Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generering og manipulering av tarmorganoider fra rotter

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65343
Automatic Translation
*1, *1,2, 3,4, 1,5,6
1Department of Genetics, Yale School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Yale School of Medicine, 3Department of Pediatrics/Gastroenterology and Hepatology, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 5Yale Stem Cell Center, Yale School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å generere tarmorganoider fra rotter og bruke dem i flere nedstrøms applikasjoner. Rotter er ofte en foretrukket preklinisk modell, og det robuste tarmorganoidsystemet fyller behovet for et in vitro-system som følger med in vivo-studier.

Abstract

Ved bruk av organoider for å vurdere fysiologi og celleskjebnebeslutninger, er det viktig å bruke en modell som nøye rekapitulerer in vivo-sammenhenger . Følgelig brukes pasientavledede organoider til sykdomsmodellering, narkotikaforskning og personlig behandlingsscreening. Intestinale organoider fra mus brukes ofte til å forstå aspekter av både tarmfunksjon/fysiologi og stamcelledynamikk/skjebnebeslutninger. Men i mange sykdomssammenhenger foretrekkes rotter ofte fremfor mus som modell på grunn av deres større fysiologiske likhet med mennesker når det gjelder sykdomspatofysiologi. Rottemodellen har vært begrenset av mangel på genetiske verktøy tilgjengelig in vivo, og tarmorganoider fra rotter har vist seg å være skjøre og vanskelige å dyrke på lang sikt. Her bygger vi på tidligere publiserte protokoller for å robust generere tarmorganoider fra rotter fra tolvfingertarmen og jejunum. Vi gir en oversikt over flere nedstrøms applikasjoner som bruker tarmorganoider fra rotter, inkludert funksjonelle hevelsesanalyser, helmonteringsfarging, generering av 2D enteroidmonolag og lentiviral transduksjon. Rotteorganoidmodellen gir en praktisk løsning på feltets behov for en in vitro-modell som beholder fysiologisk relevans for mennesker, raskt kan manipuleres genetisk og lett oppnås uten barrierene som er involvert i anskaffelse av humane tarmorganoider.

Introduction

Den menneskelige tynntarmepitelarkitekturen og cellulær sammensetning er komplekse, noe som gjenspeiler deres fysiologiske funksjoner. Tynntarmens primære rolle er å absorbere næringsstoffer fra mat som passerer gjennom lumen1. For å maksimere denne funksjonen er tarmoverflaten organisert i fingerlignende fremspring kalt villi, som øker det absorberende overflatearealet, og kopplignende invaginasjoner kalt krypter, som huser og isolerer stamceller. Innenfor epitelet genereres forskjellige spesialiserte absorberende og sekretoriske celletyper for å utføre forskjellige funksjoner1. På grunn av denne kompleksiteten har det vært vanskelig å modellere vev som tarmen i høypassasjetransformerte immortaliserte cellelinjer. Imidlertid har studien av stamceller, spesielt voksne stamceller og deres differensieringsmekanismer, tillatt utvikling av 3D intestinale organoidkulturer. Bruken av organoide modeller har forvandlet feltet, delvis på grunn av deres rekapitulering av noen arkitektoniske komponenter og celletypeheterogenitet funnet i den intakte tarmen. Intestinale organoider kan dyrkes på lang sikt in vitro på grunn av vedlikehold av den aktive stamcellepopulasjonen2.

Intestinale organoider har raskt blitt en tilpasningsdyktig modell for å studere stamcellebiologi, cellefysiologi, genetisk sykdom og ernæring3,4, samt et verktøy for å utvikle nye legemiddelleveringsmetoder5. I tillegg blir pasientavledede organoider brukt til sykdomsmodellering, narkotikaforskning og personlig behandlingsscreening, blant annet 6,7,8,9. Imidlertid gir humane tarmorganoider fortsatt utfordringer. Vevstilgjengelighet, krav til godkjenning fra Institutional Review Board og etiske problemer begrenser den utbredte bruken av menneskelige prøver. I tillegg krever humane intestinale organoider generert fra tarmkrypter to forskjellige kulturbetingelser for vedlikehold av udifferensierte stamceller eller for å indusere differensiering av modne celletyper10. Dette står i kontrast til in vivo, hvor stamceller og modne differensierte celletyper samtidig er til stede og kontinuerlig generert/vedlikeholdt1. På den annen side krever musintestinale organoider, som dyrkes i en mindre kompleks cocktail av vekstfaktorer, ikke denne bryteren i mediesammensetning og kan opprettholde stamceller og differensierte celler i samme mediekontekst 2,11. Imidlertid kan viktige forskjeller i musetarmen sammenlignet med mennesker gjøre museorganoider til en suboptimal modell i mange tilfeller. Samlet sett har mange intestinale organoider fra større pattedyr, inkludert hester, griser, sauer, kyr, hunder og katter, blitt vellykket generert i kulturforhold som er nærmere tilpasset musens intestinale organoider enn kulturbetingelsene for humane tarmorganoider12. Forskjellene i vekstfaktorforhold mellom mus og humane organoider gjenspeiler sannsynligvis forskjeller i stamcellenisjesammensetning og forskjellige krav til stamcelleoverlevelse, spredning og vedlikehold. Derfor er det behov for et lett tilgjengelig organoidsystem som 1) ligner på human tarmcellesammensetning, 2) inneholder stamceller med vekstfaktorkrav som for humane tarmorganoider, og 3) er i stand til kontinuerlig å opprettholde udifferensierte og differensierte rom. Ideelt sett vil systemet være fra en vanlig brukt preklinisk dyremodell, slik at in vivo og in vitro-eksperimenter kan korreleres og brukes sammen.

Rotter er en vanlig brukt preklinisk modell for studier av tarmfysiologi og farmakologi på grunn av deres svært like tarmfysiologi og biokjemi som mennesker13, spesielt med hensyn til intestinal permeabilitet14. Deres relativt større størrelse sammenlignet med mus gjør dem mer mottagelige for kirurgiske prosedyrer. Mens store dyremodeller, inkludert griser, noen ganger brukes, er rotter en rimeligere modell, krever mindre plass til husdyrhold, og har lett tilgjengelige standardstammer15. En ulempe ved å bruke rottemodeller er at den genetiske verktøykassen for in vivo-studier ikke er godt utviklet sammenlignet med mus, og genereringen av nye rottelinjer, inkludert knockouts, knock-ins og transgenics, er ofte kostnadsoverkommelig. Utviklingen og optimaliseringen av en robust tarmorganoidmodell for rotter vil tillate genetisk manipulasjon, farmakologiske behandlinger og høyere gjennomstrømningsstudier i en tilgjengelig modell som beholder viktig fysiologisk relevans for mennesker. Fordelene ved en gnagerorganoidmodell kontra en annen er imidlertid svært avhengig av den spesielle prosessen eller genet som studeres; Visse gener som finnes hos mennesker kan være pseudogener hos mus, men ikke rotter16,17. I tillegg blir artsspesifikke cellesubtyper i økende grad avduket av encellet RNAseq18,19,20. Endelig viser tarmsykdomsmodeller fra rotter og mus ofte betydelige variasjoner i fenotyper21,22 slik at modellen som i større grad rekapitulerer symptomene og sykdomsprosessen sett hos mennesker, må velges for nedstrøms arbeid. Genereringen av en rottetarmorganoidmodell gir ekstra fleksibilitet og valg for forskere ved å velge et modellsystem som passer best for deres omstendigheter. Her utvides eksisterende protokoller23,24 for generering av tarmorganoider fra rotter, og en protokoll er skissert for generering og vedlikehold av tarmorganoider fra rotter fra tolvfingertarmen eller jejunum. I tillegg er flere nedstrøms applikasjoner, inkludert lentiviral infeksjon, helmonteringsfarging og forskolin hevelsesanalyser, beskrevet.

Protocol

MERK: All cellekultur skal håndteres ved hjelp av riktig aseptisk teknikk i en avtrekk for vevskultur. Alt dyrearbeid i denne studien ble godkjent av Yales Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Fremstilling av cellekulturreagenser

  1. Klargjør R-spondin 1-kondisjonerte medier i henhold til produsentens instruksjoner. Forbered Wnt3a-kondisjonerte medier i henhold til produsentens instruksjoner. Klargjør AdDMEM+ som beskrevet i tabell 1.
  2. Resuspender gastrin i steril dH2O for å forberede en 100 μM lager. Aliquot og oppbevares ved -80 °C. Resuspender N-acetylcystein i sterilt vann for å tilberede en 100 mM lager. Aliquot og oppbevares ved -20 °C i opptil 1 måned.
  3. Resuspender rekombinant humant Noggin i fosfatbufret saltvann (PBS) + 0,1 % bovint serumalbumin (BSA) for å fremstille en 250 μg/ml stam. Aliquot og oppbevares ved -80 °C. Resuspender rekombinant musepidermal vekstfaktor (EGF) i PBS + 0,1% BSA for å forberede en 100 μg / ml lager. Aliquot og oppbevares ved -80 °C.
  4. Fortynn rekombinant humant IGF-1 i PBS + 0,1% BSA for å forberede en 100 μg / ml lager. Aliquot og oppbevares ved -80 °C. Resuspender rekombinant humant FGF-2 i 5 mM Tris, pH 7,6, for å tilberede en 100 μg/ml stam. Aliquot og oppbevares ved -80 °C.
    MERK: For alle vekstfaktorene, bruk en mellomfortynning i PBS + 0,1% BSA til 100x den endelige konsentrasjonen i kulturmediet. Oppbevares ved -20 °C.

2. Etablering av tarmorganoider fra rotter

MERK: Denne protokollen ble modifisert fra to tidligere publiserte protokoller for tarmorganoider fra rotter23,24.

  1. Klargjør organoid media fra rotter (rIOM) i henhold til tabell 2 og sett et vannbad på 37 °C. Dette komplette mediet er stabilt i 5 dager ved 4 °C.
  2. Klargjør 10 ml 3 ml etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i PBS i et 15 ml konisk rør og hold på is. Tine 250 μL ekstracellulært matriksekstrakt (EME) på is.
  3. Rask en rotte over natten med tilgang til vann ad libitum. Avlive rotta i henhold til den IACUC-godkjente protokollen. I denne protokollen ble voksne mannlige Sprague Dawley-rotter (som veide ~200 g) avlivet via CO2 -inhalasjon (materialfortegnelse). Cervikal dislokasjon ble brukt som sekundær metode for eutanasi.
  4. Bruk steril autoklavert tang og disseksjonssaks til disseksjon. Plasser den avlivede rotten på disseksjonsoverflaten ventral side opp. Klem hudlaget med tang; Følgende kutt bør gjøres på overflatenivå, slik at de bare skjærer gjennom dette hudlaget og ikke dypt nok til å skade indre organer.
  5. For å åpne bukhulen, ved hjelp av store, skarpe disseksjonsaks, kutt gjennom hudlaget i et stort, langsgående overflatenivå kutt i midten av magen. Deretter, som stammer fra det kuttet, gjør du to kortere horisontale kutt, en på hver side. Bruk tang til å skrelle huden bort for å eksponere bukhulen. Klipp gjennom bukhinnen for å fullstendig eksponere de indre organene i bukhulen med klar tilgang til tarmen.
  6. Bruk saks og tang, finn magen og identifiser tolvfingertarmen ca 2-3 cm distalt for den, som fremstår som et gulaktig segment. Den proksimale jejunum ligger ca. 4-5 cm distalt for ligamentet til Treitz, som fungerer som et landemerke mellom tolvfingertarmen og jejunum.
  7. Legg det isolerte tarmfragmentet i en 10 cm petriskål. Rengjør ønsket tarmsegment av mesenteri så mye som mulig. Skyll med 10 ml iskald PBS til det er fjernet for luminalt innhold. På et papirhåndkle, kutt tarmsegmentet i ~ 2 cm lange stykker. Åpne hvert tarmstykke i lengderetningen for å eksponere epitelet.
  8. Bruk et glassmikroskoplysbilde, skrap den eksponerte luminaloverflaten for å fjerne villi. Legg tarmbiter i den tilberedte EDTA-løsningen på is. Roter ved 4 °C i 30 minutter på en rørrevolver satt til 10 o / min.
  9. Ved dissekeringsmikroskopet, hell innholdet i det koniske røret i en 10 cm petriskål. Legg i ytterligere ~ 5 ml iskald PBS.
  10. Bruk fine tang, hold et tarmsegment og rist kraftig. Det vil være mulig å se epitelutslippet i PBS. I første omgang vil PBS primært inneholde villi.
  11. Fortsett å riste. Kast regelmessig PBS som inneholder villi og tilsett 10 ml fersk iskald PBS til tarmfragmentene. Fortsett å riste fragmentene og gjenta dette vasketrinnet til villi ikke lenger slippes ut i PBS, men i stedet inneholder PBS primært krypter. Ikke overskrid 15 minutter for kryptisolasjon, slik at cellens levedyktighet ikke blir kompromittert.
  12. Kast de resterende tarmfragmentene. Berik de resterende PBS i petriskålen for tarmkrypter. I en vevskulturhette samler du PBS-holdige krypter og filtrerer gjennom en 70 μm cellesil (materialfortegnelse).
  13. Sentrifuge ved 250 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml AdDMEM+. Sentrifuge igjen ved 250 x g i 5 min.
    MERK: Det anbefales å bruke en sentrifuge med en svingbøtte rotor.
  14. Fjern supernatanten, og etterlat ~ 50 μL media med pelleten. Resuspender pelleten i det gjenværende mediet og tilsett alikoten av EME på is. Pipetter forsiktig opp og ned for å henge kryptene jevnt gjennom EME. Unngå å introdusere bobler.
  15. Plate 50 μL EME-kupler i en 35 mm vevskulturskål og inkuber i 20 minutter i en 37 ° C, 5% CO2 vevskulturinkubator.
  16. Tilsett 2 ml rIOM (tabell 2) inneholdende 10 μM Y27632 og 10 μM CHIR99021 (tabell 3). Etter passering kan Y27632 og CHIR99021 seponeres.
  17. Bytt rIOM hver 2-3 dag. Passasje etter behov, vanligvis mellom 3-7 dager, avhengig av det opprinnelige antallet organoider, størrelse og veksthastighet.

3. Passaging rotte tarmorganoider

  1. Tine en 250 μl alikot EME på is og forvarm rIOM til 37 °C.
  2. Aspirer mediet fra en 35 mm plate som inneholder organoider og tilsett 1 ml dissosiasjonsreagens for umiddelbart å frigjøre organoider fra EME-kuplene.
  3. Overfør umiddelbart dissosiasjonsreagens med fragmenterte organoider til et 15 ml konisk rør. Vask dyrkningsplaten med 2 ml AdDMEM+ og tilsett det koniske røret på 15 ml som inneholder fragmenterte organoider.
  4. Med en glass Pasteur pipette, forsiktig pipette opp og ned 15-20 ganger for å fragmentere organoider. Sentrifuge ved 350 x g i 2 min.
  5. Tilsett ~ 50 μL oppløsning fra bunnen av det koniske røret inn i EME. Pipetter forsiktig opp og ned for å blande. Unngå å lage bobler.
  6. Plate 50 μL EME-kupler i en 35 mm tallerken og inkuber i 20 minutter i en 37 ° C, 5% CO2 vevskulturinkubator.
  7. Tilsett 2 ml rIOM med 10 μM Y27632 og 10 μM CHIR99021. Endre vekstmediet hver 2-3 dag. Ved mediebytte kan Y27632 og CHIR99021 utelates.

4. Kryopreservering og tining av tarmorganoider hos rotter

  1. Kryopreserverende tarmorganoider fra rotter
    MERK: Kryopreserveringsprotokollen ble modifisert fra en tidligere protokoll for humane og museorganoider25. Før frysing må organoidene ha minst to passasjer i primærkultur. Det anbefales å dyrke organoider til punktet av store sfæroider eller litt spirede organoider før kryopreservering, da dette vil resultere i et høyere utbytte av levedyktige organoider etter tining. Dette kan oppnås ved å øke det R-spondinbetingede mediet til 15 % og/eller ved å tilsette 10 mM nikotinamid (tabell 3) til organoidkulturen.
    1. Bruk et mikroskop til å telle antall organoider på 35 mm-fatet. Merk kryovialene slik at 200 organoider vil bli alisitert i hver cryovial.
    2. Fjern rIOM fra 35 mm fatet. Erstatt med 2 ml kald vevskultur klasse PBS.
    3. Bruk en P1000-spiss til å frigjøre EME-kuplene fra bunnen av dyrkingsskålen i PBS ved å pipettere opp og ned. Fortsett å pipette opp og ned ~20 ganger for å bryte opp EME og frigjøre organoidene. Samle organoider og PBS i et 15 ml konisk rør.
    4. Tilsett 2 ml kald PBS i dyrkingsskålen og pipett opp og ned for å frigjøre eventuelle gjenværende organoider i PBS. Overfør PBS til det koniske røret på 15 ml.
    5. Pellet organoidene ved sentrifugering ved 290 x g i 5 minutter. Fjern og kast supernatanten uten å forstyrre organoidpelleten.
    6. Vask pelleten ved å forsiktig resuspendere i 5 ml kald AdDMEM +. Sentrifuge ved 200 x g i 4 min. Fjern og kast supernatanten forsiktig.
    7. Resuspender den organoide pelleten i 1 ml kaldt frysemedium per 200 organoider. Aliquot 1 ml organoider i frysemedium per merket cryovial. Plasser kryovialene i en frysebeholder.
    8. Oppbevar organoidene i en frysebeholder ved -80 °C i 24 timer, og overfør deretter kryovialene til flytende nitrogen for langtidslagring.
  2. Tining av tarmorganoider fra rotter
    MERK: Denne protokollen ble modifisert fra en tidligere protokoll for tining av tarmorganoider for mennesker og mus26.
    1. Tine en 250 μL alikot av EME på is. Klargjør rIOM supplert med 15 % R-spondinbetingede medier, 10 μM Y27632 og 10 μM CHIR99021. Varm ved 37 °C.
    2. Tilsett 2 ml avrimingsmedium (tabell 3) til et 15 ml konisk rør ved romtemperatur.
    3. Hent opp og tine et hetteglass med organoider fra flytende nitrogen ved å plassere hetteglasset i et vannbad på 37 °C til hetteglasset er nesten helt tint.
    4. Tilsett 1 ml avrimingsmedium til hetteglasset og overfør alt innholdet til det koniske røret som inneholder avrimingsmedium. Vask hetteglasset to ganger med 1 ml avrimingsmedium og overfør det til koniske røret.
    5. Sentrifuge ved 200 x g i 5 min. Aspirer mediet, og etterlater ~ 50 μL medium med organoider. Overfør mediet som inneholder organoider til 250 mikrol EME.
    6. Fordel organoidene jevnt gjennom EME ved å pipettere opp og ned, unngå bobler. Pipett seks 50 μL kupler i en 35 mm vevskulturskål.
    7. Inkubere i vevskulturinkubatoren i 15-20 minutter for å tillate EME å polymerisere. Tilsett 2 ml av den tilberedte rIOM i parabolen.
    8. Etter 2 dager, bytt ut mediet med rIOM. Bruk av Y27632 og CHIR99021 kan suspenderes. Organoid vekst kan være langsom i første passasje etter tining. Det anbefales å passere organoider to ganger etter tining før du begynner eksperimenter.

5. Generering av rotte intestinal 2D monolayers fra 3D organoider

MERK: Følgende protokoll beskriver volumene som kreves for å generere 24 brønner av en 48-brønns plate belagt med EME, som starter med seks kupler på 50 μL (35 mm tallerken) som inneholder ~ 300 intestinale organoider / kuppel (skala: en kuppel genererer fire brønner), men kan skaleres opp eller ned etter behov. Som skrevet oppnår denne protokollen ~ 80% sammenløp på 4-5 dager. Ved høyere samløp begynner cellene å skaffe seg 3D-organoidstrukturer igjen. Ved lav sammenløp (≤40%) forblir cellene som monolag og er levedyktige i ~ 14 dager. Hvis formålet med studien er å bruke 2D-monolag, skaler du ned slik at en kuppel genererer åtte brønner med en 24-brønnsplate. Brønnene kan også belegges med kollagen I for å danne monolag.

  1. Forberedelse av belagte overflater
    1. For å belegge tallerkenen med EME, fortynn EME 1:20 i kaldt AdDMEM+ (tabell 1). For belegg med kollagen, lag kollagen I i henhold til produsentens instruksjoner. Fortynn 5 mg / ml kollagen I i AdDMEM + til 100 μg / ml (1:50 i dette tilfellet).
    2. Belegg platen med 200 μl fortynnet EME eller kollagen for å dekke brønnoverflaten helt. Inkuber i 1-2 timer ved 37 ° C i en vevskulturinkubator. Forbered tarmorganoidmedium fra rotter for 2D monolagskultur (rIOM2D) i henhold til tabell 4.
  2. Generering av monolayers
    1. Aspirer mediet fra en 35 mm plate som inneholder organoider. Tilsett 1 ml PBS.
    2. Forstyrr EME i brønnene ved å skrape med en P1000-spiss. Pipett opp og ned ca. 20 ganger for å løsne alt EME. Overfør alt til et 15 ml konisk rør.
    3. Tilsett 1 ml PBS til 35 mm-platen for å gjenopprette eventuelle ekstra organoider og overføre til det samme 15 ml koniske røret.
    4. Sentrifuger ved 350 x g i 2 minutter og aspirer supernatanten, inkludert EME-rester. Tilsett 1 ml trypsinoppløsning til den organoide pelleten og inkuber ved 37 °C i 2 minutter.
    5. Pipett opp og ned 10 ganger med en P1000-spiss og tilsett 2 ml AdDMEM+ for å nøytralisere trypsin.
    6. Sentrifuge ved 350 x g i 5 min. Aspirer supernatanten og tilsett 4,8 ml rIOM2D (tabell 4). Suspender cellepelleten på nytt.
    7. Før du plasserer organoidene, ta ut overflødig EME eller kollagen i AdDMEM + fra brønnene. Deretter tilsettes 200 μL organoider i rIOM2D og 10 μM Y27632 til hver forhåndsbelagt brønn.
    8. Etter 4-16 timer, samle mediet og sentrifuge ved 1000 x g i 1 min. Overfør supernatanten til et nytt 15 ml konisk rør og kast pelleten.
    9. Vask hver brønn med 300 μL PBS og tilsett 200 μL av den sentrifugerte rIOM2D til hver brønn. Endre rIOM2D hver 2-3 dag, suspendere bruken av Y27632.
  3. Reformere 3D-organoider fra monolag i 2D
    MERK: Monolayers dyrket på EME kan induseres til å reformere 3D-organoider, mens monolayers dyrket på kollagen I ikke effektivt tilbake til 3D-organoider. Vanligvis kan 2-3 brønner av organoider generert fra monolayers brukes til å lage en kuppel på 50 μL EME på dag 5.
    1. Fortynn EME 1:4 i rIOM2D. Når monolagene når ~ 80% konfluens, aspirerer mediet forsiktig og tilsett 100 μL fortynnet EME til brønnene som inneholder monolag.
    2. Inkuber ved 37 °C, 5% CO2 i en vevskulturinkubator i 20 minutter. Etterpå tilsettes 100 μL rIOM2D og går tilbake til vevskulturinkubatoren. 3D-organoider vil bli generert innen 5 dager etter tilsetning av fortynnet EME.
    3. Etter at små organoider har reformert (~ dag 5), forberede rIOM. Samle opp alt brønninnholdet, pipetter opp og ned for å forstyrre EME, og overfør til et 15 ml konisk rør.
    4. Sentrifuge ved 350 x g i 2 min. Aspirer supernatanten og EME-resten.
    5. Tilsett 1 ml kald AdDMEM+ og sentrifuge ved 350 x g i 2 minutter. Fjern supernatanten, og etterlat ~50 μL medier.
    6. Overfør 50 μL medier og organoider til en 250 μL EME-alikot. Pipett opp og ned for å fordele organoidene i hele EME.
    7. Pipette 50 μL EME-kupler i en 35 mm tallerken og inkuberes i 20 minutter i en vevskulturinkubator.
    8. Tilsett 2 ml rIOM pluss 10 μM Y27632. Endre vekstmediet hver 2-3 dag. Når du endrer mediet, kan Y27632 utelates.

6. Genetisk manipulering

  1. Transient transfeksjon av 2D monolayers
    FORSIKTIG: Forbered monolag av tarmepitel hos rotter etter pkt. 5.1 i en 48-brønnsplate. Transfeksjon må utføres ved 70%-80% konfluens. Bytt alltid ut mediene i brønnene med 200 μL fersk rIOM2D før transfeksjonering. Beregn 260/280 nm og 260/230 nm absorbansforhold for plasmid-DNA; Disse må være over 1,8 for å sikre gode transfeksjonsresultater.
    MERK: Bruk en plasmidkontroll for å beregne effektiviteten av transfeksjon. Et plasmid som koder for et fluorescerende protein anbefales for enkelhet. I denne protokollen ble pLJM1-EGFP27 brukt.
    1. Tilbered 1 mg/ml av 20 kDa polyetylenimin (PEI; Tabell 3). For hver brønn, klargjør rør A (0, 6 μg plasmid + 50 μL redusert serummedium) og rør B (1, 8 μL PEI + 50 μL redusert serummedium). Oppretthold et DNA:PEI-forhold på 1:3.
    2. Vortex begge rørene i 30 s. Kombiner rør A og rør B, og virvel igjen i 30 s. Bruk om nødvendig en sentrifuge for å spinne ned. Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
    3. Tilsett forsiktig DNA / PEI-komplekset dråpevis til 2D monolayer. Virvle forsiktig tallerkenen for å blande. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2. Uttrykket kan vanligvis oppdages etter 24 timer.
      MERK: Hvis det er nødvendig å gå tilbake til 3D-organoidstrukturer, vent i 48 timer etter transfeksjon for å tilsette fortynnet EME.
  2. Lentiviral transduksjon av tarmorganoider hos rotter
    MERK: Før du arbeider med lentivirus, få riktig autorisasjon og spesialisert opplæring fra institusjonen. Bruk alltid egnet personlig verneutstyr (PPE) når du håndterer lentivirus. Selv om det ikke er skissert her, er konsentrert lentivirus av høy kvalitet avgjørende for vellykket infeksjon av organoider. Denne protokollen benyttet tom pLJM1-EGFP-vektor27 å uttrykke løselig GFP. Denne protokollen er endret fra en tidligere publisert protokoll28. Transduksjonseffektiviteten avhenger av kvaliteten og konsentrasjonen av virale partikler, effektiv dissosiasjon av organoider i små celleklynger, og genet uttrykkes. Ved beregning 5 dager etter smitte var gjennomsnittlig transduksjonseffektivitet før seleksjon 19,4 % (± 6,5 % standardavvik).
    1. Ved 2 dager før lentiviral infeksjon, planlegg å passere (avsnitt 3) to tette brønner med en 24-brønns plate for hvert lentivirus som vil bli transducert. Hver brønn på en 24-brønns plate har plass til en 50 μL kuppel av EME.
    2. Når EME stivner, tilsett 0,5 ml rIOM supplert med 10 mM nikotinamid, 10 μM Y27632 og 2,5 μM CHIR99021. Dette induserer store sfæroidmorfologier, noe som er gunstig for effektiviteten av lentiviral transduksjon. Innen 2 dager etter plating, bør rotteorganoider være store sfæroider. Hvis signifikant differensiering (dvs. spirende) observeres, repassage organoider.
    3. Tine det konsentrerte viruset på is. Tilbered ferske transduksjonsmedier i henhold til tabell 3.
    4. Bruk en P1000-spiss til å frigjøre EME-kuplene fra bunnen av cellekulturskålen i mediet ved å pipettere opp og ned. Fortsett å pipette opp og ned 20 ganger for å bryte opp EME og frigjøre organoidene.
    5. Pipetter organoider og medier inn i et 15 ml konisk rør. Alle brønnene kan slås sammen, forutsatt at organoidene har samme genotype og er fra samme linje.
    6. Vask hver brønn to ganger med 1 ml kald AdDMEM+. Samle AdDMEM + og overfør den til det samme 15 ml koniske røret.
    7. Bruk en glass Pasteur pipette, forstyrre mekanisk rotteorganoider. Dette er et kritisk skritt, da målet er små flercellede klynger av celler. Pipette opp og ned ~30 ganger. Kontroller effektiviteten av forstyrrelsen under mikroskopet ved hjelp av et 4x-mål. Fortsett denne prosessen til cellesuspensjonen hovedsakelig består av celleklynger med få organoider igjen.
      MERK: Alternativt kan organoider sentrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur, supernatanten fjernes forsiktig og resuspenderes i 1 ml rekombinant enzym som erstatter konvensjonelt trypsin/EDTA, forvarmet til 37 °C i vevskulturinkubatoren. Inkuber organoidene i trypsinerstatning i 2 minutter i et vannbad på 37 °C, med regelmessig virvel for å fremme dissosiasjon. Unngå langvarig inkubasjon med trypsinutskifting, da dette kan fremme celledød. Kontroller regelmessig for effektiviteten av forstyrrelser under mikroskopet ved hjelp av et 4x-mål. Når suspensjonen hovedsakelig består av enkeltceller med få cellekulturer, fortynn trypsinerstatningen ved å tilsette 4 ml AdDMEM + og fortsett med følgende trinn.
    8. Spinn det kjegleformede røret på 15 ml som inneholder celleklyngene ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern og kast supernatanten forsiktig, pass på at den ikke forstyrrer cellepelleten.
    9. Resuspender celleklyngene i 230 μL transduksjonsmedium per brønn som skal infiseres. For infeksjonen, bruk en brønn på en 48-brønnplate for hvert lentivirus.
    10. Plate 230 μL cellesuspensjon i hver brønn av en merket 48-brønnplate. Tilsett 20 μL konsentrert virus til hver brønn. Bruk en P1000-spiss til å blande virus-/celleoppløsningen i hver brønn og forsegle platen med en gjennomsiktig film.
    11. Utfør spinokulering: sentrifuger platen ved 600 x g i 1 time ved 32 °C. Fjern forseglingen og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 6 timer.
    12. Forvarm en 24-brønns plate i 37 ° C inkubatoren.
    13. Etter inkubasjon, pipett hver brønn opp og ned og overfør innholdet til et merket 1,5 ml rør. Vask hver brønn med 750 μL AdDMEM + og overfør til røret. Spinn rørene ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    14. Fjern rørene fra sentrifugen og oppbevar på is. Bruk en P1000-spiss for å fjerne og kaste supernatanten forsiktig.
    15. Resuspender cellepelleten i EME og plate 50 μL kupler i den forvarmede 24-brønnsplaten. Inkuber i 15-20 minutter ved 37 °C til EME polymeriseres.
    16. Til hver brønn, tilsett 500 μL rIOM supplert med 10 mM nikotinamid, 10 μM Y27632 og 2,5 μM CHIR99021.
    17. Bytt ut mediet med rIOM pluss 10 μM Y27632 1 dag etter infeksjon. Bytt media hver 2-3 dag. Hvis utvelgelsen skal utføres, legg til valg 48-72 timer etter infeksjon. For puromycinvalg, bruk 2 μg / ml puromycin.

7. Immunfluorescens helmonteringsfarging av organoider

  1. Aspirer mediet og tilsett 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS-Tween 20 (PBS-T) (tabell 3) til organoidene i en cellekulturskål. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter.
  2. Frigjør organoidene fra EME ved å pipettere opp og ned. Samle organoider i et 0,75 ml rør. Organoidene vil slå seg til bunnen av røret ved tyngdekraften i løpet av få minutter. Sentrifuger om nødvendig ved 100 x g i 1 min.
  3. Bruk en overføringspipette, fjern PFA og resuspender organoidene i PBS-T. La organoidene slå seg til bunnen av røret. Fjern PBS-T og resuspender i 200 μL blokkoppløsning (tabell 3).
  4. Inkuber ved romtemperatur på en vippe eller nutator i 45 minutter. Organoider kan klumpe seg og slå seg ned til bunnen av røret. Fingerflikk røret med jevne mellomrom for å resuspendere og spre det gjennom hele oppløsningen.
  5. La organoidene slå seg ned til bunnen av røret. Sentrifuger om nødvendig ved 100 x g i 1 min. Fjern blokkløsning.
  6. Tilsett primært antistoff fortynnet i 100 μL blokkoppløsning. Inkuber ved romtemperatur på en nøtteblander i 45 minutter ved 24 o / min. Antistoffkonsentrasjoner varierer avhengig av antistoffet som brukes.
    MERK: Dette trinnet kan utvides basert på det primære antistoffet, opp til over natten ved 4 °C.
  7. La organoidene slå seg ned til bunnen av røret. Sentrifuger om nødvendig ved 100 x g i 1 min.
  8. Vask i PBS-T fem ganger med en overføringspipette. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter på nøtteblanderen ved 24 o / min. Gjenta dette trinnet to ganger.
  9. Legg til sekundært antistoff fortynnet 1:200 og 50 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fortynnet i 100 mikrol blokkoppløsning. Inkuber ved romtemperatur på en nøtteblander i 30 minutter ved 24 o / min.
  10. La organoidene slå seg ned til bunnen av røret. Sentrifuger om nødvendig ved 100 x g i 1 min. Fjern sekundært antistoff. Vask fem ganger i PBS-T med en overføringspipette.
  11. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter på en nøtteblander ved 24 o / min. Gjenta vasketrinnet to ganger.
  12. Mens organoidene vaskes, varm opp et alikot av VALAP tetningsmasse (tabell 3) ved 40-50 °C for å gjøre flytende. Bruk en pensel til å male en tynn firkant av VALAP på et lysbilde i mikroskop på størrelse med et deksel. Bruk en 22 mm x 22 mm Nr. 1.5 coverslip .
  13. Bruk en saks til å klippe enden av en P200 pipettespiss. Overfør organoider til VALAP-brønnen på lysbildet. Bruk en tørkeserviett til å transportere PBS-T forsiktig. Ikke la organoidene tørke ut.
  14. Oversvømme VALAP-brønnen med et antifademonteringsmedium (tabell 3). For en ~ 22 mm x 22 mm firkant, vil dette kreve 100-150 μL antifade.
  15. Organoidene kan klynge; Roter antifaden med en pipettespiss for å omfordele organoidene om nødvendig. Monteres med 22 mm x 22 mm deksel nr. 1,5, unngå luftbobler. Forsegle dekselet ved å male et tynt lag med VALAP på kantene.
    MERK: For inverterte mikroskoper kan organoidene også monteres i en 35 mm glassbunnsfat.

8. Forskolin-indusert hevelse av tarmorganoider hos rotter

  1. Voks organoider i 3-5 dager etter passering i rIOM. Det anbefales å dyrke organoider i en 24-brønns plate for å sikre at den samme regionen lett kan reimaged. Ta bilder før tilsetning av forskolin (T0).
  2. Tilsett forskolin (tabell 3) direkte til organoidmediet til en endelig konsentrasjon på 10 μM. Tilsett samme volum dimetylsulfoksid (DMSO) til kontrollbrønnene.
  3. Se for deg kontroll- og forskolinbehandlede brønner med jevne mellomrom, hvert 15.-30. minutt. Når du ikke avbildning, hold organoider i inkubatoren eller bruk et kontrollert bildebehandlingssystem med inkubasjon. Maksimal hevelse bør observeres med 120 minutter.
  4. Følg standardprotokoller for å beregne relativ hevelse fra de oppkjøpte bildene29.

Representative Results

Rotte duodenale og jejunale organoider ble generert ved hjelp av protokollen skissert i avsnitt 2. Det er svært viktig under kryptisolasjonstrinnene at villi effektivt tømmes fra PBS. Hvis for mange villi er belagt i EME med krypter, kan det føre til at hele kulturen dør og manglende etablering av en organoid linje. På grunn av dette er det nyttig å isolere krypter under et dissekeringsomfang, noe som muliggjør visuell bekreftelse av villar-uttømming. Figur 1 viser representative villarfragmenter og krypter (figur 1A). Legg merke til den betydelig mindre størrelsen på krypter sammenlignet med villi (figur 1B). Etter plating vil kryptene ekspandere til sfæroider i løpet av de neste dagene og begynne å knoppe og differensiere innen dag 4-7 (figur 2). Når organoidene når et omfattende budded stadium, bør de passeres. Under passering er det viktig å forstyrre organoidene nok til å splitte kryptknoppene fra hverandre, slik at organoidnumrene kan utvides (figur 3B).

Den vellykkede utvinningen av organoider etter frysing er svært avhengig av tilstanden der de er frosset. Organoider i en svært proliferativ utifferentiert tilstand gjenopprettes med høyeste effektivitet. Derfor anbefaler vi å indusere dem til å være sfæriske og cystiske i stedet for spirede og differensierte. For å oppnå dette kan Wnt hyperaktiveres ved å øke mengden av Wnt-liganden R-spondin i media og ved å inkludere nikotinamid i media, noe som har vist seg å støtte organoiddannelse og celleoverlevelse i flere kultursystemer30,31. Figur 3A viser en sunn organoidkultur bare 2 dager etter tining. Inkludert BSA i media under tining har også bidratt til overlevelse av tarmorganoidkulturer fra rotter, som har vist seg å være mer delikate enn museorganoider.

Mens 3D-organoidkultur ofte foretrekkes fordi den rekapitulerer noe av den normale tarmarkitekturen, gjør den andre tilnærminger, inkludert levende bildebehandling, transfeksjoner og lentivirale transduksjoner, mer teknisk utfordrende. Bruken av 2D monolayers generert fra 3D-organoider32 (figur 4) muliggjør høyere effektivitetsinnføring av plasmidene. Mens 3D-intestinale organoider tradisjonelt er resistente mot forbigående transfeksjoner, kan plasmider som koder for EGFP med hell introduseres ved hjelp av lipidbaserte transfeksjonsmetoder. Den mest kostnadseffektive tilnærmingen ved bruk av PEI er skissert i trinn 6.1 (figur 5), men elektroporering og kommersielt tilgjengelige transfeksjonsreagenser har også gitt sammenlignbare resultater (data ikke vist). Fremtidige studier vil være fokusert på om disse tilnærmingene kan brukes til å introdusere CRISPR-konstruksjoner i monolag.

Det var viktig å kunne reformere 3D-organoider fra 2D-monolag etter transfeksjon slik at de kunne opprettholdes som en passasjelinje med 3D-arkitektoniske komponenter av krypter. Interessant nok ble 2D-monolayers belagt på EME lett reformert til små sfæroider når EME ble lagt tilbake til toppen av cellene, mens et kollagen I-substrat ikke var tilstrekkelig for reformasjon av 3D-strukturer (figur 6).

Mens forbigående transfeksjoner er nyttige for mange studier, er dannelsen av stabile linjer ofte mer nyttige, noe som krever innføring av lentivirus i cellene. Intestinale organoider hos rotter ble infisert med lentivirus ved å modifisere tidligere publiserte protokoller (figur 7). Et sentralt trinn i protokollen er forstyrrelsen av organoider i små aggregater eller celleklynger. Hvis kulturer ikke forstyrres effektivt og organoider forblir intakte, vil de lentivirale partiklene ikke komme inn i cellene. Etter infeksjon må organoider gjenopprette og vokse igjen. Protokollen som er skissert her, tillater opptak av viruspartikler med 10% -48% (gjennomsnitt: 19,4% ± 6,5%) av cellene før valg.

Helmonteringsfarging av organoider kan være vanskelig på grunn av ufullstendig fjerning av EME-rester eller ufullstendig antistoffpenetrans. Protokollen som er skissert her, tillater robust farging av organoider. Visualisering av organoider på et konfokalmikroskop kan også vise seg vanskelig hvis de er for langt unna dekselet. Ved å bruke VALAP lages en brønn med noe høyde slik at organoider ikke knuses av dekkslippet, men likevel får lov til å legge seg nær dekkslippet for enkel avbildning. Representativ farging mot apikal anionkanal cystisk fibrose transmembran konduktansregulator (CFTR) og falloidin for å merke F-aktin er vist i figur 8.

Endelig har organoider nytte i funksjonelle analyser. Pasientavledede organoider fra pasienter med cystisk fibrose har blitt brukt til å screene CFTR-funksjonen, da behandling med cAMP-agonisten forskolin induserer robust CFTR-mediert væskesekresjon som forårsaker organoid hevelse 29,33-37. Et mål med dette arbeidet var å identifisere og utvikle en organoid modell som kan brukes parallelt med in vivo prekliniske studier. Derfor hadde vi som mål å avgjøre om tarmorganoider hos rotter gjennomgår forskolinindusert hevelse. Innen 30 minutter etter forskolinbehandling svulmet rotteorganoidene opp, med maksimal effekt observert etter 120 minutter (figur 9).

Figure 1
Figur 1: Villarfragmenter og krypter under epitelisolering . (A) Representativt bilde av villarfragmenter i EDTA-løsning under kryptisolasjonsprotokollen. Gule pilspisser markerer villarfragmenter. Røde piler viser krypter festet til et villarfragment. Legg merke til forskjellen i relative størrelser. (B) Høyere forstørrelse bilde av en enkelt krypt (rød pil) slik at morfologi kan visualiseres. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Progresjon av tarmorganoider hos rotter. Rotte jejunum krypter ble belagt i EME umiddelbart etter isolasjon (A,B). I løpet av 2 dager ble kryptene sfæroider (C,D). På dag 5 begynte de å starte kryptknopper (E,F), som utdypet og vokste etter dag 7 (G). Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Organoider etter tining og passering. (A) Rotte jejunale organoider ble tint etter de skisserte protokollene etter kryopreservering. Legg merke til tilstedeværelsen av både sfæroider og spireorganoider bare 2 dager etter tining. (B) Den samme organoide linjen som er avbildet i A umiddelbart etter passering etter den skisserte protokollen. Legg merke til den relative størrelsesforskjellen mellom strukturer i A og B og tilstedeværelsen av enkle kryptlignende domener i B. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: 2D monolagsdannelse fra 3D-organoider. (A-C) 2D monolagsprogresjon på EME. (D-F) 2D monolayer-progresjon på kollagen I. Ved dag 5 ga hver tilstand ~ 80% sammenløp. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Forbigående transfeksjon av et 2D monolag. Representativt bilde av et 2D-monolag dyrket på EME transfektert med pLJM1-EGFP-plasmid ved bruk av PEI. (A) Brightfield, (B) fluorescens (GFP), (C) overlegg. Den stiplede røde linjen markerer monolagsgrensen. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Reformasjon av 3D-organoider fra 2D monolayers på EME. (A) Dannelse av 3D-organoider fra 2D monolayers dyrket på EME. Organoider dannes effektivt av 5 dager etter tilsetning av EME til den apikale overflaten av monolaget. Legg merke til overflod av døde celler som omgir de små 3D-sfæroidene. (B) Persistens av 2D monolayers 5 dager etter kollagen Jeg ble lagt til den apikale overflaten av 2D monolayers dyrket på kollagen I. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Lentiviral infeksjon av 3D-organoider. Rotte jejunum organoider ble infisert med kjernefysiske GFP lentivirale partikler ved hjelp av den skisserte protokollen. Etter utvinning og vekst i 5 dager ble organoider fiksert og motfarget med DAPI. (A) DAPI: grå; kjernekraftGFP: grønn. (B) kjernekraftGFP:grønn. Den stiplede røde linjen markerer organoidgrensen. Skala barer: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Helmontert immunfluorescens av tarmorganoider fra rotter. (A) CFTR, (B) falloidin og (C) fusjonerte helmontert immunfluorescens hos rotte jejunale organoider. Legg merke til den apikale anrikningen av CFTR-farging i organoider (grå i A, magenta i C). Falloidin markerer F- aktin og merker tydelig den apikale penselkanten (grå i B, cyan i C). Skala barer: 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Intestinale organoider hos rotter svulmer ved forskolinstimulering. Representativ tidsforløp av tarmorganoid hevelse hos rotter etter tilsetning av cAMP-agonisten forskolin. 0 min-tiden representerer tidspunktet umiddelbart før tilsetning av 10 μM forskolin. Bilder viser den samme organoiden med 30 min tidsintervaller. Maksimal hevelse ble observert ved 120 min etter forskolin tillegg. Den stiplede røde linjen skisserer organoidgrensen. Det mørke materialet i midten av organoid lumen består av døde celler. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: AdDMEM+ oppskrift. Ingredienser for å lage standard AdDMEM + -medier, som er basismediet gjennom metodene som vises her. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Rotte intestinal organoid media (rIOM) oppskrift. Detaljert oppskrift på standard tarmorganoidmedier fra rotter, inkludert løsningsmiddel og lagringsbetingelser for rekombinante proteiner. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Løsninger. Oppskrifter og instruksjoner for å lage andre løsninger som brukes i hele protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4. Tarmorganoid medium for 2D monolagskultur (rIOM2D). Modifisert oppskrift av organoid kultur media optimalisert for 2D vekst av monolayers. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Utviklingen av en tarmorganoidmodell hos rotter bevarer viktige funksjonelle egenskaper som finnes i organet in vivo og er et lovende verktøy for preklinisk testing, legemiddelscreening og funksjonelle analyser. Denne in vitro-modellen kan brukes parallelt med in vivo prekliniske gastroenterologistudier, hvor rotter ofte er en foretrukket modell på grunn av deres større tarmstørrelse, delte fysiologiske aspekter med mennesker, og i noen tilfeller er bedre sykdomsmodeller38. Her er en robust trinnvis protokoll for isolering av tarmkrypter fra rotter, generering og langsiktig kultur av tarmorganoider fra rotter, samt nedstrøms applikasjoner, inkludert funksjonelle forskolin hevelsesanalyser, hele mount immunfluorescens, 2D monolagskultur og lentiviral genetisk manipulasjon skissert. Intestinale organoider fra rotter er sannsynligvis relevante i mange sykdomssammenhenger der patofysiologien til musemodeller er uhensiktsmessig og kan gi en bedre modell for human tarmfysiologi sammenlignet med intestinale organoider fra mus.

For å etablere langlivede organoidkulturer som kan passeres og utvides, er det viktig å identifisere de viktigste vekstfaktorene som kreves for å opprettholde intestinal epitelial spredning. Museorganoider dyrkes oftest i en enkel cocktail av EGF, R-spondin og Noggin, selv om det har blitt rapportert at Noggin ikke er nødvendig for intestinal organoidkultur39. Betingede medier kan erstatte rekombinante vekstfaktorer, og de mest brukte cellelinjene er L-WRN, som utskiller Wnt3a, Rspondin-3 og Noggin39, L-Wnt3a og HA-Rspondin1-Fc 293T-celler40. L-WRN betingede medier er tilstrekkelig til å støtte ikke bare mus intestinal39 organoid vekst, men veksten av intestinale organoider fra flere husdyr og følgesvenner, inkludert hunder, katter, kyllinger, hester, kyr, sauer og griser12. Imidlertid er humane intestinale organoider svært forskjellige i deres vekstfaktorkrav, da de krever forskjellige medieformuleringer for deres ekspansjonsvekstfase (dvs. progresjonen fra små til store sfæroider) versus deres differensieringsfase (dvs. generering og modning av differensierte celletyper)10. Mediekravene til tarmorganoider fra rotter speiler nøye ekspansjonsvekstmediene for humane tarmorganoider, men spesielt er rotteorganoider i stand til både vekst og differensiering i dette mediemiljøet, noe som forenkler deres kulturkrav betydelig. Mens våre første forsøk fokuserte på å etablere og dyrke tarmorganoider fra rotter i L-WRN-betingede medier, var langsiktig kultur spinkel, og rottetarmorganoidlinjer led av mangel på robusthet (data ikke vist). Dette kan skyldes at L-WRN-cellelinjer er konstruert for å skille ut R-spondin 3, mens 293T-Rspo1-cellelinjen som anbefales her, er konstruert for å skille ut R-spondin 1. Det er mulig at rotter og humane organoider foretrekker R-spondin 1, noe som potensielt kan føre til svikt i rotteorganoide linjer i L-WRN-betingede medier.

For å rekapitulere in vivo-innstillingen nærmest, er det viktig å utvikle organoidkulturbetingelser som muliggjør stamcelleoverlevelse, vedlikehold og spredning, og som kan opprettholde cellulær omsetning og samtidige differensieringshendelser i diskrete celletyper. Derfor må konsentrasjonene av rekombinante proteiner og/eller proteiner i betingede medier titreres og kontrolleres tett for å oppnå denne perfekte balansen. Spesielt er optimale Wnt-nivåer avgjørende for å unngå tap av intestinale organoidkulturer. For lite Wnt i betingede medier vil ikke være i stand til å støtte vekst, noe som fører til tap av stamceller og påfølgende organoid død; overaktivering av Wnt vil føre til at organoider blir cystiske og udifferensierte10. Selv om det ikke er beskrevet her, anbefales det sterkt å teste hver batch av L-Wnt3a og 293T-Rspo1 betingede medier ved hjelp av en Wnt reporter luciferase-analyse, for eksempel en Topflash-cellelinje41. Tidligere studier har beskrevet at et optimalt parti av L-Wnt3a-medier bør resultere i en 15 ganger signaløkning ved 12,5% og en 300 ganger signaløkning ved 50%, sammenlignet med 1% L-Wnt3a10. Siden rotteorganoider er mer følsomme enn museorganoider for kulturkrav, spesielt Wnt-aktiveringsnivåer, bidrar disse ekstra kvalitetskontrolltrinnene sterkt til å lette robustheten og påliteligheten til rotteorganoidkulturer. Fordi en lignende reporterlinje ikke er tilgjengelig for testing av Bmp-aktivitet og relative Noggin-konsentrasjoner i Noggin-kondisjonerte medier, anbefales det å bruke rekombinant Noggin når det er mulig for å nøyaktig kontrollere Noggin-nivåer. Mens mus intestinale organoider kan dyrkes og vedlikeholdes i fravær av Noggin39, har dette ikke blitt forsøkt for rotte intestinal organoid kulturer.

Utover cellekulturkrav, avhenger den vellykkede første etableringen av en rotteorganoidlinje kritisk av effektiv uttømming av differensierte villi under kryptisolasjon. Høye nivåer av villar-forurensning forårsaker kryptdød, antagelig på grunn av enten signaler fra de døende cellene eller sekvestrering av viktige faktorer. For å tømme disse differensierte villi fra epitelpreparater nøyaktig og konsekvent, anbefales det å utføre epitelisolasjoner ved hjelp av et stereoskop. Visuell undersøkelse av epitelet som frigjøres, gir et klart signal om når PBS skal kastes og erstattes (figur 1). Krypter bør ikke samles inn før det er tilstrekkelig uttømming av villi. Villar-celler er terminalt differensiert og kan ikke generere organoider i kultur. I tillegg krever etterfølgende passering av tarmorganoider fra rotter og deres bruk for enhver nedstrøms applikasjon delikat pleie. Inkubasjon i dissosiasjonsreagenser i lengre perioder (10 min) resulterer i signifikant celledød og tap av organoidlinjen.

Her beskrives en enkel og rask protokoll for generering av intestinale monolayers fra rotteorganoider. EME- og kollagen I-substrater har forskjellige effekter på epitelet, som kan utnyttes avhengig av formålet med studien. EME muliggjør rask og effektiv adhesjon av enkeltceller og dannelse av celleprojeksjoner. I motsetning til dette forsinker belegg overflaten med kollagen I disse prosessene. Når monolayers når omtrent 80% sammenløp, begynner celler dyrket på EME å generere 3D-organoidstrukturer igjen. Imidlertid mangler de tilstrekkelig fysisk og kjemisk støtte for fortsatt vekst. Denne tilbakevendingen tilbake til organoid tilstand kan forhindres ved å opprettholde monolayers i EME ved en konfluens på 50% -80%. Tilsetningen av fortynnet EME til den apikale overflaten av monolayers fremmer rask gjenoppretting og dannelse av de novo-organoider, og genererer konvergensregioner raskere og lettere. På en kollagen I-overflate kan celler danne et jevnt monolag og generere små klynger. Imidlertid er tilsetningen av kollagen I på toppen av monolayers ikke tilstrekkelig til å indusere organoiddannelse. EME må fortynnes når det legges til monolagsoverflaten, da det vil være en sterkere mekanisk motstand for den gryende organoiden å overvinne. Denne fortynnede EME tillater imidlertid ikke robust dannelse av store organoider. Alle de novo-genererte rotteorganoider som naturlig løsner fra overflaten, må umiddelbart fjernes og overføres til ufortynnet EME slik at strukturell støtte og vekst kan gjenopprettes. På grunn av den lille størrelsen på organoidene i dette trinnet, anbefales ikke passasje av organoider før robust vekst er etablert. Den underliggende biologiske betydningen av hvorfor EME kan støtte reformasjonen av organoider, men om kollagen kan eller ikke kan gjøre dette, er ikke klart. Imidlertid har det vært rapporter om at celler dyrket i 3D-kollagen ikke kan danne budded organoider42,43 eller støtte langsiktig vedlikehold. Kommersielt tilgjengelige EME-produkter er heterogene blandinger av ekstracellulære proteiner, primært laminin og kollagen IV44. Derfor kan den distinkte sammensetningen av proteiner og evnen til en epitelcelle til å engasjere seg med den ekstracellulære matrisen ved hjelp av forskjellige cellulære komplekser tillate remodellering i EME, men ikke kollagen I. Hvorvidt kollagen I-avledede monolayers kan settes inn i EME for å støtte organoiddannelse og vekst har ikke blitt testet.

Genetisk manipulering av rottetarmorganoidmodellen er beskrevet her, og protokoller for lentiviral transduksjon av 3D-organoider og forbigående transfeksjon av 2D-monolag er skissert. For å overvinne den lave effektiviteten av lentiviral organoid transduksjon ble det utviklet en protokoll for forbigående transfeksjon av 2D monolayers. Den flate morfologien og eksponerte apikale domener av monolayers gir lettere tilgang til virus og DNA-holdige komplekser. Uttrykket av en EGFP-reporter som bruker pLJM1-EGFP-vektoren ble brukt til validering av denne teknikken. GFP-reporteruttrykk ble observert etter 24 timer, og ble opprettholdt i 5-6 dager i monolag. Fremtidige studier som fokuserer på lentiviviral transduksjon av monolayers vil sannsynligvis ha høyere effektivitet enn 3D organoid transduksjon. Ved hjelp av protokollene ovenfor kan 3D-organoider reformeres fra infiserte 2D-monolag for å lette opprettelsen av stabile linjer. Med forsiktighet kan rottetarmorganoidlinjer opprettholdes i over et år, forbli stabile over mange passasjer, kryopreservert, vellykket tint og genetisk modifisert ved hjelp av lentiviviral transduksjon, og dermed adressere behovet for en tilgjengelig og håndterbar in vitro intestinal organoidmodell som beholder fysiologisk relevans for mennesker.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av Sumigray og Ameen laboratorier for deres gjennomtenkte diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av et Charles H. Hood Foundation Child Health Grant og et Cystic Fibrosis Foundation-stipend (004741P222) til KS og av National Institute of Diabetes og fordøyelses- og nyresykdommer fra National Institutes of Health til NA under tildelingsnummer 2R01DK077065-12.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-D Culture Matrix Rat Collagen I Cultrex/R&D Systems 3447-020-01
70 µm cell strainer Corning/Falcon 352350
Advanced DMEM/F12 Gibco/Thermo Fisher 12634010
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher 17504044
CHIR99021 Cayman Chemical 13122
CryoStor Stem Cell Technologies 100-1061
Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells R & D Systems 3710-001-01
FBS Gibco/Thermo Fisher 16-000-044
Gastrin I (human) Sigma Aldrich G9145
Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 100-0485
Glutamax Thermo Fisher 35-050-061
Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free Corning 356231
HEPES AmericanBio AB06021
Lanolin Beantown Chemical 144255-250G
L-glutamine Gibco/Thermo Fisher A2916801
L-Wnt3a cells ATCC CRL-2647
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher 17502-048
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165-5G
Nicotinamide  Sigma Aldrich N0636
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco/Thermo Fisher 31985070
Paraffin Fisher Scientific P31-500
Parafilm Sigma Aldrich P7793 transparent film
PBS Thermo Fisher 10010023
Penicillin/Streptomycin Gibco/Thermo Fisher 15140122
pLJM1-EGFP Addgene 19319
Polybrene Millipore TR-1003-G
Polyethylenimine hydrochloride (PEI) Sigma Aldrich 764965
p-phenylenediamine  Acros Organics/Thermo Fisher 417481000
Puromycin VWR J593-25mg
Recombinant human FGF2 protein Peprotech 100-18B-250ug
Recombinant human IGF-1 protein Biolegend B356441
Recombinant human Noggin protein R & D Systems 6057-NG-100
Recombinant mouse EGF protein Thermo Fisher PMG8041
Sprague Dawley rat Charles River Laboratories Strain 001
Triton X-100 American Bioanalytical AB02025-00500
TrypLE Express Enzyme Gibco/Thermo Fisher 12604013
Y27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nature Reviews. Molecular Cell BiologyI. 22 (1), 39-53 (2021).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Yin, Y. -B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. -L. Enteroids for nutritional studies. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (16), 1801143 (2019).
  4. Cai, T., et al. Effects of six common dietary nutrients on murine intestinal organoid growth. PLoS One. 13 (2), e0191517 (2018).
  5. Davoudi, Z., et al. Gut Organoid as a new platform to study alginate and chitosan mediated PLGA nanoparticles for drug delivery. Marine Drugs. 19 (5), 282 (2021).
  6. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  7. Yin, Y. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. L. Mini-gut: a promising model for drug development. Drug Discovery Today. 24 (9), 1784-1794 (2019).
  8. Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).
  9. Gunther, C., Winner, B., Neurath, M. F., Stappenbeck, T. S. Organoids in gastrointestinal diseases: from experimental models to clinical translation. Gut. 71 (9), 1892-1908 (2022).
  10. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
  11. Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
  12. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  13. Fagerholm, U., Johansson, M., Lennernas, H. Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum. Pharmaceutical Research. 13 (9), 1336-1342 (1996).
  14. Dubbelboer, I. R., Dahlgren, D., Sjogren, E., Lennernas, H. Rat intestinal drug permeability: A status report and summary of repeated determinations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 364-376 (2019).
  15. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  16. Zhang, Z., Carriero, N., Gerstein, M. Comparative analysis of processed pseudogenes in the mouse and human genomes. Trends in Genetics. 20 (2), 62-67 (2004).
  17. Lambracht-Washington, D., Fischer Lindahl, K. Active MHC class Ib genes in rat are pseudogenes in the mouse. Immunogenetics. 56 (2), 118-121 (2004).
  18. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
  19. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  20. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  21. Olivier, A. K., Gibson-Corley, K. N., Meyerholz, D. K. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of cystic fibrosis: gastrointestinal, pancreatic, and hepatobiliary disease and pathophysiology. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (6), G459-G471 (2015).
  22. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  23. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  24. Hedrich, W. D., et al. Development and characterization of rat duodenal organoids for ADME and toxicology applications. Toxicology. 446, 152614 (2020).
  25. How to Cryopreserve Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html (2023).
  26. How to Thaw Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html (2023).
  27. Sancak, Y., et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).
  28. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
  29. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
  30. Regent, F., et al. Nicotinamide promotes formation of retinal organoids from human pluripotent stem cells via enhanced neural cell fate commitment. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 878351 (2022).
  31. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  32. Breau, K. A., et al. Efficient transgenesis and homology-directed gene targeting in monolayers of primary human small intestinal and colonic epithelial stem cells. Stem Cell Reports. 17 (6), 1493-1506 (2022).
  33. Berkers, G., et al. Rectal organoids enable personalized treatment of cystic fibrosis. Cell Reports. 26 (7), 1701-1708 (2019).
  34. deWinter-de Groot, K. M., et al. Forskolin-induced swelling of intestinal organoids correlates with disease severity in adults with cystic fibrosis and homozygous F508del mutations. Journal of Cystic Fibrosis. 19 (4), 614-619 (2020).
  35. Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
  36. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  37. van Mourik, P., Beekman, J. M., vander Ent, C. K. Intestinal organoids to model cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 54 (1), 1802379 (2019).
  38. Tong, T., et al. Transport of artificial virus-like nanocarriers through intestinal monolayers via microfold cells. Nanoscale. 12 (30), 16339-16347 (2020).
  39. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  40. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  41. Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
  42. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9 (9), e107814 (2014).
  43. Sachs, N., Tsukamoto, Y., Kujala, P., Peters, P. J., Clevers, H. Intestinal epithelial organoids fuse to form self-organizing tubes in floating collagen gels. Development. 144 (6), 1107-1112 (2017).
  44. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).

Tags

Biologi utgave 196
Generering og manipulering av tarmorganoider fra rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zagoren, E., Santos, A. K., Ameen,… More

Zagoren, E., Santos, A. K., Ameen, N. A., Sumigray, K. Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (196), e65343, doi:10.3791/65343 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter