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Biochemistry

डीएनए-प्रोटीन क्रॉसलिंक ्स का मात्रात्मक पता लगाना और उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65315
Automatic Translation
1
1Developmental Therapeutics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल डीएनए-प्रोटीन क्रॉसलिंक (डीपीसी) और उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक संशोधित विधि पर प्रकाश डालता है, जिसमें सर्वव्यापकता, सूमोनाइलेशन और एडीपी-राइबोसिलेशन शामिल हैं, जो टोपोइसोमेरेस इनहिबिटर और फॉर्मलाडेहाइड द्वारा प्रेरित होते हैं, जिससे डीपीसी और उनके पीटीएम के गठन और मरम्मत के अध्ययन की अनुमति मिलती है।

Abstract

डीएनए-प्रोटीन क्रॉसलिंक (डीपीसी) लगातार, सर्वव्यापी और हानिकारक डीएनए घाव हैं, जो अंतर्जात डीएनए क्षति, एंजाइम (टोपोइसोमेरेस, मेथिलट्रांसफेरेज़, आदि) खराबी, या बहिर्जात एजेंटों जैसे कि कीमोथेरेपी और क्रॉसलिंकिंग एजेंटों से उत्पन्न होते हैं। एक बार जब डीपीसी को प्रेरित किया जाता है, तो कई प्रकार के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) तुरंत प्रारंभिक प्रतिक्रिया तंत्र के रूप में संयुग्मित होते हैं। यह दिखाया गया है कि डीपीसी को यूबिकिटिन, छोटे यूबिकिटिन-जैसे संशोधक (सूमो), और पॉली-एडीपी-राइबोस द्वारा संशोधित किया जा सकता है, जो सब्सट्रेट्स को अपने संबंधित मरम्मत एंजाइमों को संकेत देने के लिए प्राइम करते हैं और कुछ मामलों में, अनुक्रमिक शिष्टाचार में मरम्मत का समन्वय करते हैं। चूंकि पीटीएम जल्दी से प्रकट होते हैं और अत्यधिक प्रतिवर्ती होते हैं, इसलिए पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी को अलग करना और पता लगाना चुनौतीपूर्ण रहा है जो आमतौर पर निम्न स्तर पर रहते हैं। यहां प्रस्तुत विवो में सर्वव्यापक, सूमोइलेटेड और एडीपी-राइबोसिलेटेड डीपीसी (दवा-प्रेरित टोपोइसोमेरेस डीपीसी और एल्डिहाइड-प्रेरित गैर-विशिष्ट डीपीसी) को शुद्ध करने और मात्रात्मक रूप से पता लगाने के लिए एक इम्यूनोसे है। यह परख रडार (डीएनए जोड़ वसूली के लिए तेजी से दृष्टिकोण) परख से ली गई है जिसका उपयोग इथेनॉल वर्षा द्वारा डीपीसी युक्त जीनोमिक डीएनए के अलगाव के लिए किया जाता है। सामान्यीकरण और न्यूक्लियस पाचन के बाद, डीपीसी के पीटीएम, जिसमें सर्वव्यापकता, सूमोनाइलेशन और एडीपी-राइबोसिलेशन शामिल हैं, को उनके संबंधित एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा पता लगाया जाता है। इस मजबूत परख का उपयोग नए आणविक तंत्र ों की पहचान और विशेषता के लिए किया जा सकता है जो एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी की मरम्मत करते हैं और डीपीसी की मरम्मत के लिए पीटीएम को विनियमित करने वाले विशिष्ट कारकों को लक्षित करने वाले छोटे अणु अवरोधकों की खोज करने की क्षमता रखते हैं।

Introduction

जीनोमिक डीएनए क्षति सहज क्षय, आंतरिक क्षति औरपर्यावरणीय कारकों के कारण होती है। परिणामस्वरूप डीएनए घावों में क्षतिग्रस्त आधार, बेमेल, एकल और डबल-स्ट्रैंड ब्रेक, अंतर-और इंट्रा-स्ट्रैंड क्रॉसलिंक और डीएनए-प्रोटीन क्रॉसलिंक (डीपीसी) शामिल हैं। एक डीपीसी तब बनता है जब एक क्रोमैटिन-बाध्य प्रोटीन सहसंयोजक लिंकेज के माध्यम से डीएनए पर फंस जाता है। डीपीसी अंतर्जात डीएनए घावों और प्रतिक्रियाशील मेटाबोलाइट्स के साथ-साथ बहिर्जात एजेंटों जैसे कि कीमोथेरेपी और द्विक्रियाशील क्रॉसलिंकिंग एजेंटों से प्रेरित होते हैं। कुछ परिस्थितियों में, एंजाइम डिसफंक्शन से डीपीसी2 का गठन भी हो सकता है। डीपीसी इंड्यूसर में विशाल अंतर के परिणामस्वरूप सहसंयोजक-बाध्य प्रोटीन की पहचान, गुणसूत्र क्षेत्र जहां डीपीसी का गठन होता है, प्रोटीन से जुड़े डीएनए की संरचना प्रकार, और प्रोटीन और डीएनए 2,3,4 के बीच सहसंयोजक लिंकेज की रासायनिक संपत्ति में अंतर होता है।

उनकी रासायनिक प्रकृति के आधार पर, डीपीसी को आम तौर पर दो समूहों में वर्गीकृत किया जाता है: एंजाइमेटिक डीपीसी और गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी। कुछ एंजाइम जैसे टोपोइसोमेरेस, ग्लाइकोसिलेस, और मिथाइल / एसाइलट्रांसफेरेज़ अपनी सामान्य उत्प्रेरक प्रतिक्रियाओं के दौरान प्रतिवर्ती एंजाइम-डीएनए सहसंयोजक मध्यवर्ती बनाकर कार्य करते हैं। ये अल्पकालिक एंजाइम-डीएनए मध्यवर्ती हैं और अंतर्जात या बहिर्जात एजेंटों द्वारा उनके फंसने पर लंबे समय तक रहने वाले एंजाइमेटिक डीपीसी में परिवर्तित हो सकते हैं, विशेष रूप से कीमोथेरेपी3 द्वारा। टोपोइसोमेरेस डीपीसी यूकेरियोटिक कोशिकाओं में सबसे लगातार एंजाइमेटिक डीपीसी में से हैं, जिन्हें नैदानिक रूप से उपयोगी टोपोइसोमेरेस इनहिबिटर (टोपोइसोमेरेस आई [टॉप 1] के लिए टोपोटेकेन और इरिनोटेकन और टोपोइसोमेरेस II [टॉप 2] के लिए एटोपोसाइड और डॉक्सोर्यूबिसिन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है) और इनअवरोधकों के प्राथमिक चिकित्सीय तंत्र हैं।. डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ (डीएनएमटी) 1, 3 ए, और 3 बी 5-एज़ा-2'-डीऑक्सीसाइटिडाइन (जिसे डिसिटाबिन के रूप में भी जाना जाता है) का लक्ष्य हैं और दवा7 के संपर्क में आने पर डीपीसी बनाते हैं। प्रतिक्रियाशील एजेंट, साथ ही पराबैंगनी प्रकाश और आयनकारी विकिरण, गैर-विशेष रूप से डीएनए में क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन द्वारा गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी को प्रेरित करते हैं। एसीटैल्डिहाइड और फॉर्मलाडेहाइड (एफए) जैसे प्रतिक्रियाशील एल्डिहाइड अक्सर सेलुलर चयापचय के उपोत्पाद के रूप में उत्पन्न होते हैं, जिनके बीच एफए मेथनॉल चयापचय, लिपिड पेरोक्सीडेशन और हिस्टोन डिमिथाइलेशन के दौरान माइक्रोमोलर सांद्रता में उत्पादित होता है। इसके अलावा, एफए दुनिया भर में निर्मित एक उच्च मात्रा वाला उत्पादन रसायन है, जिसके लिए कई लोग पर्यावरण और व्यावसायिक रूप से 8,9 दोनों के संपर्क में हैं।

एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी दोनों कोशिकाओं के लिए अत्यधिक विषाक्त होते हैं क्योंकि उनके भारी प्रोटीन घटक प्रतिकृति और प्रतिलेखन सहित लगभग सभी क्रोमैटिन-आधारित प्रक्रियाओं में कुशलता पूर्वक बाधा डालते हैं, जिससे सेल चक्र गिरफ्तारी और एपोप्टोसिस होता है। पिछले दो दशकों में, डीपीसी की मरम्मत का सख्ती से अध्ययन किया गया है, और कई प्रोटीन / मार्गों को प्रमुख कारकों के रूप में पहचाना गया है जो या तो सीधे डीपीसी की मरम्मत करते हैं या उनकी मरम्मत प्रक्रियाओं को संशोधित करते हैं। उदाहरण के लिए, यह अच्छी तरह से स्थापित किया गया है कि डीपीसी के प्रोटीन थोक का प्रोटियोलिसिस डीपीसी मरम्मत का एक महत्वपूर्ण कदम है, और प्रोटियोलिसिस को प्रोटीज एसपीआरटीएन 10,11,12,13,14, FAM111A 15, जीसीएनए 16,17, या 26 एस प्रोटीसोम कॉम्प्लेक्स 18,19,20,21,22 द्वारा उत्प्रेरित किया जा सकता है।, 23,24,25,26,27 एक सेल प्रकार- या सेलुलर संदर्भ-निर्भर तरीके से। इन प्रोटीज की पहचान और लक्षण वर्णन काफी हद तक एंजाइम (आईसीई) परख28,29 के विवो कॉम्प्लेक्स और डीएनए जोड़ वसूली (रडार) परख30,31 के लिए तेजी से दृष्टिकोण पर निर्भर करता है, जो दोनों डीएनए अणुओं और उनके सहसंयोजक-बाध्य प्रोटीन को मुक्त सेलुलर प्रोटीन से अलग करते हैं ताकि क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके स्लॉट-ब्लॉट द्वारा डीपीसी का पता लगाया जा सके। इसके अलावा, ट्रैप्ड-इन अगारोस डीएनए इम्यूनोस्टेनिंग (टीएआरडीआईएस) परख का उपयोग एकल-कोशिका स्तर32 पर डीपीसी का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के साधन के रूप में किया गया था। वर्तमान में, शोधकर्ता डीपीसी को मापने के लिए आईसीई परख पर रडार परख चुनते हैं, क्योंकि आईसीई परख सीज़ियम क्लोराइड ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड के शुद्धिकरण पर निर्भर करती है, जो बेहद समय लेने वाली है, जबकि रडार परख बहुत कम अवधि के भीतर इथेनॉल का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड को अवक्षेपित करती है।

हाल के वर्षों में, बढ़ते सबूत सामने आए हैं कि डीपीसी-लक्षित प्रोटीज 3,33,34,35 के सिग्नलिंग और भर्ती में कई पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) शामिल हैं। उदाहरण के लिए, TOP1- और TOP2-DPC दोनों को छोटे यूबिकिटिन-जैसे संशोधक (SUMO)-2/3 और फिर SUMO-1 द्वारा SUMO E3 लिगेज PIAS4 द्वारा संयुग्मित पाया गया, जो डीएनए प्रतिकृति और प्रतिलेखन से स्वतंत्र था। अनुक्रमिक सूमो संशोधन यूबिकिटिन का लक्ष्य प्रतीत होते हैं, जिसे सूमोइलेटेड टीओपी-डीपीसी में जमा किया जाता है और आरएनएफ 4 नामक सूमो-लक्षित यूबिकिटिन लिगेज द्वारा अपने लाइसिन 48 अवशेषों के माध्यम से बहुलक श्रृंखला बनाता है। इसके बाद, यूबिकिटिन बहुलक 26 एस प्रोटीसम को टीओपी-डीपीसी23,36 में एक संकेत प्राप्त करता है और भर्ती करता है। उसी सूमो-यूबिकिटिन मार्ग को हाल ही में डीएनएमटी 1-डीपीसी के साथ-साथ पीएआरपी-डीएनए परिसरों पर उनकी मरम्मतके लिए 37,38 पर कार्य करने के लिए दिखाया गया था। इसके अलावा, यूबिकिटिन ई 3 लिगेज टीआरएपी द्वारा सूमो-स्वतंत्र सर्वव्यापकता को प्रतिकृति-युग्मिततरीके से प्रोटीसोमल गिरावट के लिए प्रमुख डीपीसी को सूचित किया गया है। टीओपी-डीपीसी के प्रोटीसोमल क्षरण के समान, प्रतिकृति-युग्मित मेटालोप्रोटीज एसपीआरटीएन द्वारा एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी के प्रोटियोलिसिस को भी एसपीआरटीएन40,41 को संलग्न करने के लिए एक तंत्र के रूप में डीपीसी सब्सट्रेट्स की सर्वव्यापकता की आवश्यकता होती है। सूमोनाइलेशन और सर्वव्यापकता की भूमिका के चित्रण के लिए उन डीपीसी का पता लगाने की आवश्यकता होती है जो इन पीटीएम के साथ चिह्नित हैं। चूंकि मूल आईसीई परख और रडार परख बिना पचे हुए डीएनए नमूनों को मापने के लिए स्लॉट-ब्लॉट/ डॉट-ब्लॉट उपकरण पर भरोसा करते हैं, इसलिए इन दोनों परखों में से कोई भी विभिन्न आणविक भार के साथ पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी प्रजातियों को हल करने और कल्पना करने में सक्षम नहीं है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने इथेनॉल वर्षा द्वारा उनके शुद्धिकरण के बाद डीएनए नमूनों को पचाया और क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन को छोड़ने के लिए माइक्रोकोकल न्यूक्लियस, एक डीएनए और आरएनए एंडो-एक्सोन्यूक्लिज़ के साथ नमूना सामान्यीकरण, जिसने हमें प्रोटीन के साथ-साथ सोडियम डोडेसिल-सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) के साथ उनके सहसंयोजक पीटीएम को हल करने में सक्षम बनाया। वैद्युतकणसंचलन ने हमें पीटीएम को लक्षित करने वाले विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी का पता लगाने और मात्रात्मक करने की अनुमति दी। हमने शुरू में इस बेहतर विधि को डस्ट परख नाम दिया, ताकि सर्वव्यापकता और सुमोइलेटेड टॉप-डीपीसी23 का पता लगाने में इसकी मजबूती को उजागर किया जा सके। बाद में, हमने पॉली-एडीपी-राइबोज पॉलिमर20 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, विवो में टीओपी 1-डीपीसी के एडीपी-राइबोसिलेशन का मात्रात्मक आकलन करने के लिए परख के उपयोग का विस्तार किया।

यहां प्रस्तुत परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो सर्वव्यापक, सूमोइलेटेड और एडीपी-राइबोसिलेटेड डीपीसी का पता लगाता है और मापता है, जिसे संशोधित टीओपी-डीपीसी के लिए अनुकूलित किया गया था जो उनके अवरोधकों और गैर-विशिष्ट / गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी द्वारा प्रेरित होते हैं जो एफए द्वारा प्रेरित होते हैं। यह परख पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी को एक कोट्रोपिक एजेंट के साथ कोशिकाओं को लाइज करके, इथेनॉल के साथ डीएनए को अवक्षेपित करके और अन्यथा क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन और माइक्रोकोकल न्यूक्लियस के साथ उनके संशोधक जारी करके अलग करती है। अन्यथा डीएनए-बाध्य प्रोटीन और उनके पीटीएम को विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा निर्धारित किया जाता है। यह परख आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक नया मार्ग प्रशस्त करती है जिसके द्वारा कोशिका एंजाइमैटिक और गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी दोनों की मरम्मत करती है। विशेष रूप से, यह टीओपी-डीपीसी गिरावट और मरम्मत के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण पीटीएम के प्रेरण और कैनेटीक्स के विस्तृत अध्ययन को सक्षम बनाता है, और इस प्रकार पीटीएम को निर्देशित करने वाले ई 3 लिगास जैसे नए कारकों की खोज की अनुमति देता है। साथ ही इन कारकों को लक्षित करने वाले अवरोधक। चूंकि टीओपी-डीपीसी मरम्मत के लिए जिम्मेदार कुछ पीटीएम संभवतः प्लैटिनम-आधारित दवाओं22 जैसे अन्य कीमोथेरेपी द्वारा प्रेरित डीपीसी की मरम्मत में शामिल हैं, इसलिए इस परख में नई दवाओं की खोज और उपचार आहार का मार्गदर्शन करने के लिए रोगी कोशिकाओं में टोपोइसोमेरेस इनहिबिटर या प्लैटिनम-आधारित एंटीनोप्लास्टिक्स के साथ मिश्रित उपचारों के तर्कसंगत अनुकूलन के लिए आवेदन की क्षमता भी है।

Protocol

1. मानव भ्रूण किडनी 293 (एचईके 293) सेल लाइन में सेल कल्चर और दवा उपचार

  1. कल्चर माध्यम, डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) को तैयार करें, जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 100 यूनिट / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है।
  2. बीज 1 x 106 कोशिकाओं को 60 मिमी प्लेट या 6-वेल प्लेट प्रति उपचार स्थिति और नियंत्रण में रखें।
  3. अगले दिन, कोशिकाओं को पसंद के डीपीसी इंड्यूसर के साथ इलाज करें।
    1. TOP1-DPCs और उनकी सर्वव्यापकता और SUMOylation को प्रेरित करने के लिए, कोशिकाओं में 20 μM पर TOP1 अवरोधक कैम्पटोथेसिन जोड़ें और 20, 60 और 180 मिनट पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    2. TOP2a और β-DPCs और उनकी सर्वव्यापकता और SUMOylation को प्रेरित करने के लिए, कोशिकाओं को 200 μM पर TOP2 अवरोधक etoposide को कोशिकाओं में जोड़ने और 20, 60 और 180 मिनट पर कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए उजागर करें।
    3. गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी और उनकी सर्वव्यापकता और सूमोनाइलेशन को प्रेरित करने के लिए, 1 एमएम पर एफए जोड़ें और एक्सपोजर के 2 घंटे बाद कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    4. टॉप 1-डीपीसी के पैराइलेशन को प्रेरित करने के लिए, 1 0 μM पर पॉली (ADP-राइबोज) ग्लाइकोहाइड्रोलेस (PARG) अवरोधक PDD00017273 के साथ डिपेनाइलेशन को अवरुद्ध करने के लिए कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए पूर्व-उपचार करें, इसके बाद 20, 60 और 180 मिनट के लिए 20 μM कैम्पोथेसिन के साथ सह-उपचार करें।

2. क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन युक्त डीएनए का अलगाव और सामान्यीकरण।

  1. उपचार के बाद जल्दी से मीडिया को एक सक्शनिंग पिपेट के साथ एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को बर्फ-ठंडा 1एक्स फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से कुल्ला करें। 1x प्रोटीज कॉकटेल अवरोधक, 1 mM dithiothreitol (DTT), और 20 mM N-एथिलमेलिमाइड (deSUMOylating और deunspiraling एंजाइमों का अवरोधक) युक्त DNAzol अभिकर्मक के 600 μL में कोशिकाओं को तुरंत निष्क्रिय करें।
  2. धीरे-धीरे प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक कंपन मंच पर हिलाएं।
  3. प्लेट में सीधे 100% ठंडे इथेनॉल (0.3 एमएल) की 1/2 मात्रा जोड़ें और चरण 2.2 को तब तक दोहराएं जब तक कि अपारदर्शी न्यूक्लिक एसिड एग्रीगेट दिखाई न दे। सेल लाइसेट को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूब को न्यूक्लिक एसिड और इसके क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अधिकतम गति (20,000 x ग्राम) सेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन करें।
  4. एक सक्शनिंग पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और न्यूक्लिक एसिड गोली को 75% इथेनॉल के 1 एमएल में धोएं, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,000 एक्स जी सेंट्रीफ्यूजेशन के 2 मिनट करें।
  5. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, उसी गति से नीचे घुमाएं, और पी 20 पिपेट का उपयोग करके शेष तरल को हटा दें। गोली को 5 मिनट के लिए हवा में सुखाएं।
  6. 0.1 मिलीलीटर डीडीएच2ओ में न्यूक्लिक एसिड गोली को जल्दी से घोलें। बार-बार पाइपिंग करके गोली को फिर से निलंबित करें और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि गोली कम से कम तीन गुना बड़ी (लगभग 30 मिनट) तक न हो जाए।
  7. गोली को पूरी तरह से भंग करने के लिए 10 सेकंड के लिए 30% आयाम पर अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर जांच के साथ नमूने को सोनिकेट करें।
  8. वैकल्पिक चरण: नमूनों को RNase A/ T1 मिश्रण (RNase A के 10 μg और RNase T1 के 25 U) के साथ इलाज करें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ट्यूब में 3 एम सोडियम एसीटेट की 1/10 मात्रा और बर्फ-ठंडा 100% इथेनॉल के दो वॉल्यूम जोड़ें, इसके बाद डीएनए को पुनः प्राप्त करने के लिए 10 मिनट के लिए 20,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और अवक्षेपित डीएनए को डीडीएच2ओ के 0.1 एमएल में घोलें।
  9. वैकल्पिक चरण: 20,000 x g पर 5 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  10. पराबैंगनी-दृश्य मान (यूवी-विस) स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें। विशिष्ट डीएनए उपज लगभग 600-800 एनजी / आरएनए हटाने के बाद ए 260/ए 280 अनुपात को 2.0-2.1 से घटाकर 1.8-1.9 किया जाना चाहिए।
  11. डीएनए की सांद्रता को ddH 2 O के 0.12 mL में 400-500 ng/μL में समायोजित करें। नमूने के 20 μL को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बिना पचे हुए डीएनए लोडिंग नियंत्रण के रूप में स्थानांतरित करें (चरण2.4देखें)।
  12. डीडीएच 2 ओ के शेष 100 μL में घुले डीएनए को पचाने के लिए, नमूने में 10x कैल्शियम माइक्रोकोकल न्यूक्लियस प्रतिक्रिया बफर के 1/10 वॉल्यूम (~ 11 μL) के साथ माइक्रोकोकल न्यूक्लियस की 2,000 जेल इकाइयों को जोड़ें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

3. पचे हुए डीएनए नमूनों का पश्चिमी सोख्ता।

  1. 4x Laemmli नमूना बफर जोड़ें, फिर 5 मिनट के लिए नमूना उबालें।
  2. 4% -20% पॉलीक्रिलामाइड जेल पर पचे हुए नमूने (~ 15 μL) के 5-6 μg लोड करें, इसके बाद SDS-PAGE42 को असंशोधित और पीटीएम-संयुग्मित DPC को हल करने के लिए।
  3. एफए-प्रेरित गैर-एंजाइमी डीपीसी प्रजातियों का पता लगाने के लिए, कमरे के तापमान पर रात भर कूमासी ब्लू स्टेन के साथ जेल को इनक्यूबेट करें। जेल को 2 घंटे के लिए डीडीएच2ओ के साथ धोएं और इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके एक छवि प्राप्त करें।
  4. जेल को स्थानांतरित करें और बफर को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी के उचित कमजोर पड़ने के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    1. सर्वव्यापकता का पता लगाने के लिए, एंटी-यूबिकिटिन एंटीबॉडी का 1: 100 कमजोर पड़ने का प्रयास करें।
    2. सूमो -1 या सूमो -2/3 संशोधन का पता लगाने के लिए, एंटी-सूमो -1 या एंटी-सूमो -2/3 एंटीबॉडी का 1: 250 कमजोर करना बनाएं।
    3. एडीपी-राइबोसिलेशन का पता लगाने के लिए, एंटी-पीएआर एंटीबॉडी का 1:500 कमजोर करना बनाएं।
    4. कुल TOP1-, TOP2a-, या TOP23-DPCs का पता लगाने के लिए, एंटी-TOP1, एंटी-TOP2a या एंटी-TOP23 एंटीबॉडी का 1:500 पतला करें।
      नोट: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने पर विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  5. कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए बफर को अवरुद्ध करने में 5,000 गुना पतला द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ 1x पीबीएस-टी (0.1% ट्वीन 20) धुली हुई झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  6. एन्हांस्ड केमिलुमिनेसेंस (ईसीएल) अभिकर्मक के साथ झिल्ली विकसित करें और इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके एक छवि प्राप्त करें।

4. बिना पचे हुए डीएनए नमूनों का स्लॉट-ब्लॉटिंग।

  1. सोडियम फॉस्फेट बफर (25 एमएम, पीएच 6.6) के 180 μL में 20 μL अनपचे हुए डीएनए नमूने को पतला करें।
  2. नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली (0.45 μm) को काटें और सोडियम फॉस्फेट बफर में 5 मिनट के लिए संतुलन करें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्लॉट-ब्लॉट उपकरण को इकट्ठा करें और इसे वैक्यूम सिस्टम से कनेक्ट करें।
  4. वैक्यूम लगाकर सोडियम फॉस्फेट बफर के साथ कुओं को धो लें। सुनिश्चित करें कि कुओं का रिसाव न हो।
  5. वैक्यूम को रोकें और प्रति नमूना (1 μg) डीएनए के 200 μL लोड करें। खाली कुओं को 200 μL सोडियम फॉस्फेट बफर के साथ भरें।
  6. वैक्यूम लागू करें।
  7. जब सभी कुएं पूरी तरह से खाली हो जाएं, तो वैक्यूम को रोकें, प्रत्येक कुएं में सोडियम फॉस्फेट बफर के 200 μL लोड करें, और चरण 4.6 दोहराएं।
  8. झिल्ली को पुनः प्राप्त करें और कमरे के तापमान पर 0.5 घंटे के लिए 5% ब्लॉकिंग बफर के साथ ब्लॉक करें।
  9. एंटी-डबल स्ट्रैंड डीएनए (डीएसडीएनए) एंटीबॉडी के साथ जांच 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1: 5,000 कमजोर पड़ने पर।
  10. 1x PBS-T के साथ 3x धोएं और 1: 5,000 पतला हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (HRP) से जुड़े एंटी-माउस द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
  11. एन्हांस्ड केमिलुमिनेसेंस (ईसीएल) अभिकर्मक के साथ झिल्ली विकसित करें और इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके एक छवि प्राप्त करें।

5. डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण

  1. इमेजजे का उपयोग करते हुए, बिना पचे हुए डीएनए के स्लॉट की तीव्रता के सापेक्ष प्रत्येक बैंड / स्मीयर की तीव्रता के अनुपात की गणना करें और दवा उपचार के बिना / पहले कोशिकाओं के अनुपात को सामान्य करें।

Representative Results

चित्रा 1 में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम दवा-प्रेरित टीओपी 1-डीपीसी के गठन और कैनेटीक्स और उनके सूमोनाइलेशन और सर्वव्यापकता को दर्शाते हैं। TOP1 ने डीएनए डुप्लेक्स के एक स्ट्रैंड को अलग किया और एक एंजाइम-डीएनए सहसंयोजक मध्यवर्ती का गठन किया, जिसे TOP1 क्लीवेज कॉम्प्लेक्स (TOP1cc) कहा जाता है। CAMP tothecin (CPT), एक TOP1 अवरोधक का उपचार, TOP1cc से बंधा और स्थिर हुआ, जिससे लंबे जीवन वाले TOP1-DPCs का गठन हुआ। सीपीटी के संपर्क में आने के बाद टॉप 1-डीपीसी को प्रेरित और 20 मिनट के लिए चरम पर देखा गया। समवर्ती रूप से, टॉप 1-डीपीसी को सूमो -2/3 द्वारा संशोधित किया गया था, जो सीपीटी उपचार के 20 मिनट बाद भी चरम पर पहुंच गया था। चूंकि सूमो -2 और सूमो -3 95% अनुक्रम पहचान साझा करते हैं, एंटीबॉडी एक को दूसरे से अलग नहीं करता है। 60 मिनट पर, TOP1-DPCs और उनके SUMO-2/3 संशोधन कम हो गए, साथ ही उनके SUMO-1 संशोधन और सर्वव्यापकता की परिणति भी हुई। 60 मिनट के दवा उपचार के बाद, TOP1-DPC SUMO-1 संशोधन और सर्वव्यापकता के स्तर में गिरावट शुरू हुई। स्तनधारियों में, टीओपी 2 आइसोजाइम α हैं और β डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक पेश करके कार्य करते हैं, साथ ही एक क्षणिक और प्रतिवर्ती एंजाइम-डीएनए सहसंयोजक कॉम्प्लेक्स (टीओपी 2 सीसी) के गठन के माध्यम से कार्य करते हैं। टॉप 2 इनहिबिटर, जैसे कि एटोपोसाइड (ईटीओपी), टॉप 2 सीसी को टॉप 2-डीपीसी में परिवर्तित करते हैं और उनके सूमोनाइलेशन और सर्वव्यापकता को प्रेरित करते हैं। TOP1-DPCs और उनके PTM, TOP2a- और β-DPCs के कैनेटीक्स के समान और उनके SUMO-2/3 संशोधन 20 मिनट में चरम पर पहुंच गए, फिर कम होने लगे; इस बीच, उनके सूमो -1 और यूबिकिटिन संशोधन 60 मिनट (चित्रा 2) पर पहुंच गए। टीओपी-डीपीसी की निकासी को प्रोटीसोमल गिरावट के परिणामस्वरूप प्रदर्शित किया गया है, और टीओपी-डीपीसी सूमोनाइलेशन और सर्वव्यापकता की निकासी क्रमशः डीसूमोनाइलेशन और सर्वव्यापकता द्वारा रीसाइक्लिंग के कारण होने की संभावना है, उनके रिवर्सिंग एंजाइमों द्वारा। चित्रा 3 में प्रयोगों ने एफए-प्रेरित गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी और उनके पीटीएम की जांच की। यह देखा गया कि डीपीसी और उनके सूमो -2/3, सूमो -1, और सर्वव्यापकता एफए खुराक-निर्भर तरीके से बनी और जमा हुई। अंत में, टीओपी 1-डीपीसी के पैरेनाइलेशन को मात्रात्मक रूप से उसी विधि का उपयोग करके एंटी-पीएआर एंटीबॉडी के साथ पता लगाया गया था (चित्रा 4)। TOP1-DPC PARiलेशन का पता लगाने योग्य नहीं था जब तक कि सेल में एक PARG अवरोधक नहीं जोड़ा गया था, यह सुझाव देते हुए कि PARileation तुरंत प्रकट होता है और अत्यधिक गतिशील होता है। पिछली खोज के अनुरूप, PARGI द्वारा DEPARiलेशन का निषेध TOP1-DPC को जमा करने के लिए दिखाई दिया, संभवतः प्रोटियोलिटिक गिरावट को अवरुद्ध करके।

Figure 1
चित्रा 1: HEK293 कोशिकाओं में CPT उपचार पर TOP1-DPCs के गठन और कैनेटीक्स और उनके SUMOनाइलेशन और सर्वव्यापकता का मात्रात्मक विश्लेषण। (A) HEK293 कोशिकाओं को संकेतित अवधि के लिए 20 μM CPT के साथ इलाज किया गया था। सेल लाइसेट को काटा गया और संकेतित एंटीबॉडी के साथ संशोधित रडार परख और पश्चिमी सोख्ता के अधीन किया गया। बिना पचे हुए डीएनए नमूनों को लोडिंग नियंत्रण के रूप में एंटी-डीएसडीएनए एंटीबॉडी का उपयोग करके स्लॉट-ब्लोटिंग के अधीन किया गया था। (बी) बैंड तीव्रता को इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ परिमाणित किया गया था और प्रिज्म सॉफ्टवेयर के साथ प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: HEK293 कोशिकाओं में ETOP उपचार पर TOP2-DPCs के गठन और कैनेटीक्स और उनके SUMOनाइलेशन और सर्वव्यापकता का मात्रात्मक विश्लेषण । (ए) एचईके 293 कोशिकाओं को संकेतित अवधि के लिए 200 μM ETOP के साथ इलाज किया गया था। सेल लाइसेट को काटा गया और संकेतित एंटीबॉडी के साथ संशोधित रडार परख और पश्चिमी सोख्ता के अधीन किया गया। बिना पचे हुए डीएनए नमूनों को लोडिंग नियंत्रण के रूप में एंटी-डीएसडीएनए एंटीबॉडी का उपयोग करके स्लॉट-ब्लोटिंग के अधीन किया गया था। (बी) बैंड तीव्रता को इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ परिमाणित किया गया था और प्रिज्म सॉफ्टवेयर के साथ प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एचईके 293 कोशिकाओं में एफए उपचार पर गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी और उनके सूमोनाइलेशन और सर्वव्यापकता का मात्रात्मक विश्लेषण। (ए) एचईके 293 कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए संकेतित सांद्रता के एफए के साथ इलाज किया गया था। सेल लाइसेट को काटा गया और संकेतित एंटीबॉडी के साथ संशोधित रडार परख और पश्चिमी सोख्ता के अधीन किया गया। बिना पचे हुए डीएनए नमूनों को लोडिंग नियंत्रण के रूप में एंटी-डीएसडीएनए एंटीबॉडी का उपयोग करके स्लॉट-ब्लोटिंग के अधीन किया गया था। (बी) बैंड तीव्रता को इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ परिमाणित किया गया था और प्रिज्म सॉफ्टवेयर के साथ प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एचईके 293 कोशिकाओं में सीपीटी उपचार पर टॉप 1-डीपीसी और उनके पैरिलेशन का मात्रात्मक विश्लेषण। (ए) एचईके 293 कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 10 μM PARGi के साथ पूर्व-उपचारित किया गया था और फिर संकेतित अवधि के लिए सीपीटी के साथ सह-उपचार किया गया था। सेल लाइसेट को काटा गया और संकेतित एंटीबॉडी के साथ संशोधित रडार परख और पश्चिमी सोख्ता के अधीन किया गया। बिना पचे हुए डीएनए नमूनों को लोडिंग नियंत्रण के रूप में एंटी-डीएसडीएनए एंटीबॉडी का उपयोग करके स्लॉट-ब्लोटिंग के अधीन किया गया था। (बी) बैंड तीव्रता को इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ परिमाणित किया गया था और प्रिज्म सॉफ्टवेयर के साथ प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

वर्णित विधि स्तनधारी कोशिकाओं में एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक डीएनए-प्रोटीन क्रॉसलिंक के माप की अनुमति देती है और उनकी सर्वव्यापकता, सूमोनाइलेशन और एडीपी-राइबोसिलेशन का अध्ययन करने के लिए एकमात्र उपयुक्त दृष्टिकोण है। आईसीई या रडार परख के बाद स्लॉट-ब्लॉटिंग अपने एंटीबॉडी का उपयोग करके टॉप-डीपीसी जैसे विशिष्ट एंजाइमेटिक डीपीसी का तेजी से पता लगाने की अनुमति देता है। हालांकि, इस विधि के लिए एक चेतावनी विभिन्न आणविक भार के प्रोटीन को अलग करने में असमर्थता है, जिससे पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी के आकार को निर्धारित करना असंभव हो जाता है। वर्णित विधि माइक्रोकोकल न्यूक्लियस के साथ क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन जारी करके समस्या को हल करती है, जो डीएनए को टर्मिनल 3'-फॉस्फेट के साथ ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स में नीचा दिखाती है, जिससे एसडीएस-पेज द्वारा प्रोटीन (ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ संयुग्मित) के पूर्ण पृथक्करण की अनुमति मिलती है। यूबिकिटिन, सूमो, या एडीपी-राइबोज मोनोमर्स और विभिन्न आकारों के पॉलिमर के साथ संशोधित डीपीसी को इसलिए इन पीटीएम को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी द्वारा कल्पना और मात्रा निर्धारित की जा सकती है, जिससे उनके गठन और कैनेटीक्स की विस्तृत जांच हो सकती है। प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने और सांख्यिकीय महत्व की गणना करने के लिए, प्रयोगों की जैविक प्रतिकृति की आवश्यकता होती है।

इस परख की सबसे आम समस्याओं में से एक इथेनॉल वर्षा के बाद कम डीएनए उपज है। एक तरफ, डीएनए उपज को अधिक शुरुआती सामग्री (कोशिकाओं) के साथ बढ़ाया जा सकता है। दूसरी ओर, एक एपेंडॉर्फ ट्यूब के बजाय एक फ्लैट प्लेट में इथेनॉल के साथ इनक्यूबेटिंग सेल लाइसेट डीएनए अणुओं के एकत्रीकरण में स्पष्ट रूप से सुधार कर सकते हैं और इस प्रकार उनकी वर्षा की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। दवा उपचार के बिना नमूनों में देखे गए गैर-विशिष्ट संकेत गैर-सहसंयोजक प्रोटीन संदूषण का संकेत दे सकते हैं। यदि यह मामला है, तो सोनिकेशन से पहले दूषित पदार्थों को हटाने के लिए उच्च नमक बफर के साथ डीएनए छर्रों को धोने पर विचार किया जा सकता है। सोनिकेशन और माइक्रोकोकल न्यूक्लियस पाचन के बाद डीएनए नमूनों को स्पिन करने और किसी भी अघुलनशील को त्यागने की भी सिफारिश की जाती है। खराब या कोई संकेत नहीं होने के मामले में, कई संभावित समाधानों का प्रयास किया जा सकता है। सबसे पहले, कोई एसडीएस-पेज और इम्यूनोब्लोटिंग के लिए डीएनए की लोडिंग राशि बढ़ा सकता है। सूमोइलेटेड और सर्वव्यापी डीपीसी प्रजातियों का पता लगाने योग्य बनाने के लिए, जेल पर कम से कम 4 μg डीएनए लोड करने की सिफारिश की जाती है। दूसरा, डीपीसी और उनके संबंधित पीटीएम के उच्च स्तर को प्रेरित करने के लिए दवा सांद्रता को बढ़ाया जा सकता है। तीसरा, यह सुझाव दिया जाता है कि यदि बैंड / स्मीयर कमजोर दिखाई देते हैं तो एक और दिन के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धब्बों को इनक्यूबेट करें। 2-दिवसीय इनक्यूबेशन सिग्नल को काफी शक्तिशाली बना सकता है और इस प्रकार स्वतंत्र प्रयोगों से जैविक परिवर्तनशीलता को कम कर सकताहै। पुन: धुंधला करने के लिए झिल्ली स्ट्रिपिंग अनिवार्य रूप से पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी प्रजातियों की एक निश्चित मात्रा के नुकसान का परिणाम है जो पहले से ही कम बहुतायत में हैं। इसलिए, एक धब्बे की फिर से जांच करने के बजाय यूबिकिटिन और सूमो का पता लगाने के लिए अलग-अलग जैल चलाने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। इसके अलावा, डीएनए छर्रों को एच 2 ओ या किसी अन्य सॉल्वैंट्स में विघटन से पहले गुआनिडाइन नमक युक्त शेष डीएनएज़ोल को हटाने के लिए 75% इथेनॉल के साथ धोया जाना चाहिए, जो अन्यथा लैम्मली लोडिंग बफर के अतिरिक्त नमूने के क्रिस्टलीकरण का कारण बनता है।

वर्णित विधि का वर्कफ़्लो बोझिल आईसीई परख की तुलना में बहुत अधिक समय-कुशल है, क्योंकि यह जीनोमिक डीएनए को अलग करने के लिए समय लेने वाले सीज़ियम क्लोराइड अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बजाय तेजी से इथेनॉल वर्षा पर निर्भर करता है। एक कीमत पर, इथेनॉल-आधारित शुद्धिकरण प्रोटीन दूषित पदार्थों की कम मात्रा लाता है जो आमतौर पर इम्यूनोडिटेक्शन के लिए नगण्य होते हैं। हालांकि, जब विश्लेषणात्मक अध्ययनों की बात आती है, जैसे कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण जिन्हें सटीकता और परिशुद्धता की आवश्यकता होती है, तो सीज़ियम-क्लोराइड घनत्व-ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन अभी भी शुद्ध, उच्च-बहुतायत डीएनए को अलग करने के लिए एक अधिक विश्वसनीय दृष्टिकोण है। इस विधि को संभावित रूप से क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन पर संशोधन साइटों की रूपरेखा और उचित मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित विधियों का उपयोग करके पॉली-सर्वव्यापकता और पॉली-सूमोनाइलेशन के लिंकेज प्रकारों के निर्धारण के लिए भी लागू किया जा सकता है।

ध्यान दें, यह परख डीपीसी की मरम्मत के लिए पीटीएम को विनियमित करने वाले कारकों की पहचान और लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, निष्पक्ष उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधियां (आरएनए हस्तक्षेप और सीआरआईएसपीआर) यूबिकिटिन ई 3 लिगैस, सूमो ई 3 लिगेस और उनके संबंधित कोफ़ैक्टर्स की खोज करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं जो डीपीसी इंड्यूसर ्स की साइटोटॉक्सिसिटी को कम करते हैं। वर्णित विधि यह निर्धारित करके इन प्रोटीनों के आणविक सत्यापन को सक्षम बनाती है कि क्या वे डीपीसी की मरम्मत करके कोशिकाओं को डीपीसी इंड्यूसर से बचने में मदद करते हैं। यह देखते हुए कि टोपोइसोमेरेस इनहिबिटर सबसे अधिक निर्धारित कीमोथेरेपी में से हैं, इस मजबूत परख को दवाओं के विकास के लिए एक उपकरण के रूप में विकसित किया जा सकता है जो नैदानिक टोपोइसोमेरेस इनहिबिटर के साथ तालमेल करते हैं।

Disclosures

लेखक ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

यह काम पोस्टडॉक्टरल रिसर्च ट्रांजिशन अवार्ड में नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट सेंटर फॉर कैंसर रिसर्च एक्सीलेंस द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher 70011069
4–20% precast polyacrylamide gel Bio-Rad 4561096
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
AcquaStain (coomassie blue) Bulldog Bio AS001000
anti-dsDNA (mouse monoclonal) Abcam 27156 1: 5,000 dilution is recommended
anti-PAR (mouse monoclonal) R&D systems 4335-MC-100 1: 500 dilution is recommended
anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) Cell Signaling Technology 4940 1: 250 dilution is recommended
anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) Cell Signaling Technology 4971 1: 250 dilution is recommended
anti-TOP1 (mouse monoclonal) BD Biosciences 556597 1: 500 dilution is recommended
anti-TOP2α (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-365799 1: 250 dilution is recommended
anti-TOP2β (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-25330 1: 250 dilution is recommended
anti-ubiquitin (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-8017 1: 100 dilution is recommended
Calcium chloride Sigma-Aldrich 499609 Used for micrococcal nuclease digestion
Camptothecin Sigma-Aldrich PHL89593
ChemiDo MP imaging system Bio-Rad 12003154
Disodium phosphate Sigma-Aldrich 5438380100 Used to make sodium phosphate buffer
DNAzol Thermo Fisher 10503027
DTT (dithiothreitol) Thermo Fisher R0861
Dulbecco's modified eagle's medium Sigma-Aldrich 11965084
Ethyl alcohol, 200 proof Sigma-Aldrich E7023
Etoposide Sigma-Aldrich 1268808
Formaldehyde Sigma-Aldrich 47608
Graphpad Prism Software GraphStats Prism 9.0.0
HRP-linked Mouse IgG Cytiva NA931 1: 5,000 dilution is recommended
HRP-linked Rabbit IgG Cytiva NA934 1: 5,000 dilution is recommended
ImageJ Software NIH, USA ImageJ 1.53e
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
Maximum sensitivity ECL substrate Thermo Fisher 34095
Micrococcal nuclease New England BioLabs M0247S
Monosodium phosphate Sigma-Aldrich S3139 Used to make sodium phosphate buffer
NanoDrop 2000 spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000
N-ethylmaleimide Thermo Fisher 23030 DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor
Nitrocellulose membrane, 0.45 µm Bio-Rad 1620115
Non-fat dry milk Bio-Rad 1706404XTU
PDD00017273 Selleckchem S8862 Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
Protease inhibitor cocktail Thermo Fisher 78430
Q700 sonicator Qsonica Q700-110
Ready-to-assemble PVDF transfer kit Bio-Rad 1704274
Slot-blot apparatus Bio-Rad 1706542
Slot-blot filter paper Bio-Rad 1620161
Trans-Blot turbo transfer system Bio-Rad 1704150
Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer Bio-Rad 1610732
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179
Vertical electrophoresis cell Bio-Rad 1658004

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References

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डीएनए-प्रोटीन क्रॉसलिंक ्स का मात्रात्मक पता लगाना और उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन
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