Summary
본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.
Abstract
DNA-단백질 가교결합(DPC)은 내인성 DNA 손상, 효소(토포이소머라제, 메틸트랜스퍼라제 등) 오작동 또는 화학요법제 및 가교제와 같은 외인성 제제로 인해 발생하는 빈번하고 유비쿼터스하며 유해한 DNA 병변입니다. DPC가 유도되면 여러 유형의 번역 후 변형(PTM)이 초기 반응 메커니즘으로 즉시 활용됩니다. DPC는 유비퀴틴, 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO) 및 폴리-ADP-리보오스에 의해 변형될 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 기질을 프라이밍하여 각각의 지정된 복구 효소에 신호를 보내고 경우에 따라 순차적으로 복구를 조정합니다. PTM은 빠르게 발생하고 가역성이 높기 때문에 일반적으로 낮은 수준으로 유지되는 PTM 복합 DPC를 분리하고 감지하는 것이 어려웠습니다. 여기에 제시된 것은 생체 내에서 유비퀴틸화, SUMOylated 및 ADP-리보실화 DPC(약물 유도 토포이소머라제 DPC 및 알데히드 유도 비특이적 DPC)를 정제하고 정량적으로 검출하기 위한 면역 분석법입니다. 이 분석은 에탄올 침전에 의한 DPC를 포함하는 게놈 DNA의 분리에 사용되는 RADAR (DNA adduct recovery에 대한 신속한 접근) 분석에서 파생됩니다. 정규화 및 뉴클레아제 분해 후, 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함한 DPC의 PTM은 해당 항체를 사용한 면역블로팅에 의해 검출됩니다. 이 강력한 분석은 효소 및 비효소 DPC를 복구하는 새로운 분자 메커니즘을 식별하고 특성화하는 데 사용할 수 있으며 DPC를 복구하기 위해 PTM을 조절하는 특정 요인을 표적으로 하는 소분자 억제제를 발견할 수 있는 잠재력이 있습니다.
Introduction
게놈 DNA 손상은 자연 붕괴, 내부 손상 및 환경 요인으로 인해 발생합니다1. 결과적인 DNA 병변은 손상된 염기, 불일치, 단일 및 이중 가닥 절단, 가닥 간 및 가닥 내 가교 및 DNA-단백질 가교 결합(DPC)으로 구성됩니다. DPC는 염색질 결합 단백질이 공유 결합을 통해 DNA에 갇힐 때 형성됩니다. DPC는 내인성 DNA 병변 및 반응성 대사 산물뿐만 아니라 화학 요법제 및 이중 기능성 가교제와 같은 외인성 제제에 의해 유도됩니다. 특정 상황에서 효소 기능 장애는 DPC의 형성으로 이어질 수도 있습니다2. DPC 유도제의 엄청난 차이는 공유 결합 단백질의 정체성, DPC가 형성되는 염색체 영역, 단백질에 가교된 DNA의 구조 유형, 단백질과 DNA 사이의 공유 결합의 화학적 특성의 차이를 초래합니다 2,3,4.
화학적 성질에 따라 DPC는 일반적으로 효소 DPC와 비효소 DPC의 두 그룹으로 분류됩니다. 토포이소머라제, 글리코실라제 및 메틸/아실트랜스퍼라제와 같은 특정 효소는 정상적인 촉매 반응 동안 가역적 효소-DNA 공유 중간체를 형성함으로써 작용합니다. 이들은 수명이 짧은 효소-DNA 중간체이며, 내인성 또는 외인성 작용제, 특히 화학요법제에 의해 포획될 때 수명이 긴 효소 DPC로 전환될 수 있다3. 토포이소머라제 DPC는 진핵 세포에서 가장 빈번한 효소 DPC 중 하나이며, 이는 임상적으로 유용한 토포이소머라제 억제제(토포이소머라제 I[TOP1]에 대한 토포테칸 및 이리노테칸, 토포이소머라제 II[TOP2]에 대한 에토포시드 및 독소루비신)에 의해 생성될 수 있으며 이러한 억제제의 주요 치료 기전입니다 5,6. DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 1, 3A 및 3B는 5-아자-2'-데옥시시티딘(데시타빈이라고도 함)의 표적이며 약물에 노출되면 DPC를 형성한다7. 자외선 및 전리 방사선뿐만 아니라 반응성 제제는 단백질을 DNA에 비특이적으로 가교시켜 비효소적 DPC를 유도합니다. 아세트알데히드 및 포름알데히드(FA)와 같은 반응성 알데히드는 종종 세포 대사의 부산물로 생성되며, 그 중 FA는 메탄올 대사, 지질 과산화 및 히스톤 탈메틸화 동안 마이크로몰 농도로 생성됩니다. 또한 FA는 전 세계적으로 제조되는 대량 생산 화학 물질로 많은 사람들이 환경 적으로나 직업적으로 노출되어 있습니다 8,9.
효소 및 비효소 DPC는 부피가 큰 단백질 성분이 복제 및 전사를 포함한 거의 모든 염색질 기반 과정을 효율적으로 방해하여 복구하지 않고 방치하면 세포 주기 정지 및 세포자멸사를 유발하기 때문에 세포에 매우 독성이 있습니다. 지난 20년 동안 DPC의 복구가 활발하게 연구되었으며 여러 단백질/경로가 DPC를 직접 복구하거나 복구 과정을 조절하는 핵심 요소로 확인되었습니다. 예를 들어, DPC의 단백질 벌크의 단백질 가수분해가 DPC 복구의 중추적인 단계이며, 단백질 가수분해가 프로테아제 SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A 15, GCNA 16,17 또는26S 프로테아좀 복합체 18,19,20,21,22에 의해 촉매될 수 있다는 것이 잘 확립되어 있다,23,24,25,26,27 세포 유형- 또는 세포 문맥-의존적 방식으로. 이들 프로테아제의 식별 및 특성화는 효소 (ICE) 분석28,29 및 DNA 부가물 회복에 대한 신속한 접근법 (RADAR) 분석30,31의 생체 내 복합체에 크게 의존해 왔으며, 이들 모두는 가교결합된 단백질을 표적으로 하는 항체를 사용하여 슬롯-블롯에 의해 DPC를 검출할 수 있도록 자유 세포 단백질로부터 DNA 분자 및 이들의 공유 결합 단백질을 분리한다. 또한, 단세포 수준32에서 DPC를 검출하고 정량화하는 수단으로서 포획된 아가로스 DNA 면역염색(TARDIS) 분석법을 사용하였다. 현재 연구자들은 ICE 분석이 염화세슘 구배 초원심분리를 사용한 핵산 정제에 의존하기 때문에 DPC를 측정하기 위해 ICE 분석보다 RADAR 분석을 선택하는데, 이는 시간이 많이 소요되는 반면 RADAR 분석은 훨씬 더 짧은 기간 내에 에탄올을 사용하여 핵산을 침전시키기 때문입니다.
최근 몇 년 동안, 다중 번역 후 변형(PTM)이 DPC-표적 프로테아제 3,33,34,35의 신호 전달 및 모집에 관여한다는 증거가 등장했습니다. 예를 들어, TOP1- 및 TOP2-DPC는 모두 DNA 복제 및 전사와 독립적으로 SUMO E3 리가제 PIAS4에 의해 작은 유비퀴틴 유사 변형제(SUMO)-2/3에 의해 접합된 다음 SUMO-1에 의해 접합되는 것으로 밝혀졌습니다. 순차적 SUMO 변형은 유비퀴틴의 표적으로 보이며, 이는 SUMOylated TOP-DPC에 침착되고 RNF48라고 하는 SUMO 표적 유비퀴틴 리가아제에 의해 라이신 44 잔기를 통해 고분자 사슬을 형성합니다. 이어서, 유비퀴틴 중합체는 26S 프로테아좀에 신호를 유도하고 TOP-DPCs23,36에 모집한다. 동일한 SUMO-유비퀴틴 경로가 최근 DNMT1-DPCs 및 이들의 복구를 위한 PARP-DNA 복합체에 작용하는 것으로 나타났다37,38. 또한, 유비퀴틴 E3 리가제 TRAIP에 의한 SUMO-비의존적 유비퀴틸화는 복제 결합 방식으로 프로테아좀 분해를 위한 DPC를 프라임하는 것으로 보고되었다39. TOP-DPC의 프로테아좀 분해와 유사하게, 복제 결합 메탈로프로테아제 SPRTN에 의한 효소 및 비효소 DPC의 단백질 분해는 또한 SPRTN40,41에 결합하는 메커니즘으로서 DPC 기질의 유비퀴틸화를 필요로 합니다. SUMOylation 및 유비퀴틸레이션의 역할을 설명하려면 이러한 PTM으로 표시된 DPC를 감지해야 합니다. 원래의 ICE 분석과 RADAR 분석은 분해되지 않은 DNA 샘플을 측정하기 위해 슬롯-블롯/도트-블롯 장치에 의존하기 때문에 이 두 분석 중 어느 것도 분자량이 다른 PTM 결합 DPC 종을 분해하고 시각화할 수 없습니다. 이 문제를 극복하기 위해 에탄올 침전으로 정제한 후 DNA 샘플을 분해하고 가교결합된 단백질을 방출하는 DNA 및 RNA 엔도-엑소뉴클레아제인 마이크로코칼 뉴클레아제로 샘플 정규화를 수행하여 단백질과 공유 PTM을 소듐 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리할 수 있었습니다. 전기영동을 통해 PTM을 표적으로 하는 특정 항체를 사용하여 PTM 결합 DPC를 검출하고 정량화할 수 있었습니다. 우리는 처음에 이 개선된 방법을 DUST 분석이라고 명명하여 유비퀴틸화 및 SUMOylated TOP-DPC23의 검출에 대한 견고성을 강조했습니다. 나중에, 우리는 폴리-ADP-리보스 중합체에 대한 항체를 사용하여 생체 내에서 TOP1-DPC의 ADP-리보실화를 정량적으로 평가하기 위해 분석의 사용을 확장했습니다20.
여기에 제시된 것은 유비퀴틸화, SUMOylated 및 ADP-리보실화 DPC를 검출하고 측정하는 분석에 대한 자세한 프로토콜로, 이는 억제제에 의해 유도되는 변형된 TOP-DPC 및 FA에 의해 유도되는 비특이적/비효소적 DPC에 최적화되었습니다. 이 분석은 카오트로픽 제제로 세포를 용해하고, 에탄올로 DNA를 침전시키고, 그렇지 않으면 가교된 단백질과 그 변형제를 미세구균 뉴클레아제로 방출하여 PTM 접합 DPC를 분리합니다. 그렇지 않으면 DNA 결합 단백질과 PTM은 특정 항체를 사용한 면역 블로팅에 의해 정량화됩니다. 이 분석은 세포가 효소 및 비효소 DPC를 모두 복구하는 분자 메커니즘을 설명하는 새로운 길을 열어줍니다. 특히, TOP-DPC 분해 및 복구의 조절에 중요한 PTM의 유도 및 동역학에 대한 자세한 연구를 가능하게 하여 PTM을 지시하는 E3 리가제와 같은 새로운 인자의 발견을 가능하게 합니다. 뿐만 아니라 이러한 요인을 표적으로 하는 억제제. TOP-DPC 복구를 담당하는 PTM 중 일부는 백금계 약물과 같은 다른 화학요법제에 의해 유도된 DPC의 복구에 관여할 가능성이 높기 때문에22, 이 분석은 또한 신약의 발견에 적용할 수 있는 가능성을 가지고 있으며, 치료 요법을 안내하기 위해 환자 세포에서 토포이소머라제 억제제 또는 백금계 항종양을 사용한 조합 요법의 합리적인 최적화를 가능하게 한다.
Protocol
1. 인간 배아신장293(HEK293) 세포주에서의 세포 배양 및 약물 처리
- 10% 소 태아 혈청, 1% 2mM L-글루타민 및 100단위/mL 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 배양 배지인 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 준비합니다.
- 처리 조건 및 대조군에 따라 60mm 플레이트 또는 6웰 플레이트에 1 x 106 개의 세포를 시드합니다.
- 다음날, 선택된 DPC 유도제로 세포를 처리하십시오.
- TOP1-DPC와 그 유비퀴틸화 및 SUMOylation을 유도하기 위해 TOP1 억제제인 캄프토테신을 20μM의 세포에 첨가하고 20분, 60분 및 180분에 세포를 수집합니다.
- TOP2α 및 β-DPC와 이들의 유비퀴틸화 및 SUMOylation을 유도하기 위해 세포를 노출시켜 TOP2 억제제 에토포시드를 200μM에 첨가하고 20분, 60분 및 180분에 세포를 수집합니다.
- 비효소적 DPC와 이의 유비퀴틸화 및 SUMOylation을 유도하기 위해 FA를 1mM에 추가하고 노출 후 2시간 후에 세포를 수집합니다.
- TOP1-DPC의 PARylation을 유도하기 위해 세포를 1시간 동안 전처리하여 10μM에서 폴리(ADP-리보스) 글리코하이드롤라제(PARG) 억제제 PDD00017273로 dePARylation을 차단한 후 20μM 캄프토테신으로 20분, 60분 및 180분 동안 병용 처리합니다.
2. 가교 단백질을 포함하는 DNA의 분리 및 정상화
- 처리 후 흡입 피펫으로 배지를 빠르게 흡인하고 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 헹굽니다. 1x 프로테아제 칵테일 억제제, 1mM 디티오트레이톨(DTT) 및 20mM N-에틸말레이미드(deSUMOYLATING 및 deubiquitylating 효소 억제제)를 포함하는 600μL의 DNAzol 시약에 세포를 즉시 용해합니다.
- 4°C에서 10분 동안 진동 플랫폼에서 플레이트를 천천히 교반합니다.
- 1/2 부피의 100% 차가운 에탄올(0.3mL)을 플레이트에 직접 넣고 불투명한 핵산 응집체가 보일 때까지 2.2단계를 반복합니다. 세포 용해물을 1.5mL 미세원심분리 튜브로 옮기고 튜브를 4°C에서 15분 동안 최대 속도(20,000 x g) 원심분리하여 핵산 및 가교된 단백질을 침전시킵니다.
- 흡입 피펫을 이용하여 상층액을 흡인하고, 핵산 펠릿을 75% 에탄올 1 mL로 세척한 후, 4°C에서 20,000 x g 의 원심분리를 하였다.
- 상층액을 흡인하고 동일한 속도로 회전시킨 다음 P20 피펫을 사용하여 남은 액체를 제거합니다. 펠릿을 5분 동안 자연 건조합니다.
- 핵산 펠릿을 0.1 mL의ddH2O에 신속히 용해시키고, 펠릿을 반복적인 피펫팅에 의해 재현탁시킨 다음, 펠릿이 적어도 3배 더 크게 팽창할 때까지 37°C 수조에서 인큐베이션한다(약 30분).
- 펠릿을 완전히 용해시키기 위해 10 초 동안 30 % 진폭의 초음파 프로세서 프로브로 샘플을 초음파 처리합니다.
- 선택적 단계: 샘플을 RNase A/T1 혼합물(10μg의 RNase A 및 25U의 RNase T1)로 처리하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨과 얼음처럼 차가운 100% 에탄올 2부피를 튜브에 넣은 다음 20,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 DNA를 회수합니다. 상층액을 제거하고, 침전된 DNA를 0.1 mL의ddH2O에 용해시킨다.
- 선택적 단계: 20,000 x g 에서 5분 동안 샘플을 원심분리하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
- 자외선-가시광선(UV-Vis) 분광계를 사용하여 DNA 농도를 정량화합니다. 일반적인 DNA 수율은 약 600-800 ng/μL입니다. RNA 제거 후 A260/A280 비율을 2.0-2.1에서 1.8-1.9로 줄여야 합니다.
- DNA의 농도를 400-500 ng/μL로 조정하십시오 0.12 mL의 ddH 2 O. 샘플의 20 μL을 소화되지 않은 DNA 로딩 대조군으로 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다(2.4단계 참조).
- 나머지 100μL의ddH2O에 용해된 DNA를 분해하기 위해 10x 칼슘 미세구균 뉴클레아제 반응 완충액의 1/10부피(~11μL)와 함께 2,000겔 단위의 미세구균 뉴클레아제를 샘플에 추가합니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
3. 소화된 DNA 샘플의 웨스턴 블로팅
- 4x Laemmli 시료 버퍼를 추가한 다음 시료를 5분 동안 끓입니다.
- 5-6μg의 소화된 샘플(~15μL)을 4%-20% 폴리아크릴아미드 겔에 로드한 다음 SDS-PAGE42 를 사용하여 변형되지 않은 PTM 결합 DPC를 제거합니다.
- FA 유도 비효소적 DPC 종을 검출하기 위해, 실온에서 밤새 쿠마시 블루 염색과 함께 겔을 배양한다. 겔을ddH2O로 2시간 동안 세척하고 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다.
- 겔을 옮기고, 차단 완충액에서 1차 항체의 적절한 희석액과 함께 4°C에서 밤새 멤브레인을 인큐베이션한다.
- 유비퀴틸화를 검출하려면 항-유비퀴틴 항체를 1:100으로 희석합니다.
- SUMO-1 또는 SUMO-2/3 변형을 검출하려면 항-SUMO-1 또는 항-SUMO-2/3 항체를 1:250 희석합니다.
- ADP- 리보 실화를 검출하기 위해 항 -PAR 항체를 1 : 500 희석하십시오.
- 총 TOP1-, TOP2α- 또는 TOP2β-DPC를 검출하려면 항-TOP1, 항-TOP2α 또는 항-TOP2β 항체를 1:500으로 희석합니다.
참고: 항체 희석에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 1x PBS-T (0.1% 트윈 20) 세척된 멤브레인을 실온에서 60분 동안 블로킹 완충액에서 5,000배 희석한 2차 항체와 함께 인큐베이션한다.
- ECL(Enhanced Chemiluminescence) 시약으로 멤브레인을 현상하고 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다.
4. 소화되지 않은 DNA 샘플의 슬롯 블로팅
- 20 μL의 소화되지 않은 DNA 샘플을 180 μL의 인산나트륨 완충액(25 mM, pH 6.6)에 희석합니다.
- 니트로셀룰로스 멤브레인(0.45 μm)을 절단하고 소듐 포스페이트 완충액에서 5분 동안 평형화시킨다.
- 제조업체의 지침에 따라 슬롯 블롯 장치를 조립하고 진공 시스템에 연결합니다.
- 진공을 적용하여 인산나트륨 완충액으로 웰을 세척합니다. 우물이 새지 않는지 확인하십시오.
- 진공을 중지하고 샘플당 200μL의 DNA(1μg)를 로드합니다. 빈 웰을 200 μL의 인산나트륨 완충액으로 채웁니다.
- 진공을 적용합니다.
- 모든 웰이 완전히 비워지면 진공을 중지하고 각 웰에 200μL의 인산나트륨 버퍼를 로드한 다음 4.6단계를 반복합니다.
- 멤브레인을 회수하고 실온에서 0.5시간 동안 5% 차단 완충액으로 차단합니다.
- 항이중 가닥 DNA(dsDNA) 항체로 4°C에서 하룻밤 동안 1:5,000 희석하여 프로브합니다.
- 1x PBS-T로 3x 세척하고 1:5,000 희석된 양 고추 냉이 과산화효소(HRP) 결합 항-마우스 2차 항체로 배양합니다.
- ECL(Enhanced Chemiluminescence) 시약으로 멤브레인을 현상하고 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다.
5. 밀도 분석
- ImageJ를 사용하여 소화되지 않은 DNA 슬롯의 강도에 대한 각 밴드/도말의 강도 비율을 계산하고 약물 치료 전/전의 세포 비율에 대한 비율을 정규화합니다.
Representative Results
그림 1에 제시된 대표적인 결과는 약물 유도 TOP1-DPC의 형성 및 동역학과 이들의 SUMOylation 및 유비퀴틸화를 보여줍니다. TOP1은 DNA 이중체의 한 가닥을 절단하고 TOP1 절단 복합체(TOP1cc)라고 하는 효소-DNA 공유 중간체(SELF-DNA 공유 중간체)를 형성했습니다. TOP1 억제제인 캄프토테신(CPT)의 처리는 TOP1cc에 결합하고 안정화시켜 수명이 긴 TOP1-DPC를 형성합니다. TOP1-DPC는 CPT에 노출된 후 20분 후에 유도되고 최고조에 달하는 것으로 관찰되었습니다. 동시에 TOP1-DPC는 SUMO-2/3에 의해 변형되었으며, 이는 CPT 처리 후 20분에 최고조에 달했습니다. SUMO-2와 SUMO-3은 95%의 서열 동일성을 공유하므로 항체는 서로를 구별하지 않습니다. 60분에 TOP1-DPC와 SUMO-2/3 변형이 감소하고 SUMO-1 변형 및 유비퀴틸화의 정점이 동반되었습니다. 60분 약물 치료 후, TOP1-DPC SUMO-1 변형 및 유비퀴틸화의 수준이 감소하기 시작했습니다. 포유류에서 TOP2 동종효소 α 및 β DNA 이중 가닥 절단을 도입하고 일시적이고 가역적인 효소-DNA 공유 복합체(TOP2cc)의 형성을 통해 작용합니다. 에토포시드(ETOP)와 같은 TOP2 억제제는 TOP2cc를 TOP2-DPC로 전환하고 이들의 SUMOylation 및 유비퀴틸화를 유도합니다. TOP1-DPC 및 PTM의 동역학과 유사하게, TOP2α- 및 β-DPC와 SUMO-2/3 변형은 20분에 정점에 도달한 후 감소하기 시작했습니다. 한편, SUMO-1 및 유비퀴틴 변형은 60분에 최고조에 달했습니다(그림 2). TOP-DPC의 제거는 프로테아좀 분해의 결과인 것으로 입증되었으며, TOP-DPC SUMOylation 및 유비퀴틸화의 제거는 각각 역전 효소에 의한 deSUMOylation 및 deubiquitylation에 의한 재활용으로 인한 것 같습니다. 그림 3의 실험은 FA 유도 비효소 DPC와 그 PTM을 조사했습니다. DPCs 및 이들의 SUMO-2/3, SUMO-1 및 유비퀴틸화가 FA 용량-의존적 방식으로 형성 및 축적되는 것이 관찰되었다. 마지막으로, 동일한 방법을 사용하여 항-PAR 항체로 TOP1-DPC의 PARylation을 정량적으로 검출하였다(도 4). PARG 억제제가 세포에 첨가되지 않는 한 TOP1-DPC PARylation은 검출할 수 없었으며, 이는 PARylation이 즉시 발생하고 매우 동적임을 시사합니다. 이전 발견과 일관되게, PARGi에 의한 탈파릴화의 억제는 단백질 분해를 차단함으로써 TOP1-DPC를 축적하는 것으로 나타났다.
그림 1: HEK293 세포에서 CPT 처리 시 TOP1-DPC의 형성 및 동역학과 SUMOylation 및 유비퀴틸화의 정량적 분석. (A) HEK293 세포를 지시된 기간 동안 20μM CPT로 처리하였다. 세포 용해물을 수확하고, 변형된 RADAR 분석 및 지시된 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 소화되지 않은 DNA 샘플을 로딩 대조군으로서 항-dsDNA 항체를 사용하여 슬롯-블로팅을 실시하였다. (B) 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어로 정량화하고 Prism 소프트웨어로 플로팅했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: HEK293 세포에서 ETOP 처리 시 TOP2-DPC의 형성 및 동역학과 SUMOylation 및 유비퀴틸화의 정량적 분석. (A) HEK293 세포를 표시된 기간 동안 200μM ETOP로 처리했습니다. 세포 용해물을 수확하고, 변형된 RADAR 분석 및 지시된 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 소화되지 않은 DNA 샘플을 로딩 대조군으로서 항-dsDNA 항체를 사용하여 슬롯-블로팅을 실시하였다. (B) 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어로 정량화하고 Prism 소프트웨어로 플로팅했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HEK293 세포에서 FA 처리 시 비효소적 DPC와 SUMOylation 및 유비퀴틸화의 정량적 분석. (A) HEK293 세포를 지시된 농도의 FA로 2시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 수확하고, 변형된 RADAR 분석 및 지시된 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 소화되지 않은 DNA 샘플을 로딩 대조군으로서 항-dsDNA 항체를 사용하여 슬롯-블로팅을 실시하였다. (B) 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어로 정량화하고 Prism 소프트웨어로 플로팅했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: HEK293 세포에서 CPT 처리 시 TOP1-DPC 및 PARylation의 정량적 분석. (A) HEK293 세포를 1시간 동안 10μM PARGi로 전처리한 후 표시된 기간 동안 CPT로 공동 처리했습니다. 세포 용해물을 수확하고, 변형된 RADAR 분석 및 지시된 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 소화되지 않은 DNA 샘플을 로딩 대조군으로서 항-dsDNA 항체를 사용하여 슬롯-블로팅을 실시하였다. (B) 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어로 정량화하고 Prism 소프트웨어로 플로팅했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
설명된 방법은 포유류 세포에서 효소 및 비효소적 DNA-단백질 가교결합의 측정을 가능하게 하며, 이들의 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 연구하는 데 유일하게 적합한 접근법이다. ICE 또는 RADAR 분석 후 슬롯 블로팅을 통해 항체를 사용하여 TOP-DPC와 같은 특정 효소 DPC를 빠르게 검출할 수 있습니다. 그러나 이 방법의 주의 사항은 분자량이 다른 단백질을 분리할 수 없어 PTM 결합 DPC의 크기를 결정할 수 없다는 것입니다. 설명된 방법은 DNA를 말단 3'-포스페이트를 갖는 올리고뉴클레오티드로 분해하는 마이크로코커스 뉴클레아제로 가교된 단백질을 방출함으로써 문제를 해결하고, 이에 따라 SDS-PAGE에 의해 단백질(올리고뉴클레오티드와 접합됨)의 완전한 분리를 허용한다. 따라서 유비퀴틴, SUMO 또는 ADP-리보오스 단량체 및 다양한 크기의 폴리머로 변형된 DPC는 이러한 PTM을 표적으로 하는 항체에 의해 시각화 및 정량화될 수 있으므로 형성 및 동역학에 대한 자세한 조사가 가능합니다. 재현성을 보장하고 통계적 유의성을 계산하려면 실험의 생물학적 복제물이 필요합니다.
이 분석의 가장 일반적인 문제 중 하나는 에탄올 침전 후 낮은 DNA 수율입니다. 한편으로, DNA 수율은 더 많은 출발 물질(세포)로 증가될 수 있다. 반면, Eppendorf 튜브가 아닌 평판에서 에탄올과 함께 세포 용해물을 배양하면 DNA 분자의 응집이 현저하게 개선되어 침전이 촉진될 수 있습니다. 약물 처리가 없는 샘플에서 관찰된 비특이적 신호는 비공유 단백질 오염을 나타낼 수 있습니다. 이 경우 초음파 처리 전에 오염 물질을 제거하기 위해 고염 완충액으로 DNA 펠릿을 세척하는 것을 고려할 수 있습니다. 또한 초음파 처리 및 미세 구균 뉴 클레아 제 소화 후 DNA 샘플을 스핀 다운하고 불용성을 버리는 것이 좋습니다. 신호가 불량하거나 신호가 없는 경우 몇 가지 잠재적인 솔루션을 시도할 수 있습니다. 첫째, SDS-PAGE 및 면역블롯팅을 위한 DNA의 로딩량을 증가시킬 수 있다. SUMOylated 및 ubiquitylated DPC 종을 검출 할 수 있도록하려면 최소 4 μg의 DNA를 겔에로드하는 것이 좋습니다. 둘째, 약물 농도를 증가시켜 더 높은 수준의 DPC 및 관련 PTM을 유도할 수 있습니다. 셋째, 밴드/도말이 약한 것으로 보이는 경우 다른 날 동안 1차 항체로 블롯을 배양하는 것이 좋습니다. 2일간의 배양은 신호를 상당히 강화시킬 수 있으며, 따라서 독립적인 실험으로 인한 생물학적 변동성을 감소시킬 수 있다23. 재염색을 위한 멤브레인 스트리핑은 필연적으로 이미 존재량이 적은 일정량의 PTM 복합 DPC 종의 손실을 초래합니다. 따라서 하나의 블롯을 다시 조사하는 것보다 유비퀴틴 및 SUMO 검출을 위해 별도의 젤을 실행하는 것이 좋습니다. 또한, DNA 펠릿은 H2O 또는 기타 용매에 용해되기 전에 구아니딘 염을 함유한 나머지 DNAzol을 제거하기 위해 75% 에탄올로 세척해야 하며, 그렇지 않으면 Laemmli 로딩 버퍼를 첨가한 후 샘플의 결정화를 유발합니다.
설명된 방법의 워크플로는 게놈 DNA를 분리하기 위해 시간이 많이 소요되는 염화세슘 초원심분리 대신 빠른 에탄올 침전에 의존하기 때문에 번거로운 ICE 분석에 비해 훨씬 더 시간 효율적입니다. 에탄올 기반 정제는 일반적으로 면역 검출에 무시할 수 있는 적은 양의 단백질 오염 물질을 대가를 치르게 합니다. 그러나 질량 분석 기반 단백질체 분석 또는 정확성과 정밀도가 필요한 차세대 염기서열 분석과 같은 분석 연구의 경우, 세슘-클로라이드-밀도-그래디언트 원심분리는 순수하고 풍부도가 높은 DNA를 분리하기 위한 보다 신뢰할 수 있는 접근 방식입니다. 이 방법은 또한 적절한 질량 분석 기반 방법을 사용하여 가교된 단백질의 변형 부위 프로파일링 및 폴리유비퀴틸화 및 폴리-SUMOylation의 결합 유형 결정에 잠재적으로 적용될 수 있습니다.
참고로, 이 분석을 통해 DPC 복구를 위해 PTM을 조절하는 요인을 식별하고 특성화할 수 있습니다. 예를 들어, 편향되지 않은 고처리량 스크리닝 방법(RNA 간섭 및 CRISPR)은 유비퀴틴 E3 리가아제, SUMO E3 리가제 및 DPC 유도제의 세포 독성을 완화하는 관련 보조인자를 발견하는 강력한 도구입니다. 설명된 방법은 DPC를 복구하여 세포가 DPC 유도제에서 생존하는 데 도움이 되는지 여부를 결정함으로써 이러한 단백질의 분자 검증을 가능하게 합니다. 예를 들어 가상 스크리닝에 의해 확인된 이러한 단백질을 표적으로 하는 새로운 소분자 억제제도 이 프로토콜을 사용하여 검증할 수 있습니다. 토포이소머라제 억제제가 가장 많이 처방되는 화학요법제 중 하나라는 점을 감안할 때, 이 강력한 분석은 임상 토포이소머라제 억제제와 시너지 효과를 내는 약물 개발을 위한 도구로 개발될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 암 연구소 암 연구 센터 (National Cancer Institute Center for Cancer Research)박사후 연구 전환 상 (Postdoctoral Research Transition Award)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 70011069 | |
| 4–20% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561096 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| AcquaStain (coomassie blue) | Bulldog Bio | AS001000 | |
| anti-dsDNA (mouse monoclonal) | Abcam | 27156 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| anti-PAR (mouse monoclonal) | R&D systems | 4335-MC-100 | 1: 500 dilution is recommended |
| anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4940 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4971 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-TOP1 (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 556597 | 1: 500 dilution is recommended |
| anti-TOP2α (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-365799 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-TOP2β (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-25330 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-ubiquitin (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8017 | 1: 100 dilution is recommended |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | Used for micrococcal nuclease digestion |
| Camptothecin | Sigma-Aldrich | PHL89593 | |
| ChemiDo MP imaging system | Bio-Rad | 12003154 | |
| Disodium phosphate | Sigma-Aldrich | 5438380100 | Used to make sodium phosphate buffer |
| DNAzol | Thermo Fisher | 10503027 | |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher | R0861 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium | Sigma-Aldrich | 11965084 | |
| Ethyl alcohol, 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Etoposide | Sigma-Aldrich | 1268808 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | |
| Graphpad Prism Software | GraphStats | Prism 9.0.0 | |
| HRP-linked Mouse IgG | Cytiva | NA931 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| HRP-linked Rabbit IgG | Cytiva | NA934 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| ImageJ Software | NIH, USA | ImageJ 1.53e | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
| Maximum sensitivity ECL substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| Micrococcal nuclease | New England BioLabs | M0247S | |
| Monosodium phosphate | Sigma-Aldrich | S3139 | Used to make sodium phosphate buffer |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher | 23030 | DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor |
| Nitrocellulose membrane, 0.45 µm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Non-fat dry milk | Bio-Rad | 1706404XTU | |
| PDD00017273 | Selleckchem | S8862 | Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher | 78430 | |
| Q700 sonicator | Qsonica | Q700-110 | |
| Ready-to-assemble PVDF transfer kit | Bio-Rad | 1704274 | |
| Slot-blot apparatus | Bio-Rad | 1706542 | |
| Slot-blot filter paper | Bio-Rad | 1620161 | |
| Trans-Blot turbo transfer system | Bio-Rad | 1704150 | |
| Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | |
| Vertical electrophoresis cell | Bio-Rad | 1658004 |
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