Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

एक मल्टीप्लेक्स्ड सीरोलॉजिकल टेस्ट में विभिन्न एंटीबॉडी वर्गों का एक साथ पता लगाना

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65323
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 3,4, 3,4, 3,4, 3, 1, 1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen, 2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch, 3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research, 4German Centre for Infection Research (DZIF)
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

एक तीन-चैनल दोहरे रिपोर्टर प्रतिदीप्ति प्रवाह विश्लेषण प्रणाली का उपयोग मनका-आधारित मल्टीप्लेक्स इम्यूनोसे विकसित करने के लिए किया गया था जो एक साथ आईजीजी और आईजीएम के लिए सीरम नमूनों का मूल्यांकन करता है जो विभिन्न बोरेलिया प्रजातियों के कई एंटीजन के खिलाफ प्राप्त होता है जो यूरोप और उत्तरी अमेरिका में लाइम बोरेलीओसिस का कारण बनता है।

Abstract

संक्रामक रोगों की प्रगति की निगरानी करने के लिए, विभिन्न एंटीजेनिक निर्धारकों के खिलाफ इम्यूनोरिएक्टिविटी का आकलन करना और विभिन्न एंटीबॉडी आइसोटाइप को मापना उपयोगी है क्योंकि वे मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विभिन्न चरणों में दिखाई देते हैं। लाइम बोरेलीओसिस के साथ, रोगजनक एजेंट बोरेलिया प्रजातियों के कई सदस्यों में से एक हो सकता है। इसलिए, सही नमूना वर्गीकरण के लिए विभिन्न बोरेलिया प्रजातियों के विभिन्न एंटीजन के खिलाफ इम्यूनोरिएक्टिविटी का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, रोगज़नक़ विरोधी आईजीजी और आईजीएम प्रतिक्रियाओं में रोग की प्रगति के दौरान अलग-अलग उन्मूलन समय पाठ्यक्रम हो सकते हैं। यहां हम एक दो-रिपोर्टर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोसे के विकास को प्रदर्शित करते हैं जो एक ही प्रतिक्रिया में विभिन्न जीवाणु एंटीजन के खिलाफ आईजीजी और आईजीएम इम्यूनोरिएक्टिविटी दोनों का मूल्यांकन करके मानव सीरम नमूनों में बोरेलिया-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की पहचान करने में उपयोगिता है। यह दोहरी-रिपोर्टर दृष्टिकोण समय और संसाधनों के संरक्षण और नमूना आकार की आवश्यकताओं को कम करते हुए एकल-रिपोर्टर विधियों के विश्लेषणात्मक प्रदर्शन को बरकरार रखता है। यह परख अनिवार्य रूप से आधे समय में रक्त के नमूने से उत्पन्न होने वाली सीरोलॉजिकल जानकारी को दोगुना करने की अनुमति देता है।

Introduction

लाइम बोरेलीओसिस उत्तरी गोलार्ध 1 के मध्यम जलवायु में सबसे आम टिक-जनित संक्रामक रोगहै। यह जीनस बोरेलिया के स्पाइरोचेट बैक्टीरिया के कारण होता है, जिसमें पांच ज्ञात मानव रोगजनकों होते हैं जो भौगोलिक वितरण2 में भिन्न होते हैं। यूरोप में मुख्य रोगजनक बोरेलिया प्रजातियां हैं बी. अफजेली तथा बी. गारिनी, साथ ही बी. बर्गडोरफेरी एस.एस., बी. स्पीलमानी तथा बी. बवेरेंसिस कम बार फंसाया जाता है। उत्तरी अमेरिका में, B. burgdorferi s.s. लाइम बोरेलीओसिस 2,3 का एकमात्र प्रेरक एजेंट है। बोरेलिया रोगजनकों को टिक जीनस Ixodes के सदस्यों द्वारा प्रेषित किया जाता है, जिसमें टिक काटने के 24 घंटों के भीतर संचरण होता है4.

लाइम बोरेलीओसिस निदान आमतौर पर नैदानिक लक्षणों द्वारा किया जाता है और बाद में सीरोलॉजी द्वारा पुष्टि की जाती है। यूरोप और उत्तरी अमेरिका दोनों में, नैदानिक दिशानिर्देश एक दो-चरणीय परीक्षण श्रृंखला की सिफारिश करते हैं जिसमें एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) शामिल है, जिसमें बोरेलिया विशिष्ट एंटीजन 1,5,6,7,8,9 के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एक रिफ्लेक्स इम्यूनोब्लॉट है . हालांकि, इस दृष्टिकोण में संवेदनशीलता का अभाव है और यह उप-इष्टतम है, विशेष रूप से संक्रमण के शुरुआती चरण में जब सेरोकोनवर्जन अधूरा हो सकता है और एंटी-बोरेलिया आईजीजी और आईजीएम टाइटर्स बहुत कम हैं6.

मल्टीप्लेक्स इम्यूनोएसे पारंपरिक इम्यूनोसे पर सुधार करते हैं जो एक समय में केवल एक लक्ष्य को मापते हैं, और एक साथ एक या अधिक एंटीजन10,11,12के खिलाफ कई एंटीबॉडी आइसोटाइप प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन कर सकते हैं। एलिसा जैसे परख प्रति प्रतिक्रिया एक एकल विश्लेषण की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने तक सीमित हैं, वर्तमान मामले में या तो आईजीजी या आईजीएम को बोरेलिया के संक्रमण के बाद एक एकल जीवाणु प्रतिजन के खिलाफ प्रेरित किया जाता है। यह रिपोर्ट एक मल्टीप्लेक्स इम्यूनोसे के विकास के लिए मनका-आधारित विश्लेषण प्रोफाइलिंग तकनीक का उपयोग करके दिखाती है जो एक साथ मानव सीरम नमूनों में यहां चुने गए बोरेलिया एंटीजन में से किसी के खिलाफ आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी दोनों का पता लगाती है। हमने चार एंटीजन का चयन किया जो एक साथ यूरोप में मूल निवासी सबसे आम रोगजनक बोरेलिया प्रजातियों को कवर करते हैं (बी। गारिनी, बी. अफजेली, बी. बर्गडोरफेरी एस.एस.) और उत्तरी अमेरिका (बी। (तालिका 1) 2,3. यह निर्णायक रोगज़नक़ पहचान और रोगी के नमूनों में प्रारंभिक आईजीएम और बाद में, अधिक टिकाऊ, आईजीजी इम्यूनोरिएक्टिविटी को समझने की क्षमता की अनुमति देता है।

लक्ष्य आइसोटाइप रिपोर्टर चैनल प्रतिजन बोरेलिया प्रजाति मोच एंटीजन युग्मन एकाग्रता
आईजीएम शारीरिक शिक्षा ओएसपीसी B. गरिनि 20047 5.0 μg/106 मोती
आईजीजी बीवी421 वीएलएसई B. बर्गडोरफेरी एस.एस बी31 1.25 μg/106 मोती
आईजीजी बीवी421 डीबीपीए B. बर्गडोरफेरी एस.एस. जेडएस7 10.0 μg/106 मोती
आईजीजी बीवी421 डीबीपीए B. अफजेली पीकेओ 5.0 μg/106 मोती

तालिका 1: मल्टीप्लेक्स परख विकास के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिनिधि बोरेलिया एंटीजन।

हमने शुरू में एक एकल-रिपोर्टर इम्यूनोसे विकसित किया जिसने दो अलग-अलग प्रतिक्रियाओं में एंटी-बोरेलिया एंटीजन आईजीजी या आईजीएम एंटीबॉडी का पता लगाया और फिर इन परखों को एक दोहरे रिपोर्टर मल्टीप्लेक्स परख में विलय कर दिया जो एक ही प्रतिक्रिया मिश्रण में दोनों एंटीबॉडी आइसोटाइप को मापता है। चुंबकीय मोती ब्याज की एक रोगज़नक़ लक्ष्य प्रतिजन करने के लिए युग्मित कर रहे हैं, और फिर रोगी सीरम नमूने के साथ ऊष्मायन कर रहे हैं. मनका-युग्मित एंटीजन द्वारा पहचाना जाता है, और कैप्चर करता है, दोनों सीरम में आईजीजी और आईजीएम को प्रसारित करते हैं जो उस रोगज़नक़ एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में उत्पन्न होता है। परख आईजीजी बनाम आईजीएम विशिष्टता एक माध्यमिक एंटीबॉडी के चयन से निर्धारित होती है जो आईजीजी या आईजीएम को बांधती है, प्रत्येक दो माध्यमिक एंटीबॉडी से जुड़े एक अलग फ्लोरोफोर सिग्नल के साथ। प्रत्येक फ्लोरोसेंट सिग्नल का पता उपकरण के दो रिपोर्टर चैनलों (यानी, दोहरे रिपोर्टर) में से एक में लगाया जाता है, जिसमें आईजीजी या आईजीएम (यहां ब्रिलियंट वायलेट 421 या फाइकोएरिथ्रिन क्रमशः) का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एकल फ्लोरोफोर के लिए एक अलग उत्तेजना लेजर और उत्सर्जन कैप्चर विशिष्ट होता है। साधन वर्गीकरण चैनल रंग-कोडित डाई की पहचान करता है जो विभिन्न मनका सेट में निहित है। इस प्रकार, कई लक्ष्य एंटीजन को अलग-अलग रंगे मोतियों के साथ जोड़ा जा सकता है, और मनका सेट एक साथ मिश्रित होते हैं और सीरम नमूनों में विविध एंटी-रोगज़नक़ इम्यूनोरिएक्टिविटी का व्यापक आकलन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। वर्गीकरण चैनल प्रत्येक व्यक्ति मनका सेट (यानी, विशिष्ट प्रतिजन) की पहचान करता है और उस प्रतिजन के खिलाफ आईजीजी या आईजीएम से जुड़े प्रतिदीप्ति को मापता है। परिणामी मल्टीप्लेक्स परख कम व्यापक शास्त्रीय परीक्षण बनाम समय और संसाधनों को बचाता है और सीमित नमूना संस्करणों में लाइम इम्यूनोएक्टिविटी को सटीक रूप से सूचीबद्ध करता है। जबकि एक समान दोहरे रिपोर्टर दृष्टिकोण का उपयोग पहले SARS-CoV-2 संक्रमण13 जैसे अन्य विकृति में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को वर्गीकृत करने के लिए किया गया है, इस रिपोर्ट में लाइम बोरेलीओसिस में इम्यूनोरिएक्टिविटी को चिह्नित करने के लिए मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट परख तकनीक के अनुप्रयोग का विवरण दिया गया है।

Protocol

इस प्रायोगिक श्रृंखला में मानव सीरम नमूनों के उपयोग के लिए उपयुक्त संस्थागत समीक्षा बोर्ड/आचार समिति का अनुमोदन प्राप्त हुआ था। नमूने SARS-CoV-2 सेरोप्रेवलेंस14 के एक जर्मन राष्ट्रीय अध्ययन से अवशिष्ट सामग्री को अज्ञात किया गया था। मानव नमूनों के उपयोग के लिए अनुमोदन हनोवर मेडिकल स्कूल, जर्मनी (9086_BO_S_2020) की आचार समिति द्वारा प्रदान किया गया था। वर्तमान अध्ययन में कुल 21 मानव सीरम नमूनों का उपयोग किया गया था।

1. मानव नमूनों के उपयोग के लिए नैतिक अनुमोदन

  1. मानव नमूनों के उपयोग के लिए उपयुक्त नैतिक अनुमोदन प्राप्त करें।

2. अभिकर्मकों और उपकरण

  1. मानव सीरम नमूने: पहले लाइम बोरेलीओसिस के साथ या प्रदर्शित बोरेलिया-नकारात्मक प्रतिरक्षा स्थिति12,14 से निदान व्यक्तियों से सीरम नमूनों का उपयोग करके तकनीकी परख सत्यापन और गुणवत्ता नियंत्रण करें।
  2. सिंगल-रिपोर्टर इंस्ट्रूमेंटेशन। प्रारंभिक परख विकास और तकनीकी सत्यापन के लिए एक दो चैनल एकल रिपोर्टर साधन (सामग्री की तालिका) का प्रयोग करें.
    नोट: एकल रिपोर्टर प्रणाली दो लेज़रों है: 1) की पहचान करता है और मनका सेट विशिष्ट प्रतिदीप्ति अलग मनका सेट भेदभाव करने के लिए, अगर इस्तेमाल किया (वर्गीकरण चैनल), और 2) का पता लगाता है और मनका बाध्य लक्ष्य विशिष्ट phycoerythrin मात्रा (पीई) प्रतिदीप्ति (रिपोर्टर चैनल; 532 एनएम उत्तेजना, "नारंगी" 565-585 एनएम उत्सर्जन). इस प्रकार, एकल रिपोर्टर चैनल का उपयोग करके एक समय में केवल एक एंटीबॉडी आइसोटाइप वर्ग (जैसे, आईजीजी या आईजीएम) का विश्लेषण किया जा सकता है।
    1. एंटी-बोरेलिया आईजीजी और आईजीएम का अलग-अलग आकलन करने के लिए प्रारंभिक सत्यापन अध्ययन करें, एकल-रिपोर्टर 96-अच्छी तरह से प्रारूप में जो दोनों एंटीबॉडी वर्गों के लिए पीई-लेबल डिटेक्शन अभिकर्मकों का उपयोग करता है।
      नोट: वर्तमान परख बोरेलिया एंटीजन वीएलएसई और डीबीपीए के दो वेरिएंट के लिए विशिष्ट आईजीजी को प्रसारित करने और प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में एंटीजन ओएसपीसी के लिए विशिष्ट आईजीएम को प्रसारित करने का मूल्यांकन करता है। परख अन्य विरोधी Borrelia प्रतिजनों के खिलाफ सीरम immunoreactivity का मूल्यांकन करने के लिए विस्तार किया जा सकता है, के रूप में वांछित12.
  3. डुअल-रिपोर्टर इंस्ट्रूमेंटेशन। एक तीन-चैनल दोहरे रिपोर्टर उपकरण (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें जो दोहरी आईजीएम/आईजीजी परख (नीचे विस्तृत) के विकास और तकनीकी सत्यापन के लिए एक ही प्रतिक्रिया में समवर्ती आईजीजी / आईजीएम विश्लेषण की अनुमति देता है। इस उपकरण में 3 कुल प्रतिदीप्ति का पता लगाने वाले चैनल हैं, जिनमें से 2 रिपोर्टर चैनल हैं जो लक्षित आईजी से जुड़े संकेतों का मूल्यांकन करते हैं।
    नोट: दोहरी रिपोर्टर प्रणाली में तीन लेजर हैं: 1) मनका सेट-विशिष्ट प्रतिदीप्ति (वर्गीकरण चैनल) की पहचान करता है और मात्रा निर्धारित करता है; 2) का पता लगाता है और लक्ष्य विशिष्ट phycoerythrin (पीई) प्रतिदीप्ति (रिपोर्टर चैनल 1; 532 एनएम उत्तेजना, "नारंगी" 565-585 एनएम उत्सर्जन), और 3) लक्ष्य विशिष्ट शानदार वायलेट 421 (BV421) एक दूसरे लक्ष्य विश्लेषण की प्रतिदीप्ति का मूल्यांकन करता है (रिपोर्टर चैनल 2; 405 एनएम उत्तेजना, "नीला" 421-441 एनएम उत्सर्जन). दोहरी रिपोर्टर प्रणाली 96 अच्छी तरह से और 384 अच्छी तरह से microtiter प्लेट (अर्द्ध स्वचालित हैंडलिंग) परख प्रारूपों दोनों के साथ संगत है. सामान्य परख योजना चित्रा 1 में दिखाया गया है. प्रोटोकॉल कदम नीचे विस्तृत हैं.

3. एंटीजन युग्मन

  1. चुंबकीय, कार्बोक्सिलेटेड और फ्लोरोसेंट रंग-कोडित 6.5μm microspheres (मोती; सामग्री की तालिका) 1-एथिल-3- (3-डाइमिथाइलैमिनोप्रोपाइल) कार्बोडाइमाइड (ईडीसी)/सल्फो-एन-हाइड्रॉक्सीसुकिनिमाइड (एसएनएचएस) रसायन विज्ञान का उपयोग करना।
    नोट: एक विस्तृत विवरण संदर्भ11और संदर्भ12 में पाया जा सकता है। तालिका 1 में प्रत्येक प्रतिजन की युग्मन एकाग्रता का पता लगाएं। युग्मित मोती उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहित किया जाना चाहिए. युग्मन और पहचान प्रतिक्रियाओं में उपयोग किए जाने वाले सभी बफ़र्स पूरक सामग्री में विस्तृत हैं।

4. परख प्रक्रिया: एकल-रिपोर्टर आईजीजी या आईजीएम सीरोलॉजिकल परख: 96-अच्छी तरह से प्रारूप

  1. 2 चरणों में नमूना पतला (2 कदम, दोनों 96 अच्छी तरह से प्लेटों में; परख बफर में 200 गुना सीरम नमूना कमजोर पड़ने).
    नोट: परख बफर रचना कम क्रॉस बफर का 1:4 मिश्रण है: पीबीएस जिसमें 1% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन होता है। ट्वीन-20 को मिश्रण में 0.05% (v/v) की अंतिम सांद्रता में मिलाया जाता है।
    1. नमूना कमजोर पड़ने चरण 1: परख बफर (25 गुना कमजोर पड़ने) के 120 माइक्रोन के साथ सीरम नमूने के 5 माइक्रोन मिलाएं।
    2. नमूना कमजोर पड़ने चरण 2: अंतिम नमूना कमजोर पड़ने 200 गुना बनाने के लिए परख बफर के 70 माइक्रोन के साथ कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोन को मिलाकर 25 गुना नमूना कमजोर पड़ने को अतिरिक्त रूप से 8 गुना पतला करें।
  2. चुंबकीय मनका मिश्रण कमजोर पड़ने
    1. 1.0 × 106 मनके / एमएल प्रति मनका आबादी (यानी, अद्वितीय लक्ष्य प्रतिजन प्रतिजन) युक्त एक मनका मिश्रण तैयार करें.
    2. तैयार मनका मिश्रण परख बफर में 25 गुना पतला इस पतला निलंबन में अंतिम मनका एकाग्रता बनाने के लिए अब 4 × 104 मोती / एमएल प्रति मनका आबादी (यानी, प्रति अद्वितीय लक्ष्य प्रतिजन) है।
  3. मोतियों के साथ सीरम नमूना इनक्यूबेशन
    1. पतला युग्मित मल्टीप्लेक्स मनका निलंबन (4.0 × 104 मोती/सेट/एमएल) के पिपेट 25 माइक्रोन एक 96 अच्छी तरह से आधा क्षेत्र microtiter प्लेट (सामग्री की तालिका) के सौंपा कुओं में.
    2. युग्मित मनका निलंबन के 25 माइक्रोन युक्त उपयुक्त कुओं में 200 गुना पतला सीरम नमूना (ऊपर चरण 4.1 से) के 25 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: यह एक अतिरिक्त 2 गुना कमजोर पड़ने का उत्पादन करता है, इसलिए अच्छी तरह से अंतिम सीरम नमूना कमजोर पड़ने 400 गुना है और अंतिम मनका गिनती 1000 मोती / मनका सेट / 50-माइक्रोन प्रतिक्रिया है।
    3. एक माइक्रोप्लेट सील (चिपकने वाला पन्नी या प्लास्टिक प्लेट कवर) के साथ 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट कवर.
    4. प्लेट शेकर पर 750 आरपीएम पर, 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट प्लेट।
  4. मनका धोना
    1. प्लेट शेकर से 96-अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट निकालें और चिपकने वाली प्लेट सील को ध्यान से हटा दें।
    2. एक प्लेट वॉशर में 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट रखो.
    3. स्वचालित चुंबकीय प्लेट वॉशर का उपयोग करके 100 माइक्रोन वॉश बफर (1× पीबीएस + 0.05% वी/वी ट्वीन 20) के साथ मोतियों को तीन बार धोएं।
  5. धोने बफर के 100 माइक्रोन में धोया मोती को फिर से निलंबित करें, चिपकने वाला पन्नी या प्लास्टिक प्लेट कवर के साथ प्लेट को कवर करें, और 1000 आरपीएम पर 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए प्लेट शेकर पर प्लेट को हिलाएं।
  6. धुले हुए मोतियों को विभाजित करें
    1. प्लेट शेकर से 96-अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट निकालें और चिपकने वाली प्लेट सील को ध्यान से हटा दें।
    2. पांच बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा प्रतिक्रियाओं को मिलाएं और प्रत्येक 100-माइक्रोन प्रतिक्रिया मात्रा के 50 माइक्रोन को दो नए 96-अच्छी प्रतिक्रिया प्लेटों में से प्रत्येक में स्थानांतरित करें, आईजीजी का पता लगाने के लिए एक प्लेट और आईजीएम का पता लगाने के लिए एक।
  7. डिटेक्शन एंटीबॉडी/अभिकर्मक इनक्यूबेशन
    नोट: इस बिंदु पर, लक्ष्य प्रतिजन-युग्मित मोतियों सीरम नमूनों के साथ इनक्यूबेट किया गया है ताकि सीरम में परिसंचारी एंटीबॉडी निकाले जा सकें (यदि मौजूद हो) जो एंटीजन (ओं) के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। बाध्य इम्युनोग्लोबुलिन के साथ प्रतिक्रियाशील मोतियों को दो प्लेटों में विभाजित किया गया है, और आईजीजी और आईजीएम को अब पीई लेबल के साथ आइसोटाइप-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके उनकी अलग-अलग प्लेटों में पता लगाया जाता है और मात्रा निर्धारित की जाती है। 20 मिनट से डगमगाती प्लेट हैंडलिंग।
    1. चुंबकीय प्लेट वॉशर का उपयोग कर चुंबकीय मोती युक्त कुओं से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण.
    2. प्रत्येक प्लेट के लिए, परख बफर में पीई-संयुग्मित बकरी विरोधी मानव आईजीजी (3 माइक्रोग्राम / एमएल) या पीई-संयुग्मित गधा विरोधी मानव आईजीएम (5 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त उपयुक्त आईजी डिटेक्शन अभिकर्मक मिश्रण (या तो एंटी-आईजीजी या एंटी-आईजीएम) बनाएं। प्रत्येक मनका युक्त अच्छी तरह से के लिए, 30 माइक्रोन का पता लगाने अभिकर्मक का उपयोग किया जाता है। प्रतिक्रिया कुओं के लिए पर्याप्त आईजीजी और आईजीएम डिटेक्शन अभिकर्मक वॉल्यूम तैयार करें, जिसमें पाइपिंग नुकसान को समायोजित करने के लिए पर्याप्त अतिरिक्त है।
    3. आईजीजी डिटेक्शन अभिकर्मक के पिपेट 30 माइक्रोन प्रत्येक अच्छी तरह से आईजीजी प्लेट पर प्रतिक्रिया मोती युक्त और माइक्रोप्लेट सील के साथ 96-अच्छी प्रतिक्रिया प्लेट को कवर करते हैं।
    4. आईजीएम डिटेक्शन अभिकर्मक के पिपेट 30 माइक्रोन प्रत्येक अच्छी तरह से आईजीएम प्लेट पर प्रतिक्रिया मोती युक्त और माइक्रोप्लेट सील के साथ 96-अच्छी प्रतिक्रिया प्लेट को कवर करते हैं।
    5. एक प्लेट प्रकार के बरतन पर 750 आरपीएम पर मिलाते हुए 20 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते हैं.
  8. मनका धोना
    1. प्लेट शेकर से 96-अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट निकालें और चिपकने वाली प्लेट सील को ध्यान से हटा दें।
    2. एक चुंबकीय प्लेट वॉशर में 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट रखो.
    3. चुंबकीय प्लेट वॉशर का उपयोग कर 100 माइक्रोन धोने बफर के साथ मोती तीन बार धो लें।
  9. धोने बफर के 100 माइक्रोन में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  10. एकल रिपोर्टर उपकरण पर परिणामों का विश्लेषण करें।
    1. एक माइक्रोप्लेट सील के साथ 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट कवर.
    2. एक प्लेट प्रकार के बरतन पर 1000 आरपीएम पर, 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट हिला.
    3. प्लेट शेकर से 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट स्थानांतरण और एक एकल रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषक साधन (सामग्री की तालिका) में डाल दिया.
    4. प्रत्येक नमूने के लिए, निम्न साधन सेटिंग्स का उपयोग कर औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) का विश्लेषण: तेज मात्रा = 80 माइक्रोन, गिनती = 50/मनका जनसंख्या, टाइमआउट = 60s, गेटिंग = 7,500-15,000)12,13.

5. परख प्रक्रिया: दोहरे रिपोर्टर आईजीजी और आईजीएम सीरोलॉजिकल परख: 96-अच्छी तरह से प्रारूप

  1. नमूना कमजोर पड़ने (2 कदम, दोनों 96 अच्छी तरह से प्लेटों में; परख बफर में 200 गुना सीरम नमूना कमजोर पड़ने)
    1. नमूना कमजोर पड़ने चरण 1: 120 माइक्रोन परख बफर (25 गुना कमजोर पड़ने) के साथ 5 माइक्रोन सीरम नमूना मिलाएं।
    2. नमूना कमजोर पड़ने चरण 2: 200 गुना करने के लिए अंतिम नमूना कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए, 70 माइक्रोन परख बफर (8 गुना कमजोर पड़ने) के साथ पहले कमजोर पड़ने (धारा 5.1.1 से 25 गुना पतला नमूना) के 10 माइक्रोन मिश्रण करके 25 गुना नमूना कमजोर पड़ने एक अतिरिक्त 8 गुना पतला करें।
  2. चुंबकीय मनका मिश्रण कमजोर पड़ने
    1. 1.0 × 106 लक्ष्य एंटीजन-युग्मित मोती/एमएल प्रति मनका आबादी (यानी, प्रति अद्वितीय लक्ष्य प्रतिजन) युक्त एक मनका मिश्रण तैयार करें।
      नोट: इस प्रयोगात्मक श्रृंखला में, हमने प्रत्येक प्रतिक्रिया में चार अद्वितीय बोरेलिया एंटीजन के खिलाफ आईजीजी और आईजीएम इम्यूनोरिएक्टिविटी दोनों का मूल्यांकन किया।
    2. परख बफर में तैयार मनका मिश्रण 50 गुना पतला. इस पतला निलंबन में मनका एकाग्रता अब 2.0 × 104 मोती /
      नोट: द्वैध परख प्रतिक्रिया में मोतियों की संख्या दो assays के बीच प्रत्यक्ष तुलनात्मकता के लिए अनुमति देने के लिए और संसाधनों के संरक्षण के लिए एकल रिपोर्टर प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया है कि से आधा है, प्रारंभिक अध्ययन के बाद प्रतिदीप्ति संकेत की पुष्टि की है कि मोती की आधी संख्या का उपयोग करते समय परिमाणीकरण की रैखिक सीमा के भीतर बनाए रखा गया था.
  3. मोतियों के साथ सीरम नमूना इनक्यूबेशन
    1. पतला लक्ष्य एंटीजन-युग्मित मनका निलंबन (2.0 × 104 मोती /सेट/एमएल) के पिपेट 25 माइक्रोन 96-अच्छी तरह से आधा क्षेत्र माइक्रोटिटर प्लेट के पूर्व-निर्दिष्ट कुओं में। प्रतिक्रिया कुओं की सही संख्या और प्लेट पर उनकी नियुक्ति परीक्षण किए गए नमूनों की ऑपरेटर द्वारा निर्धारित कुल संख्या पर निर्भर करती है और क्या एकल या प्रतिकृति कुओं को प्रति नमूना चलाया जाएगा।
      नोट: लक्ष्य प्रतिजन-युग्मित चुंबकीय मोती मानव सीरम नमूनों के साथ प्रतिक्रिया करेंगे। एंटी-बोरेलिया एंटीजन इम्यूनोएक्टिव आईजीजी और आईजीएम दोनों, यदि नमूनों में मौजूद हैं, तो एक ही एंटीजन-युग्मित मोतियों पर बंधेंगे और स्थिर होंगे। बाध्य आईजीजी और आईजीएम के माध्यमिक एंटीबॉडी परिमाणीकरण को आईजीजी और आईजीएम पहचान के लिए अलग-अलग फ्लोरोफोर्स का उपयोग करके एक ही प्रतिक्रियाओं में एक ही मोती पर किया जाएगा जो उनके भेदभाव की अनुमति देता है।
    2. मिश्रित लक्ष्य एंटीजन-युग्मित मनका निलंबन (चरण 5.2) के 25 माइक्रोन युक्त प्रत्येक कुएं में 200 गुना पतला सीरम (ऊपर चरण 5.1 से) के 25 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: यह एक अतिरिक्त 2 गुना कमजोर पड़ने का उत्पादन करता है, इसलिए अच्छी तरह से में अंतिम सीरम नमूना कमजोर पड़ने 400 गुना है, और अंतिम मनका गिनती 500 मोती/मनका सेट/50-माइक्रोन प्रतिक्रिया है।
    3. एक माइक्रोप्लेट सील (चिपकने वाला पन्नी या प्लास्टिक प्लेट कवर) के साथ 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट कवर.
    4. एक प्लेट प्रकार के बरतन पर 750 आरपीएम पर, 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मोती के साथ थाली सेते हैं.
  4. मनका धोना (अतिरिक्त सीरम नमूना हटाने के लिए)
    1. प्लेट शेकर से 96-अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट निकालें और चिपकने वाली प्लेट सील को हटा दें।
    2. एक चुंबकीय प्लेट वॉशर में 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट रखो.
    3. चुंबकीय प्लेट वॉशर का उपयोग कर 100 माइक्रोन धोने बफर के साथ मोती तीन बार धो लें।
  5. अंतिम धोने के चरण के बाद मोतियों से अंतिम धोने की मात्रा को महाप्राण करें।
  6. डिटेक्शन एंटीबॉडी (इनक्यूबेशन - भाग I)
    1. परख बफर में पीई-संयुग्मित गधा विरोधी मानव आईजीएम (5 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ बायोटिनिलेटेड बकरी विरोधी मानव आईजीजी (1 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त ताजा आईजीजी और आईजीएम दोहरी पहचान अभिकर्मक बनाएं। प्रत्येक मनका युक्त अच्छी तरह से, दोहरी डिटेक्शन अभिकर्मक के 30 माइक्रोन का उपयोग किया जाता है। प्रतिक्रिया कुओं के लिए पर्याप्त आईजीजी और आईजीएम दोहरी जांच अभिकर्मक वॉल्यूम तैयार करें, जिसमें पाइपिंग नुकसान को समायोजित करने के लिए पर्याप्त अतिरिक्त है।
    2. आईजीजी और आईजीएम दोहरी डिटेक्शन अभिकर्मक के पिपेट 30 माइक्रोन प्रत्येक असाइन किए गए कुएं में और माइक्रोप्लेट सील के साथ 96-अच्छी प्रतिक्रिया प्लेट को कवर करते हैं।
    3. प्लेट शेकर पर 750 आरपीएम पर मिलाते हुए 20 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  7. मनका धोना (अतिरिक्त पहचान एंटीबॉडी को हटाने के लिए)
    1. प्लेट शेकर से 96-अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट निकालें और चिपकने वाली प्लेट सील को ध्यान से हटा दें।
    2. 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट एक स्वचालित चुंबकीय प्लेट वॉशर में रखो.
    3. स्वचालित चुंबकीय प्लेट वॉशर का उपयोग करके 100 माइक्रोन वॉश बफर के साथ मोतियों को तीन बार धोएं।
  8. अंतिम धोने के चरण के बाद मोतियों से अंतिम धोने की मात्रा को महाप्राण करें।
  9. स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित रिपोर्टर (इनक्यूबेशन - भाग II)
    1. परख बफर में ताजा बीवी 421-लेबल स्ट्रेप्टाविडिन को 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में पतला करें। प्रत्येक मनका युक्त अच्छी तरह से, BV421-लेबल स्ट्रेप्टाविडिन के 30 माइक्रोन का उपयोग किया जाता है। प्रतिक्रिया कुओं के लिए पर्याप्त बीवी 421-लेबल स्ट्रेप्टाविडिन वॉल्यूम तैयार करें, जिसमें पाइपिंग नुकसान को समायोजित करने के लिए पर्याप्त अतिरिक्त है।
    2. प्रत्येक प्रतिक्रिया में पतला BV421-Streptavidin के पिपेट 30 माइक्रोन अच्छी तरह से और माइक्रोप्लेट सील के साथ 96well प्रतिक्रिया प्लेट को कवर।
    3. प्लेट शेकर पर 750 आरपीएम पर मिलाते हुए 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  10. मोती धोएं (अतिरिक्त BV421-Streptavidin को हटाने के लिए)
    1. प्लेट शेकर से 96-अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट निकालें और चिपकने वाली प्लेट सील को ध्यान से हटा दें।
    2. चुंबकीय प्लेट वॉशर में 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट रखो.
    3. स्वचालित चुंबकीय प्लेट वॉशर का उपयोग करके 100 माइक्रोन वॉश बफर के साथ मोतियों को तीन बार धोएं।
  11. धोने बफर में 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा के लिए कुओं के भीतर मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  12. दोहरे रिपोर्टर उपकरण पर परिणामों का विश्लेषण करें
    1. एक माइक्रोप्लेट सील के साथ 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट कवर.
    2. एक प्लेट प्रकार के बरतन पर 1000 आरपीएम पर, 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट सेते हैं.
    3. प्लेट शेकर से 96-अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट को दोहरे रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषक उपकरण (सामग्री की तालिका) में स्थानांतरित करें।
    4. निर्माता निर्देशों के अनुसार नमूना औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) का मूल्यांकन करें (साधन सेटिंग्स: दोहरी रिपोर्टर मोड, तेज मात्रा = 80 माइक्रोन, गिनती = 50 / मनका जनसंख्या, टाइमआउट = 60 के दशक, गेटिंग = 7,500-15,000)।

6. दोहरी रिपोर्टर आईजीजी और आईजीएम सीरोलॉजिकल परख: 384-अच्छी तरह से अर्ध-स्वचालित प्रारूप

  1. धारा 5 में विस्तृत परख चरणों का उपयोग करके 384-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में दोहरे रिपोर्टर परख करें, लेकिन एक पाइपिंग रोबोट और स्वचालित चुंबकीय प्लेट वॉशर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके नमूनों की प्रक्रिया करें। 384 अच्छी तरह से प्रारूप में, ऊष्मायन के दौरान प्लेटें हिलाएं और 1450 आरपीएम पर धोता है, और प्रतिदीप्ति को मापने से पहले, 21 डिग्री सेल्सियस और 1800 आरपीएम पर 5 मिन के लिए प्लेट को हिलाएं।

Representative Results

प्रायोगिक अवलोकन
एकल-रिपोर्टर और दोहरे रिपोर्टर मनका-आधारित बोरेलिया परख के लिए सामान्य योजनाएं चित्र 1 में दिखाई गई हैं। किसी दिए गए बोरेलिया एंटीजन के खिलाफ उत्पन्न एकल एंटीबॉडी लक्ष्यों (यानी, आईजीजी या आईजीएम) के लिए, दोनों एंटीबॉडी वर्गों का स्वतंत्र रूप से मानव सीरम नमूनों में पीई-संयुग्मित एंटी-आइसोटाइप एंटीबॉडी का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। आईजीजी और आईजीएम इम्यूनोरेएक्टिविटी दोनों के एक साथ विश्लेषण के साथ दोहरे रिपोर्टर परख के लिए, बोरेलिया एंटीजन-विशिष्ट आईजीजी डिटेक्शन ने आईजीएम डिटेक्शन के लिए पीई-संयुग्मित रिपोर्टर (नारंगी प्रतिदीप्ति) को बनाए रखते हुए एक बायोटिनिलेटेड एंटी-ह्यूमन आईजीजी + बीवी 421-लेबल स्ट्रेप्टाविडिन (ब्लू फ्लोरेसेंस) रिपोर्टर सिस्टम का इस्तेमाल किया। दोहरे रिपोर्टर परख का वर्कफ़्लो एकल-रिपोर्टर परख के समान है, जिसमें अतिरिक्त 30-मिनट की पहचान प्रणाली के अपवाद के साथ इनक्यूबेशन दूसरे-चैनल प्रतिदीप्ति का पता लगाने वाले अभिकर्मक BV421-Streptavidin के साथ।

Figure 1
चित्रा 1: एकल-रिपोर्टर और दोहरे रिपोर्टर मनका-आधारित बोरेलिया परख का योजनाबद्ध। (ए) एकल-रिपोर्टर उपकरण का उपयोग मनका-आधारित परख को विकसित करने और शुरू में मान्य करने के लिए किया गया था जो या तो एंटी-बोरेलिया आईजीजी या आईजीएम को व्यक्तिगत रूप से विशेषता देता है, दोनों एक फाइकोएरिथ्रिटिन (पीई) फ्लोरोसेंट रिपोर्टर लेबल का उपयोग करते हैं जो "नारंगी" स्पेक्ट्रा में संकेत का उत्सर्जन करता है। किसी भी वांछित बोरेलिया एंटीजन को मोतियों के साथ जोड़ा जा सकता है और सीरम नमूनों में मौजूद आईजीजी या आईजीएम को पकड़ने और मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। किसी दिए गए एंटीजन के खिलाफ आईजीजी और आईजीएम प्रतिक्रियाशीलता दोनों का मूल्यांकन करने के लिए दो अलग-अलग इम्यूनोएसे की आवश्यकता होती है। (बी) दोहरी रिपोर्टर प्रणाली ने एक ही कुएं में किसी भी व्यक्तिगत बोरेलिया एंटीजन के खिलाफ आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी दोनों के लिए सीरम नमूनों के एक साथ विश्लेषण की अनुमति दी। यह दृष्टिकोण एंटी-बोरेलिया आईजीएम को लक्षित करने के लिए एक ही पीई-संयुग्मित डिटेक्शन एंटीबॉडी का उपयोग करता है, लेकिन पीई-आधारित सिस्टम से आईजीजी डिटेक्शन को बायोटिनिलेटेड प्राथमिक डिटेक्शन एंटीबॉडी और बीवी 421-लेबल स्ट्रेप्टाविडिन (एक "ब्लू" एमिटर) का उपयोग करने के लिए प्रतिस्थापित करता है जिसे 30 मिनट के चरण इनक्यूबेशन अतिरिक्त पहचान प्रणाली की आवश्यकता होती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इंट्रा-परख परिशुद्धता
तीन प्रतिनिधि बोरेलिया एंटीजन (चित्रा 2) के लिए स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण ने मानव सीरा में मौजूद एंटी-बोरेलिया एंटीबॉडी का पता लगाते समय एमएफआई मूल्यों की समान प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन किया।

Figure 2
चित्रा 2: दोहरे रिपोर्टर मनका आधारित बोरेलिया परख की इंट्रा-परख परिशुद्धता। स्पीयरमैन के सहसंबंध विश्लेषण ने दोहरे रिपोर्टर परख की एक उच्च इंट्रा-परख परिशुद्धता दिखाई, जब बोरेलिया-विशिष्ट आईजीएम एंटीबॉडी (ए) का पता लगाने के लिए पीई डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग किया गया था और बोरेलिया विशिष्ट आईजीजी एंटीबॉडी (बी, सी) का पता लगाने के लिए बीवी 421 डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग किया गया था। अर्ध-स्वचालित प्रक्रिया का उपयोग करके डुप्लिकेट में कुल 21 सीरम नमूनों का विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक ग्राफ में, एमएफआई संकेतों को एक दूसरे के खिलाफ प्लॉट किया गया था और रैखिक प्रतिगमन द्वारा विश्लेषण किया गया था। लाल धराशायी रेखा के रूप में दिखाया गया एक रैखिक वक्र (x = y) डिटेक्शन सिस्टम के लिए समान MFI संकेतों को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अंतर-परख परिशुद्धता
अच्छा परख-से-परख प्रजनन क्षमता दोहरे रिपोर्टर परख के साथ मनाया गया था। सात स्वतंत्र रनों पर मापा गुणवत्ता नियंत्रण नमूने के एमएफआई मूल्यों के साथ लेवी-जेनिंग्स चार्ट (चित्रा 3) ने सभी प्रतिनिधि एंटीजन के लिए उच्च अंतर-परख परिशुद्धता का प्रदर्शन किया। चार प्रतिनिधि बोरेलिया एंटीजन का औसत प्रतिशत भिन्नता गुणांक (सीवी% = मानक विचलन/माध्य × 100) 5.3% था।

कमजोर पड़ने की रैखिकता
क्योंकि मूल एकल रिपोर्टर परख और नए दोहरे रिपोर्टर परख अलग प्रवाह cytometric प्लेटफार्मों को रोजगार, हम दो प्रवाह cytometry उपकरणों (चित्रा 4) के बीच एक ही प्रतिजन immunoassay के औसत प्रतिदीप्ति outputs की तुलना में. नमूना कमजोर पड़ने श्रृंखला आईजीएम और आईजीजी मूल्यांकन दोनों के लिए रैखिक कमजोर पड़ने घटता प्रदान की, पूरे कमजोर पड़ने रेंज मूल्यांकन (1: 100-1: 12,800) के माध्यम से उपकरणों के बीच खुराक प्रतिक्रिया की अच्छी समानता के साथ.

Figure 3
चित्रा 3: दोहरे रिपोर्टर मनका आधारित Borrelia परख के अंतर-परख परिशुद्धता. अंतर-परख परिशुद्धता के मूल्यांकन के लिए, गुणवत्ता नियंत्रण नमूने के बोरेलिया-विशिष्ट आईजीएम (ए) और आईजीजी (बी-डी) एंटीबॉडी प्रतिक्रिया का विश्लेषण हर बार डुप्लिकेट कुओं में सात स्वतंत्र रनों से अधिक किया गया था। परख मैन्युअल रूप से किए गए थे। एमएफआई मूल्यों को लेवी-जेनिंग्स चार्ट में प्लॉट किया गया था। एक हरी रेखा सभी मूल्यों का माध्य देती है। दो लाल धराशायी रेखाएं अंतर-परख परिशुद्धता की सहिष्णुता सीमा को इंगित करती हैं। इसकी गणना मानक विचलन (2.5 एसडी) के 2.5 गुना ± औसत मूल्य से की गई थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: दोहरे रिपोर्टर मनका आधारित Borrelia परख के कमजोर पड़ने रैखिकता. 100 गुना से 12,800 गुना के नमूना कमजोर पड़ने पर, आईजीएम डिटेक्शन (ए) और आईजीजी डिटेक्शन (बी) दोनों के लिए कमजोर पड़ने वाले घटता समान थे जब एकल-रिपोर्टर उपकरण और दोहरे रिपोर्टर उपकरण के साथ मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया गया था। सभी परीक्षण किए गए कमजोर पड़ने पर, एमएफआई मान दोहरे-रिपोर्टर उपकरण (नीले प्रतीकों) की तुलना में एकल-रिपोर्टर उपकरण (लाल प्रतीकों) का उपयोग करके थोड़ा अधिक थे। दिखाया गया है कि 2 प्रतिनिधि एंटीजन के लिए कमजोर पड़ने वाले घटता हैं, प्रत्येक कमजोर पड़ने वाले बिंदु के साथ मानक विचलन (एसडी *) के साथ ट्रिपल कुओं के औसत माप का प्रतिनिधित्व करते हैं जो त्रुटि सलाखों द्वारा इंगित किया गया है। नोट: छोटे एसडी इस पैमाने पर दिखाई नहीं देते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक सामग्री। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस रिपोर्ट में एक दो रिपोर्टर मनका आधारित Borrelia immunoassay है कि प्रजनन योग्य और संवेदनशील सीरम नमूने12 में विरोधी Borrelia immunoreactivity निर्धारित करता है के विकास पर प्रकाश डाला गया. लाइम बोरेलीओसिस का कारण बनने वाली विभिन्न रोगजनक बोरेलिया प्रजातियों को संस्करण-विशिष्ट एंटीजन विषमता 6,7,8,9 द्वारा विभेदित किया जा सकता है। मल्टीप्लेक्स परख समवर्ती रूप से आईजीजी- और आईजीएम-मध्यस्थता एंटी-बोरेलिया इम्यूनोरिएक्टिविटी का मूल्यांकन एक ही प्रतिक्रिया के भीतर अच्छी तरह से करता है, जिससे अभिकर्मकों, श्रम और नमूना सामग्री का संरक्षण होता है अन्यथा दो सिंगलप्लेक्स परख अलग-अलग करने की आवश्यकता होती है। समय के साथ आईजीएम और आईजीजी प्रतिक्रियाओं की तुलना करने से रोग की प्रगति की बेहतर ट्रैकिंग की अनुमति मिल सकती है क्योंकि संक्रमण6 के बाद आईजीएम-टू-आईजीजी सेरोकोनवर्जन होता है।

दोहरी रिपोर्टर प्रणाली दो अलग पहचान एंटीबॉडी सिस्टम13,15 का उपयोग करता है. संबंधित प्रयोगों Borrelia विरोधी आईजीएम और विरोधी आईजीजी पहचान प्रणाली के बीच कोई महत्वपूर्ण detectable पार प्रतिक्रियाशीलता का प्रदर्शन किया जब दोनों एंटीबॉडी वर्गों एक ही प्रतिक्रिया अच्छी तरह से12 में एक साथ विश्लेषण किया गया. आईजीएम बनाम आईजीजी एंटीबॉडी16,17 के कम बाध्यकारी संबंध को ध्यान में रखते हुए, हम पीई नियमित रूप से immunoassays18 में इस्तेमाल किया सबसे मजबूत उत्सर्जक fluorophores में से एक है क्योंकि आईजीएम का पता लगाने (दोहरे रिपोर्टर साधन के पहले रिपोर्टर चैनल) के लिए एक पीई संयुग्मित पहचान एंटीबॉडी चुना. आईजीजी मूल्यांकन के लिए, हमने एक बायोटिनिलेटेड डिटेक्शन एंटीबॉडी का उपयोग किया जिसे बाद में बीवी421-संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन (उपकरण का दूसरा रिपोर्टर चैनल)19के साथ प्रकाशित किया गया था। एकल-रिपोर्टर प्रणाली की तुलना में अतिरिक्त 30 मिनट इनक्यूबेशन कदम के बावजूद, दोहरी-रिपोर्टर प्रणाली प्रति प्रतिक्रिया से दोगुनी जानकारी देती है। कुल मिलाकर, दोहरे रिपोर्टर मल्टीप्लेक्स परख को दो एकल-रिपोर्टर परख चलाने की तुलना में कम संचयी समय और सामग्री इनपुट की आवश्यकता होती है।

मल्टीप्लेक्स बोरेलिया परख के मजबूत प्रदर्शन और स्थिरता को इंट्रा- और इंटर-परख सटीक अध्ययनों में उच्च प्रजनन क्षमता द्वारा उदाहरण दिया गया था, और आईजीजी और आईजीएम मूल्यांकन दोनों के लिए नमूना सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर कमजोर पड़ने की रैखिकता और कमजोर पड़ने की समानता के प्रदर्शन द्वारा। हमने एकल-चैनल उपकरण बनाम दोहरे चैनल प्रणाली (≈1.7× पीई के साथ उच्चतर) का उपयोग करके एक ही फ्लोरोफोर्स के लिए उच्च पूर्ण प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्तर देखा, जो दो उपकरणों (चित्रा 4) के बीच प्रकाशिकी और अंशांकन सेटिंग्स में अंतर के कारण है। बहरहाल, दोनों फ्लोरोफोर्स के साथ प्रतिदीप्ति उत्सर्जन घटता उच्च और निम्न नमूना कमजोर पड़ने चरम सीमाओं पर दोनों उपकरणों की रैखिक सीमा के भीतर बने रहे, और मापा गया पूर्ण प्रतिदीप्ति में कोई विसंगति बोरेलिया एक्सपोजर स्थिति के वर्गीकरण को प्रभावित नहीं करती है। 12

इस मनका आधारित Borrelia मल्टीप्लेक्स परख का एक प्रमुख लाभ आसानी है जिसके साथ परख संशोधित या अलग या अतिरिक्त विश्लेषण का मूल्यांकन करने के लिए विस्तार किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, आगे Borrelia प्रजातियों के antigens के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए. xMAP चुंबकीय मनका सेट साधन के वर्गीकरण चैनल में प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि अलग डाई संयोजन होते हैं और सैद्धांतिक रूप से एक ही नमूने के भीतर 500 अद्वितीय विश्लेषण करने के लिए समवर्ती मूल्यांकन कर सकते हैं कि मल्टीप्लेक्स परख में लागू किया जा सकता है. जबकि वर्तमान अध्ययन परख कार्यक्षमता और स्थिरता का प्रदर्शन करने के लिए और एकल और दोहरे रिपोर्टर प्रणाली की तुलना करने के लिए चार प्रतिनिधि Borrelia प्रतिजनों पर प्रकाश डाला गया, अंतिम परख एक साथ यूरोप और उत्तरी अमेरिका12 भर में घूम सभी पांच नैदानिक प्रासंगिक Borrelia रोगजनकों की पहचान कर सकते हैं कि आठ antigens पूछताछ.

अर्ध-स्वचालित परख प्रारूप में मानक 384-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेटों का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट प्रदर्शन संभव है। दोनों 96- और 384 अच्छी तरह से प्लेटों के साथ परख और साधन संगतता Borrelia मल्टीप्लेक्स परख तेजी से राष्ट्रीय अध्ययन20 के रूप में बड़े नमूना सेट का विश्लेषण करने के लिए एक कुशल स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है. परख के मैनुअल प्रदर्शन छोटे 96 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग छोटे नमूना सेट के लिए संभव रहता है.

अध्ययन सीमाओं में मानव सीरम नमूनों की एक छोटी संख्या में केवल कुछ बोरेलिया इम्यूनोएक्टिविटी लक्ष्यों का तुलनात्मक मूल्यांकन शामिल है। हालांकि, मूल अध्ययन ने पुष्टि की कि आईजीजी और आईजीएम दोनों के लिए परख प्रदर्शन को बनाए रखा गया था जब एक बड़े नमूना सेट12 के भीतर सभी पांच ज्ञात बोरेलिया प्रजातियों से आठ एंटीजन का विश्लेषण किया गया था। इसके अलावा, दोहरे रिपोर्टर साधन केवल प्रत्येक प्रतिक्रिया के भीतर एक साथ दो एंटीबॉडी आइसोटाइप का आकलन कर सकते हैं, इसलिए पूर्ण आइसोटाइप प्रोफाइलिंग के लिए अतिरिक्त परख प्रतिक्रियाओं13 के प्रदर्शन की आवश्यकता होगी।

अंत में, यह रिपोर्ट मनका-आधारित एकल-रिपोर्टर इम्यूनोएसे के दोहरे रिपोर्टर परख में सफल विलय और रूपांतरण का विवरण देती है जो एक साथ मानव सीरम नमूनों में रोगजनक बोरेलिया-विशिष्ट आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी का मूल्यांकन कर सकती है। यह संयुक्त दृष्टिकोण दो स्वतंत्र एकल-रिपोर्टर परख के समान डेटा वॉल्यूम उत्पन्न करने के लिए कुल समय, सामग्री और श्रम इनपुट बचाता है। मल्टीप्लेक्स परख को 96-अच्छी तरह से 384-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट प्रारूप तक बढ़ाया जा सकता है और रोबोट प्लेट और तरल हैंडलिंग इंस्ट्रूमेंटेशन के उपयोग से अर्ध-स्वचालित किया जा सकता है, जिससे यह बड़ी जनसंख्या सर्वेक्षण जैसे उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हो जाता है। मनका आधारित दोहरी रिपोर्टर परख प्रणालियों पहले मूल्यांकन में उपयोगिता का प्रदर्शन किया है, उदाहरण के लिए, अन्य वायरल और बैक्टीरियल रोगजनकों13,21 के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, अंग प्रत्यारोपण22 में एचएलए एपिटोप्स के खिलाफ एलोजेनिक एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का आकलन, और ऑटोइम्यून रोग23 के तंत्र की खोज. वर्तमान रिपोर्ट में लाइम रोग का कारण बनने वाले बोरेलिया रोगजनकों के संपर्क की पहचान करने के लिए मल्टीप्लेक्स तकनीक के उपयोग का विवरण दिया गया है, उदाहरण के रूप में कि प्रयोगशालाएं विभिन्न विकृति में जटिल प्रतिरक्षा तंत्र की खोज के लिए इस दृष्टिकोण को कैसे अनुकूलित कर सकती हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस रिपोर्ट को ल्यूमिनेक्स (ऑस्टिन, TX) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक विश्लेषणात्मक और वैज्ञानिक संपादन सहायता के लिए मैथ्यू सिल्वरमैन पीएचडी (बायोमेडिकल पब्लिशिंग सॉल्यूशंस, पनामा सिटी, एफएल; mattsilver@yahoo.com) को धन्यवाद देते हैं। लेखक अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले बोरेलिया एंटीजन प्रदान करने के लिए tgcBIOMICS GmbH (Bingen, जर्मनी) के हेराल्ड क्लेन और क्रिस्टोफ वॉन आइचेल-स्ट्रीबर को भी धन्यवाद देते हैं। तकनीकी परख सत्यापन और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए मानव सीरम नमूने यहां से प्राप्त किए गए थे: 1) महामारी विज्ञान विभाग, हेल्महोल्त्ज़ सेंटर फॉर इंफेक्शन रिसर्च, ब्राउनश्वेग, जर्मनी के माध्यम से जर्मनी में SARS-CoV-2 के खिलाफ एंटीबॉडी पर मल्टीलोकल और सीरियल प्रचलन अध्ययन; और 2) न्यूरोलॉजी विभाग, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, जर्मनी)। मानव नमूनों के उपयोग के लिए अनुमोदन हनोवर मेडिकल स्कूल, जर्मनी (9086_BO_S_2020) की आचार समिति द्वारा प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies and Detection Reagents Source Catalog Number
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Jackson ImmunoResearch (Dianova) 109-066-098 
Brilliant Violet 421-Streptavidin BD Biosciences 563259
Donkey Anti-Human IgM  Jackson ImmunoResearch (Dianova) 709-116-073
Borrelia Antigens tgcBIOMICS (Bingen, Germany)
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific Pierce 77149 ProteoChem (100 mg)
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
BSA Carl Roth T844.3
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) Carl Roth 4256.2
Na2HPO4 Carl Roth 4984.1
ProClin300 Sigma 48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Scientific Pierce 24510 (500 mg)
Triton X-100 Thermo Scientific 85111
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies Source
384-well plate Corning, Cat# 3570
96-well deep-well plates ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-well half-area plates  Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
BioTek MultiFlo FX Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates)  ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp., Austin, TX
SmartBlock Plates Eppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer C Eppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTop Eppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stanek, G., Strle, F. Lyme borreliosis-from tick bite to diagnosis and treatment. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 233-258 (2018).
  2. Stanek, G., Wormser, G. P., Gray, J., Strle, F. Lyme borreliosis. The Lancet. 379 (9814), 461-473 (2012).
  3. Rizzoli, A., et al. Lyme borreliosis in Europe. Eurosurveillance. 16 (27), 19906 (2011).
  4. Cook, M. J. Lyme borreliosis: a review of data on transmission time after tick attachment. International Journal of General Medicine. 8, 1-8 (2015).
  5. Strle, F., Stanek, G. Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme Borreliosis. Lyme Borreliosis: Biological and Clinical Aspects. Lipsker, D., Jaulhac, B. , Karger. 51-110 (2009).
  6. Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 49 (1), 13-21 (2007).
  7. Dessau, R. B., et al. To test or not to test? Laboratory support for the diagnosis of Lyme borreliosis: a position paper of ESGBOR, the ESCMID study group for Lyme borreliosis. Clinical Microbiology and Infection. 24 (2), 118-124 (2018).
  8. Eldin, C., et al. Review of European and American guidelines for the diagnosis of Lyme borreliosis. Médecine et Maladies Infectieuses. 49 (2), 121-132 (2019).
  9. Lantos, P. M., et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America (IDSA), American Academy of Neurology (AAN), and American College of Rheumatology (ACR): 2020 Guidelines for the Prevention, Diagnosis and Treatment of Lyme Disease. Clinical Infectious Diseases. 72 (1), e1-e48 (2021).
  10. Gerritzen, A., Brandt, S. Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology. Methods. 56 (4), 477-483 (2012).
  11. Embers, M. E., et al. Five-antigen fluorescent bead-based assay for diagnosis of Lyme disease. Clinical Vaccine Immunology. 23 (4), 294-303 (2016).
  12. Häring, J., et al. Borrelia multiplex: a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of Borrelia specific IgG/IgM class antibodies. BMC Infectious Diseases. 22 (1), 859 (2022).
  13. Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  14. Gornyk, D., et al. SARS-CoV-2 Seroprevalence in Germany. Deutsches Ärzteblatt International. 118 (48), 824-831 (2021).
  15. Luminex Corporation. xMAP Cookbook. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. , 5th ed, https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrer=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. Racine, R., Winslow, G. M. IgM in microbial infections: Taken for granted. Immunology Letters. 125 (2), 79-85 (2009).
  17. Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).
  18. Kovaleski, G., et al. Extraction and purification of phycobiliproteins from algae and their applications. Frontiers in Chemistry. 10, 1065355 (2022).
  19. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).
  20. Coors, A., et al. Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany. Parasites & Vectors. 15 (1), 241 (2022).
  21. Gürsoy, M., et al. Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn's Disease. International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385 (2023).
  22. Argani, H. Anti-HLA Antibody: The role of epitopes in organ transplantation. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (Suppl 1), 38-42 (2019).
  23. Laman, J. D., Huizinga, R., Boons, G. J., Jacobs, B. C. Guillain-Barré syndrome: expanding the concept of molecular mimicry. Trends in Immunology. 43 (4), 296-308 (2022).

Tags

एक साथ पता लगाने एंटीबॉडी कक्षाएं मल्टीप्लेक्स सीरोलॉजिकल टेस्ट इम्यूनोएक्टिविटी एंटीजेनिक निर्धारक एंटीबॉडी आइसोटाइप लाइम बोरेलीओसिस बोरेलिया प्रजाति नमूना वर्गीकरण विभिन्न एंटीजन के खिलाफ इम्यूनोरिएक्टिविटी एंटी-पैथोज़न आईजीजी आईजीएम प्रतिक्रियाएं रोग प्रगति दो-रिपोर्टर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोसे बोरेलिया-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मानव सीरम नमूने बैक्टीरियल एंटीजन दोहरे रिपोर्टर दृष्टिकोण विश्लेषणात्मक प्रदर्शन समय और संसाधन संरक्षण नमूना आकार आवश्यकताओं

Erratum

Formal Correction: Erratum: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test
Posted by JoVE Editors on 08/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. The Authors section was updated to correct an Affiliation. It was updated from:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute, University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

to:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

एक मल्टीप्लेक्स्ड सीरोलॉजिकल टेस्ट में विभिन्न एंटीबॉडी वर्गों का एक साथ पता लगाना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Häring, J., Michel, T., Becker, … More

Häring, J., Michel, T., Becker, M., Junker, D., Tchitchagua, T., Leschnik, O., Lange, B., Castell, S., Krause, G., Strengert, M., Dulovic, A., Schneiderhan-Marra, N. Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. J. Vis. Exp. (197), e65323, doi:10.3791/65323 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter