Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Metal-Organik Çerçeve Toksikolojik Profillerinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Elektrik Hücresi-Substrat Algılama

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65313
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

Summary

Aşağıdaki çalışma, gerçek zamanlı, yüksek verimli bir tarama tekniği olan elektrik hücresi-substrat empedans algılamasını (ECIS) kullanan seçilmiş bir metal-organik çerçevenin toksikolojik profilini değerlendirmektedir.

Abstract

Metal-organik çerçeveler (MOF'ler), organik çözücülerde metal iyonlarının ve organik bağlayıcıların koordinasyonu ile oluşturulan melezlerdir. MOF'ların biyomedikal ve endüstriyel uygulamalarda uygulanması, güvenlikleri ile ilgili endişelere yol açmıştır. Burada, zeolitik bir imidazol çerçevesi olan seçilmiş bir MOF'un profili, insan akciğer epitel hücrelerine maruz kaldıktan sonra değerlendirildi. Değerlendirme platformu gerçek zamanlı bir teknikti (yani, elektrik hücresi-substrat empedans algılama [ECIS]). Bu çalışma, seçilen MOF'un maruz kalan hücreler üzerindeki bazı zararlı etkilerini tanımlamakta ve tartışmaktadır. Ayrıca, bu çalışma, kapsamlı hücre değerlendirmeleri için diğer biyokimyasal tahlillere karşı gerçek zamanlı yöntemi kullanmanın faydalarını göstermektedir. Çalışma, hücre davranışında gözlenen değişikliklerin, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip MOF'lara maruz kalmanın neden olduğu olası toksisiteye ve kullanılan bu çerçevelerin dozajına işaret edebileceği sonucuna varmıştır. Hücre davranışındaki değişiklikleri anlayarak, biyomedikal uygulamalar için kullanılacak MOF'ların fizikokimyasal özelliklerini özel olarak uyarlayarak tasarım gereği güvenli stratejilerin iyileştirilmesi yeteneği öngörülmektedir.

Introduction

Metal-organik çerçeveler (MOF'ler), organik çözücülerde metal iyonları ve organik bağlayıcıların 1,2 kombinasyonu ile oluşturulan hibritlerdir. Bu tür kombinasyonların çeşitliliği nedeniyle, MOF'lar yapısal çeşitliliğe3, ayarlanabilir gözenekliliğe, yüksek termal stabiliteye ve yüksek yüzey alanlarına 4,5 sahiptir. Bu özellikler, onları gaz depolamadan 6,7'den katalize 8,9'a ve kontrast maddelerden10,11'den ilaç dağıtım birimlerine12,13'e kadar çeşitli uygulamalarda çekici adaylar haline getirir. Bununla birlikte, MOF'ların bu tür uygulamalara uygulanması, hem kullanıcılar hem de çevre için güvenlikleriyle ilgili endişeleri artırmıştır. Ön çalışmalar, örneğin, hücrelerin MOF senteziiçin kullanılan metal iyonlarına veya bağlayıcılara maruz kalmasıyla hücresel fonksiyonun ve büyümenin değiştiğini göstermiştir 1,14,15. Örneğin, Tamames-Tabar ve ark. Zn tabanlı bir MOF olan ZIF-8 MOF'un, bir insan rahim ağzı kanseri hücre hattında (HeLa) ve bir fare makrofaj hücre hattında (J774) Zr bazlı ve Fe bazlı MOF'lara göre daha fazla hücresel değişikliğe yol açtığını göstermiştir. Bu tür etkiler muhtemelen, çerçeve parçalanması ve Zn iyonu salınımı1 üzerine potansiyel olarak hücre apoptozunu indükleyebilen ZIF-8'in metal bileşeninden (yani Zn) kaynaklanıyordu. Benzer şekilde, Gandara-Loe ve ark. Cu bazlı bir MOF olan HKUST-1'in, 10 μg/mL veya daha yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında fare retinoblastom hücre canlılığında en yüksek azalmaya neden olduğunu göstermiştir. Bu muhtemelen, bu çerçevenin sentezi sırasında dahil edilen ve bir kez serbest bırakıldığında maruz kalan hücrelerde oksidatif strese neden olabilen Cu metal iyonundankaynaklanıyordu 15.

Ayrıca analiz, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip MOF'lara maruz kalmanın, maruz kalan hücrelerin değişen tepkilerine yol açabileceğini göstermiştir. Örneğin, Wagner ve ark. ölümsüzleştirilmiş bir insan bronşiyal epitel hücresinin maruz kalmasında kullanılan ZIF-8 ve MIL-160'ın (Al tabanlı bir çerçeve), çerçevelerin fizikokimyasal özelliklerine, yani hidrofobikliğine, boyutuna ve yapısal özelliklerine bağlı hücresel tepkilere yol açtığını göstermiştir16. Tamamlayıcı olarak, Chen ve ark. insan normal karaciğer hücrelerine (HL-7702) maruz kalan 160 μg / mL MIL-100 (Fe) konsantrasyonunun, muhtemelen bu spesifik çerçevenin metal bileşeni (yani, Fe17) nedeniyle hücresel canlılıkta en büyük kayba neden olduğunu göstermiştir.

Bu çalışmalar, MOF'ların hücresel sistemler üzerindeki zararlı etkilerini fizikokimyasal özelliklerine ve maruziyet konsantrasyonlarına göre sınıflandırırken, özellikle biyomedikal alanlarda çerçeve uygulamasıyla ilgili potansiyel endişeleri gündeme getirirken, bu değerlendirmelerin çoğu tek zaman noktalı kolorimetrik analizlere dayanmaktadır. Örneğin, (3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür) tetrazolyum (MTT) ve suda çözünür tetrazolyum tuzu (WST-1) tahlilleri kullanıldığında, bu biyokimyasal reaktiflerin, hücrelerin de maruz kaldığı parçacıklarla etkileşimleri üzerine yanlış pozitiflere yol açabileceğigösterilmiştir 18. Tetrazolyum tuzu ve nötr kırmızı reaktiflerin, partiküllerin yüzeylerine yüksek bir adsorpsiyon veya bağlanma afinitesine sahip olduğu gösterilmiştir, bu da ajan sinyal girişimineneden olur 19. Ayrıca, daha önce MOF'lara maruz kalan hücrelerdeki değişiklikleri değerlendirmek için kullanıldığı gösterilen akış sitometrisi gibi diğer test türleri için20,21, partiküllerin zararlı etkilerinin uygulanabilir bir analizi düşünülecekse, büyük sorunların atlatılması gerektiği gösterilmiştir. Özellikle, parçacıkların boyutlarının algılama aralıkları, özellikle MOF'lar tarafından sunulanlar gibi karışık popülasyonlarda veya hücresel değişikliklerden önce kalibrasyon için kullanılan parçacıkların referansları ele alınmalıdır22. Ayrıca, bu tür sitometri tahlilleri için hücre etiketlemesi sırasında kullanılan boyanın, hücrelerin maruz kaldığı nanopartiküllere de müdahale edebileceğigösterilmiştir 23.

Bu çalışmanın amacı, seçilmiş bir MOF'a maruz kaldıktan sonra hücre davranışındaki değişiklikleri değerlendirmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir değerlendirme testi kullanmaktı. Gerçek zamanlı değerlendirmeler, maruziyet pencereleriyle ilgili olarak zamana bağlı etkilere ilişkin içgörüler sağlamaya yardımcı olabilir16. Ayrıca, hücre-substrat etkileşimleri, hücre morfolojisi ve hücre-hücre etkileşimlerindeki değişikliklerin yanı sıra bu değişikliklerin ilgilenilen malzemelerin fizikokimyasal özelliklerine ve maruz kalma sürelerine nasıl bağlı olduğu hakkında bilgi sağlarlar24,25 sırasıyla.

Önerilen yaklaşımın geçerliliğini ve uygulanabilirliğini göstermek için insan bronşiyal epitel (BEAS-2B) hücreleri, ZIF-8 (zeolitik imidazolat16'nın hidrofobik bir çerçevesi) ve elektrik hücre-substrat empedans algılama (ECIS) kullanıldı. BEAS-2B hücreleri, akciğer maruziyeti 26 için bir modeli temsil eder ve daha önce hücrelerin nanokillere ve termal olarak bozulmuş yan ürünlerine26,27,28 maruz kalmasıyla ilgili değişiklikleri değerlendirmek ve ayrıca tek duvarlı karbon nanotüpler (SWCNT'ler) gibi nanomalzemelerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılmıştır18. Ayrıca, bu tür hücreler 30 yıldan fazla bir süredir pulmoner epitel fonksiyonu için bir model olarak kullanılmaktadır29. ZIF-8, katalizde30 ve biyogörüntüleme ve ilaç dağıtımı32 için kontrast madde31 olarak geniş uygulaması ve dolayısıyla bu tür uygulamalar sırasında akciğer maruziyeti için genişletilmiş potansiyel nedeniyle seçilmiştir. Son olarak, noninvaziv, gerçek zamanlı teknik olan ECIS, daha önce analitler (hem malzemeler hem de ilaçlar) ve maruz kalan hücreler arasındaki çeşitli etkileşimlerin bir sonucu olarak hücre aderansı, proliferasyonu, hareketliliği ve morfolojisindekideğişiklikleri değerlendirmek için kullanılıyordu 16,26 gerçek zamanlı olarak16,18,28. ECIS, altın elektrotlar üzerinde hareketsiz hale getirilen hücrelerin empedansını ölçmek için alternatif bir akım (AC) kullanır, empedans değişiklikleri, hücre-altın substrat arayüzündeki direnç ve kapasitanstaki değişiklikler, hücre-hücre etkileşimleri tarafından indüklenen bariyer işlevi ve bu tür altın elektrotların hücre üstü katman kapsamı hakkında fikir verir33,34. ECIS'in kullanılması, invaziv olmayan, gerçek zamanlı bir şekilde nano ölçekli bir çözünürlükte kantitatif ölçümlere izin verir26,34.

Bu çalışma, hücresel davranışta MOF kaynaklı değişikliklerin değerlendirilmesinin basitliğini ve kolaylığını gerçek zamanlı olarak tek noktalı tahlil değerlendirmeleri ile değerlendirmekte ve karşılaştırmaktadır. Böyle bir çalışma, ilgilenilen diğer parçacıklara maruz kalmaya yanıt olarak hücre profillerini değerlendirmek için daha fazla tahmin edilebilir, böylece tasarım gereği güvenli parçacık testine izin verir ve daha sonra uygulamaya yardımcı olur. Ayrıca, bu çalışma tek noktalı değerlendirmeler olan genetik ve hücresel tahlilleri tamamlayabilir. Bu, parçacıkların hücresel popülasyon üzerindeki zararlı etkilerinin daha bilinçli bir analizine yol açabilir ve bu tür parçacıkların toksisitesini yüksek verimli bir şekilde taramak için kullanılabilir16,35,36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ZIF-8 sentezi

  1. Bu örneğin amacı doğrultusunda, ZIF-8'i sentezlemek için 1:10:100 (metal:bağlayıcı:çözücü) kütle oranı kullanın. Bunun için çinko nitrat heksahidratı ölçün ve ölçümü kaydedin. Bağlayıcı, 2-metilimidazol ve çözücü (yani metanol) için gereken miktarı hesaplamak için örnek kütle oranını kullanın.
  2. Çinko nitrat heksahidratı ve bağlayıcıyı iki farklı cam şişeye yerleştirin. Hesaplanan metanol miktarının yarısını çinko nitrat heksahidrata ve diğer yarısını bağlayıcıya ekleyin. Her çözeltinin çözülmesine izin verin.
  3. İki çözümü birleştirin (yani, sırasıyla metal ve bağlayıcı içeren çözeltiler). Reaksiyon için kombine çözelti içeren kabı bir karıştırma plakasına yerleştirin ve oda sıcaklığında (RT) 24 saat boyunca 700 rpm'de karıştırın.

2. ZIF-8 koleksiyonu

  1. Yukarıdaki reaksiyon sona erdiğinde (yani 24 saat sonra), çözeltiyi 50 mL'lik santrifüj tüplerine yerleştirin ve 5 dakika boyunca 3.075 x g'de santrifüjleyin (eşit miktarlar kullanın ve rotoru dengeleyin). Süpernatantlardan herhangi birini santrifüjlenmiş tüplerden çıkarın.
  2. Santrifüj tüplerine metanol (5-15 mL) ekleyin ve partikülleri yeniden dağıtın.
  3. Santrifüjleme ve yıkama adımlarını en az iki ila dört kez daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra süpernatanı boşaltın.
    NOT: Yıkama adımları, çökelmemiş türleri uzaklaştırır.
  4. Tüplerin kapaklarını çıkarın ve üstüne parafilm bandı yerleştirin; Daha sonra, parafilmde delikler açın. Tüpü/tüpleri yerleştirinamp24 saat kuruması için RT'de bir vakum odasına.

3. ZIF-8 yüzey morfolojisi (taramalı elektron mikroskobu [SEM])

  1. ZIF-8'in kuru tozlarını karbon bant üzerine monte edin ve SEM analizi sırasında oluşabilecek herhangi bir şarjı önlemek için 120 saniye boyunca altın-paladyum püskürtün.
  2. Mikroskobun hızlanma voltajını 15 kV'a ayarlayın. Parçacıkları odağa getirin ve büyütmeyi ayarlayın (500x, 1.000x, 1.500x, 4.000x, 10.000x, 20.000x, 30.000x ve 40.000x büyütmeler kullanıldı.)
  3. Hem net bir parçacık boyutuna hem de morfoloji değerlendirmesine izin veren büyütme altındaki parçacıkları görüntüleyin (5 μm, 10 μm ve 20 μm'lik parçacıklar için aralıkların dikkate alınması önerilir).
  4. En az üç farklı görüş alanından veri toplayın ve her biri için farklı büyütmeleri göz önünde bulundurun.

4. ZIF-8 element bileşimi

  1. SEM görüntüleme için adımları takip ediniz.
  2. SEM mikroskobunun enerji dağıtıcı X-ışını (EDX) spektroskopi ünitesini kullanarak, numune element bileşimini analiz edin.
  3. SEM hızlandırma voltajının ve büyütmenin EDX monitörüyle eşleştiğinden emin olun. SEM mikroskobundaki kızılötesi kamerayı kapatın.
  4. EDX monitöründe Spektrum Topla'ya gidin ve 200 sn'lik bir toplama süresi girin. Bu, yanlış değerlendirmelere yol açabilecek partikül yüklenmesini ve parçalanmasını önlemek için önerilir.
  5. En az üç farklı görüş alanından veri toplayın. Toplama bittiğinde, verileri analiz edin ve ilgilenilen unsurları belirleyin.

5. Hücre kültürü

  1. Kültür, %5 fetal sığır serumu (FBS) ve %0.2 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş ortamda BEAS-2B hücrelerini ölümsüzleştirdi.
    NOT: Kullanılan hücre partisinde daha önce herhangi bir fenotipik değişiklik olmamasını sağlamak için 5-10 arasındaki pasajlar kullanılmalıdır37 (tüm reaktifler Malzeme Tablosunda listelenmiştir).
  2. 100 mm'lik bir hücre kültürü plakası alın ve 10 mL ortamı plakaya yerleştirin. Plakaya 1 mL BEAS-2B hücre çözeltisi ekleyin.
  3. Plakayı bir inkübatöre (37 °C,% 5 CO2) yerleştirin ve hücrelerin büyümesine izin verin.
  4. Hücrelerin% 80 birleşmeye ulaşıp ulaşmadığını belirlemek için 24 saat sonra plakayı kontrol edin. Burada, %80 birleşme, yapışan hücrelerin kapladığı yüzeyin yüzdesini ifade eder. Değilse, ortamı değiştirin ve% 80 birleşme seviyesine ulaşılana kadar hücrelerin büyümesine izin verin.

6. Hücre sayımı

  1. Plakadaki hücreler %80'lik bir birleşime ulaştığında, ortamı plakadan çıkarın. Plakayı 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
  2. PBS'yi plakadan çıkarın. Plakaya 2 mL tripsin ekleyin ve 2 dakika boyunca inkübatöre (37 °C,% 5 CO2) koyun.
  3. Plakaya 2 mL ortam ekleyin ve hücreleri plakadan çıkarmak için ortamı yukarı ve aşağı pipetleyin. Çözeltiyi 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 123 x g'da santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı tüpten çıkarın ve 2 mL ortam ekleyin. Hücreleri yeniden dağıtmak için ortamı yukarı ve aşağı pipetleyin.
  5. 1.5 mL'lik bir tüp kullanarak, 20 μL tripan mavisi ve ardından 20 μL hücre çözeltisi (1: 1 tripan mavisi: hücre çözeltisi oranı) ekleyin.
  6. 10 μL hücre karışımını bir cam slayt üzerine yerleştirin ve otomatik bir hücre sayacına yerleştirin. Ekran netlenene kadar bekleyin, ardından yakala'yı seçin.
  7. Ekran, canlı hücre numaralarını ve hücre canlılığını görüntüler. Ölçüm aralığı 1 x 104-1 x 107 hücre arasında uzanır.
  8. Alternatif olarak, bir hemositometre kullanarak hücreleri manuel olarak sayın.
    1. Bunun için hemositometreye 15-20 μL tripan mavisi ile muamele edilmiş hücre çözeltisi ekleyin.
    2. Hemositometrenin ızgara çizgilerine 10x objektif odaklı dik bir mikroskop kullanın.
    3. Dıştaki dört karedeki hücre sayısını sayın ve sayıyı dörde bölün. Ardından, canlı hücre sayısı sayısını elde etmek için 10.000 ile çarpın.
    4. Hücre canlılığını hesaplamak için, toplam hücre sayısını elde etmek için canlı ve ölü hücre sayısını toplayın ve ardından canlı hücre sayısını toplam hücre sayısına bölün.

7. ZIF-8 doz hazırlama

  1. 1 mg/mL'lik bir ZIF-8 stok çözeltisi yapın. Bunun için ZIF-8 miktarını ölçün ve 1 mg/mL konsantrasyona ulaşmak için partiküllere deiyonize (DI) su ekleyin.
  2. Bir su banyosunda 30 s aralıklarla 2 dakika boyunca ZIF-8 stok çözeltisini sonikleştirin (sonikatörü sonics'e ayarlayın).
  3. C 1 V1= C2V 2 denklemini kullanarak istenen dozlara ulaşmak için gereken stok çözelti miktarını ve Dulbecco'nun modifiye kartal ortamını (DMEM) hesaplayarak hücresel maruziyetler için farklı dozlardaZIF-8 yapın. Dozlar 0-950 μg / mL arasında değişecektir.
    NOT: Bu deneyde 0 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL ve 950 μg/mL dozları seçilmiştir.

8. Yarı maksimal inhibitör konsantrasyon (IC 50)

  1. Hücre sayımından sonra, BEAS-2B hücrelerini 4 x 104 hücre/mL yoğunlukta 96 oyuklu bir plakada, 100 μL/oyukluk bir hacimle tohumlayın.
    1. 4 x 104 hücre/mL yoğunluğa ulaşmak için, ortamla birleştirilmesi gereken hücre çözeltisi miktarını hesaplamak için C 1 V1= C 2 V2kullanın.
    2. Her doz için boş kuyucukların muhafaza edildiğinden emin olun; ZIF-8 maruziyetine kadar bu kuyuları boş bırakın.
  2. 96 oyuklu plakayı 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin 24 saat boyunca birleşik bir tek tabakaya büyümesine izin verin.
  3. Ortamı kuyulardan çıkarın ve BEAS-2B hücrelerini 0-950 μg/mL arasında değişen ZIF-8 dozlarına maruz bırakın. İlgili boş ve hücre kuyucuklarına 100 μL ZIF-8 ekleyin.
  4. 96 oyuklu plakaları 48 saatlik bir maruz kalma süresi için inkübatöre geri yerleştirin.
  5. Maruz kaldıktan sonra, her bir oyuğa (boş ve hücre kuyucukları) 10 μL 4-[3-(4-idofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzen disülfonat (WST-1) ekleyin ve 2 saat inkübe edin. Medya kuyularda kalır; Oran 1:10'dur (reaktif:medya).
  6. 485 nm'lik bir absorbans kullanarak bir plaka okuyucudaki absorbanstaki değişiklikleri okuyun.
  7. IC50 değerini belirlemek için yazılım aracılığıyla hücre canlılığını hesaplayın (bkz. bölüm 10).

9. Elektrik hücresi-substrat empedans algılama (ECIS)

  1. ECIS analizi yapmak için 96 oyuklu bir plaka (96W10idf) kullanın. Plaka28 , yaklaşık 4mm2'lik bir alanı kaplayan sayısallar arası parmak bağlantı elektrotları içerir.
  2. İlk olarak, tüm kuyuların sensörler tarafından okunduğunu test edin. Bunun için 96 kuyulu plakayı kuyu istasyonuna yerleştirin ve Kurulum düğmesine tıklayın.
  3. Kuyular düzgün bağlanırsa yeşil görünecektir; Bağlantısız kuyular kırmızı olarak tanımlanacaktır. Böyle bir durum ortaya çıkarsa, kuyu plakasını çıkarıp yeniden takın ve tüm kuyular uygulanabilir yeşil okumalar sunana kadar Kurulum düğmesine tekrar tıklayın.
  4. Potansiyel kaymayı önlemek için elektrotları oyuk başına 200 μL ortam ile 40 dakika stabilize edin. Kullanılan her kuyucuğa 200 μL ortam ekleyin ve ardından 96 oyuklu plakayı ECIS istasyonuna yerleştirin. Plakanın doğru şekilde bağlandığından emin olmak için Kurulum/Kontrol üzerine tıklayın. Stabilize'ye tıklayın.
  5. Stabilizasyon tamamlandıktan sonra, plakayı istasyondan çıkarın ve ortamı her bir kuyudan çıkarın.
  6. BEAS-2B hücrelerini, oyuk başına 100 μL hacimle 4 x 104 hücre/mL yoğunlukta, hücreleri içeren kuyucuklara tohumlayın ve plakayı inkübatördeki ECIS istasyonuna yerleştirin.
  7. Monitörde, tüm elektrotların istasyondaki sensörler tarafından okunduğunu belirlemek için Kontrol Et'e tıklayın.
  8. Çoklu Frekans/Zaman (MFT) öğesini seçerek zaman rotası ölçümünü ayarlayın. Program her bir kuyuyu yedi farklı frekansta ölçecektir.
  9. Başlat'a tıklayın ve hücrelerin birleşik bir tek katman oluşturabilmesi için 24 saat çalışmasına izin verin.
  10. 24 saat sonra, hücreleri içeren kuyucuklar monitörde artan direnç gösterecektir. Bu, hücrelerin elektrotlara bağlandığının bir göstergesidir.
  11. Veri toplamayı durdurmak için monitördeki Duraklat düğmesine basın.
  12. Yukarıdaki 7. bölümde belirtilen adımları izleyerek ZIF-8 dozlarını hesaplanan IC50 değerinde, üstünde ve altında yapın.
  13. ZIF-8 nanopartiküllerini, kuyu başına 100 μL'lik bir hacimde ilgili boş ve hücre kuyularına maruz bırakın ve 96 oyuklu plakayı istasyona geri yerleştirin.
  14. Sensörlerin tüm elektrotları okuduğundan emin olmak için monitörde tekrar Kontrol Et'e tıklayın. Devam Et'e tıklayın ve hücresel davranışı ve eki izlemek için sistemin 72 saat çalışmasına izin verin.
  15. Veri toplama işlemi bittiğinde, monitörde Bitir'e tıklayın. Dosyayı kaydetmek için, Dosya > Farklı Kaydet'i tıklatın. Verileri bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.
  16. Alfa parametrelerini almak için Model'e tıklayın. Ekran açılır penceresinde, Yalnızca Medya Kutusu'na tıklayın, ardından yalnızca medyası olan kuyuyu seçin.
  17. Set Ref'e tıklayın. Monitörde Bul'a tıklayın.
  18. Sistemde gösterilen kuyu seçilenle aynı değilse, 9.16 adımını tekrarlayın.
  19. Ayarla'ya tıklayın. Veri toplama için istenen zaman aralığını belirlemek için Fit T-Range'e tıklayın.
  20. İşlenirken Alfa'ya tıklayın. Sistem analizi bitirdiğinde, RbA'yı Kaydet'e tıklayın ve bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.
    NOT: Üreticinin web sitesinde bulunan ECIS kılavuzunabakın 38.

10. Veri analizi

  1. SEM
    1. SEM görüntülerini analiz etmek için görüntüleme yazılımını açın. Dosya > Aç'ı tıklatın ve analiz edilecek görüntüyü seçin.
    2. Eşik işlemini gerçekleştirmek için görüntüyü gri tonlamaya dönüştürmek için Görüntü > Türü > 8 Bit'e tıklayın.
    3. Piksellerin mesafe ölçümünü mikron olarak kalibre edin. Düz Çizgi aracına tıklayın ve ölçülmesi amaçlanan her parçacığın uzunluğunu izleyin.
    4. Analiz Et'e ve ardından Ölçeği Ayarla'ya tıklayın. Bilinen mesafe, SEM görüntüsündeki ölçek çubuğunun boyutunun uzunluğuna ayarlanacaktır. Bilinen uzunluk birimi mikron olarak ayarlanacaktır. Global'i kontrol edin ve Tamam'a basın.
    5. Düz Çizgi aracına tıklayın ve parçacığın çapını izleyin, ardından Analiz Et ve Ölç'ü seçin. Uzunluk sonucunu kaydedin.
    6. Toplanan tüm görüntüler için tekrarlayın. Uygun bir istatistik değerlendirmesi için en az 60 parçacıktan tüm çapların ortalamasını alın.
  2. EDX (Büyüköğretim Kurumu
    1. Toplanan tüm görüntülerden her bir öğenin tüm ağırlık yüzdelerinin ortalamasını alın (yukarıdaki EDX bölümüne bakın).
    2. Bir elektronik tablo kullanarak, x eksenindeki her bir öğenin çubuk grafiğini ve y eksenindeki ortalama temel ağırlık yüzdesini çizin.
  3. IC50
    1. Boş kuyucukların ortalamasını alın ve her kopya için doz kuyucuklarının ortalamasını alın.
    2. Kontrol boş ortalamasını boş doz ortalamasından çıkararak ayarlanmış boşluğu hesaplayın. Ayarlanan boşluğu ortalama doz değerinden çıkararak her doz için gerçek hücre değerini hesaplayın.
    3. Her doz için ayarlanan boş değeri ortalama kontrol değerinden çıkarın. Denklemi kullanarak her dozun hücre canlılığını hesaplayın: hücre canlılığı = (gerçek hücre değeri / (kontrol değeri - ayarlanmış boş değer)) x 100.
    4. Bunu diğer tüm çoğaltmalar için yineleyin.
    5. Her doz için nihai hücre canlılığını elde etmek için her bir kopya için hücre canlılığının ortalamasını alın.
    6. Yazılımda, ekrandaki XY sekmesini seçin.
    7. Konsantrasyon (doz) değerlerini X sütununa ve her dozdan hücre canlılığını (%) Y sütununa girin.
    8. Çözümle > Dönüştür > Tamam'a ve Transform X = Log(X)'a tıklayarak X değerlerini dönüştürün.
    9. Dönüştürülmüş Veri sayfasını seçerek, Çözümle'ye tıklayarak ve ardından Normalleştir'i seçerek Y değerlerini normalleştirin.
    10. Dönüşümün Normalleştirilmesi veri sayfasını seçin, Çözümle'ye tıklayın ve Doğrusal Olmayan Regresyon (Eğri Sığdır) seçeneğini belirleyin. Doz-Yanıt-İnhibisyon'u seçin ve Log (İnhibitör) Vs. Yanıt Değişkeni Eğimi (Dört Parametre) seçeneğine tıklayın. Sonuçları görüntülemek için Tamam'a tıklayın.
  4. ECIS (Avrupa Halk Cumhuriyeti)
    1. Elektronik tablodan, her çoğaltma (boş kuyucuklar ve doz kuyuları) için direnç (ohm) sütunlarını alın ve bunların ortalamasını 4.000 Hz frekansından alın. Bu frekans, hücre-hücre teması değerlendirmesineizin verir 38.
    2. Her bir kopya için ortalama boşluğu ortalama dozdan çıkararak düzeltilmiş direnci hesaplayın. Her doz için kopyalar için düzeltilmiş direncin ortalaması.
    3. Ortalama alfa parametresini hesaplamak için alfa değerleri için aynı adımları tekrarlayın. Her doz değeri için x eksenini zaman (h) ve y eksenini ortalama direnç/alfa değerleri olarak çizin.

11. İstatistiksel analiz

  1. SEM
    1. ZIF-8 parçacıklarının ortalama çaplarının hesaplandığı elektronik tablo dosyasında standart bir sapma gerçekleştirin.
    2. Elektronik tablodaki STDEV işlevini kullanarak, 60 parçacığın verilerini vurgulayın ve Enter'a tıklayın. Hesaplanan her ortalama çap için standart sapmanın grafiğini çizin.
  2. EDX (Büyüköğretim Kurumu
    1. SEM'e benzer şekilde (11.1.1-11.1.2 adımları), elektronik tablodaki STDEV işlevini kullanarak her bir ortalama temel bileşim için standart sapmayı hesaplayın. Her ortalama element bileşimi için standart sapmaların grafiğini çizin.
  3. IC50
    1. IC50'yi hesaplamak için kullanılan yazılımı açın ve Gruplandırılmış Veri Sayfası'na tıklayın.
    2. ZIF-8 dozlarını Grup A, Grup B vb. etiketli satırlara girin. Her doz için ortalama hücre canlılığını girin ve ZIF-8 dozuna karşılık gelen sütunda çoğaltın.
    3. Analiz Et'e tıklayın ve Sütun Analizleri'nin altında Tek Yönlü ANOVA (ve parametrik olmayan veya karma) seçeneğini belirleyin.
    4. Deneysel Tasarım sekmesinde, Eşleştirme veya Eşleştirme Yok'u seçin. Artıkların Gauss Dağılımı altında, Evet ANOVA kullan'ı seçin. Son olarak, Eşit SD'leri Varsay altında Evet Sıradan ANOVA Testini Kullan'ı seçin.
    5. Birden Çok Karşılaştırma sekmesi altında, Her Sütunun Ortalamasını Kontrol Sütununun Ortalamasıyla Karşılaştır'ı seçin. Sonuçları görüntülemek için Tamam'a tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yaygın bir in vitro model hücre hattı39 (BEAS-2B) kullanan bu çalışma, laboratuvarda sentezlenen bir MOF'a maruz kaldıktan sonra hücre davranışındaki değişiklikleri değerlendirmek için ECIS'in fizibilitesini ve uygulanabilirliğini göstermeyi amaçladı. Bu değişikliklerin değerlendirilmesi, geleneksel kolorimetrik tahliller yoluyla yapılan analizlerle tamamlanmıştır.

Çerçevenin fizikokimyasal özellikleri, kullanılan yöntemlerin tekrarlanabilirliğini, elde edilen sonuçların geçerliliğini ve bu sonuçların ilgili tartışmalarını sağlamak için ilk olarak değerlendirildi. Örneğin, ZIF-8'in yüzey morfolojisinin analizi SEM aracılığıyla gerçekleştirildi; görüntüler, çerçevelerin eşkenar dörtgen bir dodekahedron morfolojisi40 sergilediğini ve ortalama 62.87 nm ± 9.61 nm boyuta sahip olduğunu gösterdi (Şekil 1A). MOF'ların temel bileşimi EDX spektroskopisi ilebelirlendi. Sonuçlar, ZIF-8'in ana bileşiminin C, N ve Zn'den (yani, imidazolat bağlayıcının ve metal iyonunun yapısı, Zn16) oluştuğunu gösterdi (Şekil 1B). Önceki X-ışını kırınımı, ZIF-8 kristal fazlarının 10.33°, 12.8°, 14.7°, 16.5° ve 18°'de belirli zirveler tanımladığını ve bu zirvelerin sırasıyla (002), (112), (022), (013) ve (222) düzlemlerine atfedildiğini gösterdi, 16,41.

Önerilen hücre davranışı taraması için, IC 50 (ZIF-8'in hücre büyümesini%50 oranında inhibe ettiği konsantrasyon) belirlenmiştir29. Bunun için hücreler 0-950 μg/mL arasında değişen dozlarda 48 saat boyunca ZIF-8'e maruz bırakıldı (Şekil 2A). Maruz kalan hücrelerin doz-yanıt grafiği Şekil 2B'de görüntülenir ve daha sonra kaydedilen IC50 35.7 μg / mL'dir. Ek olarak, analiz, ZIF-8'e maruz kaldığında hücrelerin canlılığında doza bağlı bir eğilim ortaya çıkardı.

IC50 belirlendikten sonra ECIS analizi yapıldı. Kısaca ECIS, IC50'de ve bu konsantrasyonun altında ve üstünde, yani sırasıyla 15.7 μg/mL (C1), 35.7 μg/mL (C2), 55.7 μg/mL (C3) ve 75.7 μg/mL (C4) olmak üzere ZIF-8 MOF'lara maruz kalan BEAS-2B'nin gerçek zamanlı bir tarama stratejisi olarak kullanıldı ve hücreler toplam 72 saat süreyle maruz kaldı. ECIS'in dahil edilmesinin, hücre kapsamı, morfolojisi ve canlılığındaki değişikliklerin gerçek zamanlı olarak belirlenmesine ilişkin içgörü sağlaması öngörülmüştür. ECIS sonuçları, dirençteki değişiklikler ve hücre-substrat etkileşimlerindeki değişiklikler, yani alfa parametresi42 olarak kaydedildi.

Direnç eğilimleri, Şekil 3A'da , kontrole (siyah çizgi) (yani maruz kalmamış hücreler) kıyasla ZIF-8 ile muamele edilen hücrelerin profillerindeki değişiklikler olarak gösterilmektedir. Spesifik olarak, analiz, C2-C4 dozlarına maruz kalan altın elektrotlar üzerindeki hücreleri içeren kuyucukların, çerçevelere hücre maruziyetinden hemen sonra dirençte ilk hafif bir artış gösterdiğini gösterdi (hepsi kontrole göre [yani, maruz kalmamış hücreler]). Bu ilk değişiklikleri daha sonra kaydedilen dirençlerde keskin düşüşler izledi ve bu düşüşler maruziyetten 6-8 saat arasında yaygındı (Şekil 3A). Maruz kalma süresinden 14-18 saat sonra dirençte tam bir kayıp gözlendi. IC50 değerinin altındaki dozlara maruz kalan hücreler, direnç kayıpları ortaya çıktığında maruziyetten yaklaşık 16-18 saat sonrasına kadar, kontrol hücreli kuyucuklar gibi dirençler sergiledi. Ayrıca, hücresel maruziyet sırasında, deneylerde kullanılan kuyuların sinyalinde sürekli bir sinyal bozulması gözlenmiştir. Bu uygunluklar, alfa parametresinin analizi sırasında devam etti (Şekil 3B), bu analiz ayrıca maruz kalan hücrelerin hücre-substrat etkileşimlerini dirençli olanlara benzer profillerle değiştirdiğini gösterdi. Ayrıca, bu tür değişiklikler, maruziyetten geçen süreye ve bu maruziyette kullanılan doza bağlıydı.

Figure 1
Şekil 1: SEM görüntüsü ve ortalama element bileşimi ZIF-8 parçacıkları. (A) ZIF-8 parçacıklarının temsili SEM görüntüsü. (B) ZIF-8 parçacıklarının ortalama temel bileşimi (± standart sapma [SD] çubukları). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Hücre canlılığı. (A) Hücre tedavisi şeması (Biorender.com ile oluşturulmuştur). (B) 0-950 μg/mL arasında değişen dozlarda ZIF-8 partiküllerine maruz kalan BEAS-2B hücrelerinin canlılığı; bu analiz IC50'yi belirlemek için kullanıldı (± SD çubuğu; ***p = 0.0001 ve **** p < 0.0001 kontrole göre). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Temsili hücresel direnç ve hücresel bağlanmadaki değişiklikler. (A) IC 50 konsantrasyonunun altında, altında ve üstünde ZIF-8 parçacıklarına maruz kalan BEAS-2B hücrelerinin temsili hücresel direnci. (B) IC 50 konsantrasyonunun altında ve üstünde ZIF-8 partiküllerine maruz kaldığında BEAS-2B hücrelerinin hücresel bağlanmasındaki değişiklikler (yani, alfa parametresindeki değişiklikler). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Önceki analizler, ECIS'in analitlere maruz kalan hücrelerin davranışını değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermiştir (yani, karbon nanotüpler35, ilaçlar43 veya nanokiller16). Ayrıca, Stueckle ve ark. nanokillere ve bunların yan ürünlerine maruz kalan BEAS-2B hücrelerinin toksisitesini değerlendirmek için ECIS'i kullandılar ve hücresel davranış ve bağlanmanın bu tür malzemelerin fizikokimyasal özelliklerine bağlı olduğunu buldular42. Burada, MOF'lara maruz kalmaya yanıt olarak BEAS-2B hücrelerinin olası değişikliklerini belirlemeyi ve böylece ZIF-8'in hücresel sistemler üzerindeki zararlı etkilerini in vitro olarak ayırt etmeyi amaçlayan bilgi birikimine katkıda bulunmayı önerdik.

Analiz ilk olarak, hücresel davranıştaki değişiklikleri test edilen MOF'ların44 fizikokimyasal özellikleriyle ilişkilendirmeye yardımcı olmak için çerçeve özelliklerinin değerlendirilmesine izin verdi. Spesifik olarak, benzer element bileşimine sahip düzenli geometrilere sahip MOF'lara hücresel maruziyet üzerine (yukarıdaki sonuçlara bakınız), analiz, muhtemelen çerçevelerin alımından ve profil hücresel bozulmalarından kaynaklanan hücresel davranışta değişiklikler gösterdi. Spesifik olarak, alım açısından, bu çerçeve gibi hidrofobik malzemeler üzerindeki önceki toksisite analizi, bu tür malzemeler hücrelere maruz kaldıklarında, alımlarının, muhtemelen zarın yapısal çift tabakasından lipitleri çıkarma yeteneklerinden dolayı hidrofilik muadillerinin alımından daha fazla hücresel zar için daha yıkıcı olduğunu göstermiştir16, 45 hücresel translokasyonları sırasında membran disfonksiyonlarına veya plazma membran bozulmalarına yol açar46,47. Özellikle, lipid uzaklaştırılmasının, hücre fonksiyon etkilerinin bir dezavantajı ile zar bütünlüğünde, hücre sinyalizasyonunda48 ve hücresel alımda49 bir artışa yol açtığı gösterilmiştir. Örneğin, Farcal ve ark. hidrofobik birTiO2 nanomalzemesinin, maruz kalan alveolar makrofajlardaki hidrofilik muadili ile karşılaştırıldığında artmış bir sitotoksik etkiye sahip olduğunu göstermiştir50. Ek olarak, Wagner ve diğerleri, hidrofobik ZIF-8'in hidrofilik MIL-16016 ile karşılaştırıldığında BEAS-2B hücrelerinde daha fazla bozulmaya neden olduğunu gösterdi.

Hücre davranışında kaydedilen değişiklikler, muhtemelen, hücrenin seçilen çerçeveye maruz kalmasının bir sonucu olarak elektrotlar üzerindeki hücre-substrat etkileşimlerindeki26 ve/veya hücre canlılığı ve proliferasyonundaki16 bozukluklardan kaynaklanmaktadır. Örneğin, Wagner ve ark. nanokillere maruz kalan hücrelerde benzer parametreleri değerlendirdi. Yazarlar, 72 saatlik deneyler boyunca hücre-substrat etkileşiminde tam bir kayıp gözlemlendiğini bulmuşlardır. Ek olarak, yazarlar, BEAS-2B'ler seçtikleri nanokillere maruz kaldıklarında hücre canlılığı ve proliferasyonu üzerinde zamana bağlı bir etki gösterdiler26. Burada test edilen parçacıklar MOF olsa da, bu parçacıkların bazı fizikokimyasal özellikleri (yani boyut, hidrofobiklik ve bileşim) MOF'larınkine benzer olduğundan, nanokiller için görülen etkilerle olası genişletilmiş ilişki mümkündür. Ayrıca, Stueckle ve ark. nanokiller ölümsüzleştirilmiş BEAS-2B hücrelerine maruz kaldığında zamana ve tedaviye bağlı hücresel davranış gösterdi. Diğerleri, 100 μg/mL'lik bir dozda ZIF-8'in, muhtemelen hücre-substrat etkileşimlerindeki değişiklikler nedeniyle BEAS-2B hücrelerinin hücre tek tabakasında ve hücre canlılığında tam bir kayba neden olduğunu göstermiştir16. Bununla birlikte, bu tür çalışmalarda, ZIF-8 parçacıklarının farklı sentez koşulları altında elde edildiği (yani, bu çalışmada kullanılan 24 saate karşı 10 dakika) ve bu tür sentez koşullarının daha sonra önceki sonuçları desteklemek için çerçevelerin farklı şekilleri/morfolojileri ile sonuçlandığı belirtilmektedir. Bu, partikül sentezi sırasında kullanılan reaksiyon süresi6, sıcaklık2 ve çözücü44'ün şekillerini, boyutlarını ve bileşim profillerini etkilediğini ve daha sonra maruz kalan hücrelerde farklı etkilere ve davranışlara yol açtığını göstermektedir.

Analiz ayrıca, IC50 değerinin altındaki ZIF-8 dozlarına maruz kalan hücrelerin, kontrollerinkine benzer dirençler gösterdiğini, çünkü muhtemelen bu dozların, bu deneylerin yapıldığı koşullarda ve zaman diliminde ECIS tarafından gözlemlenebilir hücre dönüşümünü indükleyecek kadar önemli olmadığını gösterdi. Bununla birlikte, IC50'nin üzerindeki dozlarda, hücresel dirençte tam bir kayıp gözlendi ve maruziyetten sadece birkaç saat sonra, büyük olasılıkla hücre canlılığındaki değişiklikler ve hücre-substrat etkileşimlerinde indüklenen olası değişikliklernedeniyle 16 (Şekil 3A). Bu iddialar, canlı olmayan hücrelerin şekillerini değiştirdiğini ve substratlardan ayrıldığını gösteren önceki çalışmalarla desteklenmektedir. Örneğin, Verma ve ark. bir insan alveolar epitel hücre hattındaki (A549) nanokillerin sitotoksisitesini değerlendirmek için gerçek zamanlı bir empedans algılama tekniği kullandı. Trombosit tipi nanokillerin, tübüler tip nanokillere kıyasla ayrılmış ve deforme olmuş hücre sayısında artışa neden olduğu gösterilmiştir51. Ek olarak, Xiao ve ark. fibroblastik V79 hücrelerinin hücre iskeletinin, kültür ortamından su, hücre dışı iyonlar ve sitotoksik kimyasalların akışı nedeniyle kadmiyum klorüre maruz kaldığında tehlikeye girdiğini gösterdi. Hücre hücre iskeletindeki değişiklikler, hücre-substrat etkileşimlerinin kaybına yol açtı. Ayrıca, benzalkonyum klorür V79 hücrelerine maruz kaldığında, maruz kalmanın neden olduğu hücresel zarın hasar görmesi nedeniyle hücresel dirençte önemli bir azalma olmuştur52.

Ayrıca, dirençteki değişiklikler, ZIF-8'in fizikokimyasal özelliklerine hücre reaksiyonlarından kaynaklanabilir. Özellikle, ZIF-8 hidrofobik bir çerçevedir; Önceki analizler, hidrofobikliğin toksisitede bir artışa neden olabileceğini göstermiştir16. Zn gibi metal iyonlarının, Zr ve Fe1 gibi diğer metallerle karşılaştırıldığında daha yüksek derecede toksisiteye neden olduğu ve muhtemelen daha yüksek hücresel ölüme katkıda bulunduğu daha önce gösterilmiştir.

Ayrıca, tüm hücrelerin maruziyetten hemen sonra dirençte bir ilk azalma kaydettiği ve ardından bir artış kaydettiği gösterilmiştir. Eldawud ve ark. SWCNT'ler BEAS-2B hücrelerine maruz kaldığında benzer etkiler gösterdi. Yazarlar, hücresel dirençteki artışı, BEAS-2B hücrelerinin, malzemelerin maruz kalmasından kaynaklanan rahatsızlıkların üstesinden gelmesi ve daha sonra bütünlüklerini yeniden kazanması18 ve böylece elektrot kaymasını28 ortadan kaldırması ve böylece veri analizinin tekrarlanabilirliğini sağlaması nedeniyle yorumladılar (bkz. ECIS el kitabı).

Bu çalışma, ECIS'in hücre davranışı taramasında kullanılmak üzere değerli bir araç olabileceğini göstermiş olsa da, özellikle yüksek verim özelliği nedeniyle, bir malzemenin zararlı değerlendirmesinin tam bir resmi istendiğinde tekniğin tek zaman noktası tahlillerinin yerini almaması önerilir. Özellikle, tek nokta tahlili, Eldawud ve ark. tarafından gösterildiği gibi, örneğin nanoelmaslara maruz kalan BEAS-2B hücreleri ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) 45 yoluyla hücre dönüşümünün genetik seviyelerinde45,53 değerlendirilmesine izin verebilir.   Yu ve ark., hyaluronik asitle modifiye edilmiş mezogözenekli silika nanopartiküllerine (HA-MSN'ler) maruz kalan insan kolon kanseri hücrelerini (HCT0116) değerlendirmek için FACS'yi de kullandı54.

Sunulan sonuçlar, değişim yolunun MOF'ların fizikokimyasal özelliklerine ve ayrıca maruziyetlerde kullanılan bu tür çerçevelerin zamanına ve dozuna bağlı olduğunu göstermektedir. Burada açıklanan sonuçlar ve yöntemler, gerçek zamanlı ölçümlerin önemini ve hücresel profillerdeki değişiklikleri anlamadaki avantajlarını daha da vurgulamaktadır. Bunlar, toksisite mekanizmasını değerlendirmek için potansiyel olarak ek biyokimyasal tahlillerle desteklenebilir, böylece hücre bağlanması, hücre-hücre etkileşimleri veya hücre-substrat etkileşimleri olarak kaydedilen, hücre davranışı üzerinde zararlı etkileri olmayan MOF'ların tasarım gereği güvenli stratejilerine yol açar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) T32 programı (T32 GM133369) ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF 1454230) tarafından finanse edilmiştir. Ek olarak, WVU Ortak Araştırma Tesisleri ve Uygulamalı Biyofizik yardımı ve desteği kabul edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)  Roche 5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25255-056
100 mm plates Corning 430167
1300 Series A2 biofume hood Thermo Scientific 323TS
2510 Branson bath sonicator Process Equipment & Supply, Inc.  251OR-DTH
2-methylimidazole, 97% Alfa Aesar 693-98-1
5 mL sterile microtube Argos Technologies T2076S-CA
50 mL  tubes  Falcon 352098
96W10idf well plates Applied Biophysics  96W10idf PET
96-well plates Fisherbrand FB012931
Biorender Biorender N/A
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess II FL automated cell counter Life Technologies C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater Denton Vacuum N/A
Dimethly sulfoxide  Corning 25-950-CQC
DPBS/Modified Cytiva SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium Corning 10-014-CV
ECIS-ZΘ Applied Biophysics  ABP 1129
Excel Microsoft Version 2301
Falcon tubes (15 mL) Corning 352196
Fetal bovine serum Gibco 16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader BMG LABTECH 413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0) GraphPad Software, LLC Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray  Hitachi High-Technologies Corporation S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells American Type Culture Collection CRL-9609
Isotemp freezer Fisher Scientific 
Methanol, 99% Fisher Chemical 67-56-1
Parafilm sealing film The Lab Depot HS234526A
Penicillin/Steptomycin Gibco 15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge  Thermo Scientific 75004220
Sorvall T 6000B DU PONT  T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS MP Biomedicals, LLC 1691049
Vacuum Chamber Belart 999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure Acros Organic 101-96-18-9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tamames-Tabar, C., et al. Cytotoxicity of nanoscaled metal-organic frameworks. Journal of Materials Chemistry. B. 2 (3), 262-271 (2014).
  2. Lin, W. X., et al. Low cytotoxic metal-organic frameworks as temperature-responsive drug carriers. ChemPlusChem. 81 (8), 804-810 (2016).
  3. Vasconcelos, I. B., et al. Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF-8. RSC Advances. 2 (25), 9437-9442 (2012).
  4. Yang, B. C., Shen, M., Liu, J. Q., Ren, F. Post-synthetic modification nanoscale metal-organic frameworks for targeted drug delivery in cancer cells. Pharmaceutical Research. 34 (11), 2440-2450 (2017).
  5. Lucena, M. A. M., et al. Application of the metal-organic framework Eu(BTC) as a luminescent marker for gunshot residues: A synthesis, characterization, and toxicity study. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (5), 4684-4691 (2017).
  6. Kayal, S., Sun, B. C., Chakraborty, A. Study of metal-organic framework MIL-101(Cr) for natural gas (methane) storage and compare with other MOFs (metal-organic frameworks). Energy. 91, 772-781 (2015).
  7. Gutov, O. V., et al. Water-stable zirconium-based metal-organic framework material with high-surface area and gas-storage capacities. Chemistry. 20 (39), 12389-12393 (2014).
  8. Ghorbanloo, M., Safarifard, V., Morsali, A. Heterogeneous catalysis with a coordination modulation synthesized MOF: morphology-dependent catalytic activity. New Journal of Chemistry. 41 (10), 3957-3965 (2017).
  9. Valvekens, P., et al. Base catalytic activity of alkaline earth MOFs: a (micro) spectroscopic study of active site formation by the controlled transformation of structural anions. Chemical Science. 5 (11), 4517-4524 (2014).
  10. Taylor, K. M. L., Rieter, W. J., Lin, W. B. Manganese-based nanoscale metal-organic frameworks for magnetic resonance imaging. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14358-14359 (2008).
  11. Taylor-Pashow, K. M. L., Della Rocca, J., Xie, Z. G., Tran, S., Lin, W. B. Postsynthetic modifications of iron-carboxylate nanoscale metal-organic frameworks for imaging and drug delivery. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14261-14263 (2009).
  12. Kundu, T., et al. Mechanical downsizing of a gadolinium(III)-based metal-organic framework for anticancer drug delivery. Chemistry. 20 (33), 10514-10518 (2014).
  13. Orellana-Tavra, C., et al. Drug delivery and controlled release from biocompatible metal-organic frameworks using mechanical amorphization. Journal of Materials Chemistry. B. 4 (47), 7697-7707 (2016).
  14. Su, H. M., et al. A highly porous medical metal-organic framework constructed from bioactive curcumin. Chemical Communications. 51 (26), 5774-5777 (2015).
  15. Gandara-Loe, J., et al. Metal-organic frameworks as drug delivery platforms for ocular therapeutics. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (2), 1924-1931 (2019).
  16. Wagner, A., et al. Toxicity screening of two prevalent metal organic frameworks for therapeutic use in human lung epithelial cells. International Journal of Nanomedicine. 14, 7583-7591 (2019).
  17. Chen, G. S., et al. In vitro toxicity study of a porous iron(III) metal-organic framework. Molecules. 24 (7), 1211 (2019).
  18. Eldawud, R., Wagner, A., Dong, C. B., Rojansakul, Y., Dinu, C. Z. Electronic platform for real-time multi-parametric analysis of cellular behavior post-exposure to single-walled carbon nanotubes. Biosensors & Bioelectronics. 71, 269-277 (2015).
  19. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment: Limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (2), 370-377 (2009).
  20. Lucena, F. R. S., et al. Induction of cancer cell death by apoptosis and slow release of 5-fluoracil from metal-organic frameworks Cu-BTC. Biomedicine & Pharmacotherapy. 67 (8), 707-713 (2013).
  21. Orellana-Tavra, C., et al. Tuning the endocytosis mechanism of Zr-based metal-organic frameworks through linker functionalization. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (41), 35516-35525 (2017).
  22. Zucker, R. M., Ortenzio, J. N. R., Boyes, W. K. Characterization, detection, and counting of metal nanoparticles using flow cytometry. Cytometry. Part A. 89 (2), 169-183 (2016).
  23. Robson, A. L., et al. Advantages and limitations of current imaging techniques for characterizing liposome morphology. Frontiers in Pharmacology. 9, 80 (2018).
  24. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  25. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  26. Wagner, A., et al. Toxicity evaluations of nanoclays and thermally degraded byproducts through spectroscopical and microscopical approaches. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861, 3406-3415 (2017).
  27. Wagner, A., et al. Early assessment and correlations of nanoclay's toxicity to their physical and chemical properties. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (37), 32323-32335 (2017).
  28. Wagner, A., et al. Incineration of nanoclay composites leads to byproducts with reduced cellular reactivity. Scientific Reports. 8 (1), 10709 (2018).
  29. Zhao, F., Klimecki, W. T. Culture conditions profoundly impact phenotype in BEAS-2B, a human pulmonary epithelial model. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 945-951 (2015).
  30. Wu, S. X., Wang, W. H., Fang, Y. Z., Kong, X. J., Liu, J. H. Efficient Friedel-Crafts acylation of anisole over silicotungstic acid modified ZIF-8. Reaction Kinetics Mechanisms and Catalysis. 122, 357-367 (2017).
  31. Shu, F. P., et al. Fabrication of a hyaluronic acid conjugated metal organic framework for targeted drug delivery and magnetic resonance imaging. RSC Advances. 8 (12), 6581-6589 (2018).
  32. Shi, Z. Q., et al. FA-PEG decorated MOF nanoparticles as a targeted drug delivery system for controlled release of an autophagy inhibitor. Biomaterials Science. 6 (10), 2582-2590 (2018).
  33. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).
  34. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  35. Eldawud, R., et al. Carbon nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and fate. Nanoimpact. 9, 72-84 (2018).
  36. An, Y., Jin, T. Y., Zhang, F., He, P. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) for profiling cytotoxicity of cigarette smoke. Journal of Electroanalytical Chemistry. 834, 180-186 (2019).
  37. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  38. Applied Biophysics, Allied Biophysics. , Available from: https://biophysics.com (2023).
  39. Park, Y. H., Kim, D., Dai, J., Zhang, Z. Human bronchial epithelial BEAS-2B cells, an appropriate in vitro model to study heavy metals induced carcinogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 287 (3), 240-245 (2015).
  40. Yang, F., et al. Morphological map of ZIF-8 crystals with five distinctive shapes: Feature of filler in mixed-matrix membranes on C3H6/C3H8 separation. Chemistry of Materials. 30 (10), 3467-3473 (2018).
  41. Rose, O. L., et al. Thin films of metal-organic framework interfaces obtained by laser evaporation. Nanomaterials. 11 (6), 1367 (2021).
  42. Stueckle, T. A., et al. Impacts of organomodified nanoclays and their incinerated byproducts on bronchial cell monolayer integrity. Chemical Research in Toxicology. 32 (12), 2445-2458 (2019).
  43. Eldawud, R., et al. Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1864 (11), 129683 (2020).
  44. Zhuang, J., et al. Optimized metal-organic-framework nanospheres for drug delivery: Evaluation of small-molecule encapsulation. ACS Nano. 8 (3), 2812-2819 (2014).
  45. Eldawud, R., et al. Combinatorial approaches to evaluate nanodiamond uptake and induced cellular fate. Nanotechnology. 27 (8), 085107 (2016).
  46. Houthaeve, G., De Smedt, S. C., Braeckmans, K., De Vos, W. H. The cellular response to plasma membrane disruption for nanomaterial delivery. Nano Convergence. 9 (1), 6 (2022).
  47. Otero-Gonzalez, L., Sierra-Alvarez, R., Boitano, S., Field, J. A. Application and validation of an impedance-based real time cell analyzer to measure the toxicity of nanoparticles impacting human bronchial epithelial cells. Environmental Science & Technology. 46 (18), 10271-10278 (2012).
  48. Ibarguren, M., Lopez, D. J., Escriba, P. V. The effect of natural and synthetic fatty acids on membrane structure, microdomain organization, cellular functions and human health. Biochimica et Biophysica Acta. 1838 (6), 1518-1528 (2014).
  49. Nor, Y. A., et al. Shaping nanoparticles with hydrophilic compositions and hydrophobic properties as nanocarriers for antibiotic delivery. ACS Central Science. 1 (6), 328-334 (2015).
  50. Farcal, L., et al. Comprehensive in vitro toxicity testing of a panel of representative oxide nanomaterials: First steps towards an intelligent testing strategy. PLoS One. 10 (5), e0127174 (2015).
  51. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
  52. Xiao, C. D., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: Concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  53. Coyle, J. P., et al. Carbon nanotube filler enhances incinerated thermoplastics-induced cytotoxicity and metabolic disruption in vitro. Particle and Fibre Toxicology. 17 (1), 40 (2020).
  54. Yu, M. H., et al. Hyaluronic acid modified mesoporous silica nanoparticles for targeted drug delivery to CD44-overexpressing cancer cells. Nanoscale. 5 (1), 178-183 (2013).

Tags

Biyomühendislik Sayı 195
Metal-Organik Çerçeve Toksikolojik Profillerinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Elektrik Hücresi-Substrat Algılama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, O. L., Arnold, M., Dinu, C. Z. … More

Rose, O. L., Arnold, M., Dinu, C. Z. Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles. J. Vis. Exp. (195), e65313, doi:10.3791/65313 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter