Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidig påvisning af forskellige antistofklasser i en multiplexet serologisk test

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65323
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 3,4, 3,4, 3,4, 3, 1, 1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen, 2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch, 3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research, 4German Centre for Infection Research (DZIF)
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Et trekanals dual-reporter fluorescensflowanalysesystem blev brugt til at udvikle et perlebaseret multipleximmunoassay, der samtidig evaluerer serumprøver for IgG og IgM fremkaldt mod flere antigener af forskellige Borrelia-arter , der forårsager borreliose i Europa og Nordamerika.

Abstract

For at overvåge udviklingen af infektionssygdomme er det nyttigt at vurdere immunoreaktivitet mod forskellige antigene determinanter og måle forskellige antistofisotyper, fordi de forekommer på forskellige stadier af værtsimmunresponset. Med Lyme borreliose kan det patogene middel være et af de mange medlemmer af Borrelia-arten . Derfor kræver korrekt prøveklassificering evaluering af immunreaktiviteten mod forskellige antigener af forskellige Borrelia-arter . Derudover kan antipatogene IgG- og IgM-reaktioner have forskellige udløsningstidsforløb under sygdomsprogression. Her demonstrerer vi udviklingen af et to-reporter multiplex immunoassay, der har nytte til at identificere Borrelia-specifikt immunrespons i humane serumprøver ved samtidig at evaluere både IgG og IgM immunreaktivitet mod forskellige bakterielle antigener i samme reaktionsbrønd. Denne tilgang med to indberetninger bevarer den analytiske ydeevne af enkeltindberettermetoder, samtidig med at der spares tid og ressourcer, og kravene til stikprøvestørrelse reduceres. Denne analyse gør det muligt i det væsentlige at fordoble den serologiske information, der skal genereres fra en blodprøve på den halve tid.

Introduction

Lyme borreliosis er den mest almindelige krydsbårne infektionssygdom i moderate klimaer på den nordlige halvkugle1. Det er forårsaget af spirochete bakterier af slægten Borrelia, med fem kendte humane patogener, der varierer i geografisk fordeling2. De vigtigste patogene Borrelia-arter i Europa er B. afzelii og B. garinii, med B. burgdorferi s.s., B. spielmanii og B. bavariensis mindre hyppigt. I Nordamerika er B. burgdorferi s.s. det eneste årsagsmiddel til Lyme borreliosis 2,3. Borrelia-patogener overføres af medlemmer af flåtslægten Ixodes, med transmission, der kan forekomme inden for 24 timer efter flåtbid4.

Lyme borreliose diagnose er typisk lavet af kliniske symptomer og efterfølgende bekræftet af serologi. I både Europa og Nordamerika anbefaler diagnostiske retningslinjer en totrinstestserie bestående af et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) med en refleksimmunoblot til evaluering af antistofrespons mod Borrelia-specifikke antigener 1,5,6,7,8,9 . Denne fremgangsmåde mangler imidlertid følsomhed og er ikke optimal, især i den tidlige fase af infektionen, hvor serokonversion kan være ufuldstændig og anti-Borrelia IgG- og IgM-titere er for lave6.

Multipleximmunoassays forbedrer traditionelle immunoassays, der kun måler et mål ad gangen, og kan samtidig evaluere flere antistofisotyperesponser mod et eller flere antigener 10,11,12. Assays såsom ELISA'er er begrænset til at identificere og kvantificere en enkelt analysand pr. reaktion, i det foreliggende tilfælde enten cirkulerende IgG eller IgM induceret mod et enkelt bakterielt antigen efter infektion med Borrelia. Denne rapport illustrerer brugen af perlebaseret analytprofileringsteknologi til udvikling af et multipleximmunoassay, der samtidig detekterer både IgG- og IgM-antistoffer mod ethvert af de heri valgte Borrelia-antigener i humane serumprøver. Vi udvalgte fire antigener, der tilsammen dækker de mest almindelige patogene Borrelia-arter, der er hjemmehørende i Europa (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) og Nordamerika (B. burgdorferi s.s.) (Tabel 1) 2,3. Dette muliggør afgørende patogenidentifikation og evnen til at skelne tidlig IgM og senere, mere holdbar, IgG-immunreaktivitet i patientprøver.

Mål isotype Reporter Kanal Antigen Borrelia arter Stamme Koncentration af antigenkobling
Igm PE OspC B. Garinii 20047 5,0 μg/106 perler
IgG BV421 VlsE B. burgdorferi s.s B31 1,25 μg/106 perler
IgG BV421 DbpA B. burgdorferi s.s. ZS7 10,0 μg/106 perler
IgG BV421 DbpA B. Afzelii PKo 5,0 μg/106 perler

Tabel 1: Repræsentative Borrelia-antigener anvendt til udvikling af multiplexassay.

Vi udviklede oprindeligt et enkeltreporterimmunoassay, der detekterede enten anti-Borrelia-antigen IgG- eller IgM-antistoffer i to separate reaktioner og fusionerede derefter disse assays til et dual-reporter-multiplexassay, der måler begge antistofisotyper i den samme reaktionsblanding. Magnetiske perler kobles til et patogenmålantigen af interesse og inkuberes derefter med patientserumprøver. Det perlekoblede antigen genkendes af og fanger både cirkulerende IgG og IgM i serum, der genereres i et immunrespons mod det patogenantigen. Assay IgG versus IgM-specificitet bestemmes ved udvælgelsen af et sekundært antistof, der binder til enten IgG eller IgM, hver med et særskilt fluoroforsignal forbundet med de to sekundære antistoffer. Hvert fluorescerende signal detekteres i en af instrumentets to Reporterkanaler (dvs. dobbeltreporter), der har en anden excitationslaser og emissionsoptagelse, der er specifik for den enkelte fluorofor, der bruges til at detektere enten IgG eller IgM (her henholdsvis Brilliant Violet 421 eller phycoerythrin). Instrumentklassifikationskanalen identificerer det farvekodede farvestof, der er iboende for forskellige perlesæt. Således kan flere målantigener kobles til forskelligt farvede perler, og perlesættene blandes sammen og bruges til omfattende vurdering af forskellig antipatogen immunreaktivitet i serumprøver. Klassificeringskanalen identificerer hvert enkelt perlesæt (dvs. specifikt antigen) og måler fluorescensen forbundet med IgG eller IgM mod dette antigen. Det resulterende multiplex-assay sparer tid og ressourcer i forhold til mindre omfattende klassisk test og katalogiserer nøjagtigt borrelia-immunreaktivitet i begrænsede prøvevolumener. Mens en lignende dobbeltreportertilgang tidligere er blevet brugt til at kategorisere immunresponser i andre patologier såsom SARS-CoV-2-infektion13, beskriver denne rapport anvendelsen af multiplexfluorescerende assay-teknologi til karakterisering af immunreaktivitet i Lyme borreliose.

Protocol

Der blev modtaget en passende godkendelse fra Institutional Review Board/Ethics Committee til anvendelse af humane serumprøver i denne forsøgsserie. Prøverne blev anonymiseret restmaterialer fra en tysk national undersøgelse af SARS-CoV-2 seroprævalens14. Godkendelse til anvendelse af prøver fra mennesker blev givet af den etiske komité ved Hannover Medical School, Tyskland (9086_BO_S_2020). I alt 21 humane serumprøver blev anvendt i den aktuelle undersøgelse.

1. Etisk godkendelse af anvendelse af prøver fra mennesker

  1. Opnå passende etiske godkendelser til brug af humane prøver.

2. Reagenser og udstyr

  1. Humane serumprøver: Udfør teknisk analysevalidering og kvalitetskontrol ved hjælp af serumprøver fra personer, der tidligere er diagnosticeret med borreliose eller fra påvist Borrelia-negativ immunstatus12,14.
  2. Instrumentation med en enkelt reporter. Brug et tokanals enkeltreporterinstrument (materialetabel) til den indledende analyseudvikling og tekniske validering.
    BEMÆRK: Enkeltreportersystemet har to lasere: 1) identificerer og kvantificerer perlesætspecifik fluorescens for at skelne mellem forskellige perlesæt, hvis de anvendes (klassificeringskanal), og 2) registrerer og kvantificerer perlebundet målspecifik phycoerythrin (PE) fluorescens (Reporter Channel; 532 nm excitation, "orange" 565-585 nm emission). Således kan kun en enkelt antistofisotypeklasse (f.eks. Enten IgG eller IgM) analyseres ad gangen ved hjælp af den enkelte Reporterkanal.
    1. Udfør indledende valideringsundersøgelser for at vurdere anti-Borrelia IgG og IgM separat i et 96-brøndsformat med en enkelt reporter, der bruger PE-mærkede detektionsreagenser til begge antistofklasser.
      BEMÆRK: Det aktuelle assay evaluerer cirkulerende IgG'er, der er specifikke for Borrelia-antigen VlsE og to varianter af DbpA, og cirkulerende IgM, der er specifikke for antigen OspC, som repræsentative eksempler. Assayet kan udvides til at evaluere serumimmunreaktivitet mod andre anti-Borrelia-antigener efter ønske12.
  3. Instrumentering med dobbelt reporter. Brug et trekanals dobbeltreporterinstrument (materialetabel), der tillader samtidig IgG/IgM-analyse i samme reaktion, til udvikling og teknisk validering af det dobbelte IgM/IgG-assay (beskrevet nedenfor). Dette instrument har 3 samlede fluorescensdetekterende kanaler, hvoraf 2 er Reporterkanaler, der evaluerer målrettede Ig-associerede signaler.
    BEMÆRK: Dual-reporter-systemet har tre lasere: 1) identificerer og kvantificerer perlesætspecifik fluorescens (klassificeringskanal); 2) detekterer og kvantificerer målspecifik phycoerythrin (PE) fluorescens (Reporter Channel 1; 532 nm excitation, "orange" 565-585 nm emission) og 3) evaluerer målspecifik Brilliant Violet 421 (BV421) fluorescens af en anden målanalysand (Reporter Channel 2; 405 nm excitation, "blå" 421-441 nm emission). Dual-reporter-systemet er kompatibelt med både 96-brønds og 384-brønds mikrotiterplade (halvautomatisk håndtering) analyseformater. Det generelle analyseskema er vist i figur 1. Protokoltrinnene er beskrevet nedenfor.

3. Antigenkobling

  1. Par Borrelia-antigenerne til magnetiske, carboxylerede og fluorescerende farvekodede 6,5 μm mikrosfærer (perler; Tabel over materialer) anvendelse af 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/sulfo-N-hydroxysuccinimidkemi (sNHS).
    BEMÆRK: En detaljeret beskrivelse findes i reference11og reference12. Koblingskoncentrationen for hvert antigen findes i tabel 1. Koblede perler skal opbevares mørkt ved 4 °C indtil brug. Alle buffere, der anvendes til koblings- og detektionsreaktioner, er beskrevet i de supplerende materialer.

4. Analyseprocedure: Enkeltreporter IgG eller IgM serologisk assay: 96-brøndformat

  1. Fortynd prøven i 2 trin (2 trin, begge i plader med 96 huller; 200 gange serumprøvefortynding i analysebuffer).
    BEMÆRK: Assaybuffersammensætningen er en 1:4 blanding af Low Cross Buffer: PBS indeholdende 1% (w/v) bovint serumalbumin. Tween-20 tilsættes blandingen til en endelig koncentration på 0,05 % (v/v).
    1. Prøvefortyndingstrin 1: 5 μL af serumprøven blandes med 120 μL analysebuffer (25 gange fortynding).
    2. Prøvefortyndingstrin 2: Den 25 gange lange prøvefortynding fortyndes yderligere 8 gange ved at blande 10 μL af fortyndingen med 70 μL analysebuffer for at gøre slutprøvefortyndingen 200 gange.
  2. Fortynding af magnetisk perleblanding
    1. Forbered en perleblanding indeholdende 1,0 × 106 perler/ml pr. perlepopulation (dvs. pr. unikt målantigen).
    2. Fortynd den tilberedte perleblanding 25 gange i analysebuffer for at gøre den endelige perlekoncentration i denne fortyndede suspension nu 4 × 104 perler/ml pr. perlepopulation (dvs. pr. unikt målantigen).
  3. Serumprøveinkubation med perler
    1. Der pipetteres 25 μL fortyndet koblet multiplexperlesuspension (indeholdende 4,0 × 104 perler/sæt/ml) i tildelte huller i en 96-brønds mikrotiterplade med halvt areal (materialetabel).
    2. Der tilsættes 25 μL 200 gange fortyndet serumprøve (fra trin 4.1 ovenfor) i passende huller, der indeholder 25 μl koblet perlesuspension.
      BEMÆRK: Dette giver en yderligere 2 gange fortynding, så den endelige serumprøvefortynding i brønden er 400 gange, og det endelige perleantal er 1000 perler / perlesæt / 50 μL reaktion.
    3. Dæk 96-brønds reaktionspladen med en mikropladeforsegling (klæbefolie eller plastpladedæksler).
    4. Der inkuberes pladen i 2 timer ved 20 °C ved 750 o/min på en pladeryster.
  4. Vask af perler
    1. Fjern reaktionspladen med 96 brønde fra pladerysteren, og fjern forsigtigt klæbepladetætningen.
    2. Sæt 96-brønds reaktionspladen i en pladevasker.
    3. Puds perlerne tre gange med 100 μL vaskebuffer (1× PBS + 0,05% v/v Tween 20) ved hjælp af den automatiske magnetiske pladevasker.
  5. Opslæmm vaskede perler igen i 100 μL vaskebuffer, dæk pladen med selvklæbende folie eller plastpladedæksel, og ryst pladen på en pladeryster i 1 minut ved 20 °C ved 1000 omdr./min.
  6. Del de vaskede perler
    1. Fjern reaktionspladen med 96 brønde fra pladerysteren, og fjern forsigtigt klæbepladetætningen.
    2. Bland reaktioner ved pipettering op og ned fem gange, og overfør 50 μL af hvert 100 μL reaktionsvolumen til hver af to nye 96-brønds reaktionsplader, en plade til IgG-detektion og en til IgM-detektion.
  7. Inkubation af antistof/reagens
    BEMÆRK: På dette tidspunkt er målantigenkoblede perler blevet inkuberet med serumprøver for at ekstrahere cirkulerende antistoffer i serum (hvis de er til stede), der reagerer med antigenet / antigenerne. Reagerede perler med bundet immunglobulin er blevet opdelt i to plader, og IgG og IgM detekteres og kvantificeres nu i deres separate plader ved hjælp af isotypespecifikke sekundære antistoffer med en PE-etiket. Forskydende pladehåndtering med 20 min.
    1. Supernatanten suges op fra hullerne med magnetperler ved hjælp af magnetpladevaskeren.
    2. For hver plade fremstilles den passende Ig Detection Reagens-blanding (enten anti-IgG eller anti-IgM), der indeholder PE-konjugeret gedeanti-human IgG (3 μg/ml) eller PE-konjugeret æsel anti-human IgM (5 μg/ml) i analysebufferen. For hvert perleholdigt hul anvendes 30 μL detektionsreagens. Der skal fremstilles tilstrækkelige IgG- og IgM-detektionsreagensvolumener til reaktionsbrønde med tilstrækkeligt ekstra til at rumme pipetteringstab.
    3. Der pipetteres 30 μL IgG-detektionsreagens i hvert hul, der indeholder reagerede perler på IgG-pladen, og 96-brøndens reaktionsplade dækkes med en mikropladeforsegling.
    4. Der pipetteres 30 μL IgM-detektionsreagens i hvert hul, der indeholder reagerede perler på IgM-pladen, og 96-brøndens reaktionsplade dækkes med en mikropladeforsegling.
    5. Der inkuberes i 45 minutter ved 20 °C, mens du ryster ved 750 o/min på en pladeryster.
  8. Vask af perler
    1. Fjern reaktionspladen med 96 brønde fra pladerysteren, og fjern forsigtigt klæbepladetætningen.
    2. Sæt 96-brønds reaktionspladen i en magnetisk pladeskive.
    3. Puds perlerne tre gange med 100 μL vaskebuffer ved hjælp af magnetpladevaskeren.
  9. Opslæm perlerne igen i 100 μL vaskebuffer.
  10. Analysér resultaterne på instrumentet med en enkelt indberetter.
    1. Dæk 96-brønds reaktionspladen med en mikropladeforsegling.
    2. Reaktionspladen med 96 huller rystes i 3 minutter ved 20 °C ved 1000 o/min på en pladeryster.
    3. Overfør reaktionspladen med 96 brønde fra pladerysteren, og sæt et flowanalysatorinstrument med en enkelt reporter i (materialetabel).
    4. For hver prøve analyseres medianfluorescerende intensitet (MFI) ved hjælp af følgende instrumentindstillinger: Optag volumen = 80 μL, Antal = 50/perlepopulation, Timeout = 60s, Gating = 7.500-15.000)12,13.

5. Assayprocedure: Dual-reporter IgG og IgM serologisk assay: 96-brøndformat

  1. Prøvefortynding (2 trin, begge i plader med 96 huller; 200 gange serumprøvefortynding i analysebuffer)
    1. Prøvefortyndingstrin 1: Bland 5 μL serumprøve med 120 μL assaybuffer (25 gange fortynding).
    2. Prøvefortyndingstrin 2: De 25 gange fortyndede prøvefortyndinger fortyndes yderligere 8 gange ved at blande 10 μL af den første fortynding (25 gange fortyndet prøve fra punkt 5.1.1) med 70 μL assaybuffer (8 gange fortynding) for at opnå slutprøvefortynding til 200 gange.
  2. Fortynding af magnetisk perleblanding
    1. Forbered en perleblanding indeholdende 1,0 × 106 målantigenkoblede perler/ml pr. perlepopulation (dvs. pr. unikt målantigen).
      BEMÆRK: I denne eksperimentelle serie evaluerede vi både IgG- og IgM-immunreaktivitet mod fire unikke Borrelia-antigener i hver reaktion.
    2. Fortynd den tilberedte perleblanding 50 gange i analysebuffer. Perlekoncentrationen i denne fortyndede suspension er nu 2,0 × 104 perler/ml pr. perlepopulation.
      BEMÆRK: Antallet af perler i duplex-assayreaktionen halveres fra det, der anvendes i enkeltreporterreaktionen for at muliggøre direkte sammenlignelighed mellem de to assays og for at spare ressourcer, efter at foreløbige undersøgelser bekræftede, at fluorescenssignalet blev opretholdt inden for det lineære kvantificeringsområde, når der blev brugt halvdelen af antallet af perler.
  3. Serumprøveinkubation med perler
    1. Der pipetteres 25 μL fortyndet antigenkoblet målperlesuspension (indeholdende 2,0 × 104 perler/sæt/ml) i forud tildelte huller i en mikrotiterplade med 96 huller med halvt areal. Det nøjagtige antal reaktionsbrønde og deres placering på pladen afhænger af det operatørbestemte samlede antal testede prøver, og om der køres enkelt- eller replikate brønde pr. prøve.
      BEMÆRK: De antigenkoblede magnetiske perler vil blive reageret med humane serumprøver. Både anti-Borrelia antigen immunoreaktivt IgG og IgM, hvis de er til stede i prøver, vil binde til og blive immobiliseret på de samme antigenkoblede perler. Sekundær antistofkvantificering af bundet IgG og IgM vil derefter blive udført på de samme perler i de samme reaktioner ved hjælp af forskellige fluoroforer til IgG- og IgM-identifikation, der tillader deres differentiering.
    2. Der tilsættes 25 μL 200 gange fortyndet serum (fra trin 5.1 ovenfor) i hvert hul, der indeholder 25 μL blandet målantigenkoblet perlesuspension (trin 5.2).
      BEMÆRK: Dette giver en yderligere 2 gange fortynding, så den endelige serumprøvefortynding i brønden er 400 gange, og det endelige perleantal er 500 perler / perlesæt / 50 μL reaktion.
    3. Dæk 96-brønds reaktionspladen med en mikropladeforsegling (klæbefolie eller plastpladedæksel).
    4. Pladerne inkuberes med perler i 2 timer ved 20 °C ved 750 o/min på en pladeryster.
  4. Perlevask (for at fjerne overskydende serumprøve)
    1. Fjern 96-brøndens reaktionspladen fra pladerysteren, og fjern klæbepladeforseglingen.
    2. Sæt 96-brønds reaktionspladen i en magnetisk pladeskive.
    3. Puds perlerne tre gange med 100 μL vaskebuffer ved hjælp af magnetpladevaskeren.
  5. Opsug det endelige vaskevolumen fra perler efter det sidste vasketrin.
  6. Detektionsantistof (Inkubation - Del I)
    1. Lav frisk IgG og IgM Dual Detection Reagens indeholdende biotinyleret ged anti-human IgG (1 μg / ml) sammen med PE-konjugeret æsel anti-human IgM (5 μg / ml) i assaybuffer. For hvert perleholdigt hul anvendes 30 μL Dual Detection Reagens. Der skal fremstilles tilstrækkelige IgG- og IgM-reagensvolumener med dobbelt detektion til reaktionsbrønde med tilstrækkeligt ekstra til at rumme pipetteringstab.
    2. Der pipetteres 30 μL IgG og IgM Dual Detection Reagens i hvert tildelt hul, og reaktionspladen med 96 brønde dækkes med en mikropladeforsegling.
    3. Pladen inkuberes i 45 minutter ved 20 °C, mens den rystes ved 750 o/min på en pladeryster.
  7. Perlevask (for at fjerne overskydende detektionsantistoffer)
    1. Fjern reaktionspladen med 96 brønde fra pladerysteren, og fjern forsigtigt klæbepladetætningen.
    2. Sæt 96-brønds reaktionspladen i en automatiseret magnetisk pladevasker.
    3. Vask perlerne tre gange med 100 μL vaskebuffer ved hjælp af den automatiske magnetiske pladevasker.
  8. Opsug det endelige vaskevolumen fra perler efter det sidste vasketrin.
  9. Streptavidin-konjugeret reporter (Inkubation - Del II)
    1. Fortynd frisk BV421-mærket streptavidin i analysebuffer til en koncentration på 0,2 μg / ml. For hver perleholdig brønd anvendes 30 μL BV421-mærket Streptavidin. Forbered tilstrækkeligt BV421-mærket streptavidinvolumen til reaktionsbrønde med tilstrækkeligt ekstra til at rumme pipetteringstab.
    2. Der pipetteres 30 μL fortyndet BV421-streptavidin i hvert reaktionshul, og 96wells reaktionspladen dækkes med mikropladeforseglingen.
    3. Pladen inkuberes i 30 minutter ved 20 °C, mens den rystes ved 750 o/min på en pladeryster.
  10. Vask perler (for at fjerne overskydende BV421-Streptavidin)
    1. Fjern reaktionspladen med 96 brønde fra pladerysteren, og fjern forsigtigt klæbepladetætningen.
    2. Sæt 96-brønds reaktionspladen i magnetpladeskiven.
    3. Vask perlerne tre gange med 100 μL vaskebuffer ved hjælp af den automatiske magnetiske pladevasker.
  11. Resuspender perler i hullerne til et slutvolumen på 100 μL i vaskebuffer.
  12. Analysér resultater på instrumentet med dobbelt indberetning
    1. Dæk 96-brønds reaktionspladen med en mikropladeforsegling.
    2. Reaktionspladen med 96 huller inkuberes i 3 minutter ved 20 °C ved 1000 o/min på en pladeryster.
    3. Overfør 96-brønds reaktionspladen fra pladerysteren til dual-reporter-flowanalysatorinstrumentet (materialetabel).
    4. Evaluer prøvens mediane fluorescerende intensitet (MFI) i henhold til producentens instruktioner (Instrumentindstillinger: Dual-Reporter Mode, Optagelsesvolumen = 80 μL, Antal = 50/perlepopulation, Timeout = 60s, Gating = 7.500-15.000).

6. Dobbelt reporter IgG og IgM serologisk analyse: 384-brønd halvautomatisk format

  1. Udfør dual-reporter-analysen i 384-brønds pladeformat ved hjælp af analysetrinnene beskrevet i afsnit 5, men behandl prøver ved hjælp af en pipetteringsrobot og automatiseret magnetisk pladevasker (materialetabel). I 384-brøndformat rystes pladerne under inkubationer og vask ved 1450 omdr./min., og inden måling af fluorescens rystes pladen i 5 minutter ved 21 °C og 1800 omdr./min.

Representative Results

Eksperimentel oversigt
De generelle ordninger for Borrelia-assays baseret på enkeltindberetter og dobbeltindberetterperler er vist i figur 1. For enkelte antistofmål (dvs. IgG eller IgM) genereret mod et givet Borrelia-antigen blev begge antistofklasser evalueret uafhængigt i humane serumprøver ved anvendelse af et PE-konjugeret antiisotypeantistof til rapportering. Til dual-reporter-analysen med samtidig analyse af både IgG- og IgM-immunreaktivitet anvendte Borrelia-antigenspecifik IgG-detektion et biotinyleret anti-humant IgG + BV421-mærket Streptavidin (blå fluorescens) reportersystem, samtidig med at den PE-konjugerede reporter (orange fluorescens) blev bevaret til IgM-detektion. Arbejdsgangen for dual-reporter-assayet svarer til enkeltreporter-assayet, med undtagelse af en yderligere 30-minutters detektionssysteminkubation med andenkanals fluorescensdetektionsreagens BV421-Streptavidin.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over de enkeltindberetter- og dobbeltreporterperlebaserede Borrelia-assays . (A) Enkeltreporterinstrumentet blev brugt til at udvikle og oprindeligt validere det perlebaserede assay, der karakteriserede enten anti-Borrelia IgG eller IgM individuelt, begge ved hjælp af en phycoerythritin (PE) fluorescerende reporteretiket, der udsender signal i de "orange" spektre. Ethvert ønsket Borrelia-antigen kan kobles til perlerne og anvendes til at fange og kvantificere enten IgG eller IgM, der er til stede i serumprøver. To separate immunoassays er nødvendige for at evaluere både IgG og IgM reaktivitet mod et givet antigen. B) Systemet med to indberetninger tillod samtidig analyse af serumprøver for både IgG- og IgM-antistoffer mod ethvert individuelt Borrelia-antigen i samme hul. Denne tilgang bruger det samme PE-konjugerede detektionsantistof til at målrette anti-Borrelia IgM, men erstatter IgG-detektionen fra et PE-baseret system til at bruge et biotinyleret primært detektionsantistof og BV421-mærket Streptavidin (en "blå" emitter), der har brug for et yderligere detektionssysteminkubationstrin på 30 minutter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Præcision inden for assay
Spearman-korrelationsanalyse for tre repræsentative Borrelia-antigener (figur 2) viste ensartet reproducerbarhed af MFI-værdier ved påvisning af anti-Borrelia-antistoffer til stede i humant sera.

Figure 2
Figur 2: Intra-assay Præcision af dual-reporter perlebaseret Borrelia-assay . Spearmans korrelationsanalyse viste en høj intra-assay-præcision af dual-reporter-assayet, når et PE-detektionssystem blev brugt til at detektere Borrelia-specifikke IgM-antistoffer (A), og et BV421-detektionssystem blev brugt til at detektere Borrelia-specifikke IgG-antistoffer (B, C). I alt 21 serumprøver blev analyseret i to eksemplarer ved hjælp af en semiautomatiseret procedure. I hver graf blev MFI-signaler plottet mod hinanden og analyseret ved lineær regression. En lineær kurve (x = y) vist som en rød stiplet linje angiver identiske MFI-signaler til detektionssystemer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Præcision mellem analyser
Der blev observeret god assay-til-assay-reproducerbarhed med dual-reporter-assayet. Levey-Jennings-diagrammer (figur 3) med MFI-værdier for en kvalitetskontrolprøve målt over syv uafhængige kørsler viste den høje inter-assay-præcision for alle repræsentative antigener. Den gennemsnitlige procentvise variationskoefficient (CV% = standardafvigelse/gennemsnit × 100) for de fire repræsentative Borrelia-antigener var 5,3 %.

Fortynding linearitet
Fordi det oprindelige enkeltreporterassay og det nye dual-reporter-assay anvender forskellige flowcytometriske platforme, sammenlignede vi medianfluorescensoutput af det samme antigenimmunoassay mellem de to flowcytometriinstrumenter (figur 4). Prøvefortyndingsserier tilvejebragte lineære fortyndingskurver til både IgM- og IgG-evaluering med god parallelitet mellem dosisrespons mellem instrumenter gennem hele det evaluerede fortyndingsområde (1:100-1:12.800).

Figure 3
Figur 3: Inter-assay præcision af dual-reporter perlebaseret Borrelia assay. Til evaluering af inter-assay-præcisionen blev Borrelia-specifik IgM (A) og IgG (B-D) antistofrespons af en kvalitetskontrolprøve analyseret over syv uafhængige kørsler i dobbeltbrønde hver gang. Assays blev udført manuelt. MFI-værdier blev plottet i et Levey-Jennings-diagram. En grøn linje angiver middelværdien af alle værdier. To røde stiplede linjer angiver toleranceområdet for inter-assay-præcisionen. Dette blev beregnet ud fra middelværdien ± 2,5 gange standardafvigelsen (2,5 S.D.). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Fortyndingslinearitet af det dobbeltreporterperlebaserede Borrelia-assay . Ved prøvefortyndinger på 100 gange til 12 800 gange var fortyndingskurverne for både IgM-detektion (A) og IgG-detektion (B) ens, når de blev udført manuelt med enkeltreporterinstrumentet og dobbeltreporterinstrumentet. Ved alle testede fortyndinger var MFI-værdierne lidt højere ved hjælp af enkeltreporterinstrumentet (røde symboler) end dobbeltreporterinstrumentet (blå symboler). Der vises fortyndingskurver for 2 repræsentative antigener, hvor hvert fortyndingspunkt repræsenterer gennemsnittet af tredobbelte brønde med standardafvigelse (SD *) angivet med fejlbjælker. Bemærk: Små SD'er er ikke synlige i denne skala. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende materialer. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne rapport fremhæver udviklingen af et to-reporter perlebaseret Borrelia-immunoassay, der reproducerbart og følsomt bestemmer anti-Borrelia-immunreaktivitet i serumprøver12. De forskellige patogene Borrelia-arter, der forårsager borreliose, kan differentieres ved variantspecifik antigenheterogenitet 6,7,8,9. Det multipleksede assay evaluerer samtidig IgG- og IgM-medieret anti-Borrelia-immunreaktivitet inden for den samme reaktionsbrønd og bevarer derved reagenser, arbejdskraft og prøvemateriale, der ellers er nødvendigt for at udføre to enkeltplex-assays separat. Sammenligning af IgM- og IgG-responser over tid kan muliggøre bedre sporing af sygdomsprogression, da IgM-til-IgG-serokonversion opstår efter infektion6.

Dual-reporter-systemet bruger to forskellige detektionsantistofsystemer13,15. Relaterede eksperimenter viste ingen signifikant påviselig krydsreaktivitet mellem Borrelia anti-IgM og anti-IgG detektionssystemer, når begge antistofklasser blev analyseret sammen i samme reaktionsbrønd12. I betragtning af den lavere bindingsaffinitet af IgM versus IgG-antistoffer16,17 valgte vi et PE-konjugeret detektionsantistof til IgM-detektion (den første reporterkanal i dobbeltreporterinstrumentet), fordi PE er en af de stærkest emitterende fluoroforer, der rutinemæssigt anvendes i immunoassays18. Til IgG-evaluering brugte vi et biotinyleret detektionsantistof, der efterfølgende blev belyst med BV421-konjugeret streptavidin (instrumentets anden reporterkanal)19. På trods af det ekstra inkubationstrin på 30 minutter sammenlignet med enkeltreportersystemet giver dobbeltreportersystemet dobbelt så mange oplysninger pr. reaktion. Samlet set kræver multiplexanalysen med dobbelt reporter mindre kumulativ tid og materialeinput end at køre to enkeltreporteranalyser.

Den stærke ydeevne og stabilitet af det multipleksede Borrelia-assay blev eksemplificeret ved høj reproducerbarhed i præcisionsundersøgelser inden for og mellem assay og ved påvisning af fortyndingslinearitet og fortyndingsparallelisme over en lang række prøvekoncentrationer til både IgG- og IgM-vurdering. Vi observerede højere absolutte fluorescensemissionsniveauer for de samme fluoroforer ved hjælp af enkeltkanalinstrumentet versus dobbeltkanalsystemet (≈1,7× højere med PE), hvilket kan tilskrives forskelle i optik og kalibreringsindstillinger mellem de to instrumenter (figur 4). Ikke desto mindre forblev fluorescensemissionskurverne med begge fluoroforer inden for det lineære område for begge instrumenter ved høje og lave prøvefortyndingsekstremer, og eventuelle uoverensstemmelser i den absolutte fluorescens, der blev målt, påvirkede ikke klassificeringen af Borrelia-eksponeringsstatus . 12

En stor fordel ved dette perlebaserede Borrelia-multiplexassay er, at analysen let kan modificeres eller udvides til at evaluere forskellige eller yderligere analysander, f.eks. til påvisning af antistoffer mod antigener fra yderligere Borrelia-arter . xMAP magnetiske perlesæt indeholder forskellige farvekombinationer, der kan skelnes i instrumentets klassificeringskanal og teoretisk kan implementeres i multiplexassays, der samtidig kan evaluere op til 500 unikke analysander inden for samme prøve. Mens den aktuelle undersøgelse fremhæver fire repræsentative Borrelia-antigener for at demonstrere analysefunktionalitet og stabilitet og for at sammenligne enkelt- og dobbeltrapporteringssystemet, undersøger det endelige assay otte antigener, der tilsammen kan identificere alle fem klinisk relevante Borrelia-patogener , der cirkulerer i hele Europa og Nordamerika12.

Høj kapacitet er mulig ved hjælp af standard 384-brønds mikrotiterplader i et halvautomatisk analyseformat. Assay og instrumentkompatibilitet med både 96- og 384-brøndplader gør det muligt at bruge Borrelia multiplex-analysen som et effektivt screeningsværktøj til hurtig analyse af store prøvesæt, såsom nationale undersøgelser20. Manuel udførelse af analysen er fortsat mulig for mindre prøvesæt, der bruger mindre plader med 96 brønde.

Studiets begrænsninger omfatter kun sammenlignende evaluering af nogle få Borrelia-immunreaktivitetsmål i et lille antal humane serumprøver. Den oprindelige undersøgelse bekræftede imidlertid, at analyseydelsen for både IgG og IgM blev opretholdt ved analyse af otte antigener fra alle fem kendte Borrelia-arter inden for et større prøvesæt12. Desuden kan dobbeltreporterinstrumentet kun vurdere to antistofisotyper samtidigt inden for hver reaktion, så fuldstændig isotypeprofilering ville nødvendiggøre udførelse af yderligere assayreaktioner13.

Afslutningsvis beskriver denne rapport den vellykkede fusion og omdannelse af perlebaserede enkeltreporterimmunoassays til dual-reporter-assays, der samtidig kan evaluere patogene Borrelia-specifikke IgG- og IgM-antistoffer i humane serumprøver. Denne kombinerede tilgang sparer samlet tid, materiale og arbejdsinput for at generere den samme datamængde som to uafhængige enkeltreporteranalyser. Multiplexanalysen kan skaleres fra 96-brønds til 384-brønds mikrotiterpladeformat og kan halvautomatiseres ved hjælp af robotplade- og væskehåndteringsinstrumentering, hvilket gør den velegnet til applikationer med høj kapacitet såsom store befolkningsundersøgelser. Perlebaserede dual-reporter-assaysystemer har tidligere vist nytte til evaluering af for eksempel immunresponser på andre virale og bakterielle patogener13,21, vurdering af allogene antistofresponser mod HLA-epitoper i organtransplantation22 og undersøgelse af mekanismer for autoimmun sygdom23. Den aktuelle rapport beskriver brugen af multiplexteknologi til at identificere eksponering for Borrelia-patogener, der forårsager borreliose, som et eksempel på, hvordan laboratorier kan tilpasse denne tilgang til at udforske komplekse immunmekanismer i forskellige patologier.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne rapport blev finansieret af Luminex (Austin, TX). Forfatterne takker Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) for analytisk og videnskabelig redigeringsassistance. Forfatterne takker også Harald Klein og Christoph von Eichel-Streiber fra tgcBIOMICS GmbH (Bingen, Tyskland) for at levere Borrelia-antigenerne , der blev brugt i undersøgelsen. Humane serumprøver til teknisk assayvalidering og kvalitetskontrol blev opnået fra: 1) Multilocal and Serial Prevalence Study on Antibodies against SARS-CoV-2 i Tyskland via Department of Epidemiology, Helmholtz Center for Infection Research, Braunschweig, Tyskland; og 2)neurologisk afdeling, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Tyskland). Godkendelse til anvendelse af prøver fra mennesker blev givet af den etiske komité ved Hannover Medical School, Tyskland (9086_BO_S_2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies and Detection Reagents Source Catalog Number
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Jackson ImmunoResearch (Dianova) 109-066-098 
Brilliant Violet 421-Streptavidin BD Biosciences 563259
Donkey Anti-Human IgM  Jackson ImmunoResearch (Dianova) 709-116-073
Borrelia Antigens tgcBIOMICS (Bingen, Germany)
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific Pierce 77149 ProteoChem (100 mg)
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
BSA Carl Roth T844.3
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) Carl Roth 4256.2
Na2HPO4 Carl Roth 4984.1
ProClin300 Sigma 48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Scientific Pierce 24510 (500 mg)
Triton X-100 Thermo Scientific 85111
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies Source
384-well plate Corning, Cat# 3570
96-well deep-well plates ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-well half-area plates  Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
BioTek MultiFlo FX Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates)  ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp., Austin, TX
SmartBlock Plates Eppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer C Eppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTop Eppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stanek, G., Strle, F. Lyme borreliosis-from tick bite to diagnosis and treatment. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 233-258 (2018).
  2. Stanek, G., Wormser, G. P., Gray, J., Strle, F. Lyme borreliosis. The Lancet. 379 (9814), 461-473 (2012).
  3. Rizzoli, A., et al. Lyme borreliosis in Europe. Eurosurveillance. 16 (27), 19906 (2011).
  4. Cook, M. J. Lyme borreliosis: a review of data on transmission time after tick attachment. International Journal of General Medicine. 8, 1-8 (2015).
  5. Strle, F., Stanek, G. Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme Borreliosis. Lyme Borreliosis: Biological and Clinical Aspects. Lipsker, D., Jaulhac, B. , Karger. 51-110 (2009).
  6. Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 49 (1), 13-21 (2007).
  7. Dessau, R. B., et al. To test or not to test? Laboratory support for the diagnosis of Lyme borreliosis: a position paper of ESGBOR, the ESCMID study group for Lyme borreliosis. Clinical Microbiology and Infection. 24 (2), 118-124 (2018).
  8. Eldin, C., et al. Review of European and American guidelines for the diagnosis of Lyme borreliosis. Médecine et Maladies Infectieuses. 49 (2), 121-132 (2019).
  9. Lantos, P. M., et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America (IDSA), American Academy of Neurology (AAN), and American College of Rheumatology (ACR): 2020 Guidelines for the Prevention, Diagnosis and Treatment of Lyme Disease. Clinical Infectious Diseases. 72 (1), e1-e48 (2021).
  10. Gerritzen, A., Brandt, S. Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology. Methods. 56 (4), 477-483 (2012).
  11. Embers, M. E., et al. Five-antigen fluorescent bead-based assay for diagnosis of Lyme disease. Clinical Vaccine Immunology. 23 (4), 294-303 (2016).
  12. Häring, J., et al. Borrelia multiplex: a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of Borrelia specific IgG/IgM class antibodies. BMC Infectious Diseases. 22 (1), 859 (2022).
  13. Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  14. Gornyk, D., et al. SARS-CoV-2 Seroprevalence in Germany. Deutsches Ärzteblatt International. 118 (48), 824-831 (2021).
  15. Luminex Corporation. xMAP Cookbook. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. , 5th ed, https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrer=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. Racine, R., Winslow, G. M. IgM in microbial infections: Taken for granted. Immunology Letters. 125 (2), 79-85 (2009).
  17. Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).
  18. Kovaleski, G., et al. Extraction and purification of phycobiliproteins from algae and their applications. Frontiers in Chemistry. 10, 1065355 (2022).
  19. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).
  20. Coors, A., et al. Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany. Parasites & Vectors. 15 (1), 241 (2022).
  21. Gürsoy, M., et al. Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn's Disease. International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385 (2023).
  22. Argani, H. Anti-HLA Antibody: The role of epitopes in organ transplantation. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (Suppl 1), 38-42 (2019).
  23. Laman, J. D., Huizinga, R., Boons, G. J., Jacobs, B. C. Guillain-Barré syndrome: expanding the concept of molecular mimicry. Trends in Immunology. 43 (4), 296-308 (2022).

Tags

Samtidig påvisning antistofklasser multiplexet serologisk test immunoreaktivitet antigene determinanter antistofisotyper borreliose borrelia-arter prøveklassificering immunoreaktivitet mod forskellige antigener antipatogen IgG IgM-responser sygdomsprogression to-reporter multipleximmunoassay Borrelia-specifikt immunrespons humane serumprøver bakterielle antigener dobbeltreportertilgang analytisk ydeevne tids- og ressourcebevarelse prøvestørrelse Krav

Erratum

Formal Correction: Erratum: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test
Posted by JoVE Editors on 08/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. The Authors section was updated to correct an Affiliation. It was updated from:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute, University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

to:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

Samtidig påvisning af forskellige antistofklasser i en multiplexet serologisk test
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Häring, J., Michel, T., Becker, … More

Häring, J., Michel, T., Becker, M., Junker, D., Tchitchagua, T., Leschnik, O., Lange, B., Castell, S., Krause, G., Strengert, M., Dulovic, A., Schneiderhan-Marra, N. Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. J. Vis. Exp. (197), e65323, doi:10.3791/65323 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter