Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kvantitativ påvisning af DNA-protein-tværbindinger og deres posttranslationelle modifikationer

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65315
Automatic Translation
1
1Developmental Therapeutics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

Denne protokol fremhæver en modificeret metode til påvisning og kvantificering af DNA-protein-tværbindinger (DPC'er) og deres posttranslationelle modifikationer (PTM'er), herunder ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering induceret af topoisomerasehæmmere og formaldehyd, hvilket muliggør undersøgelse af dannelse og reparation af DPC'er og deres PTM'er.

Abstract

DNA-protein-tværbindinger (DPC'er) er hyppige, allestedsnærværende og skadelige DNA-læsioner, der opstår fra endogene DNA-skader, enzym (topoisomeraser, methyltransferaser osv.), Der ikke fungerer korrekt, eller eksogene midler såsom kemoterapeutika og tværbindingsmidler. Når DPC'er er induceret, konjugeres flere typer posttranslationelle modifikationer (PTM'er) straks til dem som tidlige reaktionsmekanismer. Det har vist sig, at DPC'er kan modificeres af ubiquitin, lille ubiquitin-lignende modifikator (SUMO) og poly-ADP-ribose, som primer substraterne for at signalere deres respektive udpegede reparationsenzymer og i nogle tilfælde koordinere reparationen på sekventielle måder. Da PTM'er transspirerer hurtigt og er meget reversible, har det været udfordrende at isolere og detektere PTM-konjugerede DPC'er, der normalt forbliver på lave niveauer. Præsenteret her er et immunoassay til oprensning og kvantitativt detektering af ubiquitylerede, SUMOylerede og ADP-ribosylerede DPC'er (lægemiddelinducerede topoisomerase DPC'er og aldehydinducerede ikke-specifikke DPC'er) in vivo. Dette assay er afledt af RADAR-assayet (hurtig tilgang til DNA-adduktgendannelse), der anvendes til isolering af genomisk DNA indeholdende DPC'er ved ethanoludfældning. Efter normalisering og nukleasefordøjelse detekteres PTM'er af DPC'er, herunder ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering, ved immunoblotting under anvendelse af deres tilsvarende antistoffer. Dette robuste assay kan bruges til at identificere og karakterisere nye molekylære mekanismer, der reparerer enzymatiske og ikke-enzymatiske DPC'er og har potentialet til at opdage små molekylehæmmere rettet mod specifikke faktorer, der regulerer PTM'er til reparation af DPC'er.

Introduction

Genomisk DNA-skade opstår på grund af spontant henfald, intern skade og miljøfaktorer1. De resulterende DNA-læsioner omfatter beskadigede baser, mismatch, enkelt- og dobbeltstrengsbrud, inter- og intrastrengstværbindinger og DNA-protein-tværbindinger (DPC'er). En DPC dannes, når et kromatinbundet protein fanges på DNA gennem kovalent binding. DPC'er induceres af endogene DNA-læsioner og reaktive metabolitter såvel som eksogene midler såsom kemoterapeutika og bifunktionelle tværbindingsmidler. Under visse omstændigheder kan enzymdysfunktion også føre til dannelsen af DPC'er2. Den store forskel i DPC-induktorer resulterer i en forskel i identiteten af det kovalentbundne protein, kromosomområdet, hvor DPC'en dannes, strukturtypen af DNA'et, der er tværbundet til proteinet, og den kemiske egenskab af den kovalente binding mellem proteinet og DNA 2,3,4.

Baseret på deres kemiske natur kategoriseres DPC'er generelt i to grupper: enzymatiske DPC'er og ikke-enzymatiske DPC'er. Visse enzymer såsom topoisomeraser, glycosylaser og methyl / acyltransferaser virker ved at danne reversible enzym-DNA-kovalente mellemprodukter under deres normale katalytiske reaktioner. Disse er kortlivede enzym-DNA-mellemprodukter og kan omdannes til langlivede enzymatiske DPC'er ved deres fangst af endogene eller eksogene midler, især ved kemoterapeutika3. Topoisomerase DPC'er er blandt de hyppigste enzymatiske DPC'er i eukaryote celler, som kan genereres af klinisk nyttige topoisomerasehæmmere (topotecan og irinotecan til topoisomerase I [TOP1] og etoposid og doxorubicin til topoisomerase II [TOP2]) og er de primære terapeutiske mekanismer for disse hæmmere 5,6. DNA-methyltransferaser (DNMT) 1, 3A og 3B er målet for 5-aza-2'-deoxycytidin (også kendt som decitabin) og danner DPC'er ved eksponering for lægemidlet7. Reaktive midler, såvel som ultraviolet lys og ioniserende stråling, inducerer ikke-enzymatiske DPC'er ved ikke-specifikt tværbindende proteiner til DNA. Reaktive aldehyder såsom acetaldehyd og formaldehyd (FA) genereres ofte som biprodukter af cellulære metabolismer, blandt hvilke FA produceres ved mikromolære koncentrationer under methanolmetabolisme, lipidperoxidation og histondemethylering. FA er også et højvolumenproduktionskemikalie fremstillet over hele verden, som mange mennesker udsættes for både miljømæssigt og erhvervsmæssigt 8,9.

Både enzymatiske og ikke-enzymatiske DPC'er er meget giftige for celler, da deres voluminøse proteinkomponenter effektivt hindrer næsten alle kromatinbaserede processer, herunder replikation og transkription, hvilket fører til cellecyklusstop og apoptose, hvis de ikke repareres. I løbet af de sidste to årtier er reparationen af DPC'er blevet grundigt undersøgt, og flere proteiner / veje er blevet identificeret som nøglefaktorer, der enten direkte reparerer DPC'er eller modulerer deres reparationsprocesser. For eksempel har det været veletableret, at proteolyse af proteinmassen af en DPC er et afgørende trin i DPC-reparation, og at proteolyse kan katalyseres af proteaserne SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A15, GCNA 16,17 eller 26S-proteasomkomplekset 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 på en celletype- eller cellulær kontekstafhængig måde. Identifikation og karakterisering af disse proteaser har i vid udstrækning været afhængig af in vivo-komplekset af enzymet (ICE) assay28,29 og den hurtige tilgang til DNA-adduktgendannelse (RADAR) assay30,31, som begge isolerer DNA-molekyler og deres kovalentbundne proteiner fra frie cellulære proteiner for at muliggøre påvisning af DPC'er ved slot-blot ved hjælp af antistoffer rettet mod de tværbundne proteiner. Også den fangede agarose-DNA-immunfarvning (TARDIS) assay blev anvendt som et middel til at detektere og kvantificere DPC'er på enkeltcelleniveau32. I øjeblikket vælger forskere RADAR-analysen frem for ICE-analysen til måling af DPC'er, da ICE-analysen er afhængig af oprensning af nukleinsyrer ved hjælp af cæsiumchloridgradientultracentrifugering, hvilket er ekstremt tidskrævende, mens RADAR-analysen udfælder nukleinsyrer ved anvendelse af ethanol inden for en meget kortere periode.

I de senere år er der fremkommet stigende beviser for, at flere posttranslationelle modifikationer (PTM'er) er involveret i signalering og rekruttering af DPC-målrettede proteaser 3,33,34,35. For eksempel viste både TOP1- og TOP2-DPC'er sig at være konjugeret af lille ubiquitin-lignende modifikator (SUMO)-2/3 og derefter SUMO-1 af SUMO E3-ligaasen PIAS4, uafhængigt af DNA-replikation og transkription. De sekventielle SUMO-modifikationer ser ud til at være et mål for ubiquitin, som deponeres til SUMOylerede TOP-DPC'er og danner polymere kæder gennem dets lysin 48-rest af en SUMO-målrettet ubiquitinligase kaldet RNF4. Derefter fremkalder ubiquitinpolymeren et signal til og rekrutterer 26S-proteasomet til TOP-DPC'er23,36. Den samme SUMO-ubiquitin-vej viste sig for nylig at virke på DNMT1-DPC'er såvel som PARP-DNA-komplekser til deres reparation37,38. Derudover er SUMO-uafhængig ubiquitylering af ubiquitin E3-ligase TRAIP blevet rapporteret til primære DPC'er for proteasomal nedbrydning på en replikationskoblet måde39. I lighed med den proteasomale nedbrydning af TOP-DPC'er kræver proteolyse af enzymatiske og ikke-enzymatiske DPC'er af replikationskoblet metalloprotease SPRTN også ubiquitylering af DPC-substraterne som en mekanisme til at engagere SPRTN40,41. Afgrænsning af SUMOylerings og ubiquitylerings rolle kræver påvisning af DPC'er, der er markeret med disse PTM'er. Da det originale ICE-assay og RADAR-assay er afhængige af slot-blot/dot-blot-apparat til måling af ufordøjede DNA-prøver, er ingen af disse to assays i stand til at opløse og visualisere PTM-konjugerede DPC-arter med forskellige molekylvægte. For at overvinde dette problem fordøjede vi DNA-prøverne efter deres oprensning ved ethanoludfældning og prøvenormalisering med mikrokoknuklease, en DNA- og RNA-endo-eksonuklease for at frigive de tværbundne proteiner, hvilket gjorde det muligt for os at løse proteinerne såvel som deres kovalente PTM'er med natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Elektroforesen gjorde det muligt for os at detektere og kvantificere PTM-konjugerede DPC'er ved hjælp af specifikke antistoffer rettet mod PTM'erne. Vi kaldte oprindeligt denne forbedrede metode DUST-analysen for at fremhæve dens robusthed i detekteringen af ubiquitylerede og SUMOylerede TOP-DPC'er23. Senere udvidede vi brugen af analysen til kvantitativt at vurdere ADP-ribosylering af TOP1-DPC'er in vivo ved hjælp af antistoffer mod poly-ADP-ribosepolymerer20.

Præsenteret her er en detaljeret protokol til analysen, der registrerer og måler ubiquitylerede, SUMOylerede og ADP-ribosylerede DPC'er, som blev optimeret til de modificerede TOP-DPC'er, der induceres af deres hæmmere og ikke-specifikke / ikke-enzymatiske DPC'er, der induceres af FA. Dette assay isolerer PTM-konjugerede DPC'er ved at lysere celler med et kaotropisk middel, udfælde DNA med ethanol og frigive de ellers tværbundne proteiner og deres modifikatorer med mikrokoknuklease. De ellers DNA-bundne proteiner og deres PTM'er kvantificeres ved immunoblotting ved hjælp af specifikke antistoffer. Dette assay baner en ny vej til at belyse de molekylære mekanismer, hvormed cellen reparerer både enzymatiske og ikke-enzymatiske DPC'er. Det muliggør specifikt detaljerede undersøgelser af induktion og kinetik af PTM'er, der er vigtige for reguleringen af TOP-DPC-nedbrydning og reparation, og gør det således muligt at opdage nye faktorer såsom E3-ligaser, der dikterer PTM'erne. samt hæmmere rettet mod disse faktorer. Da nogle af de PTM'er, der er ansvarlige for TOP-DPC-reparation, sandsynligvis er involveret i reparation af DPC'er induceret af andre kemoterapeutika, såsom platinbaserede lægemidler22, har dette assay også potentialet til anvendelse til opdagelse af nye lægemidler og rationel optimering af kombinatoriske terapier med topoisomerasehæmmere eller platinbaseret antineoplast i patientceller for at vejlede behandlingsregimer.

Protocol

1. Cellekultur og lægemiddelbehandling i den humane embryonale nyre 293 (HEK293) cellelinje

  1. Forbered dyrkningsmedium, Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM), suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% 2 mM L-glutamin og 100 enheder / ml penicillin-streptomycin.
  2. Frø 1 x 10 6 celler i en 60 mm plade eller en 6-brønds plade pr. behandlingsbetingelse plus kontrol.
  3. Den næste dag skal du behandle cellerne med DPC-induktorer efter eget valg.
    1. For at inducere TOP1-DPC'er og deres ubiquitylering og SUMOylering tilsættes TOP1-hæmmeren camptothecin ved 20 μM til cellerne og opsamler cellerne efter 20, 60 og 180 min.
    2. For at inducere TOP2α og β-DPC'er og deres ubiquitylering og SUMOylering udsættes cellerne for at tilføje TOP2-hæmmeren etoposid ved 200 μM til cellerne og indsamle cellerne efter 20, 60 og 180 minutter.
    3. For at inducere ikke-enzymatiske DPC'er og deres ubiquitylering og SUMOylering tilsættes FA ved 1 mM og opsamles cellerne 2 timer efter eksponeringen.
    4. For at inducere PARylering af TOP1-DPC'er skal cellerne forbehandles i 1 time for at blokere dePARylering med poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG)-hæmmer PDD00017273 ved 10 μM, efterfulgt af samtidig behandling med 20 μM camptothecin i 20, 60 og 180 minutter.

2. Isolering og normalisering af DNA indeholdende tværbundne proteiner

  1. Hurtigt suges mediet med en sugepipette efter behandling, og cellerne skylles med iskold 1x fosfatbufret saltvand (PBS). Lys straks cellerne i 600 μL DNAzol-reagens indeholdende 1x proteasecocktailhæmmer, 1 mM dithiothreitol (DTT) og 20 mM N-ethylmaleimid (hæmmer af deSUMOylerende og deubiquitylerende enzymer).
  2. Pladen omrøres langsomt på en vibrerende platform i 10 minutter ved 4 °C.
  3. Der tilsættes 1/2 volumen 100% kold ethanol (0,3 ml) direkte til pladen, og trin 2.2 gentages, indtil uigennemsigtigt nukleinsyreaggregat bliver synligt. Cellelysatet overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugeglas, og glasset centrifugeres med maksimal hastighed (20.000 x g) i 15 minutter ved 4 °C for at udfælde nukleinsyren og dens tværbundne proteiner.
  4. Supernatanten suges til synkende ved hjælp af en sugepipette, og nukleinsyrepelleten vaskes i 1 ml 75 % ethanol efterfulgt af 2 min 20.000 x g centrifugering ved 4 °C.
  5. Supernatanten suges op, centrifugeres ned med samme hastighed, og den resterende væske fjernes med en P20-pipette. Lufttør pillen i 5 min.
  6. Nukleinsyrepillen opløses hurtigt i 0,1 ml ddH2O. Pellet resuspenderes ved gentagen pipettering og inkuberes derefter i et 37 °C vandbad, indtil pelleten svulmer op til mindst tre gange større (ca. 30 min).
  7. Sonikere prøverne med en ultralydsprocessor sonde ved 30% amplitude i 10 s for fuldt ud at opløse pellet.
  8. Valgfrit trin: Prøverne behandles med RNase A/T1-blanding (10 μg RNase A og 25 U RNase T1) og inkuberes ved 37 °C i 15 minutter. Der tilsættes 1/10 volumen 3 M natriumacetat og to volumener iskold 100% ethanol til røret, efterfulgt af centrifugering ved 20.000 x g i 10 minutter for at hente DNA'et. Supernatanten fjernes og det udfældede DNA opløses i 0,1 mlddH2O.
  9. Valgfrit trin: Centrifuger prøven i 5 minutter ved 20.000 x g , og overfør supernatanten til et nyt glas.
  10. Kvantificer DNA-koncentrationen ved hjælp af et ultraviolet-synligt (UV-Vis) spektrometer. Det typiske DNA-udbytte er omkring 600-800 ng/μL. A260/A280-forholdet bør reduceres fra 2,0-2,1 til 1,8-1,9 efter RNA-fjernelse.
  11. DNA-koncentrationen justeres til 400-500 ng/μL i 0,12 ml ddH 2O.20μL af prøven overføres til et nyt mikrocentrifugeglas som ufordøjet DNA-belastningskontrol (se trin 2.4).
  12. For at fordøje DNA'et opløst i de resterende 100 μLddH2O, tilsættes 2.000 gelenheder mikrokoknuklease sammen med 1/10 volumen (~11 μL) 10x calciummikrokoknukleasereaktionsbuffer til prøven. Der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.

3. Western blotting af fordøjede DNA-prøver

  1. Tilsæt 4x Laemmli prøvebuffer, og kog derefter prøven i 5 min.
  2. Læg 5-6 μg fordøjet prøve (~15 μL) på 4%-20% polyacrylamidgel, efterfulgt af SDS-PAGE42 for at opløse umodificerede og PTM-konjugerede DPC'er.
  3. For at detektere FA-inducerede ikke-enzymatiske DPC-arter inkuberes gelen med Coomassie-blå plet natten over ved stuetemperatur. Vask gelen med ddH 2 O i2timer og få et billede ved hjælp af et billeddannelsessystem.
  4. Gelen overføres og inkuberes membranerne natten over ved 4 °C med passende fortyndinger af det primære antistof i blokerende buffer.
    1. For at detektere ubiquitylering skal du foretage en 1:100 fortynding af anti-ubiquitin-antistof.
    2. For at detektere SUMO-1 eller SUMO-2/3 modifikation, lav en 1:250 fortynding af anti-SUMO-1 eller anti-SUMO-2/3 antistof.
    3. For at detektere ADP-ribosylering foretages en 1:500 fortynding af anti-PAR-antistof.
    4. For at detektere total TOP1-, TOP2α- eller TOP2β-DPC'er skal du foretage en 1:500 fortynding af anti-TOP1, anti-TOP2α eller anti-TOP2β antistof.
      BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer om antistoffortynding.
  5. Inkuber en 1x PBS-T (0,1% tween 20) vasket membran med et sekundært antistof fortyndet 5.000 gange i blokerende buffer i 60 minutter ved stuetemperatur.
  6. Udvikl membranen med forbedret kemiluminescens (ECL) reagens og få et billede ved hjælp af billeddannelsessystemet.

4. Slot-blotting af ufordøjede DNA-prøver

  1. Den ufordøjede DNA-prøve på 20 μL fortyndes i 180 μL natriumphosphatbuffer (25 mM, pH 6,6).
  2. Skær nitrocellulosemembranen (0,45 μm) og ekvilibrer i 5 minutter i natriumphosphatbufferen.
  3. Saml slot-blot-apparatet i henhold til producentens anvisninger, og tilslut det til et vakuumsystem.
  4. Vask brøndene med natriumphosphatbuffer ved at påføre vakuumet. Sørg for, at der ikke lækker brøndene.
  5. Stop vakuummet og læg 200 μL DNA pr. prøve (1 μg). De tomme huller fyldes med 200 μL natriumphosphatbuffer.
  6. Påfør vakuumet.
  7. Når alle brøndene er helt tomme, standses vakuummet, der fyldes 200 μL natriumphosphatbuffer i hvert hul, og trin 4.6 gentages.
  8. Hent membranen og blok med 5% blokerende buffer i 0,5 timer ved stuetemperatur.
  9. Sonde med anti-dobbeltstrenget DNA (dsDNA) antistof ved en 1:5.000 fortynding natten over ved 4 °C.
  10. Vask 3x med 1x PBS-T og inkuber med 1:5.000 fortyndet peberrodsperoxidase (HRP)-bundet anti-mus sekundært antistof.
  11. Udvikl membranen med forbedret kemiluminescens (ECL) reagens og få et billede ved hjælp af billeddannelsessystemet.

5. Densitometrisk analyse

  1. Brug ImageJ til at beregne forholdet mellem intensiteten af hvert bånd/udtværing i forhold til intensiteten af spalten af ufordøjet DNA og normalisere forholdet til forholdet mellem celler uden/før lægemiddelbehandling.

Representative Results

De repræsentative resultater præsenteret i figur 1 viser dannelsen og kinetikken af lægemiddelinducerede TOP1-DPC'er og deres SUMOylering og ubiquitylering. TOP1 spaltede en streng af DNA-duplekset og dannede et enzym-DNA-kovalent mellemprodukt, kaldet TOP1-spaltningskompleks (TOP1cc). Behandlingen af camptothecin (CPT), en TOP1-hæmmer, bundet til og stabiliseret TOP1cc, hvilket fører til dannelsen af TOP1-DPC'er med lang levetid. TOP1-DPC'er blev observeret at være induceret og toppe 20 minutter efter eksponering for CPT. Samtidig blev TOP1-DPC'er modificeret af SUMO-2/3, som også toppede 20 minutter efter CPT-behandling. Da SUMO-2 og SUMO-3 deler 95% sekvensidentitet, skelner antistoffet ikke fra hinanden. Efter 60 minutter faldt TOP1-DPC'er og deres SUMO-2/3-modifikation, ledsaget af kulminationen på deres SUMO-1-modifikation og ubiquitylering. Efter 60 minutters lægemiddelbehandling begyndte niveauerne af TOP1-DPC SUMO-1-modifikation og ubiquitylering at falde. Hos pattedyr α og β TOP2-isozymer virke ved at indføre et DNA-dobbeltstrengsbrud såvel som via dannelsen af et forbigående og reversibelt enzym-DNA-kovalent kompleks (TOP2cc). TOP2-hæmmere, såsom etoposid (ETOP), konverterer TOP2cc til TOP2-DPC'er og inducerer deres SUMOylering og ubiquitylering. I lighed med kinetikken af TOP1-DPC'er og deres PTM'er nåede TOP2a- og β-DPC'er og deres SUMO-2/3-modifikation et højdepunkt på 20 minutter og begyndte derefter at falde; i mellemtiden toppede deres SUMO-1- og ubiquitin-modifikationer efter 60 minutter (figur 2). Clearance af TOP-DPC'er har vist sig at skyldes proteasomal nedbrydning, og clearance af TOP-DPC SUMOylering og ubiquitylering skyldes sandsynligvis genanvendelse ved henholdsvis deSUMOylering og deubiquitylering af deres reverserende enzymer. Eksperimenterne i figur 3 undersøgte FA-inducerede ikke-enzymatiske DPC'er og deres PTM'er. Det blev observeret, at DPC'erne og deres SUMO-2/3, SUMO-1 og ubiquitylering dannede og akkumulerede på en FA-dosisafhængig måde. Endelig blev PARyleringen af TOP1-DPC'er kvantitativt påvist med et anti-PAR-antistof ved hjælp af samme metode (figur 4). TOP1-DPC PARylering kunne ikke påvises, medmindre en PARG-hæmmer blev tilsat cellen, hvilket tyder på, at PARylering viser sig hurtigt og er meget dynamisk. I overensstemmelse med det tidligere fund syntes PARGi's hæmning af dePARylering at akkumulere TOP1-DPC'er, sandsynligvis ved at blokere proteolytisk nedbrydning.

Figure 1
Figur 1: Kvantitative analyser af dannelse og kinetik af TOP1-DPC'er og deres SUMOylering og ubiquitylering ved CPT-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler blev behandlet med 20 μM CPT i indikerede perioder. Cellelysater blev høstet og underkastet det modificerede RADAR-assay og western blotting med indikerede antistoffer. Ufordøjede DNA-prøver blev udsat for slot-blotting ved hjælp af anti-dsDNA-antistof som belastningskontrol. (B) Båndintensiteter blev kvantificeret med ImageJ-software og plottet med Prism-software. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kvantitative analyser af dannelse og kinetik af TOP2-DPC'er og deres SUMOylering og ubiquitylering ved ETOP-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler blev behandlet med 200 μM ETOP i indikerede perioder. Cellelysater blev høstet og underkastet det modificerede RADAR-assay og western blotting med indikerede antistoffer. Ufordøjede DNA-prøver blev udsat for slot-blotting ved hjælp af anti-dsDNA-antistof som belastningskontrol. (B) Båndintensiteter blev kvantificeret med ImageJ-software og plottet med Prism-software. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kvantitative analyser af ikke-enzymatiske DPC'er og deres SUMOylering og ubiquitylering ved FA-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler blev behandlet med FA med angivne koncentrationer i 2 timer. Cellelysater blev høstet og underkastet det modificerede RADAR-assay og western blotting med indikerede antistoffer. Ufordøjede DNA-prøver blev udsat for slot-blotting ved hjælp af anti-dsDNA-antistof som belastningskontrol. (B) Båndintensiteter blev kvantificeret med ImageJ-software og plottet med Prism-software. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Kvantitative analyser af TOP1-DPC'er og deres PARylering ved CPT-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler blev forbehandlet med 10 μM PARGi i 1 time og derefter co-behandlet med CPT i indikerede perioder. Cellelysater blev høstet og underkastet det modificerede RADAR-assay og western blotting med indikerede antistoffer. Ufordøjede DNA-prøver blev udsat for slot-blotting ved hjælp af anti-dsDNA-antistof som belastningskontrol. (B) Båndintensiteter blev kvantificeret med ImageJ-software og plottet med Prism-software. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Den beskrevne metode tillader måling af enzymatiske og ikke-enzymatiske DNA-protein-tværbindinger i pattedyrceller og er den eneste egnede tilgang til at studere deres ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering. Slot-blotting efter ICE- eller RADAR-analysen muliggør hurtig påvisning af specifikke enzymatiske DPC'er såsom TOP-DPC'er ved hjælp af deres antistoffer. En advarsel til denne metode er imidlertid dens manglende evne til at adskille proteiner med forskellige molekylvægte, hvilket gør det umuligt at bestemme størrelserne af PTM-konjugerede DPC'er. Den beskrevne metode løser problemet ved at frigive tværbundne proteiner med mikrokoknuklease, som nedbryder DNA til oligonukleotider med terminale 3'-fosfater, hvorved proteinerne (konjugeret med oligonukleotider) tillades ved SDS-PAGE. DPC'er modificeret med ubiquitin-, SUMO- eller ADP-ribosemonomerer og polymerer af forskellig størrelse kan derfor visualiseres og kvantificeres af antistoffer rettet mod disse PTM'er, hvilket muliggør detaljeret undersøgelse af deres dannelse og kinetik. For at sikre reproducerbarhed og beregne statistisk signifikans kræves biologiske replikater af eksperimenterne.

Et af de mest almindelige problemer med dette assay er lavt DNA-udbytte efter ethanoludfældning. På den ene side kan DNA-udbyttet øges med mere udgangsmateriale (celler). På den anden side kan inkubation af cellelysater med ethanol i en flad plade snarere end et Eppendorf-rør markant forbedre aggregeringen af DNA-molekyler og dermed lette deres udfældning. Ikke-specifikke signaler observeret i prøver uden lægemiddelbehandling kan indikere ikke-kovalent proteinkontaminering. Hvis dette er tilfældet, kan man overveje at vaske DNA-pellets med høj saltbuffer for at fjerne forurenende stoffer inden sonikering. Det anbefales også at spinde ned DNA-prøver efter sonikering og mikrokoknuklease fordøjelse og kassere enhver uopløselig. I tilfælde af dårligt eller intet signal kan flere potentielle løsninger forsøges. For det første kan man øge belastningsmængden af DNA til SDS-PAGE og immunoblotting. For at gøre SUMOylerede og ubiquitylerede DPC-arter detekterbare, anbefales det at indlæse mindst 4 μg DNA på gelen. For det andet kan man øge lægemiddelkoncentrationerne for at inducere højere niveauer af DPC'er og deres tilknyttede PTM'er. For det tredje foreslås det at inkubere blots med primære antistoffer i en anden dag, hvis bånd / udstrygninger synes at være svage. En 2-dages inkubation kan forstærke signalet betydeligt og dermed reducere biologisk variabilitet fra uafhængige forsøg23. Membranstripning til genfarvning resulterer uundgåeligt i tab af en vis mængde PTM-konjugerede DPC-arter, der allerede er i lav overflod. Derfor anbefales det stærkt at køre separate geler til ubiquitin og SUMO detektion i stedet for at undersøge en blot. Derudover skal DNA-pellets vaskes med 75% ethanol for at fjerne det resterende DNAzol indeholdende guanidinsalt før opløsning i H2O eller andre opløsningsmidler, som ellers forårsager krystallisering af prøven efter tilsætning af Laemmli påfyldningsbuffer.

Arbejdsgangen for den beskrevne metode er meget mere tidseffektiv sammenlignet med det besværlige ICE-assay, da det er afhængigt af hurtig ethanoludfældning i stedet for den tidskrævende cæsiumchloridultracentrifugering for at isolere genomisk DNA. Til en pris medfører ethanolbaseret rensning en lav mængde proteinkontaminanter, der normalt er ubetydelige til immundetektion. Men når det kommer til analytiske undersøgelser, såsom massespektrometribaseret proteomisk analyse eller næste generations sekventering, der kræver nøjagtighed og præcision, er cæsium-chloriddensitet-gradientcentrifugering stadig en mere pålidelig tilgang til isolering af rent DNA med høj forekomst. Denne metode kan også potentielt anvendes til profilering af modifikationssteder på tværbundne proteiner og bestemmelse af bindingstyper af poly-ubiquitylering og poly-SUMOylering ved hjælp af korrekte massespektrometribaserede metoder.

Bemærk, at dette assay tillader identifikation og karakterisering af faktorer, der regulerer PTM'er til DPC'er reparation. For eksempel er upartiske screeningsmetoder med høj kapacitet (RNA-interferens og CRISPR) kraftfulde værktøjer til at opdage ubiquitin E3-ligaser, SUMO E3-ligaser og deres tilknyttede cofaktorer, der mindsker cytotoksicitet af DPC-induktorer. Den beskrevne metode muliggør molekylær validering af disse proteiner ved at bestemme, om de hjælper celler med at overleve DPC-induktorer ved at reparere DPC'erne. Nye småmolekylehæmmere rettet mod disse proteiner, der er identificeret for eksempel ved virtuel screening, kan også valideres ved hjælp af denne protokol. I betragtning af at topoisomerasehæmmere er blandt de mest ordinerede kemoterapeutika, kan dette robuste assay udvikles som et værktøj til udvikling af lægemidler, der synergiserer med kliniske topoisomerasehæmmere.

Disclosures

Forfatteren erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af National Cancer Institute Center for Cancer ResearchExcellence in Postdoctoral Research Transition Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher 70011069
4–20% precast polyacrylamide gel Bio-Rad 4561096
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
AcquaStain (coomassie blue) Bulldog Bio AS001000
anti-dsDNA (mouse monoclonal) Abcam 27156 1: 5,000 dilution is recommended
anti-PAR (mouse monoclonal) R&D systems 4335-MC-100 1: 500 dilution is recommended
anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) Cell Signaling Technology 4940 1: 250 dilution is recommended
anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) Cell Signaling Technology 4971 1: 250 dilution is recommended
anti-TOP1 (mouse monoclonal) BD Biosciences 556597 1: 500 dilution is recommended
anti-TOP2α (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-365799 1: 250 dilution is recommended
anti-TOP2β (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-25330 1: 250 dilution is recommended
anti-ubiquitin (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-8017 1: 100 dilution is recommended
Calcium chloride Sigma-Aldrich 499609 Used for micrococcal nuclease digestion
Camptothecin Sigma-Aldrich PHL89593
ChemiDo MP imaging system Bio-Rad 12003154
Disodium phosphate Sigma-Aldrich 5438380100 Used to make sodium phosphate buffer
DNAzol Thermo Fisher 10503027
DTT (dithiothreitol) Thermo Fisher R0861
Dulbecco's modified eagle's medium Sigma-Aldrich 11965084
Ethyl alcohol, 200 proof Sigma-Aldrich E7023
Etoposide Sigma-Aldrich 1268808
Formaldehyde Sigma-Aldrich 47608
Graphpad Prism Software GraphStats Prism 9.0.0
HRP-linked Mouse IgG Cytiva NA931 1: 5,000 dilution is recommended
HRP-linked Rabbit IgG Cytiva NA934 1: 5,000 dilution is recommended
ImageJ Software NIH, USA ImageJ 1.53e
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
Maximum sensitivity ECL substrate Thermo Fisher 34095
Micrococcal nuclease New England BioLabs M0247S
Monosodium phosphate Sigma-Aldrich S3139 Used to make sodium phosphate buffer
NanoDrop 2000 spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000
N-ethylmaleimide Thermo Fisher 23030 DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor
Nitrocellulose membrane, 0.45 µm Bio-Rad 1620115
Non-fat dry milk Bio-Rad 1706404XTU
PDD00017273 Selleckchem S8862 Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
Protease inhibitor cocktail Thermo Fisher 78430
Q700 sonicator Qsonica Q700-110
Ready-to-assemble PVDF transfer kit Bio-Rad 1704274
Slot-blot apparatus Bio-Rad 1706542
Slot-blot filter paper Bio-Rad 1620161
Trans-Blot turbo transfer system Bio-Rad 1704150
Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer Bio-Rad 1610732
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179
Vertical electrophoresis cell Bio-Rad 1658004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Klages-Mundt, N. L., Li, L. Formation and repair of DNA-protein crosslink damage. Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).
  3. Weickert, P., Stingele, J. DNA-protein crosslinks and their resolution. Annual Review of Biochemistry. 91, 157-181 (2022).
  4. Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes. Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
  5. Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).
  6. Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).
  7. Ruggiano, A., Ramadan, K. DNA-protein crosslink proteases in genome stability. Communications Biology. 4 (1), 11 (2021).
  8. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  9. Moretton, A., Loizou, J. I. Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer. Cancers. 12 (8), 2051 (2020).
  10. Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
  11. Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).
  12. Stingele, J., et al. Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
  13. Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair. Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).
  14. Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
  15. Kojima, Y., et al. FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain. Nature Communications. 11 (1), 1318 (2020).
  16. Dokshin, G. A., et al. GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability. Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).
  17. Borgermann, N., et al. SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks. The EMBO Journal. 38 (8), e101496 (2019).
  18. Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II. Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).
  19. Sun, Y., et al. Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064 (2022).
  20. Sun, Y., et al. PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation. Nature Communications. 12 (1), 5010 (2021).
  21. Sun, Y., et al. Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC). DNA Repair. 89, 102837 (2020).
  22. Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways. DNA Repair. 94, 102926 (2020).
  23. Sun, Y., et al. A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation. Science Advances. 6 (46), (2020).
  24. Saha, S., et al. DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks. Cell Reports. 33 (13), 108569 (2020).
  25. Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).
  26. Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).
  27. Sciascia, N., et al. Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity. eLife. 9, e53447 (2020).
  28. Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).
  29. Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA. Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).
  30. Nitiss, J. L., Kiianitsa, K., Sun, Y., Nitiss, K. C., Maizels, N. Topoisomerase assays. Current Protocols. 1 (10), e250 (2021).
  31. Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
  32. Cowell, I. G., Tilby, M. J., Austin, C. A. An overview of the visualisation and quantitation of low and high MW DNA adducts using the trapped in agarose DNA immunostaining (TARDIS) assay. Mutagenesis. 26 (2), 253-260 (2011).
  33. Leng, X., Duxin, J. P. Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775 (2022).
  34. Kuhbacher, U., Duxin, J. P. How to fix DNA-protein crosslinks. DNA Repair. 94, 102924 (2020).
  35. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 563-573 (2017).
  36. Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161 (2022).
  37. Krastev, D. B., et al. The ubiquitin-dependent ATPase p97 removes cytotoxic trapped PARP1 from chromatin. Nature Cell Biology. 24 (1), 62-73 (2022).
  38. Liu, J. C. Y., et al. Mechanism and function of DNA replication-independent DNA-protein crosslink repair via the SUMO-RNF4 pathway. The EMBO Journal. 40 (18), e107413 (2021).
  39. Larsen, N. B., et al. Replication-coupled DNA-protein crosslink repair by SPRTN and the proteasome in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 73 (3), 574-588 (2019).
  40. Zhao, S., et al. A ubiquitin switch controls autocatalytic inactivation of the DNA-protein crosslink repair protease SPRTN. Nucleic Acids Research. 49 (2), 902-915 (2021).
  41. Ruggiano, A., et al. The protease SPRTN and SUMOylation coordinate DNA-protein crosslink repair to prevent genome instability. Cell Reports. 37 (10), 110080 (2021).
  42. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).

Tags

Biokemi nr. 194
Kvantitativ påvisning af DNA-protein-tværbindinger og deres posttranslationelle modifikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, Y. Quantitative Detection of… More

Sun, Y. Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications. J. Vis. Exp. (194), e65315, doi:10.3791/65315 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter