Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generering og manipulation af rottetarmorganoider

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65343
Automatic Translation
*1, *1,2, 3,4, 1,5,6
1Department of Genetics, Yale School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Yale School of Medicine, 3Department of Pediatrics/Gastroenterology and Hepatology, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 5Yale Stem Cell Center, Yale School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en protokol til generering af rottetarmorganoider og bruger dem i flere downstream-applikationer. Rotter er ofte en foretrukken præklinisk model, og det robuste tarmorganoidsystem udfylder behovet for et in vitro-system til at ledsage in vivo-undersøgelser .

Abstract

Når du bruger organoider til at vurdere fysiologi og celleskæbnebeslutninger, er det vigtigt at bruge en model, der nøje rekapitulerer in vivo-sammenhænge . Derfor anvendes patientafledte organoider til sygdomsmodellering, lægemiddelopdagelse og personlig behandlingsscreening. Musens tarmorganoider bruges almindeligvis til at forstå aspekter af både tarmfunktion / fysiologi og stamcelledynamik / skæbnebeslutninger. I mange sygdomssammenhænge foretrækkes rotter imidlertid ofte frem for mus som model på grund af deres større fysiologiske lighed med mennesker med hensyn til sygdomspatofysiologi. Rottemodellen har været begrænset af mangel på genetiske værktøjer til rådighed in vivo, og rottetarmorganoider har vist sig skrøbelige og vanskelige at dyrke på lang sigt. Her bygger vi videre på tidligere offentliggjorte protokoller for robust at generere rottetarmorganoider fra tolvfingertarmen og jejunum. Vi giver et overblik over flere downstream-applikationer, der bruger rottetarmorganoider, herunder funktionelle hævelsesanalyser, helmonteret farvning, generering af 2D enteroide monolag og lentiviral transduktion. Rotteorganoidmodellen giver en praktisk løsning på feltets behov for en in vitro-model , der bevarer fysiologisk relevans for mennesker, hurtigt kan genmanipuleres og let opnås uden de barrierer, der er involveret i anskaffelse af humane tarmorganoider.

Introduction

Den menneskelige tyndtarmepitelarkitektur og cellulære sammensætning er komplekse, hvilket afspejler deres fysiologiske funktioner. Tyndtarmens primære rolle er at absorbere næringsstoffer fra mad, der passerer gennem dens lumen1. For at maksimere denne funktion er tarmoverfladen organiseret i fingerlignende fremspring kaldet villi, som øger det absorberende overfladeareal og koplignende invaginationer kaldet krypter, som huser og isolerer stamcellerne. Inden for epitelet genereres forskellige specialiserede absorberende og sekretoriske celletyper for at udføre forskellige funktioner1. På grund af denne kompleksitet har det været vanskeligt at modellere væv som tarmen i høje passagetransformerede udødeliggjorte cellelinjer. Undersøgelsen af stamceller, især voksne stamceller og deres differentieringsmekanismer, har imidlertid muliggjort udviklingen af 3D intestinale organoidkulturer. Brugen af organoidmodeller har transformeret feltet, dels på grund af deres rekapitulation af nogle arkitektoniske komponenter og celletypeheterogenitet, der findes i den intakte tarm. Intestinale organoider kan dyrkes på lang sigt in vitro på grund af vedligeholdelsen af den aktive stamcellepopulation2.

Tarmorganoider er hurtigt blevet en tilpasningsdygtig model til at studere stamcellebiologi, cellefysiologi, genetisk sygdom og ernæring 3,4 samt et værktøj til at udvikle nye lægemiddelleveringsmetoder5. Derudover anvendes patientafledte organoider til sygdomsmodellering, lægemiddelopdagelse og personlig behandlingsscreening, blandt andet 6,7,8,9. Imidlertid udgør menneskelige tarmorganoider stadig udfordringer. Vævstilgængelighed, krav til godkendelse fra Institutional Review Board og etiske spørgsmål begrænser den udbredte anvendelse af humane prøver. Derudover kræver humane tarmorganoider genereret fra tarmkrypter to forskellige dyrkningsbetingelser for vedligeholdelse af udifferentierede stamceller eller for at inducere differentiering af modne celletyper10. Dette står i kontrast til in vivo, hvor stamceller og modne differentierede celletyper er til stede samtidigt og kontinuerligt genereres/vedligeholdes1. På den anden side kræver musens tarmorganoider, der dyrkes i en mindre kompleks cocktail af vækstfaktorer, ikke dette skift i mediesammensætning og kan opretholde stamceller og differentierede celler i samme mediekontekst 2,11. Imidlertid kan nøgleforskelle i musetarm sammenlignet med mennesker gøre museorganoider til en suboptimal model i mange tilfælde. Samlet set er mange tarmorganoider fra større pattedyr, herunder heste, svin, får, køer, hunde og katte, med succes blevet genereret under dyrkningsforhold, der er tættere på linje med musetarmorganoider end dyrkningsbetingelserne for humane tarmorganoider12. Forskellene i vækstfaktorbetingelser mellem mus og humane organoider afspejler sandsynligvis forskelle i stamcellenichesammensætning og forskellige krav til stamcelleoverlevelse, spredning og vedligeholdelse. Derfor er der behov for et let tilgængeligt modelorganoidsystem, der 1) ligner menneskets tarmcellesammensætning, 2) indeholder stamceller med vækstfaktorkrav som humane tarmorganoider, og 3) er i stand til kontinuerligt at opretholde udifferentierede og differentierede rum. Ideelt set ville systemet være fra en almindeligt anvendt præklinisk dyremodel, således at in vivo- og in vitro-forsøg kan korreleres og anvendes sammen.

Rotter er en almindeligt anvendt præklinisk model til tarmfysiologi og farmakologiske undersøgelser på grund af deres meget lignende tarmfysiologi og biokemi som mennesker13, især med hensyn til tarmpermeabilitet14. Deres relativt større størrelse sammenlignet med mus gør dem mere modtagelige for kirurgiske procedurer. Mens store dyremodeller, herunder svin, undertiden bruges, er rotter en mere overkommelig model, kræver mindre plads til husdyrhold og har let kommercielt tilgængelige standardstammer15. En ulempe ved at bruge rottemodeller er, at den genetiske værktøjskasse til in vivo-undersøgelser ikke er veludviklet sammenlignet med mus, og genereringen af nye rottelinjer, herunder knockouts, knock-ins og transgener, er ofte omkostningsuoverkommelig. Udvikling og optimering af en robust tarmorganoidmodel med rotter vil muliggøre genetisk manipulation, farmakologiske behandlinger og undersøgelser med højere gennemstrømning i en tilgængelig model, der bevarer vigtig fysiologisk relevans for mennesker. Imidlertid er fordelene ved en gnaverorganoidmodel versus en anden stærkt afhængig af den særlige proces eller det gen, der undersøges; Visse gener, der findes hos mennesker, kan være pseudogener hos mus, men ikke rotter16,17. Derudover afsløres artsspecifikke celleundertyper i stigende grad af enkeltcelle RNAseq18,19,20. Endelig viser tarmsygdomsmodeller hos rotter og mus ofte betydelige variationer i fænotype21,22, således at den model, der i højere grad rekapitulerer symptomerne og sygdomsprocessen hos mennesker, skal vælges til downstream-arbejde. Genereringen af en rottetarmorganoidmodel giver forskerne yderligere fleksibilitet og valgmuligheder med hensyn til at vælge et modelsystem, der passer bedst til deres omstændigheder. Her udvides eksisterende protokoller23,24 til generering af rottetarmorganoider, og der skitseres en protokol for generering og vedligeholdelse af rottetarmorganoider fra tolvfingertarmen eller jejunum. Desuden, flere downstream applikationer, herunder lentiviral infektion, hele mount farvning, og forskolin hævelse assays, er beskrevet.

Protocol

BEMÆRK: Al cellekultur skal håndteres ved hjælp af korrekt aseptisk teknik i en vævskulturhætte. Alt dyrearbejde i denne undersøgelse blev godkendt af Yales Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Fremstilling af cellekulturreagenser

  1. Forbered R-spondin 1 konditionerede medier ved at følge producentens anvisninger. Forbered Wnt3a-konditionerede medier ved at følge producentens anvisninger. Forbered AdDMEM+ som beskrevet i tabel 1.
  2. Gastrin resuspenderes i sterildH2Ofor at fremstille en 100 μM stamme. Alikvote og opbevares ved -80 °C. Resuspender N-acetylcystein i sterilt vand for at forberede en 100 mM bestand. Alikvote og opbevares ved -20 °C i op til 1 måned.
  3. Resuspendering af rekombinant humant Noggin i fosfatbufferet saltvand (PBS) + 0,1 % bovint serumalbumin (BSA) for at fremstille en bestand på 250 μg/ml. Alikvote og opbevares ved -80 °C. Resuspendering af rekombinant epidermal vækstfaktor hos mus (EGF) i PBS + 0,1 % BSA for at forberede en bestand på 100 μg/ml. Alikvote og opbevares ved -80 °C.
  4. Fortynd rekombinant human IGF-1 i PBS + 0,1% BSA for at forberede en 100 μg / ml bestand. Alikvote og opbevares ved -80 °C. Resuspendering af rekombinant human FGF-2 i 5 mM Tris, pH 7,6, for at forberede en 100 μg/ml stamme. Alikvote og opbevares ved -80 °C.
    BEMÆRK: For alle vækstfaktorer anvendes en mellemfortynding i PBS + 0,1 % BSA til 100x den endelige koncentration i dyrkningsmediet. Opbevares ved -20 °C.

2. Etablering af tyndtarmsorganoider hos rotter

BEMÆRK: Denne protokol blev modificeret fra to tidligere offentliggjorte protokoller for tarmorganoiderhos rotter 23,24.

  1. Forbered tarmorganoidmedier hos rotter (rIOM) i henhold til tabel 2 , og indstil et vandbad ved 37 °C. Dette komplette substrat er stabilt i 5 dage ved 4 °C.
  2. Forbered 10 ml 3 ml ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i PBS i et 15 ml konisk rør og hold på is. Optø 250 μL ekstracellulært matrixekstrakt (EME) på is.
  3. Hurtig en rotte natten over med adgang til vand ad libitum. Aflive rotten i henhold til den IACUC-godkendte protokol. I denne protokol blev voksne mandlige Sprague Dawley-rotter (vejer ~ 200 g) aflivet via CO2 -indånding (materialetabel). Cervikal dislokation blev brugt som en sekundær metode til eutanasi.
  4. Brug steril autoklaveret tang og dissektionssaks til dissektion. Placer den aflivede rotte på dissektionsoverfladen ventral side opad. Klem hudlaget med tang; Følgende nedskæringer skal udføres på overfladeniveau, så de skærer kun gennem dette hudlag og ikke dybt nok til at beskadige indre organer.
  5. For at åbne bukhulen skal du skære gennem hudlaget ved hjælp af en stor, skarp dissektionsaks i et stort, langsgående snit på overfladeniveau i midten af maven. Derefter, der stammer fra dette snit, skal du lave to kortere vandrette snit, et på hver side. Brug tang til at skrælle huden væk for at udsætte bughulen. Skær gennem peritonealmembranen for fuldt ud at udsætte de indre organer i bukhulen med let adgang til tarmen.
  6. Brug saks og tang til at lokalisere maven og identificere tolvfingertarmen ca. 2-3 cm distalt til den, der fremstår som et gulligt segment. Den proksimale jejunum ligger ca. 4-5 cm distal til ledbåndet i Treitz, som tjener som et vartegn mellem tolvfingertarmen og jejunum.
  7. Placer det isolerede tarmfragment i en 10 cm petriskål. Rens det ønskede tarmsegment af mesenteri så meget som muligt. Skyl med 10 ml iskold PBS, indtil det er renset for luminalt indhold. På et papirhåndklæde skæres tarmsegmentet i ~ 2 cm lange stykker. Åbn hvert tarmstykke i længderetningen for at udsætte epitelet.
  8. Brug et glasmikroskopglas til at skrabe den udsatte luminale overflade for at fjerne villi. Anbring tarmstykker i den tilberedte EDTA-opløsning på is. Drej ved 4 °C i 30 minutter på en rørrevolver, der er indstillet til 10 omdr./min.
  9. Ved dissekeringsmikroskopet hældes indholdet af det koniske rør i en 10 cm petriskål. Tilføj yderligere ~ 5 ml iskold PBS.
  10. Brug fine tang, hold et tarmsegment og ryst kraftigt. Det vil være muligt at se epitelfrigivelsen i PBS. I første omgang vil PBS primært indeholde villi.
  11. Fortsæt med at ryste. Kassér regelmæssigt PBS indeholdende villi og tilsæt 10 ml frisk iskold PBS til tarmfragmenterne. Fortsæt med at ryste fragmenterne og gentag dette vasketrin, indtil villi ikke længere frigives i PBS, men i stedet indeholder PBS primært krypter. Overskrid ikke 15 min til kryptisolering, så cellelevedygtigheden ikke kompromitteres.
  12. Kassér de resterende tarmfragmenter. Berig den resterende PBS i petriskålen til tarmkrypter. I en vævskulturhætte samles de PBS-holdige krypter og filtreres gennem en 70 μm cellesil (materialetabel).
  13. Centrifuger ved 250 x g i 5 min. Supernatanten fjernes og pelletsen resuspenderes i 5 ml AdDMEM+. Centrifuger igen ved 250 x g i 5 min.
    BEMÆRK: Det anbefales at bruge en centrifuge med en svingskovlrotor.
  14. Supernatanten fjernes, og pelletsen efterlades ~50 μL medie. Pellet resuspenderes i det resterende medie og tilsættes til alikvoten af EME på is. Pipette forsigtigt op og ned for at ophænge krypterne jævnt i hele EME. Undgå at indføre bobler.
  15. Plade 50 μL EME-kupler i en 35 mm vævskulturskål og inkuberes i 20 minutter i en 37 °C, 5 % CO2 vævskulturkuvøse.
  16. Der tilsættes 2 ml rIOM (tabel 2) indeholdende 10 μM Y27632 og 10 μM CHIR99021 (tabel 3). Efter passaging kan Y27632 og CHIR99021 seponeres.
  17. Skift rIOM hver 2-3 dage. Passage efter behov, normalt mellem 3-7 dage, afhængigt af det oprindelige antal organoider, størrelse og væksthastighed.

3. Passaging rotte tarmorganoider

  1. Der optøs en 250 μL delprøve EME på is, og rIOM forvarmes til 37 °C.
  2. Substratet suges ud af en 35 mm plade, der indeholder organoider, og der tilsættes 1 ml dissociationsreagens for straks at frigøre organoiderne fra EME-kuplerne.
  3. Overfør straks dissociationsreagens med fragmenterede organoider til et 15 ml konisk rør. Kulturpladen vaskes med 2 ml AdDMEM+ og tilsættes til det 15 ml koniske rør, der indeholder fragmenterede organoider.
  4. Med en glaspasteurpipette pipetteres forsigtigt op og ned 15-20 gange for at fragmentere organoiderne. Der centrifugeres ved 350 x g i 2 min.
  5. Tilsæt ~ 50 μL opløsning fra bunden af det koniske rør ind i EME. Pipette forsigtigt op og ned for at blande. Undgå at lave bobler.
  6. Plade 50 μL EME-kupler i en 35 mm skål og inkuberes i 20 minutter i en 37 °C, 5 % CO2 vævskulturkuvøse.
  7. Der tilsættes 2 ml rIOM med 10 μM Y27632 og 10 μM CHIR99021. Skift vækstmediet hver 2-3 dage. Når du skifter medie, kan Y27632 og CHIR99021 udelades.

4. Kryopræservering og optøning af rottetarmorganoider

  1. Kryokonservering af tarmorganoider hos rotter
    BEMÆRK: Kryopræserveringsprotokollen blev ændret fra en tidligere protokol for organoider fra mennesker og mus25. Før frysning skal organoiderne have mindst to passager i primærkulturen. Det er tilrådeligt at dyrke organoider til det punkt af store sfæroider eller let knoppede organoider før kryopræservering, da dette vil resultere i et højere udbytte af levedygtige organoider efter optøning. Dette kan opnås ved at øge det R-spondinkonditionerede medie til 15% og/eller ved at tilsætte 10 mM nikotinamid (tabel 3) til organoidkulturen.
    1. Brug et mikroskop til at tælle antallet af organoider på 35 mm skålen. Mærk cryovialerne således, at 200 organoider vil blive aliquoteret i hver cryovial.
    2. Fjern rIOM fra 35 mm skålen. Udskift med 2 ml koldvævskulturklasse PBS.
    3. Brug en P1000-spids til at frigøre EME-kuplerne fra bunden af kulturskålen til PBS ved at pipettere op og ned. Fortsæt med at pipette op og ned ~ 20 gange for at bryde EME op og frigive organoiderne. Organoiderne og PBS samles i et 15 ml konisk rør.
    4. Tilsæt 2 ml kold PBS til kulturskålen og pipette op og ned for at frigive eventuelle resterende organoider i PBS. Overfør PBS til det koniske rør på 15 ml.
    5. Pellet organoiderne ved centrifugering ved 290 x g i 5 min. Supernatanten fjernes og kasseres, uden at den organoide pellet forstyrres.
    6. Pelleten vaskes forsigtigt ved at resuspendere i 5 ml kold AdDMEM+. Der centrifugeres ved 200 x g i 4 min. Supernatanten fjernes forsigtigt og kasseres.
    7. Resuspender organoidpelleten i 1 ml koldfrysemedium pr. 200 organoider. Alikvote 1 ml organoider i frysemedium pr. mærket kryovial. Anbring cryovialerne i en frysebeholder.
    8. Organoiderne opbevares i en frysebeholder ved -80 °C i 24 timer, hvorefter kryoialerne overføres til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
  2. Optøning af rotte tarmorganoider
    BEMÆRK: Denne protokol blev ændret fra en tidligere protokol for optøning af tarmorganoider hos mennesker og mus26.
    1. Der optøes en 250 μL delprøve EME på is. Forbered rIOM suppleret med 15% R-spondin konditionerede medier, 10 μM Y27632 og 10 μM CHIR99021. Varm ved 37 °C.
    2. Tilsæt 2 ml afrimningsmedium (tabel 3) til et 15 ml konisk rør ved stuetemperatur.
    3. Udtag og tø et hætteglas med organoider op fra flydende nitrogen ved at anbringe hætteglasset i et 37 °C vandbad, indtil hætteglasset er næsten helt optøet.
    4. Tilsæt 1 ml optøningsmedium til hætteglasset og overfør alt indholdet til det koniske rør indeholdende optøningsmediet. Vask hætteglasset to gange med 1 ml optøningsmedium og overfør det til det koniske rør.
    5. Centrifuger ved 200 x g i 5 min. Aspirer medierne og efterlader ~ 50 μL medium med organoiderne. Mediet, der indeholder organoider, overføres til 250 μL EME.
    6. Fordel organoiderne jævnt gennem EME ved at pipettere op og ned og undgå bobler. Pipetter seks 50 μL kupler i en 35 mm vævskulturskål.
    7. Inkuberes i vævskulturinkubatoren i 15-20 minutter for at lade EME polymerisere. Tilsæt 2 ml af den tilberedte rIOM til fadet.
    8. Efter 2 dage skal du udskifte mediet med rIOM. Brugen af Y27632 og CHIR99021 kan suspenderes. Organoid vækst kan være langsom i den første passage efter optøning. Det anbefales at passere organoiderne to gange efter optøning, inden forsøgene påbegyndes.

5. Generering af rotteintestinal 2D-monolag fra 3D-organoider

BEMÆRK: Følgende protokol beskriver de mængder, der kræves for at generere 24 brønde i en 48-brønds plade belagt med EME, startende med seks kupler på 50 μL (35 mm skål) indeholdende ~ 300 tarmorganoider / kuppel (skala: en kuppel genererer fire brønde), men kan skaleres op eller ned efter behov. Som skrevet opnår denne protokol ~ 80% sammenløb på 4-5 dage. Ved højere sammenløb begynder cellerne at erhverve 3D-organoidstrukturer igen. Ved lav sammenløb (≤40%) forbliver cellerne som monolag og er levedygtige i ~ 14 dage. Hvis formålet med undersøgelsen er at bruge 2D-monolag, skal du skalere ned, så en kuppel genererer otte brønde af en 24-brøndplade. Brøndene kan også overtrækkes med kollagen I for at danne monolag.

  1. Forberedelse af coatede overflader
    1. For at belægge pladen med EME fortyndes EME 1:20 i kold AdDMEM+ (tabel 1). Til belægning med kollagen skal du forberede kollagen I i henhold til producentens anvisninger. Fortynd 5 mg/ml kollagen I i AdDMEM+ til 100 μg/ml (1:50 i dette tilfælde).
    2. Overtræk pladen med 200 μL fortyndet EME eller kollagen for at dække brøndoverfladen helt. Der inkuberes i 1-2 timer ved 37 °C i en vævskulturkuvøse. Forbered rottetarmorganoidmediet til 2D monolagskultur (rIOM2D) i henhold til tabel 4.
  2. Generering af monolag
    1. Mediet suges ud af en 35 mm plade, der indeholder organoider. Der tilsættes 1 ml PBS.
    2. Forstyrre EME i brøndene ved at ridse med en P1000-spids. Pipetten pipetteres op og ned ca. 20 gange for at løsne hele EME. Overfør alt til et 15 ml konisk rør.
    3. Der tilsættes 1 ml PBS til 35 mm-pladen for at genvinde eventuelle yderligere organoider og overføres til det samme koniske 15 ml koniske rør.
    4. Der centrifugeres ved 350 x g i 2 min. og suges til supernatanten, inklusive EME-resten. Tilsæt 1 ml trypsinopløsning til organoidpelleten og inkuber ved 37 °C i 2 minutter.
    5. Pipette op og ned 10 gange med en P1000-spids og tilsæt 2 ml AdDMEM+ for at neutralisere trypsin.
    6. Centrifuger ved 350 x g i 5 min. Supernatanten suges til sig, og der tilsættes 4,8 ml rIOM2D (tabel 4). Resuspender cellepelleten.
    7. Før organoiderne placeres, skal du fjerne overskydende EME eller kollagen i AdDMEM + fra brøndene. Derefter tilsættes 200 μL organoider i rIOM2D og 10 μM Y27632 til hvert forbelagt hul.
    8. Efter 4-16 timer opsamles mediet og centrifugeres ved 1.000 x g i 1 min. Supernatanten overføres til et nyt konisk rør på 15 ml og pelletsen kasseres.
    9. Hvert hul vaskes med 300 μL PBS, og der tilsættes 200 μL centrifugeret rIOM2D til hvert hul. Skift rIOM2D hver 2-3 dage, suspender brugen af Y27632.
  3. Reformering af 3D-organoider fra 2D-monolag
    BEMÆRK: Monolag dyrket på EME kan induceres til at reformere 3D-organoider, mens monolag dyrket på kollagen I ikke effektivt vender tilbage til 3D-organoider. Normalt kan 2-3 brønde af organoider genereret fra monolag bruges til at fremstille en kuppel på 50 μL EME på dag 5.
    1. Fortynd EME 1:4 i rIOM2D. Når monolagene når ~ 80% sammenløb, skal du forsigtigt aspirere mediet og tilsætte 100 μL fortyndet EME til hullerne, der indeholder monolag.
    2. Der inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i en vævskulturkuvøse i 20 minutter. Derefter tilsættes 100 μL rIOM2D og vender tilbage til vævskulturinkubatoren. 3D-organoider genereres inden for 5 dage efter tilsætning af fortyndet EME.
    3. Når små organoider er reformeret (~ dag 5), skal du forberede rIOM. Opsaml alt brøndens indhold, pipetter op og ned for at forstyrre EME, og overfør til et 15 ml konisk rør.
    4. Der centrifugeres ved 350 x g i 2 min. Supernatanten og EME-restproduktet suges op.
    5. Tilsæt 1 ml kold AdDMEM+ og centrifuger ved 350 x g i 2 min. Supernatanten fjernes, så der efterlades ~50 μL substrat.
    6. De 50 μL medier og organoider overføres til en 250 μL EME-delprøve. Pipette op og ned for at fordele organoiderne i hele EME.
    7. 50 μL EME-kupler pipetteres i en 35 mm skål og inkuberes i 20 minutter i en vævskulturkuvøse.
    8. Tilsæt 2 ml rIOM plus 10 μM Y27632. Skift vækstmediet hver 2-3 dage. Når du skifter medie, kan Y27632 udelades.

6. Genmanipulation

  1. Transient transfektion af 2D monolag
    FORSIGTIG: Forbered tarmepitelmonolag hos rotter efter pkt. 5.1 i en plade med 48 huller. Transfektion skal udføres ved 70% -80% sammenløb. Udskift altid mediet i hullerne med 200 μL frisk rIOM2D inden transfektering. Der beregnes absorbansforhold på 260/280 nm og 260/230 nm for plasmid-DNA'et; Disse skal være over 1,8 for at sikre gode transfektionsresultater.
    BEMÆRK: Brug en plasmidkontrol til at beregne effektiviteten af transfektion. Et plasmid, der koder for et fluorescerende protein, anbefales for nemheds skyld. I denne protokol blev pLJM1-EGFP27 anvendt.
    1. Forbered 1 mg/ml 20 kDa polyethylenimin (PEI; Tabel 3). For hvert hul fremstilles rør A (0,6 μg plasmid + 50 μL reduceret serummedium) og rør B (1,8 μL PEI + 50 μL reduceret serummedium). Oprethold et DNA: PEI-forhold på 1: 3.
    2. Vortex begge rør i 30 s. Kombiner rør A og rør B, og hvirvel igen i 30 s. Brug om nødvendigt en centrifuge til at dreje ned. Inkuber i 20 min ved stuetemperatur.
    3. Tilføj forsigtigt DNA / PEI-komplekset dråbevis til 2D-monolag. Hvirvl forsigtigt pladen for at blande. Der inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2. Udtrykket kan normalt detekteres efter 24 timer.
      BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt at vende tilbage til 3D-organoidstrukturer, skal du vente i 48 timer efter transfektion for at tilføje fortyndet EME.
  2. Lentiviral transduktion af rotte intestinale organoider
    BEMÆRK: Før du arbejder med lentivirus, skal du opnå korrekt tilladelse og specialuddannelse fra institutionen. Brug altid passende personlige værnemidler (PPE) ved håndtering af lentivirus. Selvom det ikke er skitseret her, er koncentreret lentivirus af høj kvalitet afgørende for en vellykket infektion af organoider. Denne protokol udnyttede tom pLJM1-EGFP-vektor27 at udtrykke opløselig GFP. Denne protokol er ændret fra en tidligere udgivet protokol28. Transduktionseffektiviteten afhænger af kvaliteten og koncentrationen af virale partikler, effektiv dissociation af organoider i små celleklynger og genet, der udtrykkes. Ved beregning 5 dage efter infektion var den gennemsnitlige transduktionseffektivitet før selektion 19,4 % (± 6,5 % standardafvigelse).
    1. 2 dage før lentivirusinfektion planlægges at passere (afsnit 3) to tætte brønde med en 24-brøndplade for hver lentivirus, der skal transduceres. Hver brønd i en 24-brønds plade kan rumme en 50 μL kuppel af EME.
    2. Når EME størkner, tilsættes 0,5 ml rIOM suppleret med 10 mM nikotinamid, 10 μM Y27632 og 2,5 μM CHIR99021. Dette inducerer store sfæroidmorfologier, hvilket er gunstigt for effektiviteten af lentiviral transduktion. Inden for 2 dage efter plettering bør rotteorganoider være store sfæroider. Hvis der observeres signifikant differentiering (dvs. spirende), skal du gennemgå organoiderne igen.
    3. Optø den koncentrerede virus på is. Forbered friske transduktionsmedier i henhold til tabel 3.
    4. Brug en P1000-spids til at frigøre EME-kuplerne fra bunden af cellekulturskålen i mediet ved at pipettere op og ned. Fortsæt med pipette op og ned 20 gange for at bryde EME op og frigive organoiderne.
    5. Organoiderne og mediet pipetteres i et 15 ml konisk rør. Alle brøndene kan samles sammen, forudsat at organoiderne har samme genotype og er fra samme linje.
    6. Vask hver brønd to gange med 1 ml kold AdDMEM+. Opsaml AdDMEM + og overfør det til det samme 15 ml koniske rør.
    7. Brug en glas Pasteur-pipette til mekanisk at forstyrre rotteorganoiderne. Dette er et kritisk skridt, da målet er små flercellede klynger af celler. Pipette op og ned ~30 gange. Kontroller effektiviteten af forstyrrelsen under mikroskopet ved hjælp af et 4x mål. Fortsæt denne proces, indtil cellesuspensionen primært består af celleklynger med få organoider tilbage.
      BEMÆRK: Alternativt kan organoider centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, supernatanten fjernes omhyggeligt og resuspenderes i 1 ml rekombinant enzym, der erstatter konventionelt trypsin/EDTA, forvarmet til 37 °C i vævskulturkuvøsen. Inkuber organoiderne i trypsinerstatning i 2 minutter i et 37 ° C vandbad med regelmæssig hvirvelstrøm for at fremme dissociation. Undgå langvarig inkubation med trypsinudskiftning, da dette kan fremme celledød. Kontroller regelmæssigt for effektiviteten af forstyrrelser under mikroskopet ved hjælp af et 4x mål. Når suspensionen består af primært enkeltceller med få cellekulturer, fortyndes trypsinerstatningen ved at tilsætte 4 ml AdDMEM + og fortsæt med følgende trin.
    8. Drej det 15 ml koniske rør indeholdende celleklyngerne ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes forsigtigt og kasseres, idet man passer på ikke at forstyrre cellepelletsen.
    9. Resuspender celleklyngerne i 230 μL transduktionsmedium pr. brønd, der skal inficeres. Til infektionen skal du bruge en brønd med en 48-brøndplade til hver lentivirus.
    10. Plade 230 μL cellesuspension i hvert hul i en mærket 48-brøndplade. Der tilsættes 20 μL koncentreret virus til hvert hul. Brug en P1000-spids til at blande virus-/celleopløsningen i hvert hul og forsegle pladen med en gennemsigtig film.
    11. Der udføres spinokulation: pladen centrifugeres ved 600 x g i 1 time ved 32 °C. Pladen forsegles og inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i 6 timer.
    12. Forvarm en plade med 24 brønde i inkubatoren med 37 °C.
    13. Efter inkubation pipetteres hver brønd op og ned og overføres indholdet til et mærket 1,5 ml rør. Hvert hul vaskes med 750 μL AdDMEM+ og overføres til tuben. Drej rørene ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    14. Fjern rørene fra centrifugen og opbevar på is. Brug en P1000-spids til forsigtigt at fjerne supernatanten og bortskaffe den korrekt.
    15. Resuspender cellepillen i EME og plade 50 μL kupler i den forvarmede 24-brøndplade. Der inkuberes i 15-20 minutter ved 37 °C, indtil EME er polymeriseret.
    16. Til hvert hul tilsættes 500 μL rIOM suppleret med 10 mM nikotinamid, 10 μM Y27632 og 2,5 μM CHIR99021.
    17. Udskift mediet med rIOM plus 10 μM Y27632 1 dag efter infektion. Skift mediet hver 2-3 dage. Hvis udvælgelsen udføres, skal du tilføje valg 48-72 timer efter infektion. Til valg af puromycin skal du bruge 2 μg/ml puromycin.

7. Immunofluorescens helmonteret farvning af organoider

  1. Opsug mediet og tilsæt 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS-Tween 20 (PBS-T) (tabel 3) til organoiderne i en cellekulturskål. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
  2. Frigør organoiderne fra EME ved pipettering op og ned. Saml organoiderne i et 0,75 ml rør. Organoiderne vil sætte sig til bunden af røret ved tyngdekraften inden for få minutter. Centrifuger om nødvendigt ved 100 x g i 1 min.
  3. Brug en overførselspipette til at fjerne PFA'en og resuspendere organoiderne i PBS-T. Lad organoiderne slå sig ned i bunden af røret. PBS-T fjernes og opslæmmes igen i 200 μL blokopløsning (tabel 3).
  4. Inkuber ved stuetemperatur på en vipper eller møtrikator i 45 min. Organoider kan klumpe og slå sig ned til bunden af røret. Svip regelmæssigt røret med fingeren for at resuspendere og sprede det i hele opløsningen.
  5. Lad organoiderne slå sig ned i bunden af røret. Centrifuger om nødvendigt ved 100 x g i 1 min. Fjern blokopløsning.
  6. Tilsæt primært antistof fortyndet i 100 μL blokopløsning. Inkuber ved stuetemperatur på en nøddeblander i 45 minutter ved 24 o / min. Antistofkoncentrationer varierer afhængigt af det anvendte antistof.
    BEMÆRK: Dette trin kan forlænges baseret på det primære antistof op til natten over ved 4 °C.
  7. Lad organoiderne slå sig ned i bunden af røret. Centrifuger om nødvendigt ved 100 x g i 1 min.
  8. PBS-T vaskes fem gange med en overførselspipette. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min på nøddeblander ved 24 o / min. Gentag dette trin to gange.
  9. Der tilsættes sekundært antistof fortyndet 1:200 og 50 μg/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) fortyndet i 100 μl blokopløsning. Inkuber ved stuetemperatur på en nøddeblander i 30 minutter ved 24 o / min.
  10. Lad organoiderne slå sig ned i bunden af røret. Centrifuger om nødvendigt ved 100 x g i 1 min. Fjern sekundært antistof. Vask fem gange i PBS-T med en overførselspipette.
  11. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter på en nøddeblander ved 24 o / min. Gentag vasketrinnet to gange.
  12. Mens organoiderne vaskes, opvarmes en alikvot VALAP-tætningsmiddel (tabel 3) ved 40-50 °C for at gøre det flydende. Brug en pensel til at male en tynd firkant VALAP på et mikroskopglas, der er omtrent på størrelse med en dæksel. Brug en 22 mm x 22 mm nr. 1.5 dæksel.
  13. Brug en saks til at klippe enden af en P200-pipettespids. Overfør organoider til VALAP-brønden på diaset. Brug en serviet til forsigtigt at transportere PBS-T væk. Lad ikke organoiderne tørre ud.
  14. Oversprøjt VALAP-brønden med et antifade-monteringsmedium (tabel 3). For en ~ 22 mm x 22 mm firkant kræver dette 100-150 μL antifade.
  15. Organoiderne kan klynge sig; Hvirvl antifaden med en pipettespids for at omfordele organoiderne, hvis det er nødvendigt. Monter med 22 mm x 22 mm nr. 1.5 dæksel, så du undgår luftbobler. Forsegl dækslet ved at male et tyndt lag VALAP på kanterne.
    BEMÆRK: Til inverterede mikroskoper kan organoiderne også monteres i en 35 mm glasbundskål.

8. Forskolin-induceret hævelse af rottetarmorganoider

  1. Vok organoiderne i 3-5 dage efter passaging i rIOM. Det tilrådes at dyrke organoider i en plade med 24 brønde for at sikre, at den samme region let kan genafbildes. Tag billeder før tilsætning af forskolin (T0).
  2. Tilsæt forskolin (tabel 3) direkte til organoidmediet til en endelig koncentration på 10 μM. Tilsæt det samme volumen dimethylsulfoxid (DMSO) til kontrolhullerne.
  3. Tag billeder af kontrol- og forskolinbehandlede brønde med jævne mellemrum hvert 15.-30. minut. Når du ikke billeddanner, skal du holde organoider i inkubatoren eller bruge et kontrolleret billeddannelsessystem med inkubation. Maksimal hævelse skal overholdes med 120 min.
  4. Følg standardprotokoller for at beregne relativ hævelse fra de erhvervede billeder29.

Representative Results

Rotteduodenale og jejunale organoider blev genereret ved hjælp af protokollen beskrevet i afsnit 2. Det er meget vigtigt under kryptisoleringstrinnene, at villi effektivt udtømmes fra PBS. Hvis for mange villi er belagt i EME med krypter, kan det forårsage død af hele kulturen og manglende etablering af en organoid linje. På grund af dette er det nyttigt at isolere krypter under et dissekerende omfang, hvilket giver mulighed for visuel bekræftelse af villar-udtømning. Figur 1 viser repræsentative villarfragmenter og krypter (figur 1A). Bemærk den betydeligt mindre størrelse af krypter sammenlignet med villi (figur 1B). Efter plettering vil krypterne udvide sig til sfæroider i løbet af de næste par dage og vil begynde at knoppe og differentiere på dag 4-7 (figur 2). Når organoiderne når et omfattende spiret stadium, skal de passeres. Under passaging er det vigtigt at forstyrre organoiderne nok til at splitte kryptknopperne fra hinanden, så organoidnumre kan udvides (figur 3B).

Den vellykkede genopretning af organoider efter frysning er stærkt afhængig af den tilstand, hvor de fryses. Organoider i en stærkt proliferativ udifferentieret tilstand genvinder med den højeste effektivitet. Derfor anbefaler vi at få dem til at være sfæriske og cystiske i stedet for spiret og differentieret. For at opnå dette kan Wnt hyperaktiveres ved at øge mængden af Wnt ligand R-spondin i medierne og ved at inkludere nikotinamid i medierne, hvilket har vist sig at understøtte organoiddannelse og celleoverlevelse i flere dyrkningssystemer30,31. Figur 3A viser en sund organoid kultur kun 2 dage efter optøning. Inkludering af BSA i medierne under optøning har også hjulpet med overlevelsen af rottetarmorganoidkulturer, som har vist sig at være mere sarte end mustarmorganoider.

Mens 3D-organoidkultur ofte foretrækkes, fordi den rekapitulerer noget af den normale tarmarkitektur, gør den andre tilgange, herunder levende billeddannelse, transfektioner og lentivirale transduktioner, mere teknisk udfordrende. Anvendelsen af 2D-monolag genereret fra 3D-organoider32 (figur 4) muliggør højere effektivitet introduktion af plasmiderne. Mens 3D-tarmorganoider traditionelt er resistente over for forbigående transfektioner, kan plasmider, der koder for EGFP, med succes introduceres ved hjælp af lipidbaserede transfektionsmetoder. Den mest omkostningseffektive tilgang ved anvendelse af PEI er skitseret i trin 6.1 (figur 5), men elektroporation og kommercielt tilgængelige transfektionsreagenser har også givet sammenlignelige resultater (data ikke vist). Fremtidige undersøgelser vil fokusere på, om disse tilgange kan bruges til at indføre CRISPR-konstruktioner i monolag.

Det var vigtigt at kunne reformere 3D-organoider fra 2D-monolag efter transfektion, så de kunne opretholdes som en passagebar linje med 3D-arkitektoniske komponenter i krypter. Interessant nok blev 2D-monolag belagt på EME let reformeret til små sfæroider, når EME blev tilføjet tilbage til toppen af cellerne, mens et kollagen I-substrat ikke var tilstrækkeligt til reformation af 3D-strukturer (figur 6).

Mens forbigående transfektioner er nyttige til mange undersøgelser, er dannelsen af stabile linjer ofte mere nyttig, hvilket kræver introduktion af lentivirus i cellerne. Rotteorganoider blev inficeret med lentivirus ved at ændre tidligere offentliggjorte protokoller (figur 7). Et vigtigt skridt i protokollen er forstyrrelsen af organoider i små aggregater eller celleklynger. Hvis kulturer ikke forstyrres effektivt, og organoider forbliver intakte, kommer de lentivirale partikler ikke ind i cellerne. Efter infektion skal organoider komme sig og vokse igen. Protokollen skitseret her giver mulighed for optagelse af virale partikler med 10% -48% (gennemsnit: 19,4% ± 6,5%) af celler før udvælgelse.

Helmonteret farvning af organoider kan vise sig vanskelig på grund af ufuldstændig fjernelse af EME-rester eller ufuldstændig antistofpenetrans. Den protokol, der er skitseret her, giver mulighed for robust farvning af organoider. Visualisering af organoider på et konfokalmikroskop kan også vise sig vanskeligt, hvis de er for langt væk fra dæksedlen. Ved at bruge VALAP skabes en brønd med en vis højde, således at organoider ikke knuses af dæksedlen, men stadig får lov til at sætte sig tæt på dæksedlen for at lette billeddannelsen. Repræsentativ farvning mod den apikale anionkanal cystisk fibrose transmembrankonduktansregulator (CFTR) og phalloidin til mærkning af F-actin er vist i figur 8.

Endelig har organoider anvendelighed i funktionelle assays. Patientafledte organoider fra patienter med cystisk fibrose er blevet brugt til at screene CFTR-funktionen, da behandling med cAMP-agonisten forskolin inducerer robust CFTR-medieret væskesekretion, hvilket forårsager organoid hævelse 29,33-37. Et mål med dette arbejde var at identificere og udvikle en organoid model, der kan bruges parallelt med in vivo prækliniske studier. Derfor havde vi til formål at afgøre, om rottetarmorganoider gennemgår forskolin-induceret hævelse. Faktisk svulmede rotteorganoider inden for 30 minutter efter forskolinbehandling med en maksimal effekt observeret med 120 minutter (figur 9).

Figure 1
Figur 1: Villar-fragmenter og krypter under epitelisolering. (A) Repræsentativt billede af Villar-fragmenter i EDTA-opløsning under kryptisolationsprotokollen. Gule pilespidser markerer villarfragmenter. Røde pile skildrer krypter knyttet til et villarfragment. Bemærk forskellen i relative størrelser. (B) Højere forstørrelsesbillede af en enkelt krypt (rød pil), så morfologi kan visualiseres. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Rotte intestinal organoid progression. Rottejejunumkrypter blev belagt i EME umiddelbart efter isolation (A, B). Inden for 2 dage blev krypterne sfæroider (C, D). På dag 5 begyndte de at starte kryptknopper (E, F), som uddybede og voksede på dag 7 (G). Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Organoider efter optøning og gennemtøning. (A) Jejunalorganoider fra rotter blev optøet efter de skitserede protokoller efter kryopræservering. Bemærk tilstedeværelsen af både sfæroider og spirende organoider kun 2 dage efter optøning. (B) Den samme organoide linje afbildet i A umiddelbart efter passaging efter den skitserede protokol. Bemærk den relative størrelsesforskel mellem strukturer i A og B og tilstedeværelsen af enkelte kryptlignende domæner i B. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: 2D monolagsdannelse fra 3D-organoider. (A-C) 2D monolagsprogression på EME. (D-F) 2D monolagsprogression på kollagen I. På dag 5 gav hver tilstand ~ 80% sammenløb. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Transient transfektion af et 2D-monolag. Repræsentativt billede af et 2D-monolag dyrket på EME forbigående transfekteret med pLJM1-EGFP-plasmid ved hjælp af PEI. (A) Brightfield, (B) fluorescens (GFP), (C) overlay. Den stiplede røde linje markerer monolagsgrænsen. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Reformation af 3D-organoider fra 2D-monolag på EME. (A) Dannelse af 3D-organoider fra 2D-monolag dyrket på EME. Organoider dannes effektivt 5 dage efter tilsætning af EME til monolagets apikale overflade. Bemærk overflod af døde celler omkring de små 3D-sfæroider. (B) Persistens af 2D monolag 5 dage efter kollagen I blev tilsat til den apikale overflade af 2D monolag dyrket på kollagen I. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Lentiviral infektion af 3D-organoider. Rottejejunumorganoider blev inficeret med nukleare GFP lentivirale partikler ved anvendelse af den skitserede protokol. Efter genopretning og vækst i 5 dage blev organoider fikseret og modfarvet med DAPI. A) DAPI: grå nuklearGFP: grøn. B) kernekraft: grøn. Den stiplede røde linje markerer organoidgrænsen. Skalabjælker: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Helmonteret immunfluorescens af tarmorganoider hos rotter. (A) CFTR, (B) phalloidin og (C) fusioneret helmonteret immunfluorescens af rottejejunale organoider. Bemærk den apikale berigelse af CFTR-farvning i organoider (grå i A, magenta i C). Phalloidin markerer F-actin og mærker tydeligt den apikale børstekant (grå i B, cyan i C). Vægtstænger: 25 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Rotte intestinale organoider svulme ved forskolin stimulering. Repræsentativt tidsforløb af rotte intestinal organoid hævelse efter tilsætning af cAMP-agonisten forskolin. 0 min-tiden repræsenterer tidspunktet umiddelbart før tilføjelsen af 10 μM forskolin. Billeder viser den samme organoid med 30 minutters tidsintervaller. Maksimal hævelse blev observeret 120 min efter forskolin tilsætning. Den stiplede røde linje skitserer organoidgrænsen. Det mørke materiale i midten af organoidlumen består af døde celler. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: AdDMEM + opskrift. Ingredienser til fremstilling af standard AdDMEM + medier, som er basismediet i hele metoderne vist her. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Rotte intestinal organoid media (rIOM) opskrift. Detaljeret opskrift af standard rotte intestinal organoid medier, herunder opløsningsmiddel og opbevaringsbetingelser for rekombinante proteiner. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Løsninger. Opskrifter og instruktioner til at lave andre løsninger, der bruges i hele protokollen. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4. Rotteorganoidmedium til 2D monolagskultur (rIOM2D). Modificeret opskrift af organoid kultur medier optimeret til 2D vækst af monolag. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Udviklingen af en rotte intestinal organoid model bevarer vigtige funktionelle egenskaber, der findes i organet in vivo og er et lovende værktøj til præklinisk testning, lægemiddelscreening og funktionelle assays. Denne in vitro-model kan anvendes parallelt med in vivo prækliniske gastroenterologiske undersøgelser, hvor rotter ofte er en foretrukken model på grund af deres større tarmstørrelse, delte fysiologiske aspekter med mennesker og i nogle tilfælde var bedre sygdomsmodeller38. Her skitseres en robust trin-for-trin protokol til isolering af rottetarmkrypter, generering og langsigtet kultur af rottetarmorganoider samt downstream-applikationer, herunder funktionelle forskolin-hævelsesassays, helmonteret immunofluorescens, 2D-monolagskultur og lentiviral genetisk manipulation. Rottetarmorganoider er sandsynligvis relevante i mange sygdomssammenhænge, hvor patofysiologien i musemodeller er uhensigtsmæssig og kan give en bedre model for menneskets tarmfysiologi sammenlignet med musetarmorganoider.

For at etablere langlivede organoidkulturer, der kan passeres og udvides, er det vigtigt at identificere de vigtigste vækstfaktorer, der kræves for at opretholde intestinal epitelproliferation. Musorganoider dyrkes oftest i en simpel cocktail af EGF, R-spondin og Noggin, selvom det er blevet rapporteret, at Noggin ikke er nødvendig for intestinal organoidkultur39. Konditionerede medier kan erstatte rekombinante vækstfaktorer, og de mest almindeligt anvendte cellelinjer er L-WRN, som udskiller Wnt3a, Rspondin-3 og Noggin39, L-Wnt3a og HA-Rspondin1-Fc 293T-celler40. L-WRN-konditionerede medier er tilstrækkelige til at understøtte ikke kun musetarm39 organoid vækst, men væksten af tarmorganoider fra flere husdyr og ledsagende dyr, herunder hunde, katte, kyllinger, heste, køer, får og svin12. Imidlertid er humane tarmorganoider meget forskellige i deres vækstfaktorkrav, da de kræver forskellige medieformuleringer til deres ekspansionsvækstfase (dvs. progressionen fra små til store sfæroider) versus deres differentieringsfase (dvs. generering og modning af differentierede celletyper)10. Mediekravene til rottetarmorganoider afspejler nøje ekspansionsvækstmedierne for humane tarmorganoider, men især rotteorganoider er i stand til både vækst og differentiering i dette mediemiljø, hvilket forenkler deres kulturkrav betydeligt. Mens vores indledende forsøg fokuserede på at etablere og dyrke rottetarmorganoider i L-WRN-konditionerede medier, var langvarig dyrkning spinkel, og rottetarmorganoidlinjer led af manglende robusthed (data ikke vist). Dette kan skyldes, at L-WRN-cellelinjer er konstrueret til at udskille R-spondin 3, mens 293T-Rspo1-cellelinjen, der anbefales her, er konstrueret til at udskille R-spondin 1. Det er muligt, at rotte og humane organoider foretrækker R-spondin 1, potentielt tegner sig for svigt af rotteorganoidlinjer i L-WRN-konditionerede medier.

For bedst at rekapitulere in vivo-indstillingen er det vigtigt at udvikle organoidkulturbetingelser, der muliggør stamcelleoverlevelse, vedligeholdelse og spredning, og som kan opretholde cellulær omsætning og samtidige differentieringshændelser i diskrete celletyper. Derfor skal koncentrationerne af rekombinante proteiner og/eller proteiner i konditionerede medier titreres og kontrolleres tæt for at opnå denne perfekte balance. Især er optimale Wnt-niveauer afgørende for at undgå tab af intestinale organoidkulturer. For lidt Wnt i konditionerede medier vil være ude af stand til at understøtte vækst, hvilket fører til tab af stamceller og efterfølgende organoid død; overaktivering af Wnt vil medføre, at organoider er cystiske og udifferentierede10. Selvom det ikke er detaljeret her, anbefales det kraftigt at teste hvert parti L-Wnt3a og 293T-Rspo1 konditionerede medier ved hjælp af et Wnt reporter luciferase assay, såsom en Topflash cellelinje41. Tidligere undersøgelser har beskrevet, at et optimalt parti L-Wnt3a-medier skulle resultere i en 15-fold signalforøgelse ved 12,5% og en 300-fold signalforøgelse ved 50% sammenlignet med 1% L-Wnt3a10. Da rotteorganoider er mere følsomme end museorganoider over for dyrkningskrav, især Wnt-aktiveringsniveauer, hjælper disse yderligere kvalitetskontroltrin i høj grad med at lette robustheden og pålideligheden af rotteorganoidkulturer. Da en lignende reporterlinje ikke er tilgængelig til test af Bmp-aktivitet og relative Noggin-koncentrationer i Noggin-konditionerede medier, anbefales det at bruge rekombinant Noggin, når det er muligt, for præcist at kontrollere Noggin-niveauer. Mens musens tarmorganoider kan dyrkes og vedligeholdes i fravær af Noggin39, er dette ikke blevet forsøgt for rotte intestinale organoidkulturer.

Ud over cellekulturkrav afhænger den vellykkede indledende etablering af en rotteorganoidlinje kritisk af den effektive udtømning af differentierede villi under kryptisolering. Høje niveauer af villar-forurening forårsager kryptdød, formodentlig på grund af enten signaler fra de døende celler eller sekvestrering af væsentlige faktorer. For at nedbryde disse differentierede villi fra epitelpræparater præcist og konsekvent anbefales det at udføre epitelisoleringer ved hjælp af et stereoskop. Visuel undersøgelse af epitelet, der frigives, giver et klart fingerpeg om, hvornår PBS skal kasseres og udskiftes (figur 1). Krypter bør ikke indsamles, før der er tilstrækkelig udtømning af villi. Villar-celler er terminalt differentierede og kan ikke generere organoider i kultur. Derudover kræver efterfølgende overførsel af rottetarmorganoider og deres anvendelse til enhver downstream-applikation delikat pleje. Inkubation i dissociationsreagenser i længere perioder (10 min) resulterer i signifikant celledød og tab af organoidlinjen.

Her beskrives en enkel og hurtig protokol til generering af intestinale monolag fra rotteorganoider. EME og kollagen I substrater har forskellige virkninger på epitelet, der kan udnyttes afhængigt af formålet med undersøgelsen. EME giver mulighed for hurtig og effektiv vedhæftning af enkeltceller og dannelse af cellefremspring. I modsætning hertil forsinker belægning af overfladen med kollagen I disse processer. Når monolag når ca. 80% sammenløb, begynder celler dyrket på EME at generere 3D-organoidstrukturer igen. De mangler dog tilstrækkelig fysisk og kemisk støtte til fortsat vækst. Denne tilbagevenden tilbage til organoidtilstanden kan forhindres ved at opretholde monolag i EME ved et sammenløb på 50% -80%. Tilsætningen af fortyndet EME til den apikale overflade af monolag fremmer hurtig genopretning og dannelse af de novo-organoider, hvilket genererer konvergensområder hurtigere og lettere. På en kollagen I-overflade kan celler danne et ensartet monolag og generere små klynger. Tilsætningen af kollagen I oven på monolag er imidlertid ikke tilstrækkelig til at fremkalde organoiddannelse. EME skal fortyndes ved tilsætning til monolagsoverfladen, da der vil være en stærkere mekanisk modstand for den spirende organoid at overvinde. Denne fortyndede EME tillader imidlertid ikke robust dannelse af store organoider. Alle de novo-genererede rotteorganoider, der naturligt løsner sig fra overfladen, skal straks fjernes og overføres til ufortyndet EME, så strukturel støtte og vækst kan genoprettes. På grund af organoidernes lille størrelse i dette trin anbefales passage af organoider ikke, før robust vækst er etableret. Den underliggende biologiske betydning af, hvorfor EME kan understøtte reformationen af organoider, men om kollagen I kan eller ikke kan gøre dette, er ikke klart. Der har imidlertid været rapporter om, at celler dyrket i 3D-kollagen ikke kan danne spirende organoider42,43 eller understøtte langsigtet vedligeholdelse. Kommercielt tilgængelige EME-produkter er heterogene blandinger af ekstracellulære proteiner, primært laminin og kollagen IV44. Derfor kan den særskilte sammensætning af proteiner og en epitelcelles evne til at engagere sig i den ekstracellulære matrix ved hjælp af forskellige cellulære komplekser muliggøre ombygning i EME, men ikke kollagen I. Hvorvidt kollagen I-afledte monolag kan sættes i EME for at understøtte organoid dannelse og vækst er ikke blevet testet.

Genmanipulation af rottens tarmorganoidmodel beskrives her, og protokoller for lentiviral transduktion af 3D-organoider og forbigående transfektion af 2D-monolag skitseres. For at overvinde den lave effektivitet af lentiviral organoidtransduktion blev der udviklet en protokol til forbigående transfektion af 2D-monolag. Den flade morfologi og eksponerede apikale domæner af monolag giver lettere adgang til vira og DNA-holdige komplekser. Udtrykket af en EGFP-indberetter, der anvender pLJM1-EGFP-vektoren, blev anvendt til validering af denne teknik. GFP-reporterekspression blev observeret efter 24 timer og blev opretholdt i 5-6 dage i monolag. Fremtidige undersøgelser med fokus på lentiviral transduktion af monolag vil sandsynligvis have højere effektivitet end 3D-organoidtransduktion. Ved hjælp af ovenstående protokoller kan 3D-organoider reformeres fra inficerede 2D-monolag for at lette oprettelsen af stabile linjer. Med omhu kan rottens tarmorganoidlinjer med succes opretholdes i over et år, forblive stabile over mange passager, kryopræserverede, med succes optøet og genetisk modificeret ved hjælp af lentiviral transduktion og derved imødekomme behovet for en tilgængelig og medgørlig in vitro intestinal organoidmodel, der bevarer fysiologisk relevans for mennesker.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi takker medlemmerne af laboratorierne Sumigray og Ameen for deres tankevækkende drøftelser. Dette arbejde blev støttet af et Charles H. Hood Foundation Child Health Grant og et Cystic Fibrosis Foundation-tilskud (004741P222) til KS og af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the National Institutes of Health til NA under tildelingsnummer 2R01DK077065-12.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-D Culture Matrix Rat Collagen I Cultrex/R&D Systems 3447-020-01
70 µm cell strainer Corning/Falcon 352350
Advanced DMEM/F12 Gibco/Thermo Fisher 12634010
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher 17504044
CHIR99021 Cayman Chemical 13122
CryoStor Stem Cell Technologies 100-1061
Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells R & D Systems 3710-001-01
FBS Gibco/Thermo Fisher 16-000-044
Gastrin I (human) Sigma Aldrich G9145
Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 100-0485
Glutamax Thermo Fisher 35-050-061
Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free Corning 356231
HEPES AmericanBio AB06021
Lanolin Beantown Chemical 144255-250G
L-glutamine Gibco/Thermo Fisher A2916801
L-Wnt3a cells ATCC CRL-2647
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher 17502-048
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165-5G
Nicotinamide  Sigma Aldrich N0636
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco/Thermo Fisher 31985070
Paraffin Fisher Scientific P31-500
Parafilm Sigma Aldrich P7793 transparent film
PBS Thermo Fisher 10010023
Penicillin/Streptomycin Gibco/Thermo Fisher 15140122
pLJM1-EGFP Addgene 19319
Polybrene Millipore TR-1003-G
Polyethylenimine hydrochloride (PEI) Sigma Aldrich 764965
p-phenylenediamine  Acros Organics/Thermo Fisher 417481000
Puromycin VWR J593-25mg
Recombinant human FGF2 protein Peprotech 100-18B-250ug
Recombinant human IGF-1 protein Biolegend B356441
Recombinant human Noggin protein R & D Systems 6057-NG-100
Recombinant mouse EGF protein Thermo Fisher PMG8041
Sprague Dawley rat Charles River Laboratories Strain 001
Triton X-100 American Bioanalytical AB02025-00500
TrypLE Express Enzyme Gibco/Thermo Fisher 12604013
Y27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nature Reviews. Molecular Cell BiologyI. 22 (1), 39-53 (2021).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Yin, Y. -B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. -L. Enteroids for nutritional studies. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (16), 1801143 (2019).
  4. Cai, T., et al. Effects of six common dietary nutrients on murine intestinal organoid growth. PLoS One. 13 (2), e0191517 (2018).
  5. Davoudi, Z., et al. Gut Organoid as a new platform to study alginate and chitosan mediated PLGA nanoparticles for drug delivery. Marine Drugs. 19 (5), 282 (2021).
  6. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  7. Yin, Y. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. L. Mini-gut: a promising model for drug development. Drug Discovery Today. 24 (9), 1784-1794 (2019).
  8. Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).
  9. Gunther, C., Winner, B., Neurath, M. F., Stappenbeck, T. S. Organoids in gastrointestinal diseases: from experimental models to clinical translation. Gut. 71 (9), 1892-1908 (2022).
  10. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
  11. Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
  12. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  13. Fagerholm, U., Johansson, M., Lennernas, H. Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum. Pharmaceutical Research. 13 (9), 1336-1342 (1996).
  14. Dubbelboer, I. R., Dahlgren, D., Sjogren, E., Lennernas, H. Rat intestinal drug permeability: A status report and summary of repeated determinations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 364-376 (2019).
  15. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  16. Zhang, Z., Carriero, N., Gerstein, M. Comparative analysis of processed pseudogenes in the mouse and human genomes. Trends in Genetics. 20 (2), 62-67 (2004).
  17. Lambracht-Washington, D., Fischer Lindahl, K. Active MHC class Ib genes in rat are pseudogenes in the mouse. Immunogenetics. 56 (2), 118-121 (2004).
  18. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
  19. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  20. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  21. Olivier, A. K., Gibson-Corley, K. N., Meyerholz, D. K. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of cystic fibrosis: gastrointestinal, pancreatic, and hepatobiliary disease and pathophysiology. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (6), G459-G471 (2015).
  22. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  23. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  24. Hedrich, W. D., et al. Development and characterization of rat duodenal organoids for ADME and toxicology applications. Toxicology. 446, 152614 (2020).
  25. How to Cryopreserve Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html (2023).
  26. How to Thaw Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html (2023).
  27. Sancak, Y., et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).
  28. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
  29. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
  30. Regent, F., et al. Nicotinamide promotes formation of retinal organoids from human pluripotent stem cells via enhanced neural cell fate commitment. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 878351 (2022).
  31. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  32. Breau, K. A., et al. Efficient transgenesis and homology-directed gene targeting in monolayers of primary human small intestinal and colonic epithelial stem cells. Stem Cell Reports. 17 (6), 1493-1506 (2022).
  33. Berkers, G., et al. Rectal organoids enable personalized treatment of cystic fibrosis. Cell Reports. 26 (7), 1701-1708 (2019).
  34. deWinter-de Groot, K. M., et al. Forskolin-induced swelling of intestinal organoids correlates with disease severity in adults with cystic fibrosis and homozygous F508del mutations. Journal of Cystic Fibrosis. 19 (4), 614-619 (2020).
  35. Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
  36. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  37. van Mourik, P., Beekman, J. M., vander Ent, C. K. Intestinal organoids to model cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 54 (1), 1802379 (2019).
  38. Tong, T., et al. Transport of artificial virus-like nanocarriers through intestinal monolayers via microfold cells. Nanoscale. 12 (30), 16339-16347 (2020).
  39. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  40. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  41. Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
  42. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9 (9), e107814 (2014).
  43. Sachs, N., Tsukamoto, Y., Kujala, P., Peters, P. J., Clevers, H. Intestinal epithelial organoids fuse to form self-organizing tubes in floating collagen gels. Development. 144 (6), 1107-1112 (2017).
  44. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).

Tags

Biologi nr. 196
Generering og manipulation af rottetarmorganoider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zagoren, E., Santos, A. K., Ameen,… More

Zagoren, E., Santos, A. K., Ameen, N. A., Sumigray, K. Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (196), e65343, doi:10.3791/65343 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter