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Bioengineering

Sensoriamento Elétrico Célula-Substrato para Avaliação em Tempo Real de Perfis Toxicológicos de Estrutura Metal-Orgânica

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65313
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

Summary

O estudo a seguir avalia o perfil toxicológico de uma estrutura metal-orgânica selecionada utilizando sensor de impedância de substrato de célula elétrica (ECIS), uma técnica de triagem de alto rendimento em tempo real.

Abstract

Estruturas metal-orgânicas (MOFs) são híbridos formados através da coordenação de íons metálicos e ligantes orgânicos em solventes orgânicos. A implementação de MOFs em aplicações biomédicas e industriais tem gerado preocupações quanto à sua segurança. Neste estudo, o perfil de um MOF selecionado, um quadro de imidazol zeolítico, foi avaliado após exposição a células epiteliais pulmonares humanas. A plataforma de avaliação foi uma técnica em tempo real (i.e., sensor elétrico de impedância célula-substrato [ECIS]). Este estudo identifica e discute alguns dos efeitos deletérios da MOF selecionada sobre as células expostas. Além disso, este estudo demonstra os benefícios do uso do método em tempo real versus outros ensaios bioquímicos para avaliações celulares abrangentes. O estudo conclui que as mudanças observadas no comportamento celular podem sugerir uma possível toxicidade induzida pela exposição a MOFs de diferentes características físico-químicas e à dosagem desses referenciais que estão sendo utilizados. Ao compreender as mudanças no comportamento celular, prevê-se a capacidade de melhorar estratégias seguras de MOFs a serem usadas para aplicações biomédicas, adaptando especificamente suas características físico-químicas.

Introduction

Estruturas metal-orgânicas (MOFs) são híbridos formados através da combinação de íons metálicos e ligantes orgânicos 1,2 em solventes orgânicos. Devido à variedade dessas combinações, os MOFs possuem diversidade estrutural3, porosidade ajustável, alta estabilidade térmica e altas áreas superficiais 4,5. Tais características os tornam candidatos atraentes em uma variedade de aplicações, desde o armazenamento de gás 6,7 até a catálise8,9 e dos agentes de contraste 10,11 para unidades de liberação de fármacos12,13. No entanto, a implementação de MOFs em tais aplicações tem levantado preocupações relativas à sua segurança tanto para os usuários quanto para o meio ambiente. Estudos preliminares demonstraram, por exemplo, que a função e o crescimento celular mudam com a exposição das células a íons metálicos ou ligantes utilizados para síntese de MOF 1,14,15. Por exemplo, Tamames-Tabar e colaboradores demonstraram que o ZIF-8 MOF, um MOF baseado em Zn, estava levando a mais mudanças celulares em uma linhagem de células de câncer cervical humano (HeLa) e uma linhagem de células de macrófagos de camundongo (J774) em relação a MOFs baseados em Zr e Fe. Tais efeitos foram presumivelmente devidos ao componente metálico do ZIF-8 (i.e., Zn), que poderia potencialmente induzir apoptose celular após a desintegração do arcabouço e liberação do íon Zn1. Da mesma forma, Gandara-Loe e col. demonstraram que o HKUST-1, um MOF à base de, causou a maior redução na viabilidade celular do retinoblastoma de camundongo quando usado em concentrações de 10 μg/mL ou mais. Presumivelmente, isso ocorreu devido ao íon metálico incorporado durante a síntese desse arcabouço, que, uma vez liberado, poderia induzir estresse oxidativo nas células expostas15.

Além disso, a análise mostrou que a exposição a MOFs com diferentes características físico-químicas pode levar a respostas variadas das células expostas. Por exemplo, Wagner e col. demonstraram que ZIF-8 e MIL-160 (um framework baseado em Al), usados na exposição de uma célula epitelial brônquica humana imortalizada, levaram a respostas celulares dependentes das propriedades físico-químicas dos frameworks, ou seja, hidrofobicidade, tamanho e características estruturais16. Complementarmente, Chen e col. demonstraram que uma concentração de 160 μg/mL de MIL-100(Fe) exposta a células hepáticas humanas normais (HL-7702) causou a maior perda na viabilidade celular, presumivelmente devido ao componente metálico desse quadro específico (i.e., Fe17).

Enquanto esses estudos categorizam os efeitos deletérios dos MOFs sobre os sistemas celulares com base em suas características físico-químicas e concentrações de exposição, levantando preocupações potenciais com a implementação do framework, especialmente em áreas biomédicas, a maioria dessas avaliações é baseada em ensaios colorimétricos de ponto único de tempo. Por exemplo, demonstrou-se que, quando ensaios de brometo de tetrazólio (MTT) e sal de tetrazólio solúvel em água (WST-1), brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e sal de tetrazólio solúvel em água (WST-1), esses reagentes bioquímicos poderiam levar a falsos positivos em suas interações com as partículas às quais as células também foram expostas18. O sal de tetrazólio e os reagentes vermelhos neutros demonstraram alta afinidade de adsorção ou ligação às superfícies das partículas, resultando em interferência do sinal do agente19. Além disso, para outros tipos de ensaios, como a citometria de fluxo, que já se mostrou utilizada para avaliar alterações em células expostas a MOFs20,21, demonstrou-se que grandes questões precisam ser contornadas para que uma análise viável dos efeitos deletérios das partículas seja considerada. Em particular, intervalos de detecção do tamanho das partículas, especialmente em populações mistas como as oferecidas por MOFs ou referências das partículas usadas para calibração antes de mudanças celulares, devem ser abordados22. Também foi demonstrado que o corante utilizado durante a marcação celular para tais ensaios de citometria também poderia interferir com as nanopartículas às quais as células foram expostas23.

O objetivo deste estudo foi usar um ensaio de avaliação em tempo real e de alto rendimento para avaliar mudanças no comportamento celular após a exposição a um MOF selecionado. Avaliações em tempo real podem ajudar a fornecer insights sobre os efeitos dependentes do tempo, relacionados às janelas de exposição16. Além disso, fornecem informações sobre mudanças nas interações célula-substrato, morfologia celular e interação célula-célula, bem como como tais mudanças dependem das propriedades físico-químicas dos materiais de interesse e tempos de exposição24,25, respectivamente.

Para demonstrar a validade e aplicabilidade da abordagem proposta, foram utilizadas células epiteliais brônquicas humanas (BEAS-2B), ZIF-8 (uma estrutura hidrofóbica de imidazolato zeolítico16) e sensor elétrico de impedância célula-substrato (ECIS). As células BEAS-2B representam um modelo de exposição pulmonar 26 e têm sido utilizadas anteriormente para avaliar alterações na exposição das células às nanoargilas e seus subprodutos degradados termicamente26,27,28, bem como avaliar a toxicidade de nanomateriais, como os nanotubos de carbono de parede simples (SWCNTs)18. Além disso, tais células têm sido utilizadas há mais de 30 anos como modelo para a função epitelial pulmonar29. O ZIF-8 foi escolhido devido à sua ampla implementação em catálise30 e como agentes de contraste 31 para bioimagem e liberação de fármacos32 e, portanto, pelo potencial estendido de exposição pulmonar durante tais aplicações. Por fim, a ECIS, técnica não invasiva em tempo real, foi previamente utilizada para avaliar alterações na aderência, proliferação, motilidade e morfologia celular 16,26 como resultado de uma variedade de interações entre analitos (materiais e fármacos) e células expostas em tempo real 16,18,28. A ECIS utiliza uma corrente alternada (CA) para medir a impedância de células imobilizadas em eletrodos de ouro, com as mudanças de impedância fornecendo informações sobre mudanças na resistência e capacitância na interface célula-substrato ouro, função de barreira induzida por interações célula-célula e cobertura da camada sobre-célula desses eletrodos de ouro33,34. O uso do ECIS permite medidas quantitativas em resolução nanométrica de forma não invasiva e em tempo real26,34.

Este estudo avalia e compara a simplicidade e facilidade de avaliação das mudanças induzidas por FMOS no comportamento celular em tempo real com avaliações de ensaio de ponto único. Tal estudo poderia ser extrapolado para avaliar perfis celulares em resposta à exposição a outras partículas de interesse, permitindo assim testes de partículas seguros por projeto e subsequentemente ajudando na implementação. Além disso, este estudo poderia complementar ensaios genéticos e celulares que são avaliações pontuais. Isso poderia levar a uma análise mais informada dos efeitos deletérios das partículas sobre a população celular e poderia ser usado para rastrear a toxicidade dessas partículas de maneira de alto rendimento16,35,36.

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Protocol

1. Síntese de ZIF-8

  1. Para a finalidade deste exemplo, use uma relação de massa de 1:10:100 (metal:linker:solvente) para sintetizar o ZIF-8. Para isso, meça o hexahidrato de nitrato de zinco e registre a medição. Utilize o exemplo de razão de massa para calcular a quantidade necessária para o ligante, 2-metilimidazol, e o solvente (ou seja, metanol).
  2. Coloque o hexahidrato de nitrato de zinco e o ligante em dois frascos de vidro diferentes. Adicionar metade da quantidade calculada de metanol ao hexahidrato de nitrato de zinco e a outra metade ao ligante. Deixe cada solução se dissolver.
  3. Combine as duas soluções (ou seja, soluções contendo o metal e o ligante, respectivamente). Colocar o recipiente com a solução combinada para a reacção numa placa de agitação e agitar a 700 rpm durante 24 h à temperatura ambiente (TR).

2. Coleção ZIF-8

  1. Uma vez concluída a reação acima (ou seja, após 24 h), coloque a solução em tubos de centrífuga de 50 mL e centrífuga a 3.075 x g por 5 min (use quantidades iguais e equilibre o rotor). Remova qualquer um dos sobrenadantes dos tubos centrifugados.
  2. Adicionar metanol (5-15 mL) aos tubos de centrífuga e redispersar as partículas.
  3. Repita as etapas de centrifugação e lavagem pelo menos mais duas a quatro vezes. Após a última lavagem, descarrega o sobrenadante.
    NOTA: As etapas de lavagem removem qualquer espécie não precipitada.
  4. Retire as tampas dos tubos e coloque fita parafilm por cima; Posteriormente, fure o parafilme. Colocar o(s) tubo(s) que contém a amostra numa câmara de vácuo em RT para secar durante 24 horas.

3. Morfologia da superfície do ZIF-8 (microscopia eletrônica de varredura [MEV])

  1. Monte os pós secos de ZIF-8 em fita de carbono e pulverização por 120 s com paládio de ouro para evitar qualquer carga que possa ocorrer durante a análise de MEV.
  2. Ajuste a tensão de aceleração do microscópio para 15 kV. Coloque as partículas em foco e ajuste a ampliação (foram usadas ampliações de 500x, 1.000x, 1.500x, 4.000x, 10.000x, 20.000x, 30.000x e 40.000x).
  3. Imagem das partículas sob a ampliação que permite uma avaliação clara do tamanho das partículas e da morfologia (recomendado para considerar intervalos para partículas de 5 μm, 10 μm e 20 μm).
  4. Colete dados de pelo menos três campos de visão diferentes e, para cada um, considere ampliações diferentes.

4. Composição elementar do ZIF-8

  1. Siga as etapas para imagens por MEV.
  2. Usando a unidade de espectroscopia de energia dispersiva de raios X (EDX) do microscópio de MEV, analise a composição elementar da amostra.
  3. Verifique se a tensão de aceleração e ampliação do SEM correspondem ao monitor EDX. Desligue a câmera infravermelha no microscópio de MEV.
  4. No monitor EDX, vá para Coletar espectro e insira um tempo de coleta de 200 s. Isso é recomendado para evitar a carga de partículas e a desintegração que poderiam levar a avaliações falsas.
  5. Colete dados de pelo menos três campos de visão diferentes. Finalizada a coleta, analise os dados e identifique os elementos de interesse.

5. Cultura celular

  1. Cultura imortalizou células BEAS-2B em meio suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB) e 0,2% de penicilina/estreptomicina.
    NOTA: Passagens entre 5-10 devem ser usadas para garantir que nenhuma alteração fenotípica tenha ocorrido anteriormente no lote de células que está sendo usado37 (todos os reagentes estão listados na Tabela de Materiais).
  2. Pegue uma placa de cultura celular de 100 mm e coloque 10 mL do meio na placa. Adicionar 1 ml da solução de células BEAS-2B à placa.
  3. Coloque a placa numa incubadora (37 °C, 5% CO2) e deixe as células crescerem.
  4. Verifique a placa após 24 h para determinar se as células atingiram 80% de confluência. Neste estudo, a confluência de 80% refere-se à porcentagem da superfície coberta por células aderidas. Caso contrário, troque o meio e permita que as células cresçam até que o nível de confluência de 80% seja atingido.

6. Contagem de células

  1. Uma vez que as células na placa tenham atingido uma confluência de 80%, remova o meio da placa. Lavar a placa com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
  2. Remova o PBS da placa. Adicionar 2 mL de tripsina à placa e colocá-la na incubadora (37 °C, 5% CO 2) por2 min.
  3. Adicione 2 mL de mídia à placa e pipete o meio para cima e para baixo para remover as células da placa. Transferir a solução para um tubo de 15 ml e centrifugar a 123 x g durante 5 minutos.
  4. Retire o sobrenadante do tubo e adicione 2 mL de meio. Pipetar o meio para cima e para baixo para redispersar as células.
  5. Com um tubo de 1,5 ml, adicionar 20 μL de azul de tripano e, em seguida, 20 μL da solução celular (proporção de 1:1 de azul de tripano:solução celular).
  6. Coloque 10 μL da mistura celular numa lâmina de vidro e coloque-a num contador automático de células. Aguarde até que a tela entre em foco e selecione capturar.
  7. A tela exibe os números de células ao vivo e a viabilidade da célula. A faixa de medição se estende de 1 x 104-1 x 107 células.
  8. Alternativamente, conte as células manualmente usando um hemocitômetro.
    1. Para isso, adicione 15-20 μL da solução de células tratadas com azul de tripano ao hemocitômetro.
    2. Use um microscópio vertical com foco objetivo de 10x nas linhas de grade do hemocitômetro.
    3. Conte o número de células nos quatro quadrados externos e divida o número por quatro. Em seguida, multiplique por 10.000 para obter o número de células vivas.
    4. Para calcular a viabilidade celular, adicione a contagem de células vivas e mortas para obter a contagem total de células e, subsequentemente, divida a contagem de células vivas pela contagem total de células.

7. Preparação da dose de ZIF-8

  1. Fazer uma solução-mãe ZIF-8 de 1 mg/ml. Para isso, meça a quantidade de ZIF-8 e adicione água deionizada (DI) às partículas para atingir uma concentração de 1 mg/mL.
  2. Sonicate (ajuste o sonicator para sonics) a solução estoque ZIF-8 por 2 min a intervalos de 30 s em banho-maria.
  3. Faça diferentes doses de ZIF-8 para exposições celulares calculando a quantidade de solução estoque e o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) necessário para atingir as doses desejadas usando a equação C 1 V1= C 2 V2. As doses variam de 0-950 μg/mL.
    NOTA: Neste experimento, foram selecionadas doses de 0 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL e 950 μg/mL.

8. Concentração inibitória meta-máxima (IC 50)

  1. Após a contagem celular, semear as células BEAS-2B a uma densidade de 4 x 104 células/mL em uma placa de 96 poços, com um volume de 100 μL/poço.
    1. Para atingir uma densidade de 4 x 104 células/mL, use C 1 V1= C 2 V 2para calcular a quantidade de solução celular necessária para ser combinada com o meio.
    2. Garantir a manutenção de poços em branco para cada dose; deixar esses poços vazios até a exposição ao ZIF-8.
  2. Coloque a placa de 96 poços na incubadora a 37 °C e 5% CO2 e deixe as células crescerem para uma monocamada confluente por 24 h.
  3. Remover o meio dos poços e expor as células BEAS-2B a doses de ZIF-8 que variam de 0-950 μg/mL. Adicionar 100 μL de ZIF-8 aos respectivos poços em branco e celulares.
  4. Coloque as placas de 96 poços de volta na incubadora por um tempo de exposição de 48 h.
  5. Após a exposição, adicionar 10 μL de 4-[3-(4-idofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazólio]-1,3-benzeno dissulfonato (WST-1) a cada poço (poços vazios e celulares) e incubar por 2 h. A mídia permanece nos poços; a proporção é de 1:10 (reagente:mídia).
  6. Leia as mudanças na absorbância em um leitor de placas usando uma absorbância de 485 nm.
  7. Calcular a viabilidade celular através do software para determinar o valor IC 50 (ver secção10 ).

9. Sensor elétrico de impedância célula-substrato (ECIS)

  1. Use uma placa de 96 poços (96W10idf) para realizar a análise ECIS. A placa28 contém eletrodos de conexão interdigitalizados cobrindo uma área de cerca de 4 mm2.
  2. Primeiro, teste se todos os poços estão sendo lidos pelos sensores. Para isso, coloque a placa de 96 poços na estação do poço e clique no botão Configuração .
  3. Se os poços estiverem conectados corretamente, o verde aparecerá; quaisquer poços não conectados serão identificados como vermelhos. Se esse caso surgir, remova e reinsira a placa do poço e clique no botão Configurar novamente, até que todos os poços ofereçam leituras verdes viáveis.
  4. Estabilizar os eletrodos por 40 min com 200 μL de meio por poço para evitar deriva de potencial. Adicione 200 μL de meio a cada poço usado e, em seguida, coloque a placa de 96 poços na estação ECIS. Clique em Configurar/Verificar para garantir que a placa esteja conectada corretamente. Clique em Estabilizar.
  5. Quando a estabilização estiver completa, remova a placa da estação e remova o meio de cada poço.
  6. Semeando as células BEAS-2B a uma densidade de 4 x 104 células/mL, com um volume de 100 μL por poço, nos poços contendo as células e colocar a placa na estação ECIS na incubadora.
  7. No monitor, clique em Verificar para determinar se todos os eletrodos são lidos pelos sensores da estação.
  8. Configure a medição do curso de tempo selecionando Freq/Time Múltiplo (MFT). O programa medirá cada poço em sete frequências diferentes.
  9. Clique em Iniciar e permita que ele seja executado por 24 h para que as células possam formar uma monocamada confluente.
  10. Após 24 h, os poços contendo células apresentarão maior resistência no monitor. Este é um indicador de que as células se fixaram aos eletrodos.
  11. Pressione Pausar no monitor para interromper a coleta de dados.
  12. Faça as doses de ZIF-8 em, acima e abaixo do valor IC50 calculado, seguindo os passos descritos na secção 7 acima.
  13. Exponha as nanopartículas ZIF-8 aos seus respectivos poços em branco e celulares a um volume de 100 μL por poço e coloque a placa de 96 poços de volta na estação.
  14. Clique em Verificar novamente no monitor para garantir que os sensores estão lendo todos os eletrodos. Clique em Retomar e permita que o sistema funcione por 72 h para monitorar o comportamento e a conexão celular.
  15. Quando a coleta de dados terminar, clique em Concluir no monitor. Para salvar o arquivo, clique em Arquivo > Salvar como. Salve os dados como um arquivo de planilha.
  16. Para obter os parâmetros alfa, clique em Modelo. Na tela pop-up, clique em Media Only Well, em seguida, selecione o poço que tem apenas mídia.
  17. Clique em Definir Ref. No monitor, clique em Localizar.
  18. Se o bem mostrado no sistema não for o mesmo que foi escolhido, repita o passo 9.16.
  19. Clique em Definir. Clique em Ajustar T-Range para determinar o intervalo de tempo desejado para a coleta de dados.
  20. Enquanto estiver processando, clique em Alpha. Quando o sistema terminar a análise, clique em Salvar RbA e salve-o como um arquivo de planilha.
    NOTA: Consulte o manual ECIS, que pode ser encontrado no site do fabricante38.

10. Análise dos dados

  1. MEV
    1. Abra o software de imagem para analisar as imagens de MEV. Clique em Arquivo > Abrir e selecione a imagem a ser analisada.
    2. Clique em Image > Type > 8 Bits para converter a imagem em tons de cinza para executar a operação de limite.
    3. Calibrar a medição de distância de pixels a mícrons. Clique na ferramenta Linha reta e trace o comprimento de cada partícula a ser medida.
    4. Clique em Analisar e, em seguida, em Definir escala. A distância conhecida será definida como o comprimento do tamanho da barra de escala na imagem de MEV. A unidade de comprimento conhecida será definida como mícrons. Verifique Global e pressione Ok.
    5. Clique na ferramenta Linha reta e trace o diâmetro da partícula e, em seguida, selecione Analisar e medir. Registre o resultado do comprimento.
    6. Repita para todas as imagens coletadas. Faça a média de todos os diâmetros de pelo menos 60 partículas para uma avaliação estatística adequada.
  2. EDX
    1. Faça a média de todas as porcentagens de peso de cada elemento a partir de todas as imagens coletadas (veja a seção EDX acima).
    2. Usando uma planilha, plote um gráfico de barras de cada elemento no eixo x e sua porcentagem média de peso elementar no eixo y.
  3. CI50
    1. Média dos poços em branco e média dos poços de dose para cada repetição.
    2. Calcule o branco ajustado subtraindo a média em branco do controle da média da dose em branco. Calcular o valor real da célula para cada dose subtraindo o branco ajustado do valor médio da dose.
    3. Subtrair o valor em branco ajustado para cada dose do valor médio de controle. Calcular a viabilidade celular de cada dose utilizando a equação: viabilidade celular = (valor real da célula/(valor de controle - valor em branco ajustado)) x 100.
    4. Repita isso para todas as outras replicações.
    5. Média da viabilidade celular para cada réplica em conjunto para obter a viabilidade celular final para cada dose.
    6. No software, escolha a guia XY na tela.
    7. Insira os valores de concentração (dose) na coluna X e a viabilidade celular (%) de cada dose na coluna Y.
    8. Transforme os valores X clicando em Analisar > Transformar > OK e Transformar X = Log(X).
    9. Normalize os valores Y selecionando a folha de dados Transformada , clicando em Analisar e, em seguida, selecionando Normalizar.
    10. Selecione a folha de dados Normalizar da Transformação , clique em Analisar e selecione Regressão Não Linear (Ajuste de Curva). Selecione Dose-Resposta-Inibição e clique em Log(Inibidor) Vs. Inclinação da Variável de Resposta (Quatro Parâmetros). Clique em OK para visualizar os resultados.
  4. ECIS
    1. A partir da planilha, pegue as colunas de resistência (ohm) de cada réplica (poços em branco e poços de dose) e faça a média das mesmas a partir da frequência de 4.000 Hz. Essa frequência permite a avaliação do contato célula-célula38.
    2. Calcular a resistência corrigida subtraindo o branco médio da dose média para cada réplica. Média da resistência corrigida para as repetições para cada dose.
    3. Repita as mesmas etapas para os valores alfa para calcular o parâmetro alfa médio. Plotar o eixo x como tempo (h) e o eixo y como os valores médios de resistência/alfa para cada valor de dose.

11. Análise estatística

  1. MEV
    1. Realizar um desvio padrão no arquivo de planilha eletrônica onde foram calculados os diâmetros médios das partículas ZIF-8.
    2. Utilizando a função STDEV na planilha, realce os dados das 60 partículas e clique em Enter. Gráfico do desvio padrão para cada diâmetro médio calculado.
  2. EDX
    1. Semelhante à MEV (passos 11.1.1-11.1.2), calcule o desvio padrão para cada composição elementar média usando a função STDEV na planilha. Grafar os desvios padrão para cada composição elementar média.
  3. CI50
    1. Abra o software utilizado para calcular o IC50 e clique em Ficha Agrupada.
    2. Insira as doses de ZIF-8 nas linhas rotuladas Grupo A, Grupo B, etc. Introduzir a viabilidade celular média para cada dose e replicar na coluna correspondente à dose ZIF-8.
    3. Clique em Analisar e, em Análises de coluna, selecione ANOVA unidirecional (não paramétrica ou mista).
    4. Na guia Experimental , selecione Sem correspondência ou emparelhamento. Em Distribuição Gaussiana de Resíduos, selecione Sim usar ANOVA. Finalmente, selecione Yes Use Ordinary ANOVA Test em Assume Equal SDs.
    5. Na guia Comparações Múltiplas , selecione Comparar a Média de Cada Coluna com a Média de uma Coluna de Controle. Clique em OK para visualizar os resultados.

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Representative Results

Usando uma linhagem celular modelo in vitro comum 39 (BEAS-2B), este estudo teve como objetivo demonstrar a viabilidade e aplicabilidade do ECIS para avaliar mudanças no comportamento celular após exposição a um MOF sintetizado em laboratório. A avaliação dessas alterações foi complementada pela análise por meio de ensaios colorimétricos convencionais.

As características físico-químicas do framework foram primeiramente avaliadas para garantir a reprodutibilidade dos métodos empregados, a validade dos resultados obtidos e as discussões pertinentes a tais resultados. A análise da morfologia superficial do ZIF-8, por exemplo, foi realizada por MEV; as imagens mostraram que os arcabouços apresentavam morfologia romba de dodecaedro40 e tamanho médio de 62,87 nm ± 9,61 nm (Figura 1A). A composição elementar dos MOFs foi determinada porespectroscopia EDX. Os resultados mostraram que a composição principal do ZIF-8 consistiu de C, N e Zn (isto é, a composição do ligante imidazolato e do íon metálico, Zn16) (Figura 1B). Difração de raios X prévia mostrou que as fases cristalinas ZIF-8 identificaram picos específicos em 10,33°, 12,8°, 14,7°, 16,5° e 18°, sendo tais picos atribuídos aos planos (002), (112), (022), (013) e (222), respectivamente, 16,41.

Para a triagem do comportamento celular proposta, determinou-se o CI 50 (concentração em que o ZIF-8 inibe o crescimento celular em50 %)29. Para isso, as células foram expostas ao ZIF-8 por 48 h em doses que variaram de 0-950 μg/mL (Figura 2A). O gráfico dose-resposta das células expostas é apresentado na Figura 2B, com o subsequente registro de IC50 de 35,7 μg/mL. Além disso, a análise revelou uma tendência dose-dependente na viabilidade das células após a exposição ao ZIF-8.

Na determinação do CI50, foi realizada a análise da ECIS. Resumidamente, o ECIS foi usado como uma estratégia de triagem em tempo real de BEAS-2B exposto a MOFs ZIF-8 no IC50, bem como abaixo e acima dessa concentração, ou seja, 15,7 μg/mL (C1), 35,7 μg/mL (C2), 55,7 μg/mL (C3) e 75,7 μg/mL (C4), respectivamente, com as células sendo expostas por um período total de 72 h. A inclusão do ECIS foi prevista para permitir a compreensão da determinação de mudanças na cobertura celular, morfologia e viabilidade, tudo em tempo real. Os resultados da ECIS foram registrados como mudanças na resistência e mudanças nas interações célula-substrato, ou seja, o parâmetro alfa42.

As tendências de resistência são apresentadas na Figura 3A como mudanças nos perfis das células tratadas com ZIF-8 em comparação com o controle (linha preta) (ou seja, células não expostas). Especificamente, a análise mostrou que os poços contendo células nos eletrodos de ouro expostos a doses de C2-C4 exibiram um ligeiro aumento inicial na resistência imediatamente após a exposição celular aos frameworks (todos relativos ao controle [i.e., células não expostas]). Essas mudanças iniciais foram seguidas por quedas acentuadas nas resistências registradas, sendo tais diminuições prevalentes entre 6-8 h da exposição (Figura 3A). Uma perda completa na resistência foi observada após 14-18 h do tempo de exposição. Células expostas a doses abaixo do valor de IC50 apresentaram resistência, como os poços com células controle, até cerca de 16-18 h da exposição, quando as perdas de resistência aparecem. Também, durante a exposição celular, foi observada uma perturbação contínua do sinal dos poços utilizados nos experimentos. Essas perturbações persistiram durante a análise do parâmetro alfa (Figura 3B), com esta análise mostrando ainda que as células expostas alteram suas interações célula-substrato com perfis semelhantes aos de resistência. Além disso, tais alterações foram dependentes do tempo de exposição e da dose utilizada nessa exposição.

Figure 1
Figura 1: Imagem de MEV e composição elementar média das partículas ZIF-8. (A) Imagem SEM representativa das partículas ZIF-8. (B) Composição elementar média das partículas ZIF-8 (± barras de desvio padrão [DP]). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Viabilidade celular. (A) Tratamento celular esquemático (criado com Biorender.com). (B) Viabilidade de células BEAS-2B expostas a partículas de ZIF-8 em doses que variam de 0-950 μg/mL; essa análise foi utilizada para determinar o IC50 (± barras SD; ***p = 0,0001 e **** p < 0,0001 em relação ao controle). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Resistência celular representativa e alterações na fixação celular. (A) Resistência celular representativa de células BEAS-2B expostas a partículas ZIF-8 abaixo, na concentração e acima da CI50. (B) Alterações na ligação celular (isto é, alterações no parâmetro alfa) das células BEAS-2B quando expostas a partículas ZIF-8 abaixo e acima da concentração de IC50. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Análises anteriores mostraram que o ECIS poderia ser usado para avaliar o comportamento de células expostas a analitos (i.e., nanotubos de carbono35, fármacos43 ou nanoargilas16). Além disso, Stueckle e col. avaliaram a toxicidade de células BEAS-2B expostas a nanoargilas e seus subprodutos e verificaram que o comportamento celular e a fixação eram dependentes das características físico-químicas desses materiais42. Neste trabalho, propusemo-nos a determinar as possíveis alterações das células BEAS-2B em resposta à exposição a MOFs, para assim contribuir com o corpo de conhecimento destinado a diferenciar quaisquer efeitos deletérios do ZIF-8 sobre os sistemas celulares in vitro, todos de forma de alto rendimento e em tempo real.

A análise permitiu primeiramente a avaliação das propriedades do framework para, assim, ajudar a correlacionar as mudanças no comportamento celular com as propriedades físico-químicas dos MOFs testados44. Especificamente, após a exposição celular a MOFs com geometrias regulares de composição elementar semelhante (ver resultados acima), a análise mostrou mudanças no comportamento celular, presumivelmente resultantes da absorção dos frameworks e sua degradação celular do perfil. Especificamente em termos de captação, análises prévias de toxicidade em materiais hidrofóbicos, como este quadro, mostraram que, quando tais materiais são expostos às células, sua captação é mais perturbadora para uma membrana celular do que a absorção de suas contrapartes hidrofílicas, presumivelmente devido à sua capacidade de remover lipídios da bicamada estrutural da membrana16, 45 durante sua translocação celular, levando a disfunções de membrana ou perturbações da membrana plasmática46,47. Em particular, a remoção de lipídios mostrou levar a alterações na integridade da membrana, sinalização celular48 e um aumento na captação celular49, com um lado negativo dos efeitos da função celular. Por exemplo, Farcal e col. demonstraram que um nanomaterial hidrofóbico de TiO2 tinha um efeito citotóxico aumentado quando comparado ao seu equivalente hidrofílico em macrófagos alveolares expostos50. Além disso, Wagner et al., demonstraram que o ZIF-8 hidrofóbico causou maior ruptura nas células BEAS-2B quando comparado ao hidrofílico MIL-16016.

As mudanças registradas no comportamento celular são presumivelmente devidas a distúrbios nas interações célula-substrato26 e/ou viabilidade celular e proliferação16 nos eletrodos como resultado da exposição celular ao arcabouço selecionado. Wagner et al., por exemplo, avaliaram parâmetros semelhantes em células expostas a nanoargilas. Os autores descobriram que uma perda completa na interação célula-substrato foi observada ao longo dos experimentos de 72 h. Além disso, os autores demonstraram um efeito tempo-dependente na viabilidade e proliferação celular quando os BEAS-2Bs foram expostos às suas nanoargilas selecionadas26. Embora as partículas aqui testadas sejam MOFs, a possível associação estendida com os efeitos observados para nanoargilas é viável, pois algumas das características físico-químicas dessas partículas (ou seja, tamanho, hidrofobicidade e composição) são semelhantes às dos MOFs. também demonstraram comportamento celular dependente do tempo e do tratamento quando nanoargilas foram expostas a células BEAS-2B imortalizadas. Outros demonstraram que o ZIF-8, na dose de 100 μg/mL, faz com que as células BEAS-2B tenham uma perda completa na monocamada celular e viabilidade celular, presumivelmente devido a mudanças nas interações célula-substrato16. No entanto, nota-se que, em tais estudos, as partículas ZIF-8 foram obtidas sob diferentes condições de síntese (i.e., 10 min versus 24 h utilizadas neste estudo), com tais condições de síntese subsequentemente resultando em diferentes formas/morfologias dos frameworks para apoiar conclusões anteriores. Isso mostra que o tempo de reação6, a temperatura2 e o solvente44 usados durante a síntese de partículas influenciam sua forma, tamanho e perfis de composição e, subsequentemente, levam a efeitos e comportamentos diferenciais nas células expostas.

A análise também mostrou que as células expostas a doses de ZIF-8 abaixo do valor de IC50 apresentaram resistências semelhantes às dos controles, presumivelmente uma vez que tais doses não foram significativas o suficiente para induzir a transformação celular observável por ECIS nas condições e no período em que esses experimentos foram realizados. Entretanto, em doses acima de IC50, observou-se perda completa da resistência celular e somente em poucas horas após a exposição, provavelmente devido a alterações na viabilidade celular e induziu possíveis alterações nas interações célula-substrato16 (Figura 3A). Essas alegações são apoiadas por estudos anteriores que mostraram que as células não viáveis mudam sua forma e se desprendem dos substratos. Por exemplo, Verma et al., utilizaram uma técnica de detecção de impedância em tempo real para avaliar a citotoxicidade de nanoargilas em uma linhagem celular epitelial alveolar humana (A549). Foi demonstrado que as nanoargilas tipo plaquetas causaram aumento no número de células destacadas e deformadas quando comparadas às nanoargilas tubulares51. Além disso, Xiao e col. demonstraram que o citoesqueleto das células fibroblásticas V79 estava comprometido quando expostas ao cloreto de cádmio, devido a um influxo de água, íons extracelulares e produtos químicos citotóxicos do meio de cultura. As alterações no citoesqueleto celular levaram à perda das interações célula-substrato. Além disso, quando o cloreto de benzalcônio foi exposto às células V79, houve uma diminuição significativa da resistência celular, devido aos danos à membrana celular causados pela exposição52.

Além disso, mudanças na resistência podem ser devidas às reações celulares às características físico-químicas do ZIF-8. Em particular, ZIF-8 é uma estrutura hidrofóbica; Análises prévias mostraram que a hidrofobicidade pode causar aumento da toxicidade16. Íons metálicos, como o Zn, também demonstraram anteriormente induzir um maior grau de toxicidade quando comparados a outros metais como Zr e Fe1 , possivelmente contribuindo para maior morte celular.

Foi ainda demonstrado que todas as células registaram uma diminuição inicial da resistência logo após a exposição, seguida de um aumento subsequente. demonstraram efeitos semelhantes quando SWCNTs foram expostos a células BEAS-2B. Os autores interpretaram o aumento da resistência celular como sendo devido às células BEAS-2B superarem os distúrbios causados pela exposição dos materiais e, posteriormente, recuperarem sua integridade18 , ao mesmo tempo em que eliminaram a deriva do eletrodo28, para assim garantir a reprodutibilidade da análise dos dados (ver manual ECIS).

Embora este estudo tenha mostrado que a ECIS pode ser uma ferramenta valiosa para uso na triagem do comportamento celular, especialmente devido à característica de alto rendimento, recomenda-se que a técnica não substitua ensaios de ponto único quando se deseja uma imagem completa da avaliação deletéria de um material. Em particular, o ensaio de ponto único poderia ainda permitir a avaliação da transformação celular em seu nível genético 45,53, como mostrado por Eldawud et al., por exemplo, para células BEAS-2B expostas a nanodiamantes e por meio de classificação celular ativada por fluorescência (FACS)45.   Yu et al., também utilizaram a FACS para avaliar células humanas de câncer de cólon (HCT0116) expostas a nanopartículas de sílica mesoporosa modificadas com ácido hialurônico (HA-MSNs)54.

Os resultados apresentados sugerem que a rota de mudança é dependente das características físico-químicas dos MOFs, bem como do tempo e dosagem de tais estruturas utilizadas nas exposições. Os resultados e métodos aqui descritos enfatizam ainda mais a importância das medidas em tempo real e suas vantagens na compreensão das alterações no perfil celular. Estes podem ser potencialmente suplementados com ensaios bioquímicos adicionais para avaliar o mecanismo de toxicidade, levando assim a estratégias seguras-por-projeto de MOFs que não têm efeitos deletérios sobre o comportamento celular, registrados como ligação celular, interações célula-célula, ou interações célula-substrato.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado em parte pelo programa T32 do National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (T32 GM133369) e pela National Science Foundation (NSF 1454230). Além disso, as Instalações de Pesquisa Compartilhadas da WVU e a assistência e suporte em Biofísica Aplicada são reconhecidos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)  Roche 5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25255-056
100 mm plates Corning 430167
1300 Series A2 biofume hood Thermo Scientific 323TS
2510 Branson bath sonicator Process Equipment & Supply, Inc.  251OR-DTH
2-methylimidazole, 97% Alfa Aesar 693-98-1
5 mL sterile microtube Argos Technologies T2076S-CA
50 mL  tubes  Falcon 352098
96W10idf well plates Applied Biophysics  96W10idf PET
96-well plates Fisherbrand FB012931
Biorender Biorender N/A
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess II FL automated cell counter Life Technologies C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater Denton Vacuum N/A
Dimethly sulfoxide  Corning 25-950-CQC
DPBS/Modified Cytiva SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium Corning 10-014-CV
ECIS-ZΘ Applied Biophysics  ABP 1129
Excel Microsoft Version 2301
Falcon tubes (15 mL) Corning 352196
Fetal bovine serum Gibco 16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader BMG LABTECH 413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0) GraphPad Software, LLC Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray  Hitachi High-Technologies Corporation S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells American Type Culture Collection CRL-9609
Isotemp freezer Fisher Scientific 
Methanol, 99% Fisher Chemical 67-56-1
Parafilm sealing film The Lab Depot HS234526A
Penicillin/Steptomycin Gibco 15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge  Thermo Scientific 75004220
Sorvall T 6000B DU PONT  T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS MP Biomedicals, LLC 1691049
Vacuum Chamber Belart 999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure Acros Organic 101-96-18-9

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