Summary
Detta protokoll belyser en modifierad metod för att detektera och kvantifiera DNA-proteintvärbindningar (DPC) och deras posttranslationella modifieringar (PTM), inklusive ubiquitylering, SUMOylering och ADP-ribosylering inducerad av topoisomerashämmare och av formaldehyd, vilket möjliggör studier av bildning och reparation av DPC och deras PTM.
Abstract
DNA-proteintvärbindningar (DPC) är frekventa, allestädes närvarande och skadliga DNA-lesioner, som uppstår på grund av endogena DNA-skador, enzym (topoisomeraser, metyltransferaser, etc.) som inte fungerar som de ska, eller exogena medel som kemoterapeutiska medel och tvärbindningsmedel. När DPC:er väl har inducerats konjugeras flera typer av posttranslationella modifieringar (PTM) omedelbart till dem som mekanismer för tidig respons. Det har visats att DPC:er kan modifieras av ubiquitin, liten ubiquitin-liknande modifierare (SUMO) och poly-ADP-ribos, som förbereder substraten för att signalera sina respektive utsedda reparationsenzymer och, i vissa fall, koordinerar reparationen på sekventiella sätt. Eftersom PTM transpirerar snabbt och är mycket reversibla har det varit utmanande att isolera och detektera PTM-konjugerade DPC:er som vanligtvis ligger kvar på låga nivåer. Här presenteras en immunanalys för att rena och kvantitativt detektera ubiquitylerade, SUMOylerade och ADP-ribosylerade DPC:er (läkemedelsinducerade topoisomeras DPC:er och aldehydinducerade icke-specifika DPC:er) in vivo. Denna analys härrör från RADAR-analysen (rapid approach to DNA adduct recovery) som används för isolering av genomiskt DNA som innehåller DPC genom etanolutfällning. Efter normalisering och nukleasnedbrytning detekteras PTM av DPC, inklusive ubiquitylering, SUMOylering och ADP-ribosylering, genom immunoblot med hjälp av motsvarande antikroppar. Denna robusta analys kan användas för att identifiera och karakterisera nya molekylära mekanismer som reparerar enzymatiska och icke-enzymatiska DPC:er och har potential att upptäcka småmolekylära hämmare som riktar sig mot specifika faktorer som reglerar PTM för att reparera DPC.
Introduction
Genomisk DNA-skada uppstår på grund av spontant förfall, inre skador och miljöfaktorer1. De resulterande DNA-skadorna består av skadade baser, missmatchningar, enkel- och dubbelsträngsbrott, tvärbindningar mellan och inom strängar och DNA-proteintvärbindningar (DPC). En DPC bildas när ett kromatinbundet protein fångas på DNA genom kovalent bindning. DPC induceras av endogena DNA-lesioner och reaktiva metaboliter, såväl som exogena medel såsom kemoterapeutiska och bifunktionella tvärbindningsmedel. Under vissa omständigheter kan enzymdysfunktion också leda till bildandet av DPC2. Den stora skillnaden i DPC-inducerare resulterar i en skillnad i identiteten hos det kovalent bundna proteinet, kromosomregionen där DPC bildas, strukturtypen för DNA som tvärbinds till proteinet och den kemiska egenskapen hos den kovalenta bindningen mellan proteinet och DNA 2,3,4.
Baserat på deras kemiska natur kategoriseras DPC:er i allmänhet i två grupper: enzymatiska DPC:er och icke-enzymatiska DPC:er. Vissa enzymer såsom topoisomeraser, glykosylaser, och metyl/acyltransferaser verkar genom att bilda reversibla enzym-DNA-kovalenta intermediärer under deras normala katalytiska reaktioner. Dessa är kortlivade enzym-DNA-intermediärer och kan omvandlas till långlivade enzymatiska DPC när de fångas av endogena eller exogena agens, särskilt genom kemoterapeutiska3. Topoisomeras DPC är bland de vanligaste enzymatiska DPC:erna i eukaryota celler, vilka kan genereras av kliniskt användbara topoisomerashämmare (topotekan och irinotekan för topoisomeras I [TOP1] och etoposid och doxorubicin för topoisomeras II [TOP2]) och är de primära terapeutiska mekanismerna för dessa hämmare 5,6. DNA-metyltransferaser (DNMT) 1, 3A och 3B är målet för 5-aza-2'-deoxicytidin (även känd som decitabin) och bildar DPC vid exponering för läkemedlet7. Reaktiva ämnen, såväl som ultraviolett ljus och joniserande strålning, inducerar icke-enzymatiska DPC:er genom att icke-specifikt tvärbinda proteiner till DNA. Reaktiva aldehyder som acetaldehyd och formaldehyd (FA) genereras ofta som biprodukter av cellulära metabolismer, bland vilka FA produceras vid mikromolära koncentrationer under metanolmetabolism, lipidperoxidation och histondemetylering. Dessutom är FA en högvolymproduktionskemikalie som tillverkas över hela världen, som många människor exponeras för både miljömässigt och yrkesmässigt 8,9.
Både enzymatiska och icke-enzymatiska DPC:er är mycket giftiga för celler eftersom deras skrymmande proteinkomponenter effektivt hindrar nästan alla kromatinbaserade processer, inklusive replikation och transkription, vilket leder till cellcykelstopp och apoptos om de lämnas oreparerade. Under de senaste två decennierna har reparationen av DPC:er studerats kraftigt, och flera proteiner/signalvägar har identifierats som nyckelfaktorer som antingen direkt reparerar DPC:er eller modulerar deras reparationsprocesser. Till exempel har det varit väl etablerat att proteolys av proteinmassan i en DPC är ett avgörande steg för DPC-reparation, och att proteolys kan katalyseras av proteaserna SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A15, GCNA 16,17 eller 26S-proteasomkomplexet 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 på ett celltyps- eller cellulärt kontextberoende sätt. Identifiering och karakterisering av dessa proteaser har till stor del förlitat sig på in vivo-komplexet i enzymet (ICE) -analysen28,29 och den snabba metoden för DNA-adduktåterhämtning (RADAR) -analys30,31, som båda isolerar DNA-molekyler och deras kovalent bundna proteiner från fria cellulära proteiner för att möjliggöra detektion av DPC genom slot-blot med hjälp av antikroppar riktade mot de tvärbundna proteinerna. Dessutom användes TARDIS-analysen (Trapped-in agarose DNA immunostaining) som ett sätt att detektera och kvantifiera DPC på encellsnivå32. För närvarande väljer forskare RADAR-analysen framför ICE-analysen för att mäta DPC, eftersom ICE-analysen bygger på rening av nukleinsyror med hjälp av cesiumkloridgradientultracentrifugering, vilket är extremt tidskrävande, medan RADAR-analysen fäller ut nukleinsyror med etanol inom en mycket kortare period.
Under de senaste åren har det framkommit allt fler bevis för att flera posttranslationella modifieringar (PTM) är involverade i signalering och rekrytering av DPC-riktade proteaser 3,33,34,35. Till exempel visade sig både TOP1- och TOP2-DPCs vara konjugerade av liten ubiquitin-liknande modifierare (SUMO)-2/3 och sedan SUMO-1 av SUMO E3-ligaset PIAS4, oberoende av DNA-replikation och transkription. De sekventiella SUMO-modifieringarna verkar vara ett mål för ubiquitin, som deponeras till SUMOylated TOP-DPCs och bildar polymera kedjor genom dess lysin 48-rest av ett SUMO-riktat ubiquitinligas som kallas RNF4. Därefter framkallar ubiquitinpolymeren en signal till och rekryterar 26S-proteasomen till TOP-DPCs23,36. Samma SUMO-ubiquitin-väg visade sig nyligen verka på DNMT1-DPC såväl som PARP-DNA-komplex för deras reparation37,38. Dessutom har SUMO-oberoende ubiquitylering av ubiquitin E3-ligaset TRAIP rapporterats prima DPC för proteasomal nedbrytning på ett replikationskopplat sätt39. I likhet med den proteasomala nedbrytningen av TOP-DPC, kräver proteolys av enzymatiska och icke-enzymatiska DPC:er med det replikationskopplade metalloproteas-SPRTN också ubiquitylering av DPC-substraten som en mekanism för att engagera SPRTN40,41. Avgränsning av SUMOyleringens och ubiquityleringens roll kräver detektering av DPC:er som är märkta med dessa PTM:er. Eftersom den ursprungliga ICE-analysen och RADAR-analysen förlitar sig på slot-blot/dot-blot-apparat för att mäta osmälta DNA-prover, kan ingen av dessa två analyser upplösa och visualisera PTM-konjugerade DPC-arter med olika molekylvikter. För att övervinna detta problem smälte vi DNA-proverna efter deras rening genom etanolutfällning och provnormalisering med mikrokocknukleas, ett DNA- och RNA-endo-exonukleas för att frigöra de tvärbundna proteinerna, vilket gjorde det möjligt för oss att lösa upp proteinerna såväl som deras kovalenta PTM med natriumdodecyl-sulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE). Elektroforesen gjorde det möjligt för oss att detektera och kvantifiera PTM-konjugerade DPC:er med hjälp av specifika antikroppar riktade mot PTM:erna. Vi döpte ursprungligen denna förbättrade metod till DUST-analysen, för att betona dess robusthet vid detektion av ubiquitylerade och SUMOylerade TOP-DPCs23. Senare utökade vi användningen av analysen för att kvantitativt bedöma ADP-ribosylering av TOP1-DPCs in vivo, med hjälp av antikroppar mot poly-ADP-ribospolymerer20.
Här presenteras ett detaljerat protokoll för analysen som detekterar och mäter ubiquitylerade, SUMOylerade och ADP-ribosylerade DPC:er, som optimerades för de modifierade TOP-DPC:erna som induceras av deras hämmare och icke-specifika/icke-enzymatiska DPC:er som induceras av FA. Denna analys isolerar PTM-konjugerade DPC:er genom att lysera celler med ett kaotropiskt medel, fälla ut DNA med etanol och frigöra de annars tvärbundna proteinerna och deras modifierare med mikrokocknukleas. De annars DNA-bundna proteinerna och deras PTM kvantifieras genom immunoblot med hjälp av specifika antikroppar. Denna analys banar en ny väg för att belysa de molekylära mekanismerna genom vilka cellen reparerar både enzymatiska och icke-enzymatiska DPC. Specifikt möjliggör den detaljerade studier av induktion och kinetik hos PTM:er som är viktiga för regleringen av TOP-DPC-nedbrytning och reparation, och möjliggör därmed upptäckten av nya faktorer såsom E3-ligaser som dikterar PTM:erna, samt inhibitorer som riktar sig mot dessa faktorer. Eftersom några av de PTM:er som ansvarar för TOP-DPC-reparation sannolikt är involverade i reparation av DPC inducerade av andra kemoterapeutiska läkemedel, såsom platinabaserade läkemedel22, har denna analys också potential för tillämpning på upptäckten av nya läkemedel och rationell optimering av kombinatoriska terapier med topoisomerashämmare eller platinabaserade antineoplaster i patientceller för att vägleda behandlingsregimer.
Protocol
1. Cellodling och läkemedelsbehandling i den humana embryonala njure 293 (HEK293) cellinjen
- Förbered odlingsmedium, Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM), kompletterat med 10 % fetalt bovint serum, 1 % 2 mM L-glutamin och 100 enheter/ml penicillin-streptomycin.
- Frö 1 x 106 celler i en 60 mm platta eller en 6-hålsplatta per behandlingstillstånd plus kontroll.
- Nästa dag, behandla cellerna med DPC-inducerare efter eget val.
- För att inducera TOP1-DPC och deras ubiquitylering och SUMOylering, tillsätt TOP1-hämmaren camptothecin vid 20 μM till cellerna och samla upp cellerna efter 20, 60 och 180 minuter.
- För att inducera TOP2α och β-DPC och deras ubiquitylering och SUMOylering, exponera cellerna för att tillsätta TOP2-hämmaren etoposid vid 200 μM till cellerna och samla in cellerna vid 20, 60 och 180 minuter.
- För att inducera icke-enzymatiska DPC och deras ubiquitylering och SUMOylering, tillsätt FA vid 1 mM och samla upp cellerna 2 timmar efter exponeringen.
- För att inducera PARylering av TOP1-DPC, förbehandla cellerna i 1 timme för att blockera dePARylering med poly(ADP-ribos) glykohydrolas (PARG) hämmare PDD00017273 vid 10 μM, följt av samtidig behandling med 20 μM camptothecin i 20, 60 och 180 minuter.
2. Isolering och normalisering av DNA innehållande tvärbundna proteiner
- Aspirera snabbt mediet med en sugpipett efter behandlingen och skölj cellerna med iskall 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Lyse omedelbart cellerna i 600 μL DNAzol-reagens innehållande 1x proteascocktailhämmare, 1 mM ditiotreitol (DTT) och 20 mM N-etylmaleimid (hämmare av deSUMOylerande och deubiquitylerande enzymer).
- Skaka långsamt plattan på en vibrerande plattform i 10 minuter vid 4 °C.
- Tillsätt 1/2 volym 100 % kall etanol (0,3 ml) direkt till plattan och upprepa steg 2.2 tills ogenomskinligt nukleinsyraaggregat blir synligt. Överför celllysatet till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och utsätt röret för maximal centrifugering (20 000 x g) i 15 minuter vid 4 °C för att fälla ut nukleinsyran och dess tvärbundna proteiner.
- Aspirera supernatanten med en sugpipett och tvätta nukleinsyrapelleten i 1 ml 75 % etanol följt av 2 minuters centrifugering på 20 000 x g vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten, snurra ner med samma hastighet och ta bort den återstående vätskan med en P20-pipett. Lufttorka pelleten i 5 min.
- Lös snabbt upp nukleinsyrapelleten i 0,1 ml ddH2O. Återsuspendera pelleten genom upprepad pipettering och inkubera sedan i ett 37 °C vattenbad tills pelleten sväller till minst tre gånger större (cirka 30 min).
- Ultraljudsbehandla proverna med en ultraljudsprocessorsond vid 30% amplitud i 10 s för att helt lösa upp pelleten.
- Valfritt steg: Behandla proverna med RNas A/T1-blandning (10 μg RNas A och 25 U RNas T1) och inkubera vid 37 °C i 15 minuter. Tillsätt 1/10 volym 3 M natriumacetat och två volymer iskall 100 % etanol i röret, följt av centrifugering vid 20 000 x g i 10 minuter för att hämta DNA. Ta bort supernatanten och lös upp det utfällda DNA:t i 0,1 ml ddH2O.
- Valfritt steg: Centrifugera provet i 5 minuter vid 20 000 x g och överför supernatanten till ett nytt rör.
- Kvantifiera DNA-koncentrationen med hjälp av en ultraviolett synlig (UV-Vis) spektrometer. Det typiska DNA-utbytet är cirka 600-800 ng/μL. A260/A280-förhållandet bör minskas från 2,0-2,1 till 1,8-1,9 efter RNA-borttagning.
- Justera koncentrationen av DNA till 400-500 ng/μL i 0.12 ml ddH 2 O. Överför 20 μL av sample till ett nytt mikrocentrifugrör som osmält DNA-belastningskontroll (se steg2.4).
- För att smälta DNA upplöst i de återstående 100 μL ddH 2 O, tillsätt2000 gelenheter mikrokocknukleas tillsammans med 1/10 volym (~11 μL) 10x kalciummikrokocknukleasreaktionsbuffert till provet. Inkubera vid 37 °C i 30 min.
3. Western blotting av smälta DNA-prover
- Tillsätt 4x Laemmli provbuffert och koka sedan provet i 5 minuter.
- Ladda 5-6 μg smält sample (~15 μL) på 4%-20% polyakrylamidgel, följt av SDS-PAGE42 för att lösa upp omodifierade och PTM-konjugerade DPC:er.
- För att upptäcka FA-inducerade icke-enzymatiska DPC-arter, inkubera gelen med Coomassie blå fläck över natten i rumstemperatur. Tvätta gelen med ddH 2 O i2timmar och ta en bild med hjälp av ett bildsystem.
- Överför gelen och inkubera membranen över natten vid 4 °C med lämpliga spädningar av primär antikropp i blockerande buffert.
- För att detektera ubiquitylering, gör en 1:100 utspädning av anti-ubiquitinantikropp.
- För att detektera SUMO-1- eller SUMO-2/3-modifiering, gör en 1:250-utspädning av anti-SUMO-1- eller anti-SUMO-2/3-antikroppar.
- För att detektera ADP-ribosylering, späd anti-PAR-antikroppar med 1:500.
- För att detektera totala TOP1-, TOP2α- eller TOP2β-DPC:er, gör en 1:500-utspädning av anti-TOP1-, anti-TOP2α- eller anti-TOP2β-antikroppar.
OBS: Se materialtabellen för detaljer om antikroppsutspädning.
- Inkubera ett 1x PBS-T (0,1 % tween 20) tvättat membran med en sekundär antikropp utspädd 5 000 gånger i blockerande buffert i 60 minuter vid rumstemperatur.
- Utveckla membranet med ECL-reagens (enhanced chemiluminescence) och ta en bild med hjälp av bildsystemet.
4. Slot-blotting av osmälta DNA-prover
- Späd det osmälta DNA-provet på 20 μl i 180 μl natriumfosfatbuffert (25 mM, pH 6,6).
- Klipp nitrocellulosamembranet (0,45 μm) och jämvikt i 5 minuter i natriumfosfatbufferten.
- Montera slot-blot-apparaten enligt tillverkarens instruktioner och anslut den till ett vakuumsystem.
- Tvätta brunnarna med natriumfosfatbuffert genom att applicera vakuumet. Se till att det inte läcker ut brunnarna.
- Stoppa vakuumet och fyll på 200 μL DNA per sample (1 μg). Fyll de tomma brunnarna med 200 μL natriumfosfatbuffert.
- Applicera vakuumet.
- När alla brunnar är helt tomma, stoppa vakuumet, fyll på 200 μL natriumfosfatbuffert i varje brunn och upprepa steg 4.6.
- Ta upp membranet och blockera med 5 % blockerande buffert i 0,5 timmar vid rumstemperatur.
- Sond med anti-dubbelsträngad DNA (dsDNA)-antikropp vid en spädning på 1:5 000 över natten vid 4 °C.
- Tvätta 3 gånger med 1x PBS-T och inkubera med 1:5 000 utspädd pepparrotsperoxidas (HRP)-kopplad sekundär anti-musantikropp.
- Utveckla membranet med ECL-reagens (enhanced chemiluminescence) och ta en bild med hjälp av bildsystemet.
5. Densitometrisk analys
- Med hjälp av ImageJ kan du beräkna förhållandet mellan intensiteten hos varje band/utstryk i förhållande till intensiteten hos slitsen för osmält DNA och normalisera förhållandet till det för celler utan/före läkemedelsbehandling.
Representative Results
De representativa resultaten som presenteras i figur 1 visar bildandet och kinetiken för läkemedelsinducerade TOP1-DPCs och deras SUMOylering och ubiquitylering. TOP1 klyvde en sträng av DNA-duplexen och bildade ett enzym-DNA kovalent intermediär, kallat TOP1-klyvningskomplex (TOP1cc). Behandling av camptothecin (CPT), en TOP1-hämmare, bunden till och stabiliserad TOP1cc, vilket leder till bildandet av långlivade TOP1-DPC. TOP1-DPC observerades vara inducerad och topp 20 minuter efter exponering för CPT. Samtidigt modifierades TOP1-DPCs av SUMO-2/3, som också nådde sin topp 20 minuter efter CPT-behandling. Eftersom SUMO-2 och SUMO-3 delar 95 % sekvensidentitet skiljer antikroppen inte den ena från den andra. Efter 60 minuter minskade TOP1-DPCs och deras SUMO-2/3-modifiering, åtföljd av kulminationen av deras SUMO-1-modifiering och ubiquitylering. Efter den 60 minuter långa läkemedelsbehandlingen började nivåerna av TOP1-DPC SUMO-1-modifiering och ubiquitylering att sjunka. Hos däggdjur verkar TOP2-isoenzymer α och β genom att introducera ett DNA-dubbelsträngsbrott, samt genom bildandet av ett övergående och reversibelt enzym-DNA-kovalent komplex (TOP2cc). TOP2-hämmare, såsom etoposid (ETOP), omvandlar TOP2cc till TOP2-DPC och inducerar deras SUMOylering och ubiquitylering. I likhet med kinetiken hos TOP1-DPC:er och deras PTM:er nådde TOP2α- och β-DPC:er och deras SUMO-2/3-modifiering en topp vid 20 minuter och började sedan minska; Under tiden nådde deras SUMO-1- och ubiquitin-modifieringar en topp på 60 minuter (figur 2). Clearance av TOP-DPCs har visat sig vara ett resultat av proteasomal nedbrytning, och clearance av TOP-DPC SUMOylering och ubiquitylering beror sannolikt på återvinning genom deSUMOylering respektive deubiquitylering av deras reverserande enzymer. Experimenten i figur 3 undersökte FA-inducerade icke-enzymatiska DPC:er och deras PTM. Det observerades att DPC och deras SUMO-2/3, SUMO-1 och ubiquitylering bildades och ackumulerades på ett FA-dosberoende sätt. Slutligen detekterades PARylering av TOP1-DPCs kvantitativt med en anti-PAR-antikropp med samma metod (Figur 4). TOP1-DPC PARylering kunde inte detekteras om inte en PARG-hämmare tillsattes till cellen, vilket tyder på att PARylering sker snabbt och är mycket dynamisk. I överensstämmelse med det tidigare fyndet verkade hämningen av dePARylering av PARGi ackumulera TOP1-DPCs, sannolikt genom att blockera proteolytisk nedbrytning.
Figur 1: Kvantitativa analyser av bildning och kinetik av TOP1-DPCs och deras SUMOylering och ubiquitylering vid CPT-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler behandlades med 20 μM CPT under indikerade tidsperioder. Celllysat skördades och utsattes för den modifierade RADAR-analysen och western blotting med indikerade antikroppar. Osmälta DNA-prover utsattes för slot-blotting med anti-dsDNA-antikroppar som belastningskontroll. (B) Bandintensiteter kvantifierades med ImageJ-programvara och plottades med Prism-programvara. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kvantitativa analyser av bildning och kinetik av TOP2-DPCs och deras SUMOylering och ubiquitylering vid ETOP-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler behandlades med 200 μM ETOP under indikerade tidsperioder. Celllysat skördades och utsattes för den modifierade RADAR-analysen och western blotting med indikerade antikroppar. Osmälta DNA-prover utsattes för slot-blotting med anti-dsDNA-antikroppar som belastningskontroll. (B) Bandintensiteter kvantifierades med ImageJ-programvara och plottades med Prism-programvara. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kvantitativa analyser av icke-enzymatiska DPC:er och deras SUMOylering och ubiquitylering vid FA-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler behandlades med FA med indikerade koncentrationer i 2 timmar. Celllysat skördades och utsattes för den modifierade RADAR-analysen och western blotting med indikerade antikroppar. Osmälta DNA-prover utsattes för slot-blotting med anti-dsDNA-antikroppar som belastningskontroll. (B) Bandintensiteter kvantifierades med ImageJ-programvara och plottades med Prism-programvara. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kvantitativa analyser av TOP1-DPCs och deras PARylering vid CPT-behandling i HEK293-celler. (A) HEK293-celler förbehandlades med 10 μM PARGi i 1 timme och sambehandlades sedan med CPT under indikerade tidsperioder. Celllysat skördades och utsattes för den modifierade RADAR-analysen och western blotting med indikerade antikroppar. Osmälta DNA-prover utsattes för slot-blotting med anti-dsDNA-antikroppar som belastningskontroll. (B) Bandintensiteter kvantifierades med ImageJ-programvara och plottades med Prism-programvara. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Den beskrivna metoden möjliggör mätning av enzymatiska och icke-enzymatiska DNA-proteintvärbindningar i däggdjursceller och är den enda lämpliga metoden för att studera deras ubiquitylering, SUMOylering och ADP-ribosylering. Slot-blotting efter ICE- eller RADAR-analysen möjliggör snabb detektion av specifika enzymatiska DPC:er såsom TOP-DPCs med hjälp av deras antikroppar. En invändning mot denna metod är dock dess oförmåga att separera proteiner med olika molekylvikter, vilket gör det omöjligt att bestämma storleken på PTM-konjugerade DPC:er. Den beskrivna metoden löser problemet genom att frisätta tvärbundna proteiner med mikrokocknukleas, vilket bryter ned DNA till oligonukleotider med terminala 3'-fosfater, vilket möjliggör fullständig separation av proteinerna (konjugerade med oligonukleotider) med SDS-PAGE. DPC:er modifierade med ubiquitin-, SUMO- eller ADP-ribosmonomerer och polymerer av olika storlekar kan därför visualiseras och kvantifieras av antikroppar riktade mot dessa PTM, vilket möjliggör detaljerad undersökning av deras bildning och kinetik. För att säkerställa reproducerbarhet och beräkna statistisk signifikans krävs biologiska replikat av experimenten.
Ett av de vanligaste problemen med denna analys är lågt DNA-utbyte efter etanolutfällning. Å ena sidan kan DNA-utbytet ökas med mer utgångsmaterial (celler). Å andra sidan kan inkubering av celllysat med etanol i en platt platta i stället för ett Eppendorfrör markant förbättra aggregeringen av DNA-molekyler och därmed underlätta deras utfällning. Ospecifika signaler som observerats i prover utan läkemedelsbehandling kan tyda på icke-kovalent proteinkontaminering. Om så är fallet, man kan överväga att tvätta DNA-pellets med hög saltbuffert för att avlägsna föroreningarna före ultraljudsbehandling. Det rekommenderas också att spinna ner DNA-prover efter ultraljudsbehandling och mikrokocknukleas matsmältning och kassera alla olösliga. Vid dålig eller ingen signal kan flera potentiella lösningar prövas. För det första kan man öka mängden DNA för SDS-PAGE och immunoblot. För att göra SUMOylerade och ubiquitylerade DPC-arter detekterbara rekommenderas att minst 4 μg DNA laddas på gelen. För det andra kan man öka läkemedelskoncentrationerna för att inducera högre nivåer av DPC och deras associerade PTM. För det tredje föreslås det att man inkuberar fläckar med primära antikroppar i ytterligare en dag om band/utstryk verkar vara svaga. En 2-dagars inkubation kan avsevärt potentiera signalen och därmed minska den biologiska variabiliteten från oberoende experiment23. Membranstrippning för omfärgning resulterar oundvikligen i förlust av en viss mängd PTM-konjugerade DPC-arter som redan finns i låg förekomst. Därför rekommenderas det starkt att köra separata geler för ubiquitin- och SUMO-detektion snarare än att undersöka en blot på nytt. Dessutom måste DNA-pellets tvättas med 75 % etanol för att avlägsna det återstående DNAzol-innehållande guanidinsaltet före upplösning i H2O eller andra lösningsmedel, vilket annars orsakar kristallisation av provet efter tillsats av Laemmli laddningsbuffert.
Arbetsflödet för den beskrivna metoden är mycket mer tidseffektivt jämfört med den besvärliga ICE-analysen, eftersom den förlitar sig på snabb etanolutfällning istället för den tidskrävande cesiumkloridultracentrifugeringen för att isolera genomiskt DNA. Etanolbaserad rening ger ett pris på en låg mängd proteinföroreningar som normalt är försumbara för immundetektion. Men när det gäller analytiska studier, såsom masspektrometribaserad proteomikanalys eller nästa generations sekvensering som kräver noggrannhet och precision, är cesium-kloriddensitetsgradientcentrifugering fortfarande en mer tillförlitlig metod för att isolera rent DNA med hög förekomst. Denna metod kan också potentiellt tillämpas på profilering av modifieringsställen på tvärbundna proteiner och bestämning av kopplingstyper av poly-ubiquitylering och poly-SUMOylering med hjälp av lämpliga masspektrometribaserade metoder.
Observera att denna analys möjliggör identifiering och karakterisering av faktorer som reglerar PTM för reparation av DPC:er. Till exempel är opartiska screeningmetoder med hög genomströmning (RNA-interferens och CRISPR) kraftfulla verktyg för att upptäcka ubiquitin E3-ligaser, SUMO E3-ligaser och deras associerade kofaktorer som minskar cytotoxiciteten hos DPC-inducerare. Den beskrivna metoden möjliggör molekylär validering av dessa proteiner genom att avgöra om de hjälper celler att överleva DPC-inducerare genom att reparera DPC:erna. Nya småmolekylära hämmare riktade mot dessa proteiner som identifierats, till exempel genom virtuell screening, kan också valideras med hjälp av detta protokoll. Med tanke på att topoisomerashämmare är bland de mest förskrivna kemoterapierna kan denna robusta analys utvecklas som ett verktyg för utveckling av läkemedel som synergiserar med kliniska topoisomerashämmare.
Disclosures
Författaren redovisar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av National Cancer Institute Center for Cancer ResearchExcellence in Postdoctoral Research Transition Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 70011069 | |
| 4–20% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561096 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| AcquaStain (coomassie blue) | Bulldog Bio | AS001000 | |
| anti-dsDNA (mouse monoclonal) | Abcam | 27156 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| anti-PAR (mouse monoclonal) | R&D systems | 4335-MC-100 | 1: 500 dilution is recommended |
| anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4940 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4971 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-TOP1 (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 556597 | 1: 500 dilution is recommended |
| anti-TOP2α (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-365799 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-TOP2β (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-25330 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-ubiquitin (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8017 | 1: 100 dilution is recommended |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | Used for micrococcal nuclease digestion |
| Camptothecin | Sigma-Aldrich | PHL89593 | |
| ChemiDo MP imaging system | Bio-Rad | 12003154 | |
| Disodium phosphate | Sigma-Aldrich | 5438380100 | Used to make sodium phosphate buffer |
| DNAzol | Thermo Fisher | 10503027 | |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher | R0861 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium | Sigma-Aldrich | 11965084 | |
| Ethyl alcohol, 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Etoposide | Sigma-Aldrich | 1268808 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | |
| Graphpad Prism Software | GraphStats | Prism 9.0.0 | |
| HRP-linked Mouse IgG | Cytiva | NA931 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| HRP-linked Rabbit IgG | Cytiva | NA934 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| ImageJ Software | NIH, USA | ImageJ 1.53e | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
| Maximum sensitivity ECL substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| Micrococcal nuclease | New England BioLabs | M0247S | |
| Monosodium phosphate | Sigma-Aldrich | S3139 | Used to make sodium phosphate buffer |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher | 23030 | DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor |
| Nitrocellulose membrane, 0.45 µm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Non-fat dry milk | Bio-Rad | 1706404XTU | |
| PDD00017273 | Selleckchem | S8862 | Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher | 78430 | |
| Q700 sonicator | Qsonica | Q700-110 | |
| Ready-to-assemble PVDF transfer kit | Bio-Rad | 1704274 | |
| Slot-blot apparatus | Bio-Rad | 1706542 | |
| Slot-blot filter paper | Bio-Rad | 1620161 | |
| Trans-Blot turbo transfer system | Bio-Rad | 1704150 | |
| Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | |
| Vertical electrophoresis cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Klages-Mundt, N. L., Li, L. Formation and repair of DNA-protein crosslink damage. Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).
- Weickert, P., Stingele, J.
- Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes. Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
- Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).
- Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).
- Ruggiano, A., Ramadan, K.
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Moretton, A., Loizou, J. I. Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer. Cancers. 12 (8), 2051 (2020).
- Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
- Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).
- Stingele, J., et al. Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
- Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair. Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).
- Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
- Kojima, Y., et al. FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain. Nature Communications. 11 (1), 1318 (2020).
- Dokshin, G. A., et al. GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability. Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).
- Borgermann, N., et al. SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks. The EMBO Journal. 38 (8), e101496 (2019).
- Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II. Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).
- Sun, Y., et al. Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064 (2022).
- Sun, Y., et al. PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation. Nature Communications. 12 (1), 5010 (2021).
- Sun, Y., et al. Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC). DNA Repair. 89, 102837 (2020).
- Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways. DNA Repair. 94, 102926 (2020).
- Sun, Y., et al. A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation. Science Advances. 6 (46), (2020).
- Saha, S., et al. DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks. Cell Reports. 33 (13), 108569 (2020).
- Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).
- Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).
- Sciascia, N., et al. Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity. eLife. 9, e53447 (2020).
- Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).
- Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA. Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).
- Nitiss, J. L., Kiianitsa, K., Sun, Y., Nitiss, K. C., Maizels, N.
- Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
- Cowell, I. G., Tilby, M. J., Austin, C. A. An overview of the visualisation and quantitation of low and high MW DNA adducts using the trapped in agarose DNA immunostaining (TARDIS) assay. Mutagenesis. 26 (2), 253-260 (2011).
- Leng, X., Duxin, J. P. Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775 (2022).
- Kuhbacher, U., Duxin, J. P.
- Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J.
- Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161 (2022).
- Krastev, D. B., et al. The ubiquitin-dependent ATPase p97 removes cytotoxic trapped PARP1 from chromatin. Nature Cell Biology. 24 (1), 62-73 (2022).
- Liu, J. C. Y., et al. Mechanism and function of DNA replication-independent DNA-protein crosslink repair via the SUMO-RNF4 pathway. The EMBO Journal. 40 (18), e107413 (2021).
- Larsen, N. B., et al. Replication-coupled DNA-protein crosslink repair by SPRTN and the proteasome in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 73 (3), 574-588 (2019).
- Zhao, S., et al. A ubiquitin switch controls autocatalytic inactivation of the DNA-protein crosslink repair protease SPRTN. Nucleic Acids Research. 49 (2), 902-915 (2021).
- Ruggiano, A., et al. The protease SPRTN and SUMOylation coordinate DNA-protein crosslink repair to prevent genome instability. Cell Reports. 37 (10), 110080 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
