Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidig påvising av olika antikroppsklasser i ett multiplexerat serologiskt test

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65323
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 3,4, 3,4, 3,4, 3, 1, 1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen, 2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch, 3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research, 4German Centre for Infection Research (DZIF)
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Ett trekanaligt dubbelrapportör fluorescensflödesanalyssystem användes för att utveckla en pärlbaserad multiplex immunanalys som samtidigt utvärderar serumprover för IgG och IgM framkallade mot flera antigener av olika Borrelia-arter som orsakar Lyme borrelios i Europa och Nordamerika.

Abstract

För att övervaka utvecklingen av infektionssjukdomar är det användbart att bedöma immunreaktivitet mot olika antigena determinanter och mäta olika antikroppsisotyper eftersom de uppträder i olika stadier av värdens immunsvar. När det gäller borrelia kan det patogena ämnet vara en av de många medlemmarna av Borrelia-arten . En korrekt provklassificering kräver därför att immunreaktiviteten mot olika antigener hos olika Borrelia-arter utvärderas. Dessutom kan antipatogena IgG- och IgM-svar ha olika eliciteringstidsförlopp under sjukdomsprogression. Här demonstrerar vi utvecklingen av en multiplex immunoassay med två rapportörer som har nytta för att identifiera Borrelia-specifikt immunsvar i humana serumprover genom att samtidigt utvärdera både IgG- och IgM-immunreaktivitet mot olika bakteriella antigener i samma reaktionsbrunn. Denna metod med dubbla rapportörer bibehåller den analytiska prestandan hos metoder med en rapportör samtidigt som tid och resurser sparas och kraven på stickprovsstorlek minskar. Denna analys gör det möjligt att generera i princip dubbelt så mycket serologisk information från ett blodprov på halva tiden.

Introduction

Borrelia borrelios är den vanligaste fästingburna infektionssjukdomen i måttliga klimat på norra halvklotet. Den orsakas av spiroketbakterier av släktet Borrelia, med fem kända humanpatogener som varierar i geografisk utbredning2. De viktigaste patogena borreliaarterna i Europa är B. afzelii och B. garinii, medan B. burgdorferi s.s., B. spielmanii och B. bavariensis är mer sällsynta. I Nordamerika är B. burgdorferi s.s. den enda orsaken till Lyme borreliosis 2,3. Borreliapatogener överförs av medlemmar av fästingsläktet Ixodes, och överföringen kan ske inom 24 timmar efter fästingbett4.

Diagnosen borrelia ställs vanligtvis av kliniska symtom och bekräftas därefter av serologi. I både Europa och Nordamerika rekommenderar diagnostiska riktlinjer en testserie i två steg bestående av en enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) med en refleximmunoblot för att utvärdera antikroppssvar mot Borrelia-specifika antigener 1,5,6,7,8,9 . Detta tillvägagångssätt saknar dock känslighet och är suboptimalt, särskilt i den tidiga fasen av infektionen när serokonversionen kan vara ofullständig och anti-Borrelia IgG- och IgM-titrar är för låga6.

Multiplexa immunanalyser förbättrar traditionella immunanalyser som endast mäter ett mål åt gången och kan samtidigt utvärdera flera antikroppsisotypsvar mot ett eller flera antigen 10,11,12. Analyser som ELISA är begränsade till att identifiera och kvantifiera en enda analyt per reaktion, i det aktuella fallet antingen cirkulerande IgG eller IgM inducerad mot ett enda bakteriellt antigen efter infektion med Borrelia. Denna rapport illustrerar användningen av pärlbaserad analytprofileringsteknik för utveckling av en multiplex immunanalys som samtidigt detekterar både IgG- och IgM-antikroppar mot något av de här utvalda Borrelia-antigenerna i humana serumprover. Vi valde ut fyra antigener som tillsammans täcker de vanligaste patogena Borrelia-arterna som är inhemska i Europa (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) och Nordamerika (B. burgdorferi s.s.) (Tabell 1) 2,3. Detta möjliggör avgörande identifiering av patogener och förmågan att urskilja tidig IgM och senare, mer varaktig, IgG-immunreaktivitet i patientprover.

Mål isotyp Reporter Kanal Antigen Borrelia-arter Anstränga Koncentration av antigenkoppling
Igm PE OspC B. garinii 20047 5,0 μg/106 pärlor
IgG BV421 VlsE B. burgdorferi s.s B31 (B31) 1,25 μg/106 pärlor
IgG BV421 DbpA (på engelska) B. burgdorferi s.s. ZS7 10,0 μg/106 pärlor
IgG BV421 DbpA (på engelska) B. afzelii PKo 5,0 μg/106 pärlor

Tabell 1: Representativa Borrelia-antigener som används för utveckling av multiplexa analyser.

Vi utvecklade initialt en immunoanalys med en reporter som detekterade antingen anti-Borrelia-antigen IgG- eller IgM-antikroppar i två separata reaktioner och slog sedan samman dessa analyser till en multiplexanalys med dubbla rapportörer som mäter båda antikroppsisotyperna i samma reaktionsblandning. Magnetiska pärlor kopplas till ett patogent målantigen av intresse och inkuberas sedan med patientserumprover. Det pärlkopplade antigenet känns igen av, och fångar upp, både cirkulerande IgG och IgM i serum som genereras i ett immunsvar mot det patogena antigenet. Bestämning av IgG kontra IgM-specificitet bestäms genom valet av en sekundär antikropp som binder till antingen IgG eller IgM, var och en med en distinkt fluoroforsignal associerad med de två sekundära antikropparna. Varje fluorescerande signal detekteras i en av instrumentets två reporterkanaler (dvs. dubbelreporter) som har en annan excitationslaser och emissionsavskiljning som är specifik för den enda fluoroforen som används för att detektera antingen IgG eller IgM (här Brilliant Violet 421 respektive fykoerytrin). Instrumentets klassificeringskanal identifierar det färgkodade färgämnet som är inneboende i olika stränguppsättningar. Således kan flera målantigener kopplas till olikfärgade pärlor, och pärluppsättningarna blandas ihop och användas för att på ett heltäckande sätt bedöma olika antipatogena immunreaktivitet i serumprover. Klassificeringskanalen identifierar varje enskild pärluppsättning (dvs. specifikt antigen) och mäter fluorescensen associerad med IgG eller IgM mot det antigenet. Den resulterande multiplexanalysen sparar tid och resurser jämfört med mindre omfattande klassisk testning och katalogiserar noggrant Lyme-borrelios immunreaktivitet i begränsade provvolymer. Medan en liknande dual-reporter-metod tidigare har använts för att kategorisera immunsvar i andra patologier såsom SARS-CoV-2-infektion13, beskriver denna rapport tillämpningen av multiplex fluorescerande analysteknik för att karakterisera immunreaktivitet vid Lyme borrelios.

Protocol

Godkännande från Institutional Review Board/Ethics Committee erhölls för användning av humana serumprover i denna experimentella serie. Proverna var anonymiserade restmaterial från en tysk nationell studie av SARS-CoV-2-seroprevalens14. Godkännande för användning av humanprover beviljades av den etiska kommittén vid Hannover Medical School, Tyskland (9086_BO_S_2020). Totalt användes 21 humana serumprover i den aktuella studien.

1. Etiskt godkännande för användning av humanprover

  1. Erhålla lämpliga etiska godkännanden för användning av humanprover.

2. Reagenser och utrustning

  1. Humana serumprover: Utför teknisk analysvalidering och kvalitetskontroll med hjälp av serumprover från personer som tidigare diagnostiserats med borrelia borrelios eller från påvisad borrelianegativ immunstatus12,14.
  2. Instrumentation med en rapportör. Använd ett tvåkanaligt instrument med en rapportör (Table of Materials) för den inledande analysutvecklingen och den tekniska valideringen.
    OBS: Single-reporter-systemet har två lasrar: 1) identifierar och kvantifierar pärluppsättningsspecifik fluorescens för att urskilja olika pärluppsättningar, om de används (klassificeringskanal), och 2) detekterar och kvantifierar pärlbunden målspecifik fykoerytrin (PE) fluorescens (Reporter Channel; 532 nm excitation, "orange" 565-585 nm emission). Således kan endast en enda antikroppsisotypklass (t.ex. antingen IgG eller IgM) analyseras åt gången med hjälp av den enda reporterkanalen.
    1. Utför inledande valideringsstudier för att bedöma anti-Borrelia IgG och IgM separat, i ett 96-brunnars format med en rapportör som använder PE-märkta detektionsreagenser för båda antikroppsklasserna.
      OBS: Den aktuella analysen utvärderar cirkulerande IgG:er specifika för Borrelia-antigen VlsE och två varianter av DbpA, och cirkulerande IgM-specifika för antigen-OspC, som representativa exempel. Analysen kan utvidgas för att utvärdera serumimmunreaktivitet mot andra anti-Borrelia-antigener , enligt önskemål12.
  3. Instrumentering med dubbla rapportörer. Använd ett trekanaligt instrument med dubbla rapportörer (materialtabell) som möjliggör samtidig IgG/IgM-analys i samma reaktion, för utveckling och teknisk validering av den dubbla IgM/IgG-analysen (beskrivs nedan). Detta instrument har totalt 3 fluorescensdetekterande kanaler, varav 2 är reporterkanaler som utvärderar riktade Ig-associerade signaler.
    OBS: Systemet med dubbla rapportörer har tre lasrar: 1) identifierar och kvantifierar pärluppsättningsspecifik fluorescens (klassificeringskanal); 2) detekterar och kvantifierar målspecifik fykoerytrin (PE) fluorescens (Reporter Channel 1; 532 nm excitation, "orange" 565-585 nm emission), och 3) utvärderar målspecifik Brilliant Violet 421 (BV421) fluorescens av en andra målanalyt (Reporter Channel 2; 405 nm excitation, "blå" 421-441 nm emission). Systemet med dubbla rapportörer är kompatibelt med både 96-håls och 384-håls mikrotiterplatta (halvautomatisk hantering) analysformat. Det allmänna analysschemat visas i figur 1. Protokollstegen beskrivs nedan.

3. Koppling av antigener

  1. Koppla Borrelia-antigenerna till magnetiska, karboxylerade och fluorescerande färgkodade 6,5 μm mikrosfärer (pärlor; Materialförteckning) med användning av 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC)/sulfo-N-hydroxisuccinimid (sNHS) kemi.
    OBS: En detaljerad beskrivning finns i referens11ochreferens 12. Hitta kopplingskoncentrationen för varje antigen i tabell 1. Kopplade pärlor ska förvaras i mörker vid 4 °C fram till användning. Alla buffertar som används i kopplings- och detektionsreaktioner beskrivs i tilläggsmaterialen.

4. Analysförfarande: Single-reporter IgG eller IgM serologisk analys: 96-hålsformat

  1. Späd provet i 2 steg (2 steg, båda i 96-hålsplattor; 200-faldig serumprovutspädning i analysbuffert).
    OBS: Analysbuffertsammansättningen är en 1:4 blandning av Low Cross Buffer: PBS som innehåller 1 % (w/v) bovint serumalbumin. Tween-20 tillsätts blandningen till en slutlig koncentration på 0,05 % (v/v).
    1. Spädningssteg 1: Blanda 5 μl av serumprovet med 120 μl av analysbufferten (25-faldig spädning).
    2. Provspädningssteg 2: Späd den 25-faldiga provutspädningen ytterligare 8 gånger genom att blanda 10 μl av utspädningen med 70 μl analysbuffert så att den slutliga provutspädningen blir 200-faldig.
  2. Magnetisk utspädning av pärlblandning
    1. Bered en pärlblandning som innehåller 1,0 × 106 pärlor/ml per pärlpopulation (dvs. per unikt målantigen).
    2. Späd den beredda pärlblandningen 25 gånger i analysbuffert för att få den slutliga pärlkoncentrationen i denna utspädda suspension att nu vara 4 ×10 4 pärlor/ml per pärlpopulation (dvs. per unikt målantigen).
  3. Inkubation av serumprov med pärlor
    1. Pipettera 25 μL utspädd kopplad multiplex pärlsuspension (innehållande 4,0 ×10 4 kulor/set/ml) till tilldelade brunnar med en 96-håls mikrotiterplatta med halv area (materialtabell).
    2. Tillsätt 25 μl 200-faldigt utspätt serumprov (från steg 4.1 ovan) i lämpliga brunnar som innehåller 25 μL kopplad pärlsuspension.
      OBS: Detta ger en ytterligare 2-faldig utspädning, så den slutliga serumprovutspädningen i brunnen är 400-faldig och det slutliga pärlantalet är 1000 pärlor/pärluppsättning/50-μL-reaktion.
    3. Täck reaktionsplattan med 96 brunnar med en mikroplatttätning (självhäftande folie eller plastplattlock).
    4. Inkubationsplattan i 2 timmar vid 20 °C, vid 750 rpm på en plattskakare.
  4. Tvätt av pärlor
    1. Ta bort reaktionsplattan med 96 brunnar från plattskakaren och ta försiktigt bort den självhäftande plattans tätning.
    2. Sätt in reaktionsplattan med 96 brunnar i en plattbricka.
    3. Tvätta pärlorna tre gånger med 100 μL tvättbuffert (1× PBS + 0,05 % v/v Tween 20) med hjälp av den automatiska magnetplattbrickan.
  5. Blanda om tvättade pärlor i 100 μL tvättbuffert, täck plattan med självhäftande folie eller plastplåt och skaka plattan på en plattskakare i 1 minut vid 20 °C vid 1000 rpm.
  6. Dela de tvättade pärlorna
    1. Ta bort reaktionsplattan med 96 brunnar från plattskakaren och ta försiktigt bort den självhäftande plattans tätning.
    2. Blanda reaktioner genom pipettering upp och ner fem gånger och överför 50 μL av varje 100-μL reaktionsvolym till var och en av två nya 96-håls reaktionsplattor, en platta för IgG-detektion och en för IgM-detektion.
  7. Inkubation av antikroppar/reagens för påvisande
    OBS: Vid denna tidpunkt har målantigenkopplade kulor inkuberats med serumprover för att extrahera cirkulerande antikroppar i serum (om sådana finns) som reagerar med antigenet/antigenerna. Reagerade kulor med bundet immunglobulin har delats upp i två plattor, och IgG och IgM detekteras och kvantifieras nu i sina separata plattor med hjälp av isotypspecifika sekundära antikroppar med PE-märkning. Förskjut plåthanteringen med 20 min.
    1. Sug upp supernatanten från brunnarna som innehåller magnetiska pärlor med hjälp av magnetplattbrickan.
    2. För varje platta görs en lämplig blandning av Ig-detektionsreagens (antingen anti-IgG eller anti-IgM), innehållande PE-konjugerad get anti-human-IgG (3 μg/ml) eller PE-konjugerad åsna anti-human IgM (5 μg/ml) i analysbufferten. För varje brunn som innehåller pärlor används 30 μL detektionsreagens. Förbered tillräckliga IgG- och IgM-detektionsreagensvolymer för reaktionsbrunnar, med tillräckligt med extra för att hantera pipetteringsförluster.
    3. Pipettera 30 μL IgG-detektionsreagens i varje brunn som innehåller reagerade pärlor på IgG-plattan och täck 96-hålens reaktionsplatta med en mikroplattförsegling.
    4. Pipettera 30 μL IgM-detektionsreagens i varje brunn som innehåller reagerade pärlor på IgM-plattan och täck 96-hålens reaktionsplatta med en mikroplattförsegling.
    5. Inkubera i 45 minuter vid 20 °C under omskakning vid 750 varv per minut i en plattskakare.
  8. Tvätt av pärlor
    1. Ta bort reaktionsplattan med 96 brunnar från plattskakaren och ta försiktigt bort den självhäftande plattans tätning.
    2. Sätt reaktionsplattan med 96 brunnar i en magnetisk plattbricka.
    3. Tvätta pärlorna tre gånger med 100 μL tvättbuffert med hjälp av magnetplattbrickan.
  9. Återsuspendera pärlorna i 100 μL tvättbuffert.
  10. Analysera resultaten på det enskilda rapportörinstrumentet.
    1. Täck reaktionsplattan med 96 brunnar med en mikroplatttätning.
    2. Skaka reaktionsplattan med 96 brunnar i 3 minuter vid 20 °C, vid 1000 rpm på en plattskakare.
    3. Överför 96-brunnars reaktionsplatta från plattskakaren och sätt i ett flödesanalysinstrument med en rapportör (materialtabell).
    4. För varje prov, analysera medianlysrörsintensiteten (MFI) med hjälp av följande instrumentinställningar: Upptagningsvolym = 80 μL, Count = 50/pärlpopulation, Timeout = 60s, Gating = 7 500-15 000)12,13.

5. Analysförfarande: Dual-reporter IgG och IgM serologisk analys: 96-hålsformat

  1. Provutspädning (2 steg, båda i 96-hålsplattor; 200-faldig serumprovutspädning i analysbuffert)
    1. Provspädningssteg 1: Blanda 5 μl serumprov med 120 μl analysbuffert (25-faldig utspädning).
    2. Provspädning steg 2: Späd de 25-faldiga provspädningarna ytterligare 8 gånger genom att blanda 10 μl av den första spädningen (25-faldigt utspätt prov från punkt 5.1.1) med 70 μl analysbuffert (8-faldig utspädning) för att erhålla slutlig provutspädning till 200-faldigt.
  2. Magnetisk utspädning av pärlblandning
    1. Bered en pärlblandning som innehåller 1,0 × 106 antigenkopplade målkulor/ml per pärlpopulation (dvs. per unikt målantigen).
      OBS: I denna experimentella serie utvärderade vi både IgG- och IgM-immunreaktivitet mot fyra unika Borrelia-antigener i varje reaktion.
    2. Späd den förberedda pärlblandningen 50 gånger i analysbufferten. Pärlkoncentrationen i denna utspädda suspension är nu 2,0 × 104 pärlor/ml per pärlpopulation.
      OBS: Antalet pärlor i duplexanalysreaktionen halveras från det som används i enkelrapportreaktionen för att möjliggöra direkt jämförbarhet mellan de två analyserna och för att spara resurser, efter att preliminära studier bekräftat att fluorescenssignalen bibehölls inom det linjära kvantifieringsområdet vid användning av halva antalet pärlor.
  3. Inkubation av serumprov med pärlor
    1. Pipettera 25 μl utspädd antigenkopplad målpärlsuspension (innehållande 2,0 ×10 4 kulor/set/ml) till förtilldelade brunnar med en 96-håls mikrotiterplatta med halv area. Det exakta antalet reaktionsbrunnar och deras placering på plattan beror på det operatörsbestämda totala antalet testade prover och om enstaka brunnar eller replikatbrunnar kommer att köras per prov.
      OBS: De antigenkopplade magnetiska målpärlorna kommer att reageras med humana serumprover. Både anti-Borrelia-antigen immunoreaktivt IgG och IgM, om de finns i prover, kommer att binda till och immobiliseras på samma antigenkopplade kulor. Sekundär antikroppskvantifiering av bundet IgG och IgM kommer sedan att utföras på samma kulor i samma reaktioner, med användning av olika fluoroforer för IgG- och IgM-identifiering som möjliggör deras differentiering.
    2. Tillsätt 25 μl 200-faldigt utspätt serum (från steg 5.1 ovan) i varje brunn som innehåller 25 μl blandad antigenkopplad pärlsuspension (steg 5.2).
      OBS: Detta ger en ytterligare 2-faldig utspädning, så den slutliga serumprovsutspädningen i brunnen är 400-faldig, och det slutliga pärlantalet är 500 pärlor/pärluppsättning/50-μL-reaktion.
    3. Täck reaktionsplattan med 96 brunnar med en mikroplatttätning (självhäftande folie eller plastplatta).
    4. Inkubera plattan med pärlor i 2 timmar vid 20 °C, vid 750 rpm på en plattskakare.
  4. Pärltvätt (för att ta bort överflödigt serumprov)
    1. Ta bort reaktionsplattan med 96 brunnar från plattskakaren och ta bort den självhäftande plattans tätning.
    2. Sätt reaktionsplattan med 96 brunnar i en magnetisk plattbricka.
    3. Tvätta pärlorna tre gånger med 100 μL tvättbuffert med hjälp av magnetplattbrickan.
  5. Aspirera den slutliga tvättvolymen från pärlor efter det sista tvättsteget.
  6. Detektionsantikropp (Inkubation - Del I)
    1. Gör färskt IgG och IgM Dual Detection Reagens innehållande biotinylerat get-anti-humant IgG (1 μg/ml) tillsammans med PE-konjugerad åsna anti-humant IgM (5 μg/ml) i analysbuffert. För varje brunn som innehåller en sträng används 30 μL dubbeldetektionsreagens. Förbered tillräckliga IgG- och IgM-reagensvolymer med dubbel detektion för reaktionsbrunnar, med tillräckligt med extra för att hantera pipetteringsförluster.
    2. Pipettera 30 μL IgG och IgM Dual Detection Reagens i varje tilldelad brunn och täck 96-hålens reaktionsplatta med en mikroplattförsegling.
    3. Inkubera plattan i 45 minuter vid 20 °C medan du skakar den vid 750 varv per minut i en plattskakare.
  7. Pärltvätt (för att ta bort överflödiga detektionsantikroppar)
    1. Ta bort reaktionsplattan med 96 brunnar från plattskakaren och ta försiktigt bort den självhäftande plattans tätning.
    2. Sätt in reaktionsplattan med 96 brunnar i en automatiserad magnetplattbricka.
    3. Tvätta pärlorna tre gånger med 100 μL tvättbuffert med hjälp av den automatiska magnetplatttvätten.
  8. Aspirera den slutliga tvättvolymen från pärlor efter det sista tvättsteget.
  9. Streptavidin-konjugerad reporter (Inkubation - Del II)
    1. Späd färskt BV421-märkt Streptavidin i analysbuffert till en koncentration av 0,2 μg/ml. För varje pärlhaltig brunn används 30 μL BV421-märkt Streptavidin. Förbered tillräcklig BV421-märkt Streptavidin-volym för reaktionsbrunnar, med tillräckligt med extra för att hantera pipetteringsförluster.
    2. Pipettera över 30 μl utspädd BV421-Streptavidin i varje reaktionsbrunn och täck 96-hålsreaktionsplattan med mikroplattförseglingen.
    3. Inkubera plattan i 30 minuter vid 20 °C medan du skakar den med 750 varv per minut i en plattskakare.
  10. Tvätta pärlor (för att ta bort överskott av BV421-Streptavidin)
    1. Ta bort reaktionsplattan med 96 brunnar från plattskakaren och ta försiktigt bort den självhäftande plattans tätning.
    2. Sätt in reaktionsplattan med 96 brunnar i magnetplattbrickan.
    3. Tvätta pärlorna tre gånger med 100 μL tvättbuffert med hjälp av den automatiska magnetplatttvätten.
  11. Återsuspendera pärlor i brunnar till en slutlig volym på 100 μL i tvättbuffert.
  12. Analysera resultat på instrumentet med dubbla rapportörer
    1. Täck reaktionsplattan med 96 brunnar med en mikroplatttätning.
    2. Inkubera reaktionsplattan med 96 brunnar i 3 minuter vid 20 °C, vid 1000 rpm på en plattskakare.
    3. Överför 96-håls reaktionsplattan från plattskakaren till flödesanalysatorinstrumentet med dubbelrapportör (materialtabell).
    4. Utvärdera sample median fluorescerande intensitet (MFI) enligt tillverkarens instruktioner (Instrumentinställningar: Dual-Reporter-läge, upptagningsvolym = 80 μL, antal = 50/pärlpopulation, Timeout = 60s, Gating = 7 500-15 000).

6. Dual reporter IgG och IgM serologisk analys: 384-brunnars halvautomatiskt format

  1. Utför dubbelrapportanalysen i 384-brunnars plattformat med hjälp av analysstegen som beskrivs i avsnitt 5, men bearbeta proverna med hjälp av en pipetteringsrobot och automatiserad magnetisk plattbricka (materialtabell). I 384-brunnsformat, skaka plattorna under inkubationer och tvättar vid 1450 rpm, och innan du mäter fluorescens, skaka plattan i 5 minuter vid 21 °C och 1800 rpm.

Representative Results

Experimentell översikt
De allmänna schemana för de enkel- och dubbelrapportörsbaserade Borrelia-analyserna visas i figur 1. För enskilda antikroppsmål (dvs. IgG eller IgM) som genererats mot ett givet Borrelia-antigen utvärderades båda antikroppsklasserna oberoende av varandra i humana serumprover med hjälp av en PE-konjugerad antiisotypantikropp för rapportering. För dubbelrapportanalysen med samtidig analys av både IgG- och IgM-immunreaktivitet använde Borrelia-antigenspecifik IgG-detektion ett biotinylerat antihumant IgG + BV421-märkt Streptavidin-rapporteringssystem (blå fluorescens), samtidigt som den PE-konjugerade reportern (orange fluorescens) bibehölls för IgM-detektion. Arbetsflödet för analysen med dubbla rapportörer liknar analysen med en rapportör, med undantag för ytterligare en 30-minuters inkubation av detektionssystemet med det andra kanalens fluorescensdetektionsreagens BV421-Streptavidin.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av de enkel- och dubbelrapportörsbaserade Borrelia-analyserna . (A) Instrumentet med en rapportör användes för att utveckla och initialt validera den pärlbaserade analysen som karakteriserade antingen anti-Borrelia IgG eller IgM individuellt, båda med hjälp av en fluorescerande reporteretikett för fykoerytritin (PE) som avger signal i det "orangea" spektra. Vilket Borrelia-antigen som helst kan kopplas till kulorna och användas för att fånga upp och kvantifiera antingen IgG eller IgM som finns i serumprover. Två separata immunanalyser behövs för att utvärdera både IgG- och IgM-reaktivitet mot ett givet antigen. B) Systemet med dubbla rapportörer gjorde det möjligt att samtidigt analysera serumprover med avseende på både IgG- och IgM-antikroppar mot varje enskilt borreliaantigen i samma brunn. Detta tillvägagångssätt använder samma PE-konjugerade detektionsantikropp för att rikta in sig på anti-Borrelia IgM, men ersätter IgG-detektionen från ett PE-baserat system till att använda en biotinylerad primär detektionsantikropp och BV421-märkt Streptavidin (en "blå" emitter) som behöver ett ytterligare inkubationssteg för detektionssystemet på 30 minuter. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Precision inom analys
Spearmans korrelationsanalys för tre representativa Borrelia-antigener (Figur 2) visade enhetlig reproducerbarhet av MFI-värden vid detektion av anti-Borrelia-antikroppar närvarande i humant serum.

Figure 2
Figur 2: Intra-analys Precision för den dubbelrapporterande pärlbaserade Borrelia-analysen . Spearmans korrelationsanalys visade en hög intra-analysprecision hos dual-reporter-analysen när ett PE-detektionssystem användes för att detektera Borrelia-specifika IgM-antikroppar (A) och ett BV421-detektionssystem användes för att detektera Borrelia-specifika IgG-antikroppar (B, C). Totalt 21 serumprover analyserades i duplikat med hjälp av en halvautomatisk procedur. I varje graf plottades MFI-signaler mot varandra och analyserades med linjär regression. En linjär kurva (x=y) som visas som en röd streckad linje indikerar identiska MFI-signaler för detekteringssystem. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Precision mellan analyser
God reproducerbarhet från analys till analys observerades med dubbelrapportanalysen. Levey-Jennings-diagram (figur 3) med MFI-värden för ett kvalitetskontrollprov uppmätt över sju oberoende omgångar visade den höga interanalysprecisionen för alla representativa antigener. Den genomsnittliga procentuella variationskoefficienten (CV% = standardavvikelse/medelvärde × 100) för de fyra representativa Borrelia-antigenerna var 5,3 %.

Linjäritet vid utspädning
Eftersom den ursprungliga single-reporter-analysen och den nya dual-reporter-analysen använder olika flödescytometriska plattformar, jämförde vi medianfluorescensutgångarna för samma antigenimmunanalys mellan de två flödescytometriinstrumenten (figur 4). Provspädningsserierna gav linjära utspädningskurvor för både IgM- och IgG-utvärdering, med god parallellitet i dos-respons mellan instrumenten genom hela det utvärderade utspädningsintervallet (1:100-1:12,800).

Figure 3
Figur 3: Precisionen mellan analyserna för den dubbelrapportör pärlbaserade Borrelia-analysen . För utvärdering av interanalysprecisionen analyserades Borrelia-specifikt IgM (A) och IgG (B-D) antikroppssvar från ett kvalitetskontrollprov över sju oberoende körningar, i dubbla brunnar varje gång. Analyserna utfördes manuellt. MFI-värden plottades i ett Levey-Jennings-diagram. En grön linje ger medelvärdet av alla värden. Två röda streckade linjer anger toleransområdet för interanalysprecisionen. Detta beräknades utifrån medelvärdet ± 2,5 gånger standardavvikelsen (2,5 SD). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Utspädningslinjäritet för den dubbelrapportörsbaserade Borrelia-analysen . Vid provutspädningar på 100-faldiga till 12 800-faldiga var utspädningskurvorna för både IgM-detektion (A) och IgG-detektion (B) likartade när de utfördes manuellt med instrumentet med en rapportör och instrumentet med två rapporter. Vid alla testade spädningar var MFI-värdena något högre med instrumentet med en rapportör (röda symboler) än med instrumentet med dubbel rapportör (blå symboler). Utspädningskurvor för 2 representativa antigener visas, där varje utspädningspunkt representerar den genomsnittliga mätningen av tre brunnar med standardavvikelse (SD *) indikerad av felstaplar. Notera: Små SD är inte synliga i denna skala. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande material. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Denna rapport belyser utvecklingen av en två-rapportör pärlbaserad Borrelia immunanalys som reproducerbart och känsligt bestämmer anti-Borrelia immunreaktivitet i serumprover12. De olika patogena borreliaarterna som orsakar borrelia kan särskiljas genom variantspecifik antigenheterogenitet 6,7,8,9. Den multiplexerade analysen utvärderar samtidigt IgG- och IgM-medierad anti-Borrelia-immunreaktivitet inom samma reaktionsbrunn, och bevarar därigenom reagenser, arbetskraft och provmaterial som annars behövs för att utföra två singleplex-analyser separat. Jämförelse av IgM- och IgG-svar över tid kan möjliggöra bättre spårning av sjukdomsprogression eftersom IgM-till-IgG-serokonversion inträffar efter infektion6.

Systemet med dubbla rapportörer använder två olika detektionsantikroppssystem13,15. Relaterade experiment visade ingen signifikant detekterbar korsreaktivitet mellan Borrelia anti-IgM- och anti-IgG-detektionssystem när båda antikroppsklasserna analyserades tillsammans i samma reaktionsbrunn12. Med tanke på den lägre bindningsaffiniteten hos IgM jämfört med IgG-antikroppar16,17 valde vi en PE-konjugerad detektionsantikropp för IgM-detektion (den första reporterkanalen för instrumentet med dubbla rapportörer) eftersom PE är en av de starkast emitterande fluoroforerna som rutinmässigt används i immunanalyser18. För IgG-utvärdering använde vi en biotinylerad detektionsantikropp som därefter belystes med BV421-konjugerat streptavidin (instrumentets andra rapportkanal)19. Trots det extra inkubationssteget på 30 minuter jämfört med systemet med en rapportör, ger systemet med dubbla rapportörer dubbelt så mycket information per reaktion. Sammantaget kräver den multiplexerade analysen med dubbla rapportörer mindre kumulativ tid och materialinmatningar än att köra två analyser med en rapportör.

Stark prestanda och stabilitet hos den multiplexerade Borrelia-analysen exemplifierades av hög reproducerbarhet i precisionsstudier inom och mellan analyser, och genom demonstration av utspädningslinjäritet och utspädningsparallellitet över ett brett spektrum av provkoncentrationer för både IgG- och IgM-bedömning. Vi observerade högre absoluta fluorescensemissionsnivåer för samma fluoroforer med enkanalsinstrumentet jämfört med tvåkanalssystemet (≈1,7× högre med PE), vilket kan tillskrivas skillnader i optik och kalibreringsinställningar mellan de två instrumenten (figur 4). Icke desto mindre förblev fluorescensemissionskurvorna med båda fluoroforerna inom det linjära intervallet för båda instrumenten vid höga och låga utspädningsextremer, och eventuella avvikelser i uppmätt absolut fluorescens påverkade inte klassificeringen av borreliaexponeringsstatus . 12

En stor fördel med denna pärlbaserade Borrelia multiplex-analys är den lätthet med vilken analysen kan modifieras eller utökas för att utvärdera olika eller ytterligare analyter, t.ex. för att detektera antikroppar mot antigener från ytterligare Borrelia-arter . xMAP magnetiska pärluppsättningar innehåller olika färgkombinationer som kan särskiljas i instrumentets klassificeringskanal och kan teoretiskt implementeras i multiplexanalyser som samtidigt kan utvärdera upp till 500 unika analyter inom samma prov. Medan den aktuella studien lyfter fram fyra representativa Borrelia-antigener för att demonstrera analysens funktionalitet och stabilitet och för att jämföra single- och dual-reporter-systemet, undersöker den slutliga analysen åtta antigener som tillsammans kan identifiera alla fem kliniskt relevanta Borrelia-patogener som cirkulerar i Europa och Nordamerika12.

Hög genomströmningsprestanda är möjlig med hjälp av standard 384-håls mikrotiterplattor i ett halvautomatiskt analysformat. Analys- och instrumentkompatibilitet med både 96- och 384-brunnsplattor gör att Borrelia-multiplexanalysen kan användas som ett effektivt screeningverktyg för att snabbt analysera stora provuppsättningar, såsom nationella studier20. Manuell utförande av analysen är fortfarande möjlig för mindre provuppsättningar med mindre 96-hålsplattor.

Studiens begränsningar inkluderar jämförande utvärdering av endast ett fåtal Borrelia-immunreaktivitetsmål i ett litet antal humana serumprover. Den ursprungliga studien bekräftade dock att analysprestanda för både IgG och IgM bibehölls vid analys av åtta antigener från alla fem kända Borrelia-arter inom en större provuppsättning12. Dessutom kan instrumentet med dubbla rapportörer endast bedöma två antikroppsisotyper samtidigt inom varje reaktion, så fullständig isotypprofilering skulle kräva att ytterligare analysreaktioner utförs13.

Sammanfattningsvis beskriver denna rapport den framgångsrika sammanslagningen och omvandlingen av pärlbaserade single-reporter immunoassays till dual-reporter-analyser som samtidigt kan utvärdera patogena Borrelia-specifika IgG- och IgM-antikroppar i humana serumprover. Detta kombinerade tillvägagångssätt sparar total tid, material och arbetsinsatser för att generera samma datavolym som två oberoende analyser med en rapportör. Multiplexanalysen kan skalas från 96-brunnars till 384-brunnars mikrotiterplattformat och kan halvautomatiseras med hjälp av robotplatt- och vätskehanteringsinstrument, vilket gör den lämplig för applikationer med hög genomströmning som stora befolkningsundersökningar. Pärlbaserade analyssystem med dubbla rapportörer har tidigare visat sig vara användbara för att utvärdera till exempel immunsvar mot andra virala och bakteriella patogener13,21, bedöma allogena antikroppssvar mot HLA-epitoper vid organtransplantation22 och utforska mekanismer för autoimmun sjukdom23. Den aktuella rapporten beskriver användningen av multiplexteknik för att identifiera exponering för Borrelia-patogener som orsakar Lyme-borrelios, som ett exempel på hur laboratorier kan anpassa detta tillvägagångssätt för att utforska komplexa immunmekanismer i olika patologier.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna rapport finansierades av Luminex (Austin, TX). Författarna tackar Matthew Silverman, PhD (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, Florida; mattsilver@yahoo.com) för analytisk och vetenskaplig redigeringshjälp. Författarna tackar också Harald Klein och Christoph von Eichel-Streiber från tgcBIOMICS GmbH (Bingen, Tyskland) för att ha tillhandahållit de Borrelia-antigener som användes i studien. Humana serumprover för teknisk analysvalidering och kvalitetskontroll erhölls från: 1) Multilocal and Serial Prevalence Study on Antibodies against SARS-CoV-2 i Tyskland via Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research, Braunschweig, Tyskland; och 2)Neurologiska kliniken, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Tyskland). Godkännande för användning av humanprover beviljades av etikkommittén vid Hannover Medical School, Tyskland (9086_BO_S_2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies and Detection Reagents Source Catalog Number
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Jackson ImmunoResearch (Dianova) 109-066-098 
Brilliant Violet 421-Streptavidin BD Biosciences 563259
Donkey Anti-Human IgM  Jackson ImmunoResearch (Dianova) 709-116-073
Borrelia Antigens tgcBIOMICS (Bingen, Germany)
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific Pierce 77149 ProteoChem (100 mg)
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
BSA Carl Roth T844.3
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) Carl Roth 4256.2
Na2HPO4 Carl Roth 4984.1
ProClin300 Sigma 48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Scientific Pierce 24510 (500 mg)
Triton X-100 Thermo Scientific 85111
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies Source
384-well plate Corning, Cat# 3570
96-well deep-well plates ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-well half-area plates  Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
BioTek MultiFlo FX Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates)  ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp., Austin, TX
SmartBlock Plates Eppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer C Eppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTop Eppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stanek, G., Strle, F. Lyme borreliosis-from tick bite to diagnosis and treatment. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 233-258 (2018).
  2. Stanek, G., Wormser, G. P., Gray, J., Strle, F. Lyme borreliosis. The Lancet. 379 (9814), 461-473 (2012).
  3. Rizzoli, A., et al. Lyme borreliosis in Europe. Eurosurveillance. 16 (27), 19906 (2011).
  4. Cook, M. J. Lyme borreliosis: a review of data on transmission time after tick attachment. International Journal of General Medicine. 8, 1-8 (2015).
  5. Strle, F., Stanek, G. Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme Borreliosis. Lyme Borreliosis: Biological and Clinical Aspects. Lipsker, D., Jaulhac, B. , Karger. 51-110 (2009).
  6. Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 49 (1), 13-21 (2007).
  7. Dessau, R. B., et al. To test or not to test? Laboratory support for the diagnosis of Lyme borreliosis: a position paper of ESGBOR, the ESCMID study group for Lyme borreliosis. Clinical Microbiology and Infection. 24 (2), 118-124 (2018).
  8. Eldin, C., et al. Review of European and American guidelines for the diagnosis of Lyme borreliosis. Médecine et Maladies Infectieuses. 49 (2), 121-132 (2019).
  9. Lantos, P. M., et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America (IDSA), American Academy of Neurology (AAN), and American College of Rheumatology (ACR): 2020 Guidelines for the Prevention, Diagnosis and Treatment of Lyme Disease. Clinical Infectious Diseases. 72 (1), e1-e48 (2021).
  10. Gerritzen, A., Brandt, S. Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology. Methods. 56 (4), 477-483 (2012).
  11. Embers, M. E., et al. Five-antigen fluorescent bead-based assay for diagnosis of Lyme disease. Clinical Vaccine Immunology. 23 (4), 294-303 (2016).
  12. Häring, J., et al. Borrelia multiplex: a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of Borrelia specific IgG/IgM class antibodies. BMC Infectious Diseases. 22 (1), 859 (2022).
  13. Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  14. Gornyk, D., et al. SARS-CoV-2 Seroprevalence in Germany. Deutsches Ärzteblatt International. 118 (48), 824-831 (2021).
  15. Luminex Corporation. xMAP Cookbook. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. , 5th ed, https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrer=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. Racine, R., Winslow, G. M. IgM in microbial infections: Taken for granted. Immunology Letters. 125 (2), 79-85 (2009).
  17. Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).
  18. Kovaleski, G., et al. Extraction and purification of phycobiliproteins from algae and their applications. Frontiers in Chemistry. 10, 1065355 (2022).
  19. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).
  20. Coors, A., et al. Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany. Parasites & Vectors. 15 (1), 241 (2022).
  21. Gürsoy, M., et al. Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn's Disease. International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385 (2023).
  22. Argani, H. Anti-HLA Antibody: The role of epitopes in organ transplantation. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (Suppl 1), 38-42 (2019).
  23. Laman, J. D., Huizinga, R., Boons, G. J., Jacobs, B. C. Guillain-Barré syndrome: expanding the concept of molecular mimicry. Trends in Immunology. 43 (4), 296-308 (2022).

Tags

Samtidig detektion antikroppsklasser multiplexerat serologiskt test immunreaktivitet antigena determinanter antikroppsisotyper borreliaborrelios borreliaarter provklassificering immunreaktivitet mot olika antigener antipatogen IgG IgM-svar sjukdomsprogression två-rapportör multiplex immunanalys borreliaspecifikt immunsvar humana serumprover bakteriella antigener dual-reporter-metod analytisk prestanda tids- och resursbevarande provstorlek Krav

Erratum

Formal Correction: Erratum: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test
Posted by JoVE Editors on 08/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. The Authors section was updated to correct an Affiliation. It was updated from:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute, University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

to:

Julia Häring1
Tanja Michel1
Matthias Becker1
Daniel Junker1
Tatia Tchitchagua2
Olaf Leschnik2
Berit Lange3,4
Stefanie Castell3,4
Gérard Krause3,4
Monika Strengert3
Alex Dulovic1
Nicole Schneiderhan-Marra1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen
2Department of Neurology, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research
4German Centre for Infection Research (DZIF)

Samtidig påvising av olika antikroppsklasser i ett multiplexerat serologiskt test
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Häring, J., Michel, T., Becker, … More

Häring, J., Michel, T., Becker, M., Junker, D., Tchitchagua, T., Leschnik, O., Lange, B., Castell, S., Krause, G., Strengert, M., Dulovic, A., Schneiderhan-Marra, N. Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. J. Vis. Exp. (197), e65323, doi:10.3791/65323 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter