-8 표면 형태 (주사 전자 현미경 [SEM])

  1. ZIF-8의 건조 분말을 탄소 테이프에 장착하고 금-팔라듐으로 120초 동안 스퍼터링하여 SEM 분석 중에 발생할 수 있는 충전을 방지합니다.
  2. 현미경의 가속 전압을 15kV로 설정합니다. 입자에 초점을 맞추고 배율을 조정합니다(500x, 1,000x, 1,500x, 4,000x, 10,000x, 20,000x, 30,000x 및 40,000x의 배율이 사용됨).
  3. 입자 크기와 형태를 명확하게 평가할 수 있는 배율로 입자를 이미지화합니다(5μm, 10μm 및 20μm의 입자 범위를 고려하는 것이 좋습니다).
  4. 최소 3개의 서로 다른 시야에서 데이터를 수집하고 각각에 대해 서로 다른 배율을 고려합니다.

4. ZIF-8 원소 조성

  1. SEM 이미징 단계를 따르십시오.
  2. SEM 현미경의 에너지 분산 X선(EDX) 분광 장치를 사용하여 샘플 원소 조성을 분석합니다.
  3. SEM 가속 전압과 배율이 EDX 모니터와 일치하는지 확인하십시오. SEM 현미경의 적외선 카메라를 끕니다.
  4. EDX 모니터에서 Collect Spectrum 으로 이동하여 수집 시간을 200초로 입력합니다. 이는 잘못된 평가로 이어질 수 있는 입자 충전 및 분해를 방지하기 위해 권장됩니다.
  5. 최소 3개의 서로 다른 시야에서 데이터를 수집합니다. 수집이 완료되면 데이터를 분석하고 관심 있는 요소를 식별합니다.

5. 세포 배양

  1. 5% 소 태아 혈청(FBS)과 0.2% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 배지에서 불멸화된 BEAS-2B 세포를 배양했습니다.
    참고: 5-10 사이의 계대는 사용 중인 세포 배치에서 이전에 표현형 변화가 발생하지 않았는지 확인하기 위해 사용해야 합니다37 (모든 시약은 재료 표에 나열되어 있음).
  2. 100mm 세포 배양 플레이트를 가져다가 배지 10mL를 플레이트에 놓습니다. 플레이트에 BEAS-2B 세포 용액 1mL를 추가합니다.
  3. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 넣고 세포가 성장하도록 합니다.
  4. 24시간 후 플레이트를 확인하여 세포가 80% 밀도에 도달했는지 확인합니다. 여기서, 80% 밀도는 부착된 세포에 의해 덮인 표면의 백분율을 의미한다. 그렇지 않은 경우 배지를 변경하고 80% 밀도 수준에 도달할 때까지 세포가 성장하도록 합니다.

6. 세포 계수

  1. 플레이트의 셀이 80%의 밀도에 도달하면 플레이트에서 배지를 제거합니다. 플레이트를 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.
  2. 플레이트에서 PBS를 제거합니다. 플레이트에 트립신 2mL를 넣고 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 2분 동안 넣습니다.
  3. 플레이트에 2mL의 배지를 추가하고 배지를 위아래로 피펫하여 플레이트에서 세포를 제거합니다. 용액을 15mL 튜브로 옮기고 123 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  4. 튜브에서 상청액을 제거하고 배지 2mL를 추가합니다. 세포를 재분산시키기 위해 배지를 위아래로 피펫합니다.
  5. 1.5mL 튜브를 사용하여 트리판 블루 20μL를 넣은 다음 세포 용액 20μL(트리판 블루:세포 용액의 1:1 비율)를 추가합니다.
  6. 세포 혼합물 10μL를 유리 슬라이드에 놓고 자동 세포 계수기에 놓습니다. 화면에 초점이 맞춰질 때까지 기다렸다가 캡처를 선택합니다.
  7. 화면에는 살아있는 세포 번호와 세포 생존율이 표시됩니다. 측정 범위는 1 x 104-1 x 107 셀까지 확장됩니다.
  8. 또는 혈구계를 사용하여 수동으로 세포를 계산합니다.
    1. 이를 위해 15-20 μL의 트립판 블루 처리 세포 용액을 혈구계에 첨가하십시오.
    2. 혈구계의 그리드 라인에 10x 대물렌즈 초점이 있는 정립 현미경을 사용하십시오.
    3. 네 개의 바깥 쪽 사각형에있는 셀 수를 세고 숫자를 4로 나눕니다. 그런 다음 10,000을 곱하여 살아있는 세포 수 번호를 얻습니다.
    4. 세포 생존율을 계산하려면 살아있는 세포와 죽은 세포 수를 더하여 총 세포 수를 구한 다음 살아있는 세포 수를 총 세포 수로 나눕니다.

7. ZIF-8 용량 준비

  1. 8mg/mL의 ZIF-1 원액을 만듭니다. 이를 위해 ZIF-8의 양을 측정하고 입자에 탈이온수(DI)를 추가하여 1mg/mL 농도에 도달합니다.
  2. 수조에서 30초 간격으로 2분 동안 ZIF-8 스톡 용액을 초음파 처리(초음파 처리기를 음파로 설정)합니다.
  3. 방정식C1V1=C2V2를 사용하여 원하는 선량에 도달하는 데 필요한 원액과 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)의 양을 계산하여 세포 노출에 대해 ZIF-8의 다른 용량을 만듭니다. 용량 범위는 0-950 μg/mL입니다.
    참고: 이 실험에서는 0μg/mL, 1μg/mL, 10μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL, 250μg/mL, 500μg/mL, 750μg/mL 및 950μg/mL의 용량을 선택했습니다.

8. 절반 최대 억제 농도 (IC 50)

  1. 세포 계수 후 BEAS-2B 세포를 4 x 104 cells/mL의 밀도로 96 μL/웰의 부피로 시드합니다.
    1. 4 x 104 cells/mL의 밀도에 도달하려면 C 1 V1 = C2 V2를 사용하여 배지와 결합하는 데 필요한 세포 용액의 양을 계산합니다.
    2. 각 복용량에 대해 빈 웰을 유지해야 합니다. ZIF-8에 노출될 때까지 이 우물을 비워 두십시오.
  2. 96-웰 플레이트를 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이터에 넣고 세포가 24시간 동안 합류성 단분자층으로 성장하도록 합니다.
  3. 웰에서 배지를 제거하고 BEAS-2B 세포를 0-950μg/mL 범위의 ZIF-8 용량에 노출시킵니다. 100 μL의 ZIF-8을 각각의 블랭크 및 셀 웰에 추가합니다.
  4. 96웰 플레이트를 48시간의 노출 시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
  5. 노출 후 10μL의 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate(WST-1)를 각 웰(블랭크 및 셀 웰)에 넣고 2시간 동안 배양합니다. 미디어는 우물에 남아 있습니다. 비율은 1:10(시약:미디어)입니다.
  6. 485nm 흡광도를 사용하여 플레이트 리더에서 흡광도의 변화를 읽습니다.
  7. IC50 값을 결정하기 위해 소프트웨어를 통해 세포 생존율을 계산한다(섹션 10 참조).

9. 전기 셀-기판 임피던스 감지(ECIS)

  1. 96웰 플레이트(96W10idf)를 사용하여 ECIS 분석을 수행합니다. 플레이트(28 )는 약 4mm2의 면적을 커버하는 인터-디지타이티드 핑거 연결 전극들을 포함한다.
  2. 먼저 센서가 모든 웰을 읽고 있는지 테스트합니다. 이를 위해 96웰 플레이트를 웰 스테이션에 놓고 설정 버튼을 클릭합니다.
  3. 우물이 제대로 연결되면 녹색이 나타납니다. 연결되지 않은 우물은 빨간색으로 식별됩니다. 이러한 경우가 발생하면 웰 플레이트를 제거했다가 다시 삽입하고 모든 웰이 실행 가능한 녹색 판독값을 제공할 때까지 설정 버튼을 다시 클릭합니다.
  4. 잠재적인 드리프트를 방지하기 위해 웰당 200μL의 배지로 40분 동안 전극을 안정화합니다. 사용 중인 각 웰에 200μL의 배지를 추가한 다음 96웰 플레이트를 ECIS 스테이션에 놓습니다. 설정/확인을 클릭하여 플레이트가 제대로 연결되었는지 확인합니다. 안정화를 클릭합니다.
  5. 안정화가 완료되면 스테이션에서 플레이트를 제거하고 각 웰에서 매체를 제거합니다.
  6. BEAS-2B 세포를 웰당 100μL의 부피로 4 x 104 cells/ mL의 밀도로 세포가 포함된 웰에 시드하고 플레이트를 인큐베이터의 ECIS 스테이션에 놓습니다.
  7. 모니터에서 확인을 클릭하여 스테이션의 센서가 모든 전극을 읽는지 확인합니다.
  8. 다중 주파수/시간(MFT)을 선택하여 시간 경과 측정을 설정합니다. 이 프로그램은 7개의 다른 주파수에서 각 웰을 측정합니다.
  9. 시작을 클릭하고 셀이 합류 단층을 형성할 수 있도록 24시간 동안 실행합니다.
  10. 24시간 후, 세포가 포함된 웰은 모니터에서 증가된 저항을 보일 것입니다. 이것은 세포가 전극에 부착되었음을 나타내는 지표입니다.
  11. 모니터에서 일시 중지를 눌러 데이터 수집을 중지 합니다.
  12. 위의 섹션 8에 설명된 단계에 따라 계산된IC50 값에서 ZIF-7 용량을 확인하십시오.
  13. ZIF-8 나노 입자를 웰 당 100 μL의 부피로 각각의 블랭크 및 셀 웰에 노출시키고 96 웰 플레이트를 스테이션에 다시 놓습니다.
  14. 모니터를 다시 확인하여 센서가 모든 전극을 읽고 있는지 확인하십시오. 재개 를 클릭하고 시스템이 72시간 동안 실행되도록 하여 셀룰러 동작과 부착을 모니터링합니다.
  15. 데이터 수집이 완료되면 모니터에서 마침 을 클릭합니다. 파일을 저장하려면 파일 > 다른 이름으로 저장을 클릭합니다. 데이터를 스프레드시트 파일로 저장합니다.
  16. 알파 매개 변수를 얻으려면 모델을 클릭합니다. 화면 팝업에서 Media-Only Well을 클릭한 다음 미디어만 있는 Well을 선택합니다.
  17. 참조 설정(Set Ref)을 클릭합니다. 모니터에서 찾기를 클릭합니다.
  18. 시스템에 표시된 웰이 선택한 것과 동일하지 않은 경우 9.16 단계를 반복하십시오.
  19. 설정을 클릭합니다. T-범위 맞춤을 클릭하여 데이터 수집에 원하는 시간 범위를 결정합니다.
  20. 처리하는 동안 알파를 클릭합니다. 시스템이 분석을 마치면 RbA 저장을 클릭하고 스프레드시트 파일로 저장합니다.
    알림: 제조업체의 웹 사이트38에서 찾을 수 있는 ECIS 설명서를 참조하십시오.

10. 데이터 분석

  1. 증권 시세 표시기
    1. 이미징 소프트웨어를 열어 SEM 이미지를 분석합니다. 파일 > 열기를 클릭한 다음 분석할 이미지를 선택합니다.
    2. Image > Type > 8 Bits 를 클릭하여 이미지를 회색조로 변환하여 임계값 작업을 수행합니다.
    3. 픽셀 단위의 거리 측정값을 미크론 단위로 보정합니다. 직선 도구를 클릭하고 측정하려는 각 입자의 길이를 추적합니다.
    4. Analyze(분석)를 클릭한 다음 Set Scale(배율 설정)을 클릭합니다. 알려진 거리는 SEM 이미지 상의 스케일 바의 크기의 길이로 설정될 것이다. 알려진 길이 단위는 미크론으로 설정됩니다. Global(글로벌)을 확인하고 Ok(확인)를 누릅니다.
    5. 직선(Straight-Line) 도구를 클릭하고 파티클의 지름을 추적한 다음 분석 및 측정(Analyze and Measure)을 선택합니다. 길이 결과를 기록합니다.
    6. 수집된 모든 이미지에 대해 반복합니다. 적절한 통계 평가를 위해 최소 60개 입자의 모든 직경을 평균화합니다.
  2. 증권 시세 표시기
    1. 수집된 모든 이미지에서 각 요소의 모든 중량 백분율을 평균화합니다(위의 EDX 섹션 참조).
    2. 스프레드시트를 사용하여 x축에 각 원소의 막대 그래프를 표시하고 y축에 평균 원소 중량 백분율을 표시합니다.
  3. IC50 (영어)
    1. 블랭크 웰의 평균을 구하고 각 반복실험에 대한 선량 웰의 평균을 구합니다.
    2. 용량 블랭크 평균에서 대조군 블랭크 평균을 빼서 조정된 블랭크를 계산합니다. 평균 투여량 값에서 조정된 블랭크를 빼서 각 투여량에 대한 실제 세포 값을 계산합니다.
    3. 평균 대조군에서 각 용량에 대해 조정된 블랭크 값을 뺍니다. 다음 방정식을 사용하여 각 용량의 세포 생존율을 계산합니다: 세포 생존율 = (실제 세포 값/(대조군 - 조정된 공백 값)) x 100.
    4. 다른 모든 반복실험에 대해 이 작업을 반복합니다.
    5. 각 복제에 대한 세포 생존율을 함께 평균화하여 각 용량에 대한 최종 세포 생존율을 얻습니다.
    6. 소프트웨어에서 화면의 XY 탭을 선택합니다.
    7. X 열에 농도(용량) 값을 입력하고 Y 열에 각 용량의 세포 생존율(%)을 입력합니다.
    8. 분석 > 변환 > 확인 및 변환 X = Log(X)를 클릭하여 X 값을 변환합니다.
    9. 변환된 데이터 시트를 선택하고 분석을 클릭한 다음 정규화를 선택하여 Y 값을 정규화합니다.
    10. Normalize of Transform 데이터 시트를 선택하고 분석을 클릭한 다음 비선형 회귀(곡선 피팅)를 선택합니다. Dose-Response-Inhibition(용량-반응-억제)을 선택하고 Log(Inhibitor) Vs. Response-Variable Slope (Four Parameters)를 클릭합니다. 확인을 클릭하여 결과를 봅니다.
  4. 증권 시세 표시기
    1. 스프레드시트에서 각 반복실험(빈 웰 및 선량 웰)에 대한 저항(옴) 열을 가져와서 4,000Hz 주파수에서 함께 평균을 구합니다. 이 주파수는 세포-세포 접촉 평가(38)를 허용한다.
    2. 각 반복실험에 대한 평균 선량에서 평균 블랭크를 빼서 수정된 저항을 계산합니다. 각 용량에 대한 반복실험에 대한 수정된 저항의 평균을 구합니다.
    3. 알파 값에 대해 동일한 단계를 반복하여 평균 알파 매개 변수를 계산합니다. x축을 시간(h)으로 표시하고 y축을 각 선량 값에 대한 평균 저항/알파 값으로 표시합니다.

11. 통계 분석

  1. 증권 시세 표시기
    1. ZIF-8 입자의 평균 직경이 계산된 스프레드시트 파일에서 표준 편차를 수행합니다.
    2. 스프레드시트의 STDEV 함수를 활용하여 60개 입자의 데이터를 강조 표시하고 Enter를 클릭합니다. 계산된 각 평균 직경에 대한 표준 편차를 그래프로 표시합니다.
  2. 증권 시세 표시기
    1. SEM(단계 11.1.1-11.1.2)과 유사하게 스프레드시트의 STDEV 함수를 사용하여 각 평균 원소 조성에 대한 표준 편차를 계산합니다. 각 평균 원소 조성에 대한 표준 편차를 그래프로 표시합니다.
  3. IC50 (영어)
    1. IC50 을 계산하는 데 사용된 소프트웨어를 열고 그룹화된 데이터 시트를 클릭합니다.
    2. 그룹 A, 그룹 B 등으로 표시된 행에 ZIF-8 용량을 입력합니다. 각 용량에 대한 평균 세포 생존율을 입력하고 ZIF-8 용량에 해당하는 열에 복제합니다.
    3. 분석( Analyze)을 클릭하고 컬럼 분석( Column Analyses)에서 일원 분산 분석(One-way ANOVA)(및 비모수적 분석(Nonparametric or mixed))을 선택합니다.
    4. 실험 설계 탭에서 일치 또는 페어링 없음을 선택합니다. 잔차의 가우스 분포(Gaussian Distribution Of Residuals)에서 예, 분산 분석 사용(Yes use ANOVA)을 선택합니다. 마지막으로 Assume Equal SDs(SD 동일 가정)에서 Yes Use Ordinary ANOVA Test(예, 일반 분산 분석 검정 사용)를 선택합니다.
    5. 다중 비교 탭에서 각 열의 평균과 대조 열의 평균 비교를 선택합니다. 확인을 클릭하여 결과를 봅니다.

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Representative Results

이 연구는 일반적인 시험관 내 모델 세포주39 (BEAS-2B)를 사용하여 실험실에서 합성된 MOF에 노출되었을 때 세포 행동의 변화를 평가하기 위한 ECIS의 타당성과 적용 가능성을 입증하는 것을 목표로 했습니다. 이러한 변화 평가는 종래의 비색 분석을 통한 분석에 의해 보완되었다.

프레임워크의 물리화학적 특성은 사용된 방법의 재현성, 얻은 결과의 타당성 및 그러한 결과에 대한 적절한 논의를 보장하기 위해 먼저 평가되었습니다. 예를 들어, ZIF-8의 표면 형태 분석은 SEM을 통해 수행되었습니다. 이미지는 골격이 마름모꼴 십이면체 형태40을 나타내고 평균 크기가 62.87nm ± 9.61nm임을 보여주었습니다(그림 1A). MOF의 원소 조성은 EDX 분광법을 통해결정되었습니다. 결과는 ZIF-8의 주요 조성이 C, N 및 Zn(즉, 이미다졸레이트 링커와 금속 이온, Zn16의 구성)으로 구성됨을 보여주었습니다(그림 1B). 이전의 X선 회절은 ZIF-8 결정상이 10.33°, 12.8°, 14.7°, 16.5° 및 18°에서 특정 피크를 식별했으며, 이러한 피크는 평면 (002), (112), (022), (013) 및 (222), 각각 16,41.

제안된 세포 거동 스크리닝을 위해,IC50 (ZIF-8이 세포 성장을 50% 억제하는 농도)을 측정하였다29. 이를 위해 세포는 0-950μg/mL 범위의 용량으로 48시간 동안 ZIF-8에 노출되었습니다(그림 2A). 노출된 세포의 용량-반응 그래프는 그림 2B에 표시되며, 이후 기록된 IC50 은 35.7μg/mL입니다. 또한, 분석은 ZIF-8에 노출시 세포의 생존율의 용량 의존적 경향을 밝혀 냈습니다.

IC50을 결정하면, ECIS 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, ECIS는IC50에서 ZIF-8 MOF에 노출된 BEAS-2B의 실시간 스크리닝 전략으로 사용되었으며, 이 농도 이하 및 이상, 즉 15.7μg/mL(C1), 35.7μg/mL(C2), 55.7μg/mL(C3) 및 75.7μg/mL(C4)는 각각 세포가 총 72시간 동안 노출되었습니다. ECIS의 포함은 세포 범위, 형태 및 생존력에 대한 변화를 모두 실시간으로 결정하는 데 대한 통찰력을 제공하기 위해 구상되었습니다. ECIS 결과는 저항의 변화 및 세포-기질 상호작용의 변화, 즉 알파 파라미터42로 기록되었습니다.

저항성 경향은 대조군(검은색 선)(즉, 노출되지 않은 세포)과 비교하여 ZIF-8로 처리된 세포의 프로파일의 변화로서 도 3A 에 표시된다. 구체적으로, 분석에 따르면 C2-C4 용량에 노출된 금 전극 상의 세포를 포함하는 웰은 프레임워크에 대한 세포 노출 직후 초기에 약간의 내성 증가를 나타냈습니다(모두 대조군[즉, 노출되지 않은 세포]에 비해). 이러한 초기 변화는 이후 기록된 저항의 급격한 감소로 이어졌으며, 이러한 감소는 노출 후 6-8시간 사이에 만연했습니다(그림 3A). 저항의 완전한 손실은 노출 시간으로부터 14-18 시간 후에 관찰되었다. IC50 값 미만의 선량에 노출된 세포는 저항성 손실이 나타날 때 노출로부터 약 16-18시간까지 대조군 세포가 있는 웰과 같이 저항성을 나타냈습니다. 또한, 세포 노출 동안, 실험에 사용된 웰의 신호의 연속적인 신호 섭동이 관찰되었다. 이러한 perturbances는 알파 매개 변수 (그림 3B)의 분석 중에 지속되었으며,이 분석은 노출 된 세포가 저항성 세포와 유사한 프로파일로 세포-기질 상호 작용을 변경한다는 것을 추가로 보여줍니다. 더욱이, 이러한 변화는 노출로부터의 시간 및 그러한 노출에 사용된 선량에 의존적이었다.

Figure 1
그림 1: SEM 이미지 및 평균 원소 조성 ZIF-8 입자. (A) ZIF-8 입자의 대표적인 SEM 이미지. (B) ZIF-8 입자의 평균 원소 조성(± 표준 편차[SD] 막대). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 세포 생존율. (A) 세포 처리 개략도(Biorender.com 로 생성됨). (B) 0-950 μg/mL 범위의 용량에서 ZIF-8 입자에 노출된 BEAS-2B 세포의 생존력; 이 분석은IC50을 결정하기 위해 사용되었다 (± SD 바; 대조군에 대해 ***p = 0.0001 및 **** p < 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 대표적인 세포 저항성 및 세포 부착의 변화. (A)IC50 농도 이하, 그 이상에서 ZIF-8 입자에 노출된 BEAS-2B 세포의 대표적인 세포 저항성. (B)IC50 농도 이하 및 위의 ZIF-8 입자에 노출되었을 때 BEAS-2B 세포의 세포 부착의 변화(즉, 알파 파라미터의 변화). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이전 분석에서는 ECIS를 사용하여 분석물(즉, 탄소 나노튜브(35), 약물(43) 또는 나노클레이(nanoclays))에 노출된 세포의 거동을 평가할 수 있었습니다. 또한, Stueckle et al. ECIS를 사용하여 나노클레이 및 그 부산물에 노출된 BEAS-2B 세포의 독성을 평가했으며 세포 거동 및 부착이 이러한 물질의 물리화학적 특성에 의존한다는 것을 발견했습니다42. 여기에서 우리는 MOF에 대한 노출에 대한 반응으로 BEAS-2B 세포의 가능한 변화를 결정하여 시험관 내 세포 시스템에 대한 ZIF-8의 유해한 영향을 구별하는 것을 목표로 하는 지식 체계에 기여할 것을 제안했습니다.

분석은 먼저 골격 특성의 평가를 허용하여 세포 행동의 변화를 테스트된 MOF의 물리화학적 특성과 연관시키는 데 도움이 되도록 했습니다(44). 특히, 유사한 원소 조성의 규칙적인 기하학적 구조를 가진 MOF에 세포에 노출되었을 때(위의 결과 참조), 분석은 아마도 프레임워크의 흡수와 프로필 세포 분해로 인한 세포 행동의 변화를 보여주었습니다. 구체적으로 흡수의 관점에서, 이러한 골격과 같은 소수성 물질에 대한 독성의 이전 분석은, 그러한 물질이 세포에 노출될 때, 이들의 흡수가 아마도 막의 구조적 이중층으로부터 지질을 제거하는 능력 때문인 친수성 대응물의 흡수보다 세포막에 더 파괴적이라는 것을 보여주었다16, 45 세포 전좌 동안 막 기능 장애 또는 원형질막 섭동을 유발합니다46,47. 특히, 지질 제거는 세포 기능 효과의 단점과 함께 막 무결성, 세포 신호 전달48 및 세포 흡수 증가(49)의 변화를 초래하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, Farcal et al. 소수성TiO2 나노 물질은 노출된 폐포 대식세포에서 친수성 대응물과 비교할 때 증가된 세포독성 효과를 가짐을 입증했습니다50. 또한, Wagner 등은 소수성 ZIF-8이 친수성 MIL-160과 비교했을 때 BEAS-2B 세포에 더 많은 파괴를 일으킨다는 것을 입증했다16.

세포 거동의 기록된 변화는 아마도 선택된 프레임워크에 대한 세포 노출의 결과로서 세포-기질 상호작용(26 ) 및/또는 전극 상으로의 세포 생존 및 증식(16 )의 교란에 기인하는 것으로 추정된다. 예를 들어, Wagner et al. 나노클레이에 노출된 세포에서 유사한 매개변수를 평가했습니다. 저자들은 72 시간 실험 과정에서 세포 - 기질 상호 작용의 완전한 손실이 관찰되었음을 발견했다. 또한, 저자들은 BEAS-2B가 선택된 나노클레이에 노출되었을 때 세포 생존율과 증식에 시간 의존적 영향을 미친다는 것을 입증했다26. 본원에서 시험되는 입자가 MOF인 반면, 나노클레이에 대해 보이는 효과와의 가능한 확장된 연관성은 이들 입자의 물리화학적 특성 중 일부(즉, 크기, 소수성 및 조성)가 MOF의 것과 유사하기 때문에 실현 가능하다. 또한, Stueckle et al. 또한 나노클레이가 불멸화된 BEAS-2B 세포에 노출되었을 때 시간 및 치료 의존적 세포 거동을 입증했습니다. 다른 연구자들은 ZIF-8이 100 μg/mL 용량일 때 BEAS-2B 세포가 세포 단층과 세포 생존율이 완전히 소실되게 하는데, 이는 아마도 세포-기질 상호작용의 변화로 인한 것으로 추정된다16. 그러나 이러한 연구에서 ZIF-8 입자는 다른 합성 조건(즉, 이 연구에서 사용된 10분 대 24시간)에서 얻어졌으며, 이러한 합성 조건은 이후에 프레임워크의 다른 모양/형태를 초래하여 이전 결론을 뒷받침합니다. 이는 입자 합성 동안 사용되는 반응 시간(6), 온도(2) 및 용매(44 )가 이들의 형상, 크기 및 조성 프로파일에 영향을 미치고, 이후에 노출된 세포에서 차등적인 효과 및 거동을 유도한다는 것을 보여준다.

분석은 또한IC50 값 미만의 ZIF-8 용량에 노출된 세포가 대조군과 유사한 내성을 나타내는 것으로 나타났는데, 이는 아마도 이러한 용량이 이러한 실험이 수행된 조건 및 기간에서 ECIS-관찰 가능한 세포 형질전환을 유도할 만큼 충분히 유의하지 않았기 때문일 것입니다. 그러나,IC50 이상의 투여량에서, 세포 저항성의 완전한 손실이 관찰되었고, 노출 후 몇 시간 이내에만 관찰되었는데, 이는 세포 생존율의 변화 및 세포-기질 상호작용의 가능한 변화를 유도했기 때문일 가능성이 가장 높다16 (도 3A). 이러한 주장은 생존할 수 없는 세포가 모양을 바꾸고 기질에서 분리된다는 것을 보여준 이전 연구에 의해 뒷받침됩니다. 예를 들어, Verma et al. 실시간 임피던스 감지 기술을 사용하여 인간 폐포 상피 세포주(A549)에서 나노클레이의 세포 독성을 평가했습니다. 혈소판형 나노클레이는 관형형 나노클레이와 비교하였을 때 박리 및 변형된 세포의 수가 증가한 것으로 나타났다(51). 또한 Xiao et al. 섬유아세포 V79 세포의 세포골격은 염화카드뮴에 노출되었을 때 배양 배지에서 물, 세포외 이온 및 세포독성 화학물질의 유입으로 인해 손상되었음을 입증했습니다. 세포 세포 골격의 변화는 세포-기질 상호 작용의 손실을 초래했습니다. 또한, 염화 벤잘코늄이 V79 세포에 노출되었을 때, 노출로 인한 세포막 손상으로 인해 세포 저항이 현저히 감소했습니다(52).

또한 저항의 변화는 ZIF-8의 물리 화학적 특성에 대한 세포 반응으로 인한 것일 수 있습니다. 특히, ZIF-8은 소수성 골격이다; 이전 분석에서는 소수성으로 인해 독성이 증가할 수 있음이 밝혀졌다16. Zn과 같은 금속 이온은 이전에 Zr 및 Fe1 과 같은 다른 금속과 비교할 때 더 높은 수준의 독성을 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 아마도 더 높은 세포 사멸에 기여할 수 있습니다.

또한 모든 세포가 노출 직후 저항성의 초기 감소를 기록한 후 후속 증가를 기록한 것으로 나타났습니다. Eldawud et al. SWCNT가 BEAS-2B 세포에 노출되었을 때 유사한 효과를 입증했다. 저자들은 세포 저항의 증가를 BEAS-2B 세포가 재료의 노출로 인한 교란을 극복하고 전극 드리프트28을 제거하면서 무결성18을 회복하여 데이터 분석의 재현성을 보장하기 때문이라고 해석했습니다 (ECIS 핸드북 참조).

이 연구는 ECIS가 특히 높은 처리량 기능으로 인해 세포 행동 스크리닝에 사용할 수 있는 귀중한 도구가 될 수 있음을 보여주었지만, 물질의 유해한 평가에 대한 전체 그림이 필요한 경우 이 기술이 단일 시점 분석을 대체하지 않는 것이 좋습니다. 특히, 단일 지점 분석은 예를 들어 나노다이아몬드에 노출된 BEAS-2B 세포에 대해 Eldawud et al.에 의해 보여진 바와 같이 유전자 수준 45,53에서 세포 형질전환의 평가를 추가로 허용할 수 있습니다(45).   Yu 등은 또한 히알루론산 변형 메조다공성 실리카 나노입자(HA-MSNs)에 노출된 인간 결장암 세포(HCT0116)를 평가하기 위해 FACS를 사용했습니다54.

제시된 결과는 변화 경로가 MOF의 물리화학적 특성과 노출에 사용된 이러한 프레임워크의 시간 및 투여량에 따라 달라진다는 것을 시사합니다. 본원에 기술된 결과 및 방법은 실시간 측정의 중요성 및 세포 프로파일의 변화를 이해하는데 있어서 이들의 이점을 더욱 강조한다. 이들은 독성 메커니즘을 평가하기 위해 잠재적으로 추가 생화학적 분석으로 보완될 수 있으므로 세포 부착, 세포-세포 상호 작용 또는 세포-기질 상호 작용으로 기록된 세포 행동에 해로운 영향을 미치지 않는 MOF의 안전한 설계 전략으로 이어질 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이 작업에 대한 이해 상충이 없다고 보고합니다.

Acknowledgments

이 연구는 NIGMS (National Institute of General Medical Sciences) T32 프로그램 (T32 GM133369)과 National Science Foundation (NSF 1454230)이 부분적으로 자금을 지원했습니다. 또한 WVU 공유 연구 시설과 응용 생물 물리학 지원 및 지원이 인정됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)  Roche 5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25255-056
100 mm plates Corning 430167
1300 Series A2 biofume hood Thermo Scientific 323TS
2510 Branson bath sonicator Process Equipment & Supply, Inc.  251OR-DTH
2-methylimidazole, 97% Alfa Aesar 693-98-1
5 mL sterile microtube Argos Technologies T2076S-CA
50 mL  tubes  Falcon 352098
96W10idf well plates Applied Biophysics  96W10idf PET
96-well plates Fisherbrand FB012931
Biorender Biorender N/A
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess II FL automated cell counter Life Technologies C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater Denton Vacuum N/A
Dimethly sulfoxide  Corning 25-950-CQC
DPBS/Modified Cytiva SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium Corning 10-014-CV
ECIS-ZΘ Applied Biophysics  ABP 1129
Excel Microsoft Version 2301
Falcon tubes (15 mL) Corning 352196
Fetal bovine serum Gibco 16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader BMG LABTECH 413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0) GraphPad Software, LLC Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray  Hitachi High-Technologies Corporation S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells American Type Culture Collection CRL-9609
Isotemp freezer Fisher Scientific 
Methanol, 99% Fisher Chemical 67-56-1
Parafilm sealing film The Lab Depot HS234526A
Penicillin/Steptomycin Gibco 15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge  Thermo Scientific 75004220
Sorvall T 6000B DU PONT  T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS MP Biomedicals, LLC 1691049
Vacuum Chamber Belart 999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure Acros Organic 101-96-18-9

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생명 공학 문제 195
금속-유기 프레임워크 독성 프로파일의 실시간 평가를 위한 전기 전지-기질 감지
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Rose, O. L., Arnold, M., Dinu, C. Z. Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles. J. Vis. Exp. (195), e65313, doi:10.3791/65313 (2023).

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