Summary
Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.
Abstract
DNA-protein çapraz bağları (DPC'ler), endojen DNA hasarı, enzim (topoizomerazlar, metiltransferazlar, vb.) işlev bozukluğundan veya kemoterapötikler ve çapraz bağlama ajanları gibi eksojen ajanlardan kaynaklanan sık, her yerde bulunan ve zararlı DNA lezyonlarıdır. DPC'ler indüklendikten sonra, erken yanıt mekanizmaları olarak çeşitli translasyon sonrası modifikasyonlar (PTM'ler) derhal bunlara konjuge edilir. DPC'lerin, substratları ilgili belirlenmiş onarım enzimlerini işaret etmeye hazırlayan ve bazı durumlarda onarımı sıralı bir şekilde koordine eden ubikuitin, küçük ubikuitin benzeri değiştirici (SUMO) ve poli-ADP-riboz ile değiştirilebileceği gösterilmiştir. PTM'ler hızlı bir şekilde ortaya çıktığından ve yüksek oranda geri dönüşümlü olduğundan, genellikle düşük seviyelerde kalan PTM konjuge DPC'leri izole etmek ve tespit etmek zor olmuştur. Burada sunulan, ubikitile edilmiş, SUMOile edilmiş ve ADP-ribosillenmiş DPC'leri (ilaca bağlı topoizomeraz DPC'ler ve aldehit kaynaklı spesifik olmayan DPC'ler) in vivo saflaştırmak ve kantitatif olarak tespit etmek için bir immünolojik testtir. Bu tahlil, DPC'leri içeren genomik DNA'nın etanol çökeltme ile izolasyonu için kullanılan RADAR (DNA eklenti geri kazanımına hızlı yaklaşım) testinden türetilmiştir. Normalizasyon ve nükleaz sindirimini takiben, ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribosilasyon dahil olmak üzere DPC'lerin PTM'leri, karşılık gelen antikorları kullanılarak immünoblotlama ile tespit edilir. Bu sağlam test, enzimatik ve enzimatik olmayan DPC'leri onaran yeni moleküler mekanizmaları tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir ve DPC'leri onarmak için PTM'leri düzenleyen spesifik faktörleri hedefleyen küçük molekül inhibitörlerini keşfetme potansiyeline sahiptir.
Introduction
Genomik DNA hasarı, spontan çürüme, iç hasar ve çevresel faktörler nedeniyle oluşur1. Ortaya çıkan DNA lezyonları, hasarlı bazlar, uyumsuzluklar, tek ve çift iplikçik kopmaları, iplikçikler arası ve zincir içi çapraz bağlar ve DNA-protein çapraz bağları (DPC'ler) içerir. Kromatine bağlı bir protein, kovalent bağ yoluyla DNA üzerinde tutulduğunda bir DPC oluşur. DPC'ler, endojen DNA lezyonları ve reaktif metabolitlerin yanı sıra kemoterapötikler ve iki işlevli çapraz bağlama ajanları gibi eksojen ajanlar tarafından indüklenir. Belirli koşullar altında, enzim disfonksiyonu da DPC'lerinoluşumuna yol açabilir 2. DPC indükleyicilerindeki büyük fark, kovalent bağlı proteinin kimliğinde, DPC'nin oluştuğu kromozom bölgesinde, proteine çapraz bağlı DNA'nın yapı tipinde ve protein ile DNAarasındaki kovalent bağın kimyasal özelliğinde bir farklılığa neden olur 2,3,4.
Kimyasal yapılarına bağlı olarak, DPC'ler genellikle iki gruba ayrılır: enzimatik DPC'ler ve enzimatik olmayan DPC'ler. Topoizomerazlar, glikozilazlar ve metil/asiltransferazlar gibi bazı enzimler, normal katalitik reaksiyonları sırasında tersinir enzim-DNA kovalent ara ürünleri oluşturarak etki eder. Bunlar kısa ömürlü enzim-DNA ara ürünleridir ve endojen veya eksojen ajanlar, özellikle kemoterapötikler tarafından yakalanmaları üzerine uzun ömürlü enzimatik DPC'lere dönüştürülebilir3. Topoizomeraz DPC'leri, klinik olarak yararlı topoizomeraz inhibitörleri (topoizomeraz I için topotakan ve irinotekan [TOP1] ve topoizomeraz II için etoposid ve doksorubisin [TOP2]) tarafından üretilebilen ökaryotik hücrelerde en sık görülen enzimatik DPC'ler arasındadır ve bu inhibitörlerin birincil terapötik mekanizmalarıdır 5,6. DNA metiltransferazlar (DNMT) 1, 3A ve 3B, 5-aza-2'-deoksisitidinin (desitabin olarak da bilinir) hedefidir ve ilaca maruz kaldığında DPC'ler oluşturur7. Reaktif ajanların yanı sıra ultraviyole ışık ve iyonlaştırıcı radyasyon, proteinleri DNA'ya spesifik olmayan çapraz bağlayarak enzimatik olmayan DPC'leri indükler. Asetaldehit ve formaldehit (FA) gibi reaktif aldehitler genellikle hücresel metabolizmaların yan ürünleri olarak üretilir, bunların arasında FA, metanol metabolizması, lipid peroksidasyonu ve histon demetilasyonu sırasında mikromolar konsantrasyonlarda üretilir. Ayrıca FA, dünya çapında üretilen ve birçok insanın hem çevresel hem de mesleki olarak maruz kaldığı yüksek hacimli bir üretim kimyasalıdır 8,9.
Hem enzimatik hem de enzimatik olmayan DPC'ler, hacimli protein bileşenleri, replikasyon ve transkripsiyon dahil olmak üzere neredeyse tüm kromatin bazlı süreçleri verimli bir şekilde engellediğinden, onarılmadan bırakılırsa hücre döngüsü durmasına ve apoptoza yol açtığından, hücreler için oldukça toksiktir. Son yirmi yılda, DPC'lerin onarımı güçlü bir şekilde incelenmiştir ve DPC'leri doğrudan onaran veya onarım süreçlerini modüle eden anahtar faktörler olarak birkaç protein/yol tanımlanmıştır. Örneğin, bir DPC'nin protein kütlesinin proteolizinin, DPC onarımının çok önemli bir adımı olduğu ve proteolizin SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A 15, GCNA 16,17 veya26S proteazom kompleksi 18,19,20,21,22 tarafından katalize edilebileceği iyi bilinmektedir, 23,24,25,26,27 hücre tipine veya hücresel bağlama bağlı bir şekilde. Bu proteazların tanımlanması ve karakterizasyonu büyük ölçüde enzimin in vivo kompleksine (ICE) testine28,29 ve DNA eklenti geri kazanımına hızlı yaklaşıma (RADAR) testine30,31 dayanmıştır, her ikisi de DNA moleküllerini ve bunların kovalent bağlı proteinlerini serbest hücresel proteinlerden izole ederek çapraz bağlı proteinleri hedefleyen antikorları hedef alan antikorlar kullanarak DPC'lerin saptanmasına izin verir. Ayrıca, hapsolmuş agaroz DNA immün boyama (TARDIS) testi, tek hücre seviyesinde DPC'leri tespit etmek ve ölçmek için bir araç olarak kullanıldı32. Şu anda, araştırmacılar DPC'leri ölçmek için ICE testi yerine RADAR testini seçmektedir, çünkü ICE testi, son derece zaman alıcı olan sezyum klorür gradyan ultrasantrifüjleme kullanılarak nükleik asitlerin saflaştırılmasına dayanırken, RADAR testi çok daha kısa bir süre içinde etanol kullanarak nükleik asitleri çökeltir.
Son yıllarda, DPC hedefli proteazların 3,33,34,35 sinyalizasyonunda ve işe alınmasında çoklu translasyon sonrası modifikasyonların (PTM'ler) rol oynadığına dair artan kanıtlar ortaya çıkmıştır. Örneğin, hem TOP1- hem de TOP2-DPC'lerin, DNA replikasyonu ve transkripsiyonundan bağımsız olarak, küçük ubikuitin benzeri değiştirici (SUMO)-2/3 ve daha sonra SUMO-1'in SUMO E3 ligaz PIAS4 tarafından konjuge edildiği bulundu. Sıralı SUMO modifikasyonları, SUMOylated TOP-DPC'lere bırakılan ve RNF4 olarak adlandırılan SUMO hedefli bir ubikuitin ligaz tarafından lizin 48 kalıntısı yoluyla polimerik zincirler oluşturan ubikuitinin bir hedefi gibi görünmektedir. Daha sonra, ubikitin polimeri, 26S proteazomunu TOP-DPC'lere23,36 bir sinyal verir ve işe alır. Aynı SUMO-ubiquitin yolunun yakın zamanda DNMT1-DPC'lerin yanı sıra onarımları için PARP-DNA kompleksleri üzerinde etkili olduğu gösterilmiştir37,38. Ek olarak, ubikuitin E3 ligaz TRAIP tarafından SUMO'dan bağımsız ubikitilasyonun, replikasyona bağlı bir şekilde proteazomal bozunma için DPC'leri hazırladığı bildirilmiştir39. TOP-DPC'lerin proteazomal bozunmasına benzer şekilde, enzimatik ve enzimatik olmayan DPC'lerin replikasyona bağlı metalloprotaz SPRTN tarafından proteolizi ayrıca SPRTN40,41'i devreye sokmak için bir mekanizma olarak DPC substratlarının her yerde bulunmasını gerektirir. SUMOylation ve ubiquitylation rolünün tanımlanması, bu PTM'lerle işaretlenmiş DPC'lerin algılanmasını gerektirir. Orijinal ICE tahlili ve RADAR tahlili, sindirilmemiş DNA örneklerini ölçmek için yarık-leke/nokta-leke aparatına dayandığından, bu iki testin hiçbiri farklı moleküler ağırlıklara sahip PTM konjuge DPC türlerini çözemez ve görselleştiremez. Bu sorunun üstesinden gelmek için, çapraz bağlı proteinleri serbest bırakmak için etanol çökeltme ve numune normalizasyonu ile saflaştırıldıktan sonra DNA örneklerini sindirdik, bu da proteinleri ve kovalent PTM'lerini sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile çözmemizi sağladı. Elektroforez, PTM'leri hedef alan spesifik antikorlar kullanarak PTM konjuge DPC'leri tespit etmemize ve ölçmemize izin verdi. Her yerde bulunan ve SUMOile edilmiş TOP-DPC'lerin tespitindeki sağlamlığını vurgulamak için başlangıçta bu geliştirilmiş yöntemi DUST testi olarak adlandırdık23. Daha sonra, poli-ADP-riboz polimerlerine karşı antikorlar kullanarak in vivo TOP1-DPC'lerin ADP-ribozilasyonunu kantitatif olarak değerlendirmek için testin kullanımını genişlettik20.
Burada, inhibitörleri tarafından indüklenen modifiye TOP-DPC'ler ve FA tarafından indüklenen spesifik olmayan/enzimatik olmayan DPC'ler için optimize edilmiş, her yerde bulunan, SUMOyleated ve ADP-ribosillenmiş DPC'leri tespit eden ve ölçen test için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, hücreleri kaotropik bir ajanla parçalayarak, DNA'yı etanol ile çökelterek ve aksi takdirde çapraz bağlı proteinleri ve bunların değiştiricilerini mikrokokal nükleaz ile serbest bırakarak PTM konjuge DPC'leri izole eder. Aksi takdirde DNA'ya bağlı proteinler ve bunların PTM'leri, spesifik antikorlar kullanılarak immünoblotlama ile ölçülür. Bu tahlil, hücrenin hem enzimatik hem de enzimatik olmayan DPC'leri onardığı moleküler mekanizmaları aydınlatmak için yeni bir yol açar. Spesifik olarak, TOP-DPC bozunması ve onarımının düzenlenmesi için önemli olan PTM'lerin indüksiyonu ve kinetiğinin ayrıntılı çalışmalarını mümkün kılar ve böylece PTM'leri dikte eden E3 ligazları gibi yeni faktörlerin keşfedilmesine izin verir, yanı sıra bu faktörleri hedef alan inhibitörler. TOP-DPC onarımından sorumlu PTM'lerin bazıları, platin bazlı ilaçlar22 gibi diğer kemoterapötikler tarafından indüklenen DPC'lerin onarımında yer aldığından, bu test aynı zamanda yeni ilaçların keşfine ve tedavi rejimlerine rehberlik etmek için hasta hücrelerinde topoizomeraz inhibitörleri veya platin bazlı antineoplastikler ile kombinatoryal tedavilerin rasyonel optimizasyonuna uygulama potansiyeline sahiptir.
Protocol
1. İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücre hattında hücre kültürü ve ilaç tedavisi
- %10 fetal sığır serumu, %1 2 mM L-glutamin ve 100 ünite/mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle besiyeri (DMEM) kültür ortamını hazırlayın.
- 60 mm'lik bir plakada 1 x 10 6 hücreyi veya tedavi koşulu artı kontrol başına6 oyuklu bir plakayı tohumlayın.
- Ertesi gün, hücreleri tercih edilen DPC indükleyicileri ile tedavi edin.
- TOP1-DPC'leri ve bunların her yerde bulunmasını ve SUMOylasyonunu indüklemek için, hücrelere 20 μM'de TOP1 inhibitörü kamptotekin ekleyin ve hücreleri 20, 60 ve 180 dakikada toplayın.
- TOP2α ve β-DPC'leri ve bunların her yerde bulunmasını ve SUMOylasyonunu indüklemek için, hücrelerin hücrelere 200 μM'de TOP2 inhibitörü etoposid eklemesine ve hücreleri 20, 60 ve 180 dakikada toplamasına maruz bırakın.
- Enzimatik olmayan DPC'leri ve bunların her yerde bulunmasını ve SUMOylation'ını indüklemek için, 1 mM'de FA ekleyin ve maruziyetten 2 saat sonra hücreleri toplayın.
- TOP1-DPC'lerin PARilasyonunu indüklemek için, 10 μM'de PDD00017273 poli (ADP-riboz) glikohidrolaz (PARG) inhibitörü ile dePARilasyonu bloke etmek için hücreleri 1 saat ön işlemden geçirin, ardından 20, 60 ve 180 dakika boyunca 20 μM kamptoteksin ile birlikte tedavi edin.
2. Çapraz bağlı proteinler içeren DNA'nın izolasyonu ve normalizasyonu
- İşlemden sonra ortamı bir emme pipeti ile hızlı bir şekilde aspire edin ve hücreleri buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın. Hücreleri, 1x proteaz kokteyl inhibitörü, 1 mM ditiyotreitol (DTT) ve 20 mM N-etilmaleimid (deSUMOylalayıcı ve deubikitilleyici enzimlerin inhibitörü) içeren 600 μL DNAzol reaktifinde hemen parçalayın.
- Plakayı titreşimli bir platform üzerinde 4 °C'de 10 dakika yavaşça çalkalayın.
- Doğrudan plakaya 1/2 hacim %100 soğuk etanol (0,3 mL) ekleyin ve opak nükleik asit agregası görünür hale gelene kadar 2,2. adımı tekrarlayın. Hücre lizatını 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve nükleik asidi ve çapraz bağlı proteinlerini çökeltmek için tüpü 4 ° C'de 15 dakika boyunca maksimum hızda (20.000 x g) santrifüjlemeye tabi tutun.
- Bir emme pipeti kullanarak süpernatanı aspire edin ve nükleik asit peletini 1 mL %75 etanol içinde yıkayın, ardından 4 °C'de 2 dakika 20.000 x g santrifüjleme yapın.
- Süpernatanı aspire edin, aynı hızda döndürün ve kalan sıvıyı bir P20 pipeti kullanarak çıkarın. Peletleri 5 dakika havayla kurutun.
- Nükleik asit peletini 0.1 mL ddH2O'da hızla çözün.Pelet, tekrarlanan pipetleme ile yeniden süspanse edin, ardından pelet en az üç kat daha büyük olana kadar (yaklaşık 30 dakika) 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin.
- Peletin tamamen çözülmesi için numuneleri 10 saniye boyunca% 30 genlikte bir ultrasonik işlemci probu ile sonikleştirin.
- İsteğe bağlı adım: Numuneleri RNase A/T1 karışımı (10 μg RNase A ve 25 U RNase T1) ile işlemden geçirin ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Tüpe 1/10 hacim 3 M sodyum asetat ve iki hacim buz gibi soğuk %100 etanol ekleyin, ardından DNA'yı almak için 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve çökeltilmiş DNA'yı 0.1 mLddH2O'daçözün.
- İsteğe bağlı adım: Numuneyi 20.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
- Ultraviyole görünür (UV-Vis) spektrometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. Tipik DNA verimi 600-800 ng/μL civarındadır. RNA çıkarıldıktan sonra A260/A280 oranı 2.0-2.1'den 1.8-1.9'a düşürülmelidir.
- DNA konsantrasyonunu 0.12 mLddH2O'da400-500 ng / μL'ye ayarlayın. Numunenin 20 μL'sini sindirilmemiş DNA yükleme kontrolü olarak yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (bkz. adım 2.4).
- Kalan 100 μL ddH2O'da çözünen DNA'yı sindirmek için, numuneye 1/10 hacim (~ 11 μL) 10x kalsiyum mikrokoksiaz nükleaz reaksiyon tamponu ile birlikte 2.000 jel birim mikrokokal nükleaz ekleyin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
3. Sindirilmiş DNA örneklerinin batı lekelenmesi
- 4x Laemmli numune tamponu ekleyin, ardından numuneyi 5 dakika kaynatın.
- Modifiye edilmemiş ve PTM ile konjuge DPC'leri çözmek için %4-20 poliakrilamid jel üzerine 5-6 μg sindirilmiş numune (~15 μL) ve ardından SDS-PAGE42 yükleyin.
- FA kaynaklı enzimatik olmayan DPC türlerini tespit etmek için, jeli gece boyunca oda sıcaklığında Coomassie mavi boyası ile inkübe edin. Jeli ddH 2 O ile2saat yıkayın ve bir görüntüleme sistemi kullanarak bir görüntü elde edin.
- Jeli aktarın ve membranları gece boyunca 4 ° C'de bloke edici tamponda uygun primer antikor dilüsyonları ile inkübe edin.
- Ubikitilasyonu tespit etmek için, anti-ubikuitin antikorunun 1:100 oranında seyreltilmesini sağlayın.
- SUMO-1 veya SUMO-2/3 modifikasyonunu tespit etmek için, anti-SUMO-1 veya anti-SUMO-2/3 antikorunun 1:250 oranında seyreltilmesini sağlayın.
- ADP-ribozilasyonunu tespit etmek için, anti-PAR antikorunun 1:500 seyreltilmesini yapın.
- Toplam TOP1-, TOP2α- veya TOP2β-DPC'leri tespit etmek için anti-TOP1, anti-TOP2α veya anti-TOP2β antikorunun 1:500 seyreltilmesini yapın.
NOT: Antikor seyreltmesi ile ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
- 1x PBS-T (%0.1 ara 20) yıkanmış membranı, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca bloke edici tamponda 5.000 kat seyreltilmiş ikincil bir antikor ile inkübe edin.
- Membranı gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktifi ile geliştirin ve görüntüleme sistemini kullanarak bir görüntü elde edin.
4. Sindirilmemiş DNA örneklerinin yuva lekelenmesi
- 20 μL sindirilmemiş DNA örneğini 180 μL sodyum fosfat tamponu (25 mM, pH 6.6) içinde seyreltin.
- Nitroselüloz membranı (0.45 μm) kesin ve sodyum fosfat tamponunda 5 dakika dengeleyin.
- Yarık leke aparatını üreticinin talimatlarına göre monte edin ve bir vakum sistemine bağlayın.
- Vakum uygulayarak kuyuları sodyum fosfat tamponu ile yıkayın. Kuyularda sızıntı olmadığından emin olun.
- Vakumu durdurun ve numune başına 200 μL DNA yükleyin (1 μg). Boş kuyucukları 200 μL sodyum fosfat tamponu ile doldurun.
- Vakumu uygulayın.
- Tüm kuyucuklar tamamen boşaldığında, vakumu durdurun, her kuyucuğa 200 μL sodyum fosfat tamponu yükleyin ve adım 4.6'yı tekrarlayın.
- Membranı alın ve oda sıcaklığında 0,5 saat boyunca %5 bloke edici tamponla bloke edin.
- Anti-çift sarmallı DNA (dsDNA) antikoru ile gece boyunca 4 ° C'de 1: 5.000 seyreltmede sondalayın.
- 3x'i 1x PBS-T ile yıkayın ve 1: 5.000 seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz (HRP) bağlantılı anti-fare ikincil antikoru ile inkübe edin.
- Membranı gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktifi ile geliştirin ve görüntüleme sistemini kullanarak bir görüntü elde edin.
5. Dansitometrik analiz
- ImageJ'yi kullanarak, her bir bandın/yaymanın yoğunluğunun sindirilmemiş DNA yuvasının yoğunluğuna oranını hesaplayın ve oranı, ilaç tedavisi olmayan/ilaç tedavisinden önceki hücrelerinkine göre normalleştirin.
Representative Results
Şekil 1'de sunulan temsili sonuçlar, ilaca bağlı TOP1-DPC'lerin oluşumunu ve kinetiğini ve bunların SUMOylation ve ubiquitylation'ını göstermektedir. TOP1, DNA dupleksinin bir zincirini parçaladı ve TOP1 bölünme kompleksi (TOP1cc) olarak adlandırılan bir enzim-DNA kovalent ara maddesi oluşturdu. Bir TOP1 inhibitörü olan kamptothecin (CPT) tedavisi, TOP1cc'ye bağlanmış ve stabilize edilmiştir, bu da uzun ömürlü TOP1-DPC'lerin oluşumuna yol açar. TOP1-DPC'lerin indüklendiği ve CPT'ye maruz kaldıktan 20 dakika sonra zirveye ulaştığı gözlendi. Aynı zamanda, TOP1-DPC'ler, CPT tedavisinden 20 dakika sonra da zirve yapan SUMO-2/3 ile modifiye edildi. SUMO-2 ve SUMO-3 %95 dizi özdeşliğini paylaştığından, antikor birini diğerinden ayırt etmez. 60. dakikada, TOP1-DPC'ler ve SUMO-2/3 modifikasyonları, SUMO-1 modifikasyonlarının ve her yerde bulunmalarının doruk noktasıyla birlikte azaldı. 60 dakikalık ilaç tedavisinden sonra, TOP1-DPC SUMO-1 modifikasyonu ve ubikitilasyon seviyeleri düşmeye başladı. Memelilerde, TOP2 izozimleri α ve β, bir DNA çift sarmallı kırılması ve ayrıca geçici ve geri dönüşümlü bir enzim-DNA kovalent kompleksinin (TOP2cc) oluşumu yoluyla etki eder. Etoposid (ETOP) gibi TOP2 inhibitörleri, TOP2cc'yi TOP2-DPC'lere dönüştürür ve bunların SUMOylasyonunu ve ubikitilasyonunu indükler. TOP1-DPC'lerin ve bunların PTM'lerinin kinetiğine benzer şekilde, TOP2α- ve β-DPC'ler ve SUMO-2/3 modifikasyonları 20 dakikada zirveye ulaştı, ardından azalmaya başladı; bu arada, SUMO-1 ve ubikuitin modifikasyonları 60 dakikada zirveye ulaştı (Şekil 2). TOP-DPC'lerin klerensinin proteazomal bozunmadan kaynaklandığı gösterilmiştir ve TOP-DPC SUMOylation ve ubiquitylation'ın klirensi, muhtemelen tersine çevirici enzimleri tarafından sırasıyla deSUMOylation ve deubiquitylation yoluyla geri dönüşümden kaynaklanmaktadır. Şekil 3'teki deneyler, FA ile indüklenen enzimatik olmayan DPC'leri ve bunların PTM'lerini inceledi. DPC'lerin ve bunların SUMO-2/3, SUMO-1 ve ubikitilasyonunun FA dozuna bağlı bir şekilde oluştuğu ve biriktiği gözlendi. Son olarak, TOP1-DPC'lerin PARilasyonu, aynı yöntem kullanılarak bir anti-PAR antikoru ile kantitatif olarak tespit edildi (Şekil 4). Hücreye bir PARG inhibitörü eklenmedikçe TOP1-DPC PARilasyonu tespit edilemedi, bu da PARilasyonun hemen gerçekleştiğini ve oldukça dinamik olduğunu düşündürdü. Önceki bulgu ile tutarlı olarak, PARGi tarafından dePARilasyonun inhibisyonunun, muhtemelen proteolitik bozunmayı bloke ederek TOP1-DPC'leri biriktirdiği görülmüştür.
Şekil 1: HEK293 hücrelerinde CPT tedavisi üzerine TOP1-DPC'lerin oluşumu ve kinetiğinin ve bunların SUMOylation ve ubiquitylation'ının kantitatif analizleri. (A) HEK293 hücreleri, belirtilen süreler boyunca 20 μM CPT ile muamele edildi. Hücre lizatları hasat edildi ve modifiye edilmiş RADAR testine ve belirtilen antikorlarla western blotlamaya tabi tutuldu. Sindirilmemiş DNA örnekleri, yükleme kontrolü olarak anti-dsDNA antikoru kullanılarak yuva lekelemeye tabi tutuldu. (B) Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü ve Prism yazılımı ile çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HEK293 hücrelerinde ETOP tedavisi üzerine TOP2-DPC'lerin oluşumu ve kinetiğinin ve bunların SUMOylation ve ubiquitylation'ının kantitatif analizleri. (A) HEK293 hücreleri, belirtilen süreler boyunca 200 μM ETOP ile muamele edildi. Hücre lizatları hasat edildi ve modifiye edilmiş RADAR testine ve belirtilen antikorlarla western blotlamaya tabi tutuldu. Sindirilmemiş DNA örnekleri, yükleme kontrolü olarak anti-dsDNA antikoru kullanılarak yuva lekelemeye tabi tutuldu. (B) Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü ve Prism yazılımı ile çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HEK293 hücrelerinde FA tedavisi üzerine enzimatik olmayan DPC'lerin kantitatif analizleri ve bunların SUMOylation ve ubiquitylation'ı. (A) HEK293 hücreleri, 2 saat boyunca belirtilen konsantrasyonlarda FA ile muamele edildi. Hücre lizatları hasat edildi ve modifiye edilmiş RADAR testine ve belirtilen antikorlarla western blotlamaya tabi tutuldu. Sindirilmemiş DNA örnekleri, yükleme kontrolü olarak anti-dsDNA antikoru kullanılarak yuva lekelemeye tabi tutuldu. (B) Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü ve Prism yazılımı ile çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: HEK293 hücrelerinde CPT tedavisi üzerine TOP1-DPC'lerin kantitatif analizleri ve bunların PARilasyonu. (A) HEK293 hücreleri, 1 saat boyunca 10 μM PARGi ile ön işleme tabi tutuldu ve daha sonra belirtilen süreler boyunca CPT ile birlikte muamele edildi. Hücre lizatları hasat edildi ve modifiye edilmiş RADAR testine ve belirtilen antikorlarla western blotlamaya tabi tutuldu. Sindirilmemiş DNA örnekleri, yükleme kontrolü olarak anti-dsDNA antikoru kullanılarak yuva lekelemeye tabi tutuldu. (B) Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü ve Prism yazılımı ile çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Açıklanan yöntem, memeli hücrelerinde enzimatik ve enzimatik olmayan DNA-protein çapraz bağlarının ölçülmesine izin verir ve bunların ubikitilasyonunu, SUMOylation'ını ve ADP-ribozilasyonunu incelemek için tek uygun yaklaşımdır. ICE veya RADAR tahlilini takiben yuva lekeleme, antikorlarını kullanarak TOP-DPC'ler gibi spesifik enzimatik DPC'lerin hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Bununla birlikte, bu yönteme yönelik bir uyarı, farklı moleküler ağırlıklara sahip proteinleri ayıramamasıdır, bu da PTM ile konjuge DPC'lerin boyutlarını belirlemeyi imkansız hale getirir. Açıklanan yöntem, DNA'yı terminal 3'-fosfatlarla oligonükleotidlere indirgeyen ve böylece proteinlerin (oligonükleotidlerle konjuge edilmiş) SDS-PAGE tarafından tam olarak ayrılmasına izin veren mikrokokal nükleaz ile çapraz bağlı proteinleri serbest bırakarak sorunu çözer. Bu nedenle, ubikitin, SUMO veya ADP-riboz monomerleri ve farklı boyutlardaki polimerler ile modifiye edilmiş DPC'ler, bu PTM'leri hedefleyen antikorlar tarafından görselleştirilebilir ve ölçülebilir, bu da oluşumlarının ve kinetiklerinin ayrıntılı olarak araştırılmasını sağlar. Tekrarlanabilirliği sağlamak ve istatistiksel anlamlılığı hesaplamak için deneylerin biyolojik kopyaları gereklidir.
Bu testin en yaygın sorunlarından biri, etanol çökeltmesinden sonra düşük DNA verimidir. Bir yandan, daha fazla başlangıç materyali (hücreleri) ile DNA verimi arttırılabilir. Öte yandan, hücre lizatlarının bir Eppendorf tüpü yerine düz bir plaka içinde etanol ile inkübe edilmesi, DNA moleküllerinin toplanmasını belirgin şekilde iyileştirebilir ve böylece çökelmelerini kolaylaştırabilir. İlaç tedavisi olmayan numunelerde gözlenen spesifik olmayan sinyaller, kovalent olmayan protein kontaminasyonunu gösterebilir. Bu durumda, sonikasyondan önce kirleticileri çıkarmak için DNA peletlerini yüksek tuz tamponu ile yıkamak düşünülebilir. Ayrıca, sonikasyon ve mikrokokal nükleaz sindiriminden sonra DNA örneklerinin döndürülmesi ve çözünmeyenlerin atılması önerilir. Sinyalin zayıf olması veya hiç olmaması durumunda, birkaç potansiyel çözüm denenebilir. İlk olarak, SDS-PAGE ve immünoblotlama için DNA yükleme miktarı arttırılabilir. SUMOylated ve ubiquitylated DPC türlerini tespit edilebilir hale getirmek için, jel üzerine en az 4 μg DNA yüklenmesi önerilir. İkincisi, daha yüksek DPC seviyelerini ve bunlarla ilişkili PTM'leri indüklemek için ilaç konsantrasyonları arttırılabilir. Üçüncüsü, bantlar/yaymalar zayıf görünüyorsa, birincil antikorlarla lekelerin başka bir gün inkübe edilmesi önerilir. 2 günlük bir inkübasyon, sinyali önemli ölçüde güçlendirebilir ve böylece bağımsız deneylerden kaynaklanan biyolojik değişkenliği azaltır23. Yeniden boyama için membran sıyırma, kaçınılmaz olarak, zaten düşük miktarda bulunan belirli miktarda PTM konjuge DPC türünün kaybına neden olur. Bu nedenle, bir lekeyi yeniden araştırmak yerine ubikuitin ve SUMO tespiti için ayrı jellerin çalıştırılması şiddetle tavsiye edilir. Ek olarak, H2O veya başka herhangi bir çözücü içinde çözünmeden önce guanidin tuzu içeren kalan DNAzol'ü çıkarmak için DNA peletleri %75 etanol ile yıkanmalıdır, aksi takdirde Laemmli yükleme tamponu eklendikten sonra numunenin kristalleşmesine neden olur.
Açıklanan yöntemin iş akışı, genomik DNA'yı izole etmek için zaman alıcı sezyum klorür ultrasantrifüjleme yerine hızlı etanol çökeltmesine dayandığından, hantal ICE tahliline kıyasla çok daha fazla zaman verimlidir. Bir fiyata, etanol bazlı saflaştırma, normalde immüno-tespit için ihmal edilebilir olan düşük miktarda protein kirleticisi sağlar. Bununla birlikte, kütle spektrometresi tabanlı proteomik analiz veya doğruluk ve kesinlik gerektiren yeni nesil dizileme gibi analitik çalışmalar söz konusu olduğunda, sezyum-klorür yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, saf, yüksek bolluktaki DNA'yı izole etmek için hala daha güvenilir bir yaklaşımdır. Bu yöntem aynı zamanda potansiyel olarak çapraz bağlı proteinler üzerindeki modifikasyon bölgelerinin profillenmesine ve uygun kütle spektrometresi tabanlı yöntemler kullanılarak poli-ubikitilasyon ve poli-SUMOilasyonun bağlantı tiplerinin belirlenmesine de uygulanabilir.
Bu tahlil, DPC'lerin onarımı için PTM'leri düzenleyen faktörlerin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna izin verir. Örneğin, tarafsız yüksek verimli tarama yöntemleri (RNA girişimi ve CRISPR), ubikitin E3 ligazlarını, SUMO E3 gazlarını ve DPC indükleyicilerinin sitotoksisitesini azaltan ilişkili kofaktörlerini keşfetmek için güçlü araçlardır. Açıklanan yöntem, DPC'leri onararak hücrelerin DPC indükleyicilerinden kurtulmasına yardımcı olup olmadıklarını belirleyerek bu proteinlerin moleküler doğrulamasını sağlar. Örneğin sanal tarama ile tanımlanan bu proteinleri hedefleyen yeni küçük moleküllü inhibitörler de bu protokol kullanılarak doğrulanabilir. Topoizomeraz inhibitörlerinin en çok reçete edilen kemoterapötikler arasında olduğu göz önüne alındığında, bu sağlam test, klinik topoizomeraz inhibitörleri ile sinerji oluşturan ilaçların geliştirilmesi için bir araç olarak geliştirilebilir.
Disclosures
Yazar, hiçbir rakip çıkar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Araştırmaları Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 70011069 | |
| 4–20% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561096 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| AcquaStain (coomassie blue) | Bulldog Bio | AS001000 | |
| anti-dsDNA (mouse monoclonal) | Abcam | 27156 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| anti-PAR (mouse monoclonal) | R&D systems | 4335-MC-100 | 1: 500 dilution is recommended |
| anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4940 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4971 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-TOP1 (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 556597 | 1: 500 dilution is recommended |
| anti-TOP2α (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-365799 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-TOP2β (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-25330 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-ubiquitin (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8017 | 1: 100 dilution is recommended |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | Used for micrococcal nuclease digestion |
| Camptothecin | Sigma-Aldrich | PHL89593 | |
| ChemiDo MP imaging system | Bio-Rad | 12003154 | |
| Disodium phosphate | Sigma-Aldrich | 5438380100 | Used to make sodium phosphate buffer |
| DNAzol | Thermo Fisher | 10503027 | |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher | R0861 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium | Sigma-Aldrich | 11965084 | |
| Ethyl alcohol, 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Etoposide | Sigma-Aldrich | 1268808 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | |
| Graphpad Prism Software | GraphStats | Prism 9.0.0 | |
| HRP-linked Mouse IgG | Cytiva | NA931 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| HRP-linked Rabbit IgG | Cytiva | NA934 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| ImageJ Software | NIH, USA | ImageJ 1.53e | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
| Maximum sensitivity ECL substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| Micrococcal nuclease | New England BioLabs | M0247S | |
| Monosodium phosphate | Sigma-Aldrich | S3139 | Used to make sodium phosphate buffer |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher | 23030 | DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor |
| Nitrocellulose membrane, 0.45 µm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Non-fat dry milk | Bio-Rad | 1706404XTU | |
| PDD00017273 | Selleckchem | S8862 | Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher | 78430 | |
| Q700 sonicator | Qsonica | Q700-110 | |
| Ready-to-assemble PVDF transfer kit | Bio-Rad | 1704274 | |
| Slot-blot apparatus | Bio-Rad | 1706542 | |
| Slot-blot filter paper | Bio-Rad | 1620161 | |
| Trans-Blot turbo transfer system | Bio-Rad | 1704150 | |
| Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | |
| Vertical electrophoresis cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Klages-Mundt, N. L., Li, L. Formation and repair of DNA-protein crosslink damage. Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).
- Weickert, P., Stingele, J.
- Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes. Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
- Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).
- Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).
- Ruggiano, A., Ramadan, K.
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Moretton, A., Loizou, J. I. Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer. Cancers. 12 (8), 2051 (2020).
- Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
- Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).
- Stingele, J., et al. Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
- Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair. Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).
- Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
- Kojima, Y., et al. FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain. Nature Communications. 11 (1), 1318 (2020).
- Dokshin, G. A., et al. GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability. Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).
- Borgermann, N., et al. SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks. The EMBO Journal. 38 (8), e101496 (2019).
- Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II. Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).
- Sun, Y., et al. Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064 (2022).
- Sun, Y., et al. PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation. Nature Communications. 12 (1), 5010 (2021).
- Sun, Y., et al. Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC). DNA Repair. 89, 102837 (2020).
- Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways. DNA Repair. 94, 102926 (2020).
- Sun, Y., et al. A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation. Science Advances. 6 (46), (2020).
- Saha, S., et al. DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks. Cell Reports. 33 (13), 108569 (2020).
- Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).
- Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).
- Sciascia, N., et al. Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity. eLife. 9, e53447 (2020).
- Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).
- Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA. Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).
- Nitiss, J. L., Kiianitsa, K., Sun, Y., Nitiss, K. C., Maizels, N.
- Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
- Cowell, I. G., Tilby, M. J., Austin, C. A. An overview of the visualisation and quantitation of low and high MW DNA adducts using the trapped in agarose DNA immunostaining (TARDIS) assay. Mutagenesis. 26 (2), 253-260 (2011).
- Leng, X., Duxin, J. P. Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775 (2022).
- Kuhbacher, U., Duxin, J. P.
- Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J.
- Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161 (2022).
- Krastev, D. B., et al. The ubiquitin-dependent ATPase p97 removes cytotoxic trapped PARP1 from chromatin. Nature Cell Biology. 24 (1), 62-73 (2022).
- Liu, J. C. Y., et al. Mechanism and function of DNA replication-independent DNA-protein crosslink repair via the SUMO-RNF4 pathway. The EMBO Journal. 40 (18), e107413 (2021).
- Larsen, N. B., et al. Replication-coupled DNA-protein crosslink repair by SPRTN and the proteasome in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 73 (3), 574-588 (2019).
- Zhao, S., et al. A ubiquitin switch controls autocatalytic inactivation of the DNA-protein crosslink repair protease SPRTN. Nucleic Acids Research. 49 (2), 902-915 (2021).
- Ruggiano, A., et al. The protease SPRTN and SUMOylation coordinate DNA-protein crosslink repair to prevent genome instability. Cell Reports. 37 (10), 110080 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
