Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generering och manipulation av tarmorganoider hos råttor

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65343
Automatic Translation
*1, *1,2, 3,4, 1,5,6
1Department of Genetics, Yale School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Yale School of Medicine, 3Department of Pediatrics/Gastroenterology and Hepatology, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 5Yale Stem Cell Center, Yale School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att generera tarmorganoider från råttor och använda dem i flera nedströmsapplikationer. Råttor är ofta en föredragen preklinisk modell, och det robusta tarmorganoidsystemet fyller behovet av ett in vitro-system för att åtfölja in vivo-studier .

Abstract

När man använder organoider för att bedöma fysiologi och cellens öde är det viktigt att använda en modell som nära rekapitulerar in vivo-sammanhang . Följaktligen används patienthärledda organoider för sjukdomsmodellering, läkemedelsupptäckt och personlig behandlingsscreening. Mus tarmorganoider används ofta för att förstå aspekter av både tarmfunktion/fysiologi och stamcellsdynamik/ödesbeslut. Men i många sjukdomssammanhang är råttor ofta att föredra framför möss som modell på grund av deras större fysiologiska likhet med människor när det gäller sjukdomspatofysiologi. Råttmodellen har begränsats av brist på genetiska verktyg tillgängliga in vivo, och organoider från råttors tarmar har visat sig vara ömtåliga och svåra att odla på lång sikt. Här bygger vi vidare på tidigare publicerade protokoll för att på ett robust sätt generera tarmorganoider från råttor från tolvfingertarmen och jejunum. Vi ger en översikt över flera nedströmsapplikationer som använder tarmorganoider från råttor, inklusive funktionella svullnadsanalyser, helmonteringsfärgning, generering av 2D-enteroidmonolager och lentiviral transduktion. Råttorganoidmodellen ger en praktisk lösning på fältets behov av en in vitro-modell som behåller fysiologisk relevans för människor, snabbt kan manipuleras genetiskt och lätt erhålls utan de hinder som är involverade i att skaffa mänskliga tarmorganoider.

Introduction

Den mänskliga tunntarmens epitelarkitektur och cellulära sammansättning är komplexa, vilket återspeglar deras fysiologiska funktioner. Tunntarmens primära roll är att absorbera näringsämnen från mat som passerar genom dess lumen1. För att maximera denna funktion är tarmytan organiserad i fingerliknande utsprång som kallas villi, som ökar den absorberande ytan, och koppliknande invaginationer som kallas kryptor, som rymmer och isolerar stamcellerna. Inom epitelet genereras olika specialiserade absorberande och sekretoriska celltyper för att utföra distinkta funktioner1. På grund av denna komplexitet har det varit svårt att modellera vävnader som tarmen i högpassagetransformerade immortaliserade cellinjer. Studien av stamceller, särskilt vuxna stamceller och deras differentieringsmekanismer, har dock möjliggjort utvecklingen av 3D-tarmorganoidkulturer. Användningen av organoidmodeller har förändrat fältet, delvis på grund av deras rekapitulation av vissa arkitektoniska komponenter och celltypsheterogenitet som finns i den intakta tarmen. Tarmorganoider kan odlas på lång sikt in vitro på grund av upprätthållandet av den aktiva stamcellspopulationen2.

Tarmorganoider har snabbt blivit en anpassningsbar modell för att studera stamcellsbiologi, cellfysiologi, genetiska sjukdomar och nutrition3,4, samt ett verktyg för att utveckla nya metoder för läkemedelstillförsel5. Dessutom används patienthärledda organoider för sjukdomsmodellering, läkemedelsupptäckt och personlig behandlingsscreening, bland annat 6,7,8,9. Mänskliga tarmorganoider utgör dock fortfarande utmaningar. Tillgången på vävnader, krav på godkännande från Institutional Review Board och etiska frågor begränsar den utbredda användningen av humanprover. Dessutom kräver mänskliga tarmorganoider som genereras från tarmkryptor två distinkta odlingsbetingelser för att upprätthålla odifferentierade stamceller eller för att inducera differentiering av mogna celltyper10. Detta står i kontrast till in vivo, där stamceller och mogna differentierade celltyper är närvarande samtidigt och kontinuerligt genereras/upprätthålls1. Å andra sidan kräver tarmorganoider från möss, som odlas i en mindre komplex cocktail av tillväxtfaktorer, inte denna förändring i mediesammansättningen och kan upprätthålla stamceller och differentierade celler i samma mediekontext 2,11. Viktiga skillnader i mustarm jämfört med människor kan dock göra musorganoider till en suboptimal modell i många fall. Sammantaget har många tarmorganoider från större däggdjur, inklusive hästar, grisar, får, kor, hundar och katter, framgångsrikt genererats i odlingsförhållanden som är närmare anpassade till mustarmsorganoider än odlingsförhållandena för mänskliga tarmorganoider12. Skillnaderna i tillväxtfaktorförhållanden mellan mus och humana organoider återspeglar sannolikt skillnader i stamcellsnischsammansättning och olika krav på stamcellers överlevnad, proliferation och underhåll. Därför finns det ett behov av ett lättillgängligt modellorganoidsystem som 1) liknar mänsklig tarmcellssammansättning, 2) innehåller stamceller med tillväxtfaktorkrav som de hos mänskliga tarmorganoider, och 3) kan kontinuerligt upprätthålla odifferentierade och differentierade fack. Helst skulle systemet vara från en vanligt förekommande preklinisk djurmodell, så att in vivo- och in vitro-experiment kan korreleras och användas tillsammans.

Råttor är en vanligt förekommande preklinisk modell för tarmfysiologi och farmakologiska studier på grund av deras mycket lika tarmfysiologi och biokemi som människor13, särskilt med avseende på tarmpermeabilitet14. Deras relativt större storlek jämfört med möss gör dem mer mottagliga för kirurgiska ingrepp. Även om modeller av stora djur, inklusive grisar, ibland används, är råttor en mer prisvärd modell, kräver mindre utrymme för djurhållning och har lätt kommersiellt tillgängliga standardstammar15. En nackdel med att använda råttmodeller är att den genetiska verktygslådan för in vivo-studier inte är välutvecklad jämfört med möss, och genereringen av nya råttlinjer, inklusive knockouts, knock-ins och transgena läkemedel, är ofta kostsam. Utvecklingen och optimeringen av en robust tarmorganoidmodell för råttor skulle möjliggöra genetisk manipulation, farmakologiska behandlingar och studier med högre genomströmning i en tillgänglig modell som behåller viktig fysiologisk relevans för människor. Fördelarna med en gnagarorganoidmodell jämfört med en annan är dock mycket beroende av den specifika process eller gen som studeras; Vissa gener som finns hos människor kan vara pseudogener hos möss men inte hos råttor16,17. Dessutom avslöjas artspecifika cellsubtyper i allt högre grad av encells-RNAseq18,19,20. Slutligen uppvisar modeller för tarmsjukdomar hos råttor och möss ofta betydande variationer i fenotyper21,22 så att den modell som närmare rekapitulerar symtomen och sjukdomsprocessen som ses hos människor måste väljas ut för nedströmsarbete. Genereringen av en tarmorganisationsmodell för råttor ger ytterligare flexibilitet och valmöjligheter för forskare att välja ett modellsystem som är mest lämpligt för deras omständigheter. Här utökas befintliga protokoll23,24 för generering av råtttarmorganoider och ett protokoll beskrivs för generering och underhåll av råtttarmorganoider från tolvfingertarmen eller jejunum. Dessutom beskrivs flera nedströmsapplikationer, inklusive lentiviral infektion, helmonteringsfärgning och forskolin svullnadsanalyser.

Protocol

OBS: All cellodling ska hanteras med korrekt aseptisk teknik i en vävnadsodlingshuv. Allt djurarbete i denna studie godkändes av Yale's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Beredning av cellodlingsreagenser

  1. Förbered R-spondin 1 konditionerat medium enligt tillverkarens instruktioner. Förbered Wnt3a-konditionerade medier enligt tillverkarens instruktioner. Förbered AdDMEM+ enligt beskrivningen i tabell 1.
  2. Återsuspendera gastrin i steril dH2O för att bereda ett 100 μM stammaterial. Alikvot och förvaras vid -80 °C. Återsuspendera N-acetylcystein i sterilt vatten för att bereda en stam på 100 mM. Alikvot och förvaras vid -20 °C i upp till 1 månad.
  3. Återsuspendera rekombinant humant Noggin i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) + 0,1 % bovint serumalbumin (BSA) för att bereda en stam på 250 μg/ml. Alikvot och förvaras vid -80 °C. Resuspendera rekombinant epidermal tillväxtfaktor hos möss (EGF) i PBS + 0,1 % BSA för att bereda en stam på 100 μg/ml. Alikvot och förvaras vid -80 °C.
  4. Späd ut rekombinant human IGF-1 i PBS + 0,1 % BSA för att bereda ett 100 μg/ml lager. Alikvot och förvaras vid -80 °C. Återsuspendera rekombinant FGF-2 från människa i 5 mM Tris, pH 7,6, för att bereda en stam på 100 μg/ml. Alikvot och förvaras vid -80 °C.
    OBS: För alla tillväxtfaktorer, använd en intermediär utspädning i PBS + 0,1 % BSA till 100 gånger den slutliga koncentrationen i odlingssubstratet. Förvaras vid -20 °C.

2. Etablering av organoider av tunntarm hos råtta

OBS: Detta protokoll har modifierats från två tidigare publicerade protokoll för tarmorganoider på råtta23,24.

  1. Bered intestinala organoidmedier (rIOM) för råttor enligt tabell 2 och ställ in ett vattenbad vid 37 °C. Detta helmedium är stabilt i 5 dagar vid 4 °C.
  2. Bered 10 ml 3 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i PBS i ett 15 ml koniskt rör och lägg på is. Tina 250 μl extracellulärt matrixextrakt (EME) på is.
  3. Fasta en råtta över natten med tillgång till vatten ad libitum. Avliva råttan enligt det IACUC-godkända protokollet. I detta protokoll avlivades vuxna hanråttor av Sprague Dawley (som vägde ~200 g) via CO2-inandning (Materialförteckning). Cervikal luxation användes som en sekundär metod för avlivning.
  4. Använd steril autoklaverad pincett och dissektionssax för dissektion. Placera den avlivade råttan på dissektionsytan med den ventrala sidan uppåt. Nyp ihop hudlagret med pincett; Följande snitt bör göras på ytnivå, så att de bara skär igenom detta hudlager och inte tillräckligt djupt för att skada inre organ.
  5. För att öppna bukhålan, använd en stor, vass dissektionssax och skär genom hudlagret i ett stort, längsgående, ytnivåsnitt i mitten av buken. Gör sedan två kortare horisontella snitt, ett på varje sida, med utgångspunkt från det snittet. Använd en pincett för att dra bort huden för att exponera bukhålan. Skär igenom peritonealmembranet för att helt exponera de inre organen i bukhålan med enkel tillgång till tarmen.
  6. Använd sax och pincett, lokalisera magen och identifiera tolvfingertarmen cirka 2-3 cm distalt om den, som ser ut som ett gulaktigt segment. Det proximala jejunum ligger cirka 4-5 cm distalt om Treitz ligament, som fungerar som ett landmärke mellan tolvfingertarmen och jejunum.
  7. Lägg det isolerade tarmfragmentet i en 10 cm petriskål. Rengör det önskade tarmsegmentet av tarmkäxet så mycket som möjligt. Spola med 10 ml iskall PBS tills den är fri från ljusinnehåll. Skär tarmsegmentet i ~2 cm långa bitar på en pappershandduk. Öppna varje tarmdel i längdriktningen för att exponera epitelet.
  8. Använd ett glasmikroskopglas och skrapa den exponerade ljusytan för att ta bort villi. Lägg inälvsbitar i den beredda EDTA-lösningen på is. Rotera vid 4 °C i 30 minuter på en rörrevolver inställd på 10 rpm.
  9. Häll innehållet i det koniska röret i en 10 cm petriskål i dissekeringsmikroskopet. Tillsätt ytterligare ~5 ml iskall PBS.
  10. Använd en fin pincett, håll ett tarmsegment och skaka kraftigt. Det kommer att vara möjligt att se epitelet släppas ut i PBS. Till en början kommer PBS i första hand att innehålla villi.
  11. Fortsätt att skaka. Kassera regelbundet PBS som innehåller villi och tillsätt 10 ml färsk iskall PBS till tarmfragmenten. Fortsätt att skaka fragmenten och upprepa detta tvättsteg tills villi inte längre släpps ut i PBS, utan istället innehåller PBS främst kryptor. Överskrid inte 15 minuter för krypteringsisolering, så att cellens livskraft inte äventyras.
  12. Kassera de återstående tarmfragmenten. Berika den återstående PBS:en i petriskålen för tarmkryptor. I en vävnadsodlingshuva, samla de PBS-innehållande kryptorna och filtrera genom en 70 μm cellsil (Materialtabell).
  13. Centrifugera vid 250 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 ml AdDMEM+. Centrifugera igen med 250 x g i 5 minuter.
    OBS: Det rekommenderas att använda en centrifug med en svängskopa.
  14. Ta bort supernatanten och lämna ~50 μL media med pelleten. Återsuspendera pelleten i det återstående mediet och tillsätt alikvoten för EME på is. Pipettera försiktigt upp och ner för att hänga upp kryptorna jämnt i hela EME. Undvik att introducera bubblor.
  15. Platta 50 μL EME kupoleras i en 35 mm vävnadsodlingsskål och inkuberas i 20 minuter i en 37 °C, 5 %CO 2 vävnadskulturinkubator.
  16. Tillsätt 2 ml rIOM (tabell 2) innehållande 10 μM Y27632 och 10 μM CHIR99021 (tabell 3). Efter passaging kan Y27632 och CHIR99021 sättas ut.
  17. Ändra rIOM var 2–3:e dag. Passage vid behov, vanligtvis mellan 3-7 dagar, beroende på det ursprungliga antalet organoider, storlek och tillväxthastighet.

3. Passerande råtttarmorganoider

  1. Tina en 250 μL alikvot EME på is och förvärm rIOM till 37 °C.
  2. Aspirera mediet från en 35 mm platta som innehåller organoider och tillsätt 1 ml dissociationsreagens för att omedelbart frigöra organoiderna från EME-kupolerna.
  3. Överför omedelbart dissociationsreagens med fragmenterade organoider till ett 15 ml koniskt rör. Tvätta odlingsplattan med 2 ml AdDMEM+ och tillsätt till det 15 ml koniska röret som innehåller fragmenterade organoider.
  4. Med en Pasteur-pipett i glas pipetterar du försiktigt upp och ner 15-20 gånger för att fragmentera organoiderna. Centrifugera vid 350 x g i 2 min.
  5. Tillsätt ~50 μL lösning från botten av det koniska röret till EME. Pipettera försiktigt upp och ner för att blanda. Undvik att göra bubblor.
  6. Platta 50 μL EME kupoleras i en 35 mm skål och inkuberas i 20 minuter i en 37 °C, 5 % CO2 vävnadsodlingsinkubator.
  7. Tillsätt 2 ml rIOM med 10 μM Y27632 och 10 μM CHIR99021. Byt odlingsmedium var 2-3:e dag. Vid byte av media kan Y27632 och CHIR99021 utelämnas.

4. Kryokonservering och upptining av tarmorganoider från råttor

  1. Kryokonserverande tarmorganoider från råttor
    OBS: Kryokonserveringsprotokollet modifierades från ett tidigare protokoll för organoider hos människor och möss25. Före frysning måste organoiderna ha minst två passager i primärkulturen. Det är tillrådligt att odla organoider till den punkt där stora sfäroider eller lätt knoppade organoider före kryokonservering, eftersom detta kommer att resultera i ett högre utbyte av livskraftiga organoider efter upptining. Detta kan åstadkommas genom att öka R-spondinkonditionerade medier till 15 % och/eller genom att tillsätta 10 mM nikotinamid (tabell 3) till organoidkulturen.
    1. Använd ett mikroskop för att räkna antalet organoider på 35 mm skålen. Märk kryovialerna så att 200 organoider kommer att aliciteras i varje kryovial.
    2. Ta bort rIOM från 35 mm-skålen. Ersätt med 2 ml PBS av kall vävnadskulturkvalitet.
    3. Använd en P1000-spets och släpp EME-kupolerna från botten av odlingsskålen in i PBS genom att pipettera upp och ner. Fortsätt att pipettera upp och ner ~20 gånger för att bryta upp EME och frigöra organoiderna. Samla organoiderna och PBS i ett 15 ml koniskt rör.
    4. Tillsätt 2 ml kall PBS till odlingsskålen och pipettera upp och ner för att frigöra eventuella kvarvarande organoider i PBS. Överför PBS till det 15 ml koniska röret.
    5. Pelletera organoiderna genom centrifugering vid 290 x g i 5 minuter. Ta bort och kassera supernatanten utan att störa organoidpelleten.
    6. Tvätta pelleten genom att försiktigt suspendera i 5 ml kall AdDMEM+. Centrifugera vid 200 x g i 4 min. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten.
    7. Återsuspendera organoidpelleten i 1 ml kallt frysmedium per 200 organoider. Alikvot 1 ml organoider i frysmedium per märkt kryovial. Lägg kryovialerna i en frysbehållare.
    8. Förvara organoiderna i en frysbehållare vid -80 °C i 24 timmar och överför sedan kryovialerna till flytande kväve för långtidsförvaring.
  2. Upptining av råtttarmorganoider
    OBS: Detta protokoll har modifierats från ett tidigare protokoll för upptining av tarmorganoider hos människor och möss26.
    1. Tina en 250 μl alikvot EME på is. Förbered rIOM kompletterat med 15 % R-spondinkonditionerade medier, 10 μM Y27632 och 10 μM CHIR99021. Värm vid 37 °C.
    2. Tillsätt 2 ml avfrostningsmedel (tabell 3) till ett 15 ml koniskt rör vid rumstemperatur.
    3. Ta upp och tina en injektionsflaska med organoider från flytande kväve genom att placera injektionsflaskan i ett 37 °C vattenbad tills injektionsflaskan är nästan helt tinad.
    4. Tillsätt 1 ml avfrostningsmedel i injektionsflaskan och överför allt innehåll till det koniska röret med avfrostningsmedel. Tvätta injektionsflaskan två gånger med 1 ml upptiningsmedel och överför den till det koniska röret.
    5. Centrifugera vid 200 x g i 5 min. Aspirera mediet och lämna ~50 μL medium med organoiderna. Överför mediet som innehåller organoider till 250 μl EME.
    6. Fördela organoiderna jämnt genom EME genom att pipettera upp och ner, undvik bubblor. Pipettera över sex 50 μL kupoler till en 35 mm vävnadsodlingsskål.
    7. Inkubera i vävnadsodlingsinkubatorn i 15-20 minuter så att EME kan polymeriseras. Tillsätt 2 ml av den förberedda rIOM till skålen.
    8. Efter 2 dagar byter du ut mediet mot rIOM. Användningen av Y27632 och CHIR99021 kan avbrytas. Organoidtillväxten kan vara långsam i den första passagen efter upptining. Det rekommenderas att passera organoiderna två gånger efter upptining innan experiment påbörjas.

5. Generering av råtttarm 2D-monolager från 3D-organoider

OBS: Följande protokoll beskriver de volymer som krävs för att generera 24 brunnar av en 48-brunnars platta belagd med EME, med början med sex kupoler på 50 μL (35 mm skål) som innehåller ~300 tarmorganoider/kupol (skala: en kupol genererar fyra brunnar), men kan skalas upp eller ner efter behov. Som skrivet uppnår detta protokoll ~80 % sammanflöde på 4-5 dagar. Vid högre sammanflöde börjar cellerna förvärva 3D-organoidstrukturer igen. Vid lågt sammanflöde (≤40%) förblir cellerna som monolager och är livskraftiga i ~14 dagar. Om syftet med studien är att använda 2D-monolager, skala ner så att en kupol genererar åtta brunnar av en 24-hålsplatta. Brunnarna kan också beläggas med kollagen I för att bilda monolager.

  1. Förberedelse av belagda ytor
    1. För att belägga plattan med EME, späd EME 1:20 i kall AdDMEM+ (tabell 1). För beläggning med kollagen, förbered kollagen I enligt tillverkarens instruktioner. Späd 5 mg/ml kollagen I i AdDMEM+ till 100 μg/ml (1:50 i detta fall).
    2. Täck plattan med 200 μL utspädd EME eller kollagen för att täcka brunnens yta helt. Inkubera i 1–2 timmar vid 37 °C i en vävnadsinkubator. Förbered råtttarmorganoidmedium för 2D-monolagerodling (rIOM2D) enligt tabell 4.
  2. Generering av monolager
    1. Aspirera mediet från en 35 mm platta som innehåller organoider. Tillsätt 1 ml PBS.
    2. Stör EME i brunnarna genom att repa med en P1000-spets. Pipettera upp och ner cirka 20 gånger för att lossa hela EME. Överför allt till ett 15 ml koniskt rör.
    3. Tillsätt 1 ml PBS till 35 mm-plattan för att återvinna eventuella ytterligare organoider och överför till samma 15 ml koniska rör.
    4. Centrifugera vid 350 x g i 2 minuter och aspirera supernatanten, inklusive EME-rester. Tillsätt 1 ml trypsinlösning till organoidpelleten och inkubera vid 37 °C i 2 min.
    5. Pipettera upp och ner 10 gånger med en P1000-spets och tillsätt 2 ml AdDMEM+ för att neutralisera trypsin.
    6. Centrifugera vid 350 x g i 5 min. Aspirera supernatanten och tillsätt 4,8 ml rIOM2D (tabell 4). Återsuspendera cellpelleten.
    7. Innan organoiderna placeras, ta bort eventuellt överskott av EME eller kollagen i AdDMEM+ från brunnarna. Tillsätt sedan 200 μL organoider i rIOM2D och 10 μM Y27632 till varje förbelagd brunn.
    8. Efter 4–16 timmar samlar du upp mediet och centrifugerar med 1 000 x g i 1 minut. Överför supernatanten till ett nytt 15 ml koniskt rör och kassera pelleten.
    9. Tvätta varje brunn med 300 μL PBS och tillsätt 200 μL centrifugerad rIOM2D till varje brunn. Ändra rIOM2D var 2–3:e dag och pausa användningen av Y27632.
  3. Reformering av 3D-organoider från 2D-monolager
    OBS: Monolager odlade på EME kan induceras att reformera 3D-organoider, medan monolager odlade på kollagen I inte effektivt återgår till 3D-organoider. Vanligtvis kan 2-3 brunnar av organoider genererade från monolager användas för att göra en kupol av 50 μL EME på dag 5.
    1. Späd ut EME 1:4 i rIOM2D. När monolagren når ~80 % sammanflöde, aspirera försiktigt mediet och tillsätt 100 μL utspädd EME till brunnarna som innehåller monolager.
    2. Inkubera 5 % CO2 vid 37 °C i en vävnadsodlingsinkubator i 20 min. Tillsätt sedan 100 μL rIOM2D och återgå till vävnadsodlingsinkubatorn. 3D-organoider kommer att genereras inom 5 dagar efter tillsats av utspädd EME.
    3. Efter att små organoider har återbildats (~dag 5), förbered rIOM. Samla upp allt brunnsinnehåll, pipettera upp och ner för att störa EME och överför till ett 15 ml koniskt rör.
    4. Centrifugera vid 350 x g i 2 min. Aspirera supernatanten och EME-resterna.
    5. Tillsätt 1 ml kall AdDMEM+ och centrifugera vid 350 x g i 2 minuter. Ta bort supernatanten och lämna ~50 μL media.
    6. Överför 50 μl av media och organoider till en 250 μl EME-alikvot. Pipettera upp och ner för att fördela organoiderna i hela EME.
    7. Pipettera 50 μl EME-kupoler i en 35 mm skål och inkubera i 20 minuter i en vävnadsodlingsinkubator.
    8. Tillsätt 2 ml rIOM plus 10 μM Y27632. Byt odlingsmedium var 2-3:e dag. Vid byte av media kan Y27632 utelämnas.

6. Genetisk manipulation

  1. Transient transfektion av 2D-monolager
    VARNING: Förbered intestinala epitellager på råtta enligt avsnitt 5.1 på en platta med 48 brunnar. Transfektion måste utföras vid 70%-80% sammanflöde. Byt alltid ut mediet i brunnarna mot 200 μL färsk rIOM2D före transfektering. Beräkna absorbanskvoterna 260/280 nm och 260/230 nm för plasmid-DNA; Dessa måste vara över 1,8 för att säkerställa goda transfektionsresultat.
    OBS: Använd en plasmidkontroll för att beräkna transfektionens effektivitet. En plasmid som kodar för ett fluorescerande protein rekommenderas för enkelhetens skull. I detta protokoll användes pLJM1-EGFP27 .
    1. Bered 1 mg/ml 20 kDa polyetylenimin (PEI; (se tabell 3). För varje brunn bereds rör A (0,6 μg plasmid + 50 μl reducerat serummedium) och rör B (1,8 μl PEI + 50 μl reducerat serummedium). Upprätthåll ett DNA:PEI-förhållande på 1:3.
    2. Virvla båda rören i 30 s. Kombinera rör A och rör B och virvla igen i 30 s. Använd vid behov en centrifug för att snurra ner. Inkubera i 20 min i rumstemperatur.
    3. Tillsätt försiktigt DNA/PEI-komplexet droppvis till 2D-monolager. Snurra försiktigt plattan för att blanda. Inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 Uttrycket kan vanligtvis detekteras efter 24 timmar.
      OBS: Om det är nödvändigt att återgå till 3D-organoidstrukturer, vänta i 48 timmar efter transfektion för att tillsätta utspädd EME.
  2. Lentiviral transduktion av tarmorganoider hos råtta
    OBS: Innan du arbetar med lentivirus bör du skaffa rätt tillstånd och specialutbildning från institutionen. Använd alltid lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) vid hantering av lentivirus. Även om det inte beskrivs här, är högkvalitativt, koncentrerat lentivirus viktigt för framgångsrik infektion av organoider. Detta protokoll använde tom pLJM1-EGFP-vektor27 för att uttrycka löslig GFP. Detta protokoll är modifierat från ett tidigare publicerat protokoll28. Transduktionseffektiviteten beror på kvaliteten och koncentrationen av viruspartiklar, effektiv dissociation av organoider i små cellkluster och genen som uttrycks. Vid beräkning 5 dagar efter infektion var den genomsnittliga transduktionseffektiviteten före selektion 19,4 % (± 6,5 % standardavvikelse).
    1. 2 dagar före lentivirusinfektion ska du planera att passera (avsnitt 3) två täta brunnar med en 24-brunnsplatta för varje lentivirus som kommer att transduceras. Varje brunn på en 24-hålars platta kan rymma en 50 μL kupol av EME.
    2. När EME stelnat, tillsätt 0,5 ml rIOM kompletterat med 10 mM nikotinamid, 10 μM Y27632 och 2,5 μM CHIR99021. Detta inducerar stora sfäroidmorfologier, vilket är gynnsamt för effektiviteten av lentiviral transduktion. Inom 2 dagar efter plätering bör råttorganoider vara stora sfäroider. Om signifikant differentiering (dvs. knoppning) observeras, återpassage av organoiderna.
    3. Tina upp det koncentrerade viruset på is. Förbered nya transduktionsmedier enligt tabell 3.
    4. Använd en P1000-spets för att släppa EME-kupolerna från botten av cellodlingsskålen in i mediet genom att pipettera upp och ner. Fortsätt att pipettera upp och ner 20 gånger för att bryta upp EME och frigöra organoiderna.
    5. Pipettera organoiderna och medierna i ett 15 ml koniskt rör. Alla brunnar kan slås samman, förutsatt att organoiderna har samma genotyp och kommer från samma linje.
    6. Tvätta varje väl två gånger med 1 ml kall AdDMEM+. Samla upp AdDMEM+ och överför den till samma 15 ml koniska rör.
    7. Använd en Pasteur-pipett av glas för att mekaniskt störa råttorganoiderna. Detta är ett kritiskt steg, eftersom målet är små flercelliga kluster av celler. Pipettera upp och ner ~30 gånger. Kontrollera hur effektiv störningen är under mikroskopet med hjälp av ett 4x-objektiv. Fortsätt denna process tills cellsuspensionen huvudsakligen består av cellkluster med få organoider kvar.
      OBS: Alternativt kan organoider centrifugeras vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur, supernatanten avlägsnas försiktigt och återsuspenderas i 1 ml rekombinant enzym som ersätter konventionellt trypsin/EDTA, förvärmt till 37 °C i vävnadsodlingsinkubatorn. Inkubera organoiderna i trypsinersättning i 2 minuter i ett 37 °C vattenbad, med regelbunden vortexing för att främja dissociation. Undvik långvarig inkubation med trypsinersättning, eftersom detta kan främja celldöd. Kontrollera regelbundet om störningen är effektiv under mikroskopet med hjälp av ett 4x-objektiv. När suspensionen huvudsakligen består av enstaka celler med få cellkulturer, späd trypsinersättningen genom att tillsätta 4 ml AdDMEM+ och fortsätt med följande steg.
    8. Snurra det 15 ml koniska röret med cellklustren vid 200 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten, var försiktig så att du inte stör cellpelleten.
    9. Återsuspendera cellklustren i 230 μl transduktionsmedium per brunn som ska infekteras. För infektionen, använd en brunn med en 48-hålsplatta för varje lentivirus.
    10. Platta 230 μL cellsuspension i varje brunn på en märkt 48-hålsplatta. Tillsätt 20 μl koncentrerat virus till varje brunn. Använd en P1000-spets för att blanda virus-/celllösningen i varje brunn och försegla plattan med en genomskinlig film.
    11. Utför spinoculation: centrifugera plattan vid 600 x g i 1 timme vid 32 °C. Förslut plattan och inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 i 6 timmar.
    12. Förvärm en 24-hålsplatta i 37 °C-inkubatorn.
    13. Efter inkubationen, pipettera varje väl upp och ner och överför innehållet till ett märkt 1.5 ml rör. Tvätta varje brunn med 750 μL AdDMEM+ och överför till röret. Centrifugera tuberna i 600 x g i 5 minuter vid 4 °C.
    14. Ta bort rören från centrifugen och förvara på is. Använd en P1000-spets för att försiktigt ta bort och kassera supernatanten på rätt sätt.
    15. Återsuspendera cellpelleten i EME och platta 50 μL kupoler i den förvärmda 24-hålsplattan. Inkubera i 15-20 minuter vid 37 °C tills EME har polymeriserats.
    16. Tillsätt 500 μL rIOM till varje brunn kompletterat med 10 mM nikotinamid, 10 μM Y27632 och 2,5 μM CHIR99021.
    17. Byt ut mediet mot rIOM plus 10 μM Y27632 1 dag efter infektion. Byt media var 2-3:e dag. Om selektion ska utföras, lägg till selektion 48-72 timmar efter infektion. För val av puromycin, använd 2 μg/ml puromycin.

7. Immunofluorescens helmontefärgning av organoider

  1. Aspirera mediet och tillsätt 4 % paraformaldehyd (PFA) i PBS-Tween 20 (PBS-T) (tabell 3) till organoiderna i en cellodlingsskål. Inkubera i rumstemperatur i 10 min.
  2. Lossa organoiderna från EME genom att pipettera upp och ner. Samla organoiderna i ett 0,75 ml rör. Organoiderna kommer att sätta sig på botten av röret genom gravitationen inom några minuter. Centrifugera vid behov vid 100 x g i 1 min.
  3. Använd en överföringspipett, ta bort PFA och återsuspendera organoiderna i PBS-T. Låt organoiderna sätta sig i botten av röret. Avlägsna PBS-T och återsuspendera i 200 μl blocklösning (tabell 3).
  4. Inkubera i rumstemperatur på en vippa eller mutter i 45 min. Organoider kan klumpa ihop sig och sätta sig i botten av röret. Snärta med fingret med fingret med fingret för att återsuspendera och dispergera i lösningen.
  5. Låt organoiderna sätta sig i botten av röret. Centrifugera vid behov vid 100 x g i 1 min. Ta bort blocklösningen.
  6. Tillsätt primär antikropp utspädd i 100 μl blocklösning. Inkubera i rumstemperatur på en mutterblandare i 45 min vid 24 rpm. Antikroppskoncentrationerna varierar beroende på vilken antikropp som används.
    OBS: Detta steg kan förlängas baserat på den primära antikroppen, upp till över natten vid 4 °C.
  7. Låt organoiderna sätta sig i botten av röret. Centrifugera vid behov vid 100 x g i 1 min.
  8. Tvätta i PBS-T fem gånger med en överföringspipett. Inkubera i rumstemperatur i 5 min på mutterblandaren vid 24 rpm. Upprepa detta steg två gånger.
  9. Tillsätt sekundär antikropp utspädd 1:200 och 50 μg/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) utspädd i 100 μl blocklösning. Inkubera i rumstemperatur på en mutterblandare i 30 minuter vid 24 rpm.
  10. Låt organoiderna sätta sig i botten av röret. Centrifugera vid behov vid 100 x g i 1 min. Ta bort sekundär antikropp. Tvätta fem gånger i PBS-T med en överföringspipett.
  11. Inkubera i rumstemperatur i 5 minuter på en mutterblandare vid 24 rpm. Upprepa tvättsteget två gånger.
  12. Medan organoiderna tvättas, värm en alikvot VALAP-tätningsmedel (tabell 3) vid 40-50 °C för att göra den flytande. Använd en pensel och måla en tunn fyrkant av VALAP på ett objektglas som är ungefär lika stort som ett täckglas. Använd en 22 mm x 22 mm nr 1.5 täckglas.
  13. Använd en sax för att klippa av änden på en P200-pipettspets. Överför organoider till VALAP-brunnen på objektglaset. Använd en servett och torka försiktigt bort PBS-T. Låt inte organoiderna torka ut.
  14. Översvämma VALAP-brunnen med ett antiblekningsmonteringsmedium (tabell 3). För en kvadrat på ~22 mm x 22 mm krävs 100-150 μL antifade.
  15. Organoiderna kan klustras; Snurra antifade med en pipettspets för att omfördela organoiderna, om det behövs. Montera med 22 mm x 22 mm nr 1.5 täckglas, undvik luftbubblor. Försegla täckglaset genom att måla ett tunt lager VALAP på kanterna.
    OBS: För inverterade mikroskop kan organoiderna även monteras i en 35 mm glasbotten.

8. Forskolin-inducerad svullnad av råtttarmorganoider

  1. Odla organoiderna i 3-5 dagar efter passering i rIOM. Det är tillrådligt att odla organoider i en platta med 24 brunnar för att säkerställa att samma region lätt kan avbildas. Ta bilder innan du lägger till forskolin (T0).
  2. Tillsätt forskolin (tabell 3) direkt till organoidmediet till en slutlig koncentration av 10 μM. Tillsätt samma volym dimetylsulfoxid (DMSO) till kontrollbrunnarna.
  3. Föreställ dig kontroll- och forskolin-behandlade brunnar med jämna mellanrum, var 15-30:e minut. När du inte avbildar, håll organoider i inkubatorn eller använd ett kontrollerat bildsystem med inkubation. Maximal svullnad bör observeras efter 120 minuter.
  4. Följ standardprotokoll för att beräkna relativ svullnad från de insamlade bilderna29.

Representative Results

Råtta duodenal och jejunal organoider genererades med hjälp av protokollet som beskrivs i avsnitt 2. Det är mycket viktigt under kryptisoleringsstegen att villi effektivt töms från PBS. Om för många villi pläteras i EME med kryptor kan det orsaka död för hela kulturen och misslyckande med att etablera en organoidlinje. På grund av detta är det användbart att isolera kryptor under ett dissekeringsomfång, vilket möjliggör visuell bekräftelse av utarmning av villar. Figur 1 visar representativa villarfragment och kryptor (figur 1A). Observera den betydligt mindre storleken på kryptor jämfört med villi (figur 1B). Efter plätering kommer kryptorna att expandera till sfäroider under de närmaste dagarna och kommer att börja knoppa och differentiera sig vid dag 4-7 (figur 2). När organoiderna når ett extensivt knoppat stadium bör de passeras. Under passeringen är det viktigt att störa organoiderna tillräckligt för att dela upp kryptknopparna, så att organoidantalet kan utökas (Figur 3B).

Den framgångsrika återhämtningen av organoider efter frysning är starkt beroende av i vilket tillstånd de är frysta. Organoider i ett mycket proliferativt odifferentierat tillstånd återhämtar sig med högsta effektivitet. Därför rekommenderar vi att du inducerar dem att vara sfäriska och cystiska istället för knoppade och differentierade. För att uppnå detta kan Wnt hyperaktiveras genom att öka mängden av Wnt-liganden R-spondin i mediet och genom att inkludera nikotinamid i mediet, vilket har visat sig stödja organoidbildning och cellöverlevnad i flera odlingssystem30,31. Figur 3A visar en hälsosam organoidkultur bara 2 dagar efter upptining. Att inkludera BSA i media under upptining har också hjälpt till att överleva tarmorganoidkulturer från råttor, som har visat sig vara känsligare än tarmorganoider från möss.

Även om 3D-organoidodling ofta är att föredra eftersom den rekapitulerar en del av den normala tarmarkitekturen, gör den andra metoder, inklusive levande avbildning, transfektioner och lentivirala transduktioner, mer tekniskt utmanande. Användningen av 2D-monolager genererade från 3D-organoider32 (figur 4) möjliggör introduktion av plasmiderna med högre effektivitet. Medan 3D-tarmorganoider traditionellt är resistenta mot transienta transfektioner, kan plasmider som kodar för EGFP framgångsrikt introduceras med hjälp av lipidbaserade transfektionsmetoder. Det mest kostnadseffektiva tillvägagångssättet med PEI beskrivs i steg 6.1 (figur 5), men elektroporering och kommersiellt tillgängliga transfektionsreagenser har också gett jämförbara resultat (data visas inte). Framtida studier kommer att fokusera på om dessa metoder kan användas för att introducera CRISPR-konstruktioner i monolager.

Det var viktigt att kunna reformera 3D-organoider från 2D-monolager efter transfektion så att de kunde bibehållas som en passagebar linje med 3D-arkitektoniska komponenter av kryptor. Intressant nog återbildades 2D-monolager på EME lätt till små sfäroider när EME lades tillbaka till toppen av cellerna, medan ett kollagen I-substrat inte var tillräckligt för att reformera 3D-strukturer (Figur 6).

Även om transienta transfektioner är användbara för många studier, är bildandet av stabila linjer ofta mer användbart, vilket kräver att lentivirus förs in i cellerna. Organoider från råttor infekterades med lentivirus genom att modifiera tidigare publicerade protokoll (Figur 7). Ett viktigt steg i protokollet är att dela upp organoider i små aggregat eller cellkluster. Om odlingarna inte störs effektivt och organoiderna förblir intakta kommer de lentivirala partiklarna inte att komma in i cellerna. Efter infektion måste organoider återhämta sig och växa igen. Protokollet som beskrivs här tillåter upptag av viruspartiklar med 10%-48% (medelvärde: 19,4% ± 6,5%) av cellerna före urval.

Helinfärgning av organoider kan visa sig vara svår på grund av ofullständigt avlägsnande av EME-rester eller ofullständig antikroppspenetrans. Protokollet som beskrivs här möjliggör robust färgning av organoider. Visualiseringen av organoider på ett konfokalmikroskop kan också visa sig vara svårt om de är för långt bort från täckglaset. Genom att använda VALAP skapas en brunn med viss höjd så att organoider inte krossas av täckglaset, men ändå får sätta sig nära täckglaset för att underlätta avbildningen. Representativ färgning mot den apikala anjonkanalen cystisk fibros transmembrankonduktansregulator (CFTR) och falloidin för att märka F-aktin visas i figur 8.

Slutligen har organoider användbarhet i funktionella analyser. Patienthärledda organoider från patienter med cystisk fibros har använts för att screena CFTR-funktionen, eftersom behandling med cAMP-agonisten forskolin inducerar robust CFTR-medierad vätskesekretion, vilket orsakar organoidsvullnad 29,33-37. Ett mål med detta arbete var att identifiera och utveckla en organoidmodell som kan användas parallellt med prekliniska studier in vivo. Därför syftade vi till att avgöra om råtttarmorganoider genomgår forskolin-inducerad svullnad. Faktum är att inom 30 minuter efter behandling med forskolin svällde råttorganoider, med en maximal effekt observerad av 120 minuter (Figur 9).

Figure 1
Figur 1: Villarfragment och kryptor under epitelisolering . (A) Representativ bild av villarfragment i EDTA-lösning under kryptisoleringsprotokollet. Gula pilspetsar markerar villarfragment. Röda pilar visar kryptor som är fästa vid ett villarfragment. Notera skillnaden i relativa storlekar. (B) Högre förstoringsbild av en enda krypta (röd pil) så att morfologi kan visualiseras. Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Organoidprogression i tarmen hos råtta. Råtta jejunum-kryptor pläterades i EME omedelbart efter isolering (A,B). Inom 2 dagar blev kryptorna sfäroider (C,D). Vid dag 5 började de initiera kryptknoppar (E,F), som utvecklades och växte vid dag 7 (G). Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Organoider efter upptining och passering. (A) Råttjejunala organoider tinades upp enligt de beskrivna protokollen efter kryokonservering. Observera närvaron av både sfäroider och knoppade organoider bara 2 dagar efter upptining. (B) Samma organoidlinje avbildad i A omedelbart efter passering enligt det beskrivna protokollet. Observera den relativa storleksskillnaden mellan strukturer i A och B och förekomsten av enstaka kryptliknande domäner i B. Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Bildning av 2D-monolager från 3D-organoider. (A-C) 2D-monolagerprogression på EME. (D-F) 2D monolagerprogression på kollagen I. Vid dag 5 gav varje tillstånd ~80 % sammanflöde. Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Transient transfektion av ett 2D-monolager. Representativ bild av ett 2D-monolager odlat på EME transfekterat med pLJM1-EGFP-plasmid med hjälp av PEI. (A) Ljusfält, (B) fluorescens (GFP), (C) överlagring. Den prickade röda linjen markerar gränsen för det enkla skiktet. Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Reformering av 3D-organoider från 2D-monolager på EME. (A) Bildning av 3D-organoider från 2D-monolager odlade på EME. Organoider bildas effektivt 5 dagar efter tillsats av EME till monolagrets apikala yta. Lägg märke till överflödet av döda celler som omger de små 3D-sfäroiderna. (B) Persistens av 2D-monolager 5 dagar efter det att kollagen I tillsattes till den apikala ytan av 2D-monolager odlade på kollagen I. Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Lentivirusinfektion av 3D-organoider. Råtta jejunum-organoider infekterades med nukleära GFP-lentivirala partiklar med hjälp av det beskrivna protokollet. Efter återhämtning och tillväxt i 5 dagar fixerades organoider och motfärgades med DAPI. A) DAPI: grå. nukleär GFP: grön. (B) NuclearGFP:grön. Den prickade röda linjen markerar organoidgränsen. Skalstaplar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Helmonterad immunofluorescens av råtttarmorganoider. (A) CFTR, (B) falloidin och (C) sammanslagen helmonterad immunofluorescens av jejunala organoider hos råtta. Notera den apikala anrikningen av CFTR-färgning i organoider (grå i A, magenta i C). Falloidin markerar F-aktin och märker tydligt den apikala borstkanten (grå i B, cyan i C). Skalstreck: 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Råtta tarmorganoider sväller vid forskolin stimulering. Representativt tidsförlopp för organoidsvullnad hos råtta efter tillsats av cAMP-agonisten forskolin. Tiden 0 minuter representerar tidpunkten omedelbart före tillsatsen av 10 μM forskolin. Bilderna visar samma organoid med 30 minuters tidsintervall. Maximal svullnad observerades vid 120 minuter efter tillägg av forskolin. Den prickade röda linjen beskriver organoidgränsen. Det mörka materialet i mitten av organoidlumen består av döda celler. Skalstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Recept för AdDMEM+. Ingredienser för att tillverka standardmediet AdDMEM+, som är basmediet genom de metoder som visas här. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Recept på intestinala organoidmedier på råttor (rIOM). Detaljerat recept för standardtarmorganoidmedia för råttor, inklusive lösningsmedel och lagringsförhållanden för rekombinanta proteiner. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Lösningar. Recept och instruktioner för att göra andra lösningar som används i hela protokollet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4. Tarmorganoidmedium på råtta för 2D-monolagerodling (rIOM2D). Modifierat recept för organoidodlingsmedia optimerat för 2D-tillväxt av monolager. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

Utvecklingen av en tarmorganisationsmodell på råttor bevarar viktiga funktionella egenskaper som finns i organet in vivo och är ett lovande verktyg för prekliniska tester, läkemedelsscreening och funktionella analyser. Denna in vitro-modell kan användas parallellt med prekliniska gastroenterologiska studier in vivo , för vilka råttor ofta är en föredragen modell på grund av deras större tarmstorlek, delade fysiologiska aspekter med människor och i vissa fall är bättre sjukdomsmodeller38. Här beskrivs ett robust steg-för-steg-protokoll för isolering av råtttarmkryptor, generering och långtidsodling av råtttarmorganoider, såväl som nedströmsapplikationer inklusive funktionella forskolinsvullnadsanalyser, immunfluorescens på hela berget, 2D-monolagerodling och lentiviral genetisk manipulation. Tarmorganoider från råttor är sannolikt relevanta i många sjukdomssammanhang där patofysiologin hos musmodeller är olämplig och kan ge en bättre modell för mänsklig tarmfysiologi jämfört med mustarmsorganoider.

För att etablera långlivade organoidkulturer som kan passera och expanderas är det viktigt att identifiera de viktigaste tillväxtfaktorerna som krävs för att upprätthålla tarmepitelproliferationen. Musorganoider odlas oftast i en enkel cocktail av EGF, R-spondin och Noggin, även om det har rapporterats att Noggin inte är nödvändigt för tarmorganoidodling39. Konditionerade medier kan ersätta rekombinanta tillväxtfaktorer och de vanligaste cellinjerna är L-WRN, som utsöndrar Wnt3a, Rspondin-3 och Noggin39, L-Wnt3a och HA-Rspondin1-Fc 293T-celler40. L-WRN-konditionerade medier är tillräckliga för att stödja inte bara mustarmens39 organoidtillväxt, utan även tillväxten av tarmorganoider från flera husdjur och sällskapsdjur, inklusive hundar, katter, kycklingar, hästar, kor, får och grisar12. Mänskliga tarmorganoider är dock mycket olika i sina krav på tillväxtfaktorer, eftersom de kräver distinkta medieformuleringar för sin expansionstillväxtfas (dvs. progressionen från små till stora sfäroider) kontra deras differentieringsfas (dvs. generering och mognad av differentierade celltyper)10. Mediekraven för råtttarmsorganoider speglar nära de för expansionsodlingsmediet för mänskliga tarmorganoider, men framför allt kan råttorganoider både växa och differentiera sig i denna mediemiljö, vilket avsevärt förenklar deras odlingskrav. Medan våra första försök fokuserade på att etablera och odla tarmorganoider från råttor i L-WRN-betingade medier, var långtidsodlingen svag och råtttarmens organoidlinjer led av brist på robusthet (data visas inte). Detta kan bero på att L-WRN-cellinjer är konstruerade för att utsöndra R-spondin 3, medan 293T-Rspo1-cellinjen som rekommenderas här är konstruerad för att utsöndra R-spondin 1. Det är möjligt att råttor och mänskliga organoider föredrar R-spondin 1, vilket potentiellt kan förklara misslyckandet av råttorganoidlinjer i L-WRN-konditionerade medier.

För att så nära som möjligt rekapitulera in vivo-miljön är det viktigt att utveckla organoidodlingsbetingelser som möjliggör stamcellers överlevnad, underhåll och proliferation, och som kan upprätthålla cellulär omsättning och samtidiga differentieringshändelser till diskreta celltyper. Därför måste koncentrationerna av rekombinanta proteiner och/eller proteiner i konditionerade medier titreras och kontrolleras noggrant för att uppnå denna perfekta balans. I synnerhet är optimala Wnt-nivåer viktiga för att undvika förlust av tarmorganoidkulturer. För lite Wnt i betingade medier kommer att vara oförmögna att stödja tillväxten, vilket leder till förlust av stamceller och efterföljande organoiddöd; överaktivering av Wnt kommer att leda till att organoider blir cystiska och odifferentierade10. Även om det inte beskrivs här, rekommenderas det starkt att testa varje sats av L-Wnt3a- och 293T-Rspo1-konditionerade medier med hjälp av en Wnt-reporterluciferasanalys, såsom en Topflash-cellinje41. Tidigare studier har beskrivit att en optimal sats av L-Wnt3a-media bör resultera i en 15-faldig signalökning vid 12,5 % och en 300-faldig signalökning vid 50 %, jämfört med 1 % L-Wnt3a10. Eftersom råttorganoider är känsligare än musorganoider för odlingskrav, särskilt Wnt-aktiveringsnivåer, bidrar dessa ytterligare kvalitetskontrollsteg i hög grad till att underlätta robustheten och tillförlitligheten hos råttorganoidkulturer. Eftersom en liknande rapportlinje inte finns tillgänglig för att testa Bmp-aktivitet och relativa Noggin-koncentrationer i Noggin-konditionerade medier, är det tillrådligt att använda rekombinant Noggin när det är möjligt för att exakt kontrollera Noggin-nivåerna. Även om tarmorganoider från möss kan odlas och bibehållas i frånvaro av Noggin39, har detta inte gjorts för organoidkulturer från råtttarmar.

Utöver cellodlingskraven beror den framgångsrika initiala etableringen av en råttorganoidlinje kritiskt på den effektiva utarmningen av differentierade villi under kryptisolering. Höga nivåer av villarkontaminering orsakar kryptdöd, förmodligen på grund av antingen signaler från de döende cellerna eller bindning av viktiga faktorer. För att tömma dessa differentierade villi från epitelpreparat exakt och konsekvent, rekommenderas det att utföra epitelisoleringar med hjälp av ett stereoskop. Visuell undersökning av epitelet som frigörs ger en tydlig signal om när man ska kassera PBS och ersätta den (figur 1). Kryptor bör inte samlas in förrän det finns tillräcklig utarmning av villi. Villarceller är terminalt differentierade och kan inte generera organoider i odling. Dessutom kräver efterföljande passage av råtttarmorganoider och deras användning för någon nedströms applikation känslig vård. Inkubation i dissociationsreagenser under längre tidsperioder (10 min) resulterar i signifikant celldöd och förlust av organoidlinjen.

Här beskrivs ett enkelt och snabbt protokoll för att generera tarmmonolager från råttorganoider. EME- och kollagen I-substrat har olika effekter på epitelet, som kan utnyttjas beroende på syftet med studien. EME möjliggör snabb och effektiv vidhäftning av enskilda celler och bildandet av cellprojektioner. Däremot fördröjer beläggning av ytan med kollagen I dessa processer. När monolager når cirka 80 % sammanflöde börjar celler som odlas på EME att generera 3D-organoidstrukturer igen. De saknar dock tillräckligt fysiskt och kemiskt stöd för fortsatt tillväxt. Denna återgång till organoidtillståndet kan förhindras genom att upprätthålla monolager i EME vid ett sammanflöde på 50%-80%. Tillsatsen av utspädd EME till den apikala ytan av monolager främjar snabb återhämtning och bildning av de novo-organoider, vilket genererar konvergensregioner snabbare och lättare. På en kollagen I-yta kan celler bilda ett enhetligt monolager och generera små kluster. Tillsatsen av kollagen I ovanpå monolager är dock inte tillräcklig för att inducera organoidbildning. EME måste spädas ut när man lägger till monolagerytan, eftersom det kommer att finnas ett starkare mekaniskt motstånd för den begynnande organoiden att övervinna. Denna utspädda EME tillåter dock inte en robust bildning av stora organoider. Alla de novo-genererade råttorganoider som naturligt lossnar från ytan måste omedelbart avlägsnas och överföras till outspädd EME så att strukturellt stöd och tillväxt kan återställas. På grund av den lilla storleken på organoiderna i detta steg rekommenderas inte passage av organoider förrän robust tillväxt har etablerats. Den underliggande biologiska betydelsen av varför EME kan stödja reformationen av organoider, men om kollagen I kan eller inte kan göra detta, är inte klarlagt. Det har dock förekommit rapporter om att celler som odlas i 3D-kollagen inte kan bilda knoppade organoider42,43 eller stödja långsiktigt underhåll. Kommersiellt tillgängliga EME-produkter är heterogena blandningar av extracellulära proteiner, främst laminin och kollagen IV44. Därför kan den distinkta sammansättningen av proteiner och förmågan hos en epitelcell att engagera sig i den extracellulära matrisen med hjälp av olika cellulära komplex möjliggöra ombyggnad i EME men inte kollagen I. Huruvida kollagen I-härledda monolager kan sättas in i EME för att stödja organoidbildning och tillväxt har inte testats.

Genetisk manipulation av råtttarmens organoidmodell beskrivs här, och protokoll för lentiviral transduktion av 3D-organoider och transient transfektion av 2D-monolager beskrivs. För att övervinna den låga effektiviteten av lentiviral organoidtransduktion utvecklades ett protokoll för transient transfektion av 2D-monolager. Den platta morfologin och de exponerade apikala domänerna hos monolager ger lättare tillgång till virus och DNA-innehållande komplex. Uttrycket av en EGFP-rapportör som använde pLJM1-EGFP-vektorn användes för validering av denna teknik. GFP-reporterns uttryck observerades efter 24 timmar och bibehölls i 5-6 dagar i monolager. Framtida studier som fokuserar på lentiviral transduktion av monolager kommer sannolikt att ha högre effektivitet än 3D-organoidtransduktion. Med hjälp av ovanstående protokoll kan 3D-organoider reformeras från infekterade 2D-monolager för att underlätta skapandet av stabila linjer. Med försiktighet kan råtttarmorganoider framgångsrikt upprätthållas i över ett år, förbli stabila över många passager, kryokonserveras, framgångsrikt tinas och genetiskt modifieras med hjälp av lentiviral transduktion, vilket tillgodoser behovet av en tillgänglig och hanterbar in vitro tarmorganoidmodell som behåller fysiologisk relevans för människor.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmarna i Sumigray- och Ameen-laboratorierna för deras tankeväckande diskussioner. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Charles H. Hood Foundation Child Health Grant och ett bidrag från Cystic Fibrosis Foundation (004741P222) till KS och av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the National Institutes of Health till NA under tilldelningsnummer 2R01DK077065-12.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-D Culture Matrix Rat Collagen I Cultrex/R&D Systems 3447-020-01
70 µm cell strainer Corning/Falcon 352350
Advanced DMEM/F12 Gibco/Thermo Fisher 12634010
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher 17504044
CHIR99021 Cayman Chemical 13122
CryoStor Stem Cell Technologies 100-1061
Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells R & D Systems 3710-001-01
FBS Gibco/Thermo Fisher 16-000-044
Gastrin I (human) Sigma Aldrich G9145
Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 100-0485
Glutamax Thermo Fisher 35-050-061
Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free Corning 356231
HEPES AmericanBio AB06021
Lanolin Beantown Chemical 144255-250G
L-glutamine Gibco/Thermo Fisher A2916801
L-Wnt3a cells ATCC CRL-2647
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher 17502-048
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165-5G
Nicotinamide  Sigma Aldrich N0636
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco/Thermo Fisher 31985070
Paraffin Fisher Scientific P31-500
Parafilm Sigma Aldrich P7793 transparent film
PBS Thermo Fisher 10010023
Penicillin/Streptomycin Gibco/Thermo Fisher 15140122
pLJM1-EGFP Addgene 19319
Polybrene Millipore TR-1003-G
Polyethylenimine hydrochloride (PEI) Sigma Aldrich 764965
p-phenylenediamine  Acros Organics/Thermo Fisher 417481000
Puromycin VWR J593-25mg
Recombinant human FGF2 protein Peprotech 100-18B-250ug
Recombinant human IGF-1 protein Biolegend B356441
Recombinant human Noggin protein R & D Systems 6057-NG-100
Recombinant mouse EGF protein Thermo Fisher PMG8041
Sprague Dawley rat Charles River Laboratories Strain 001
Triton X-100 American Bioanalytical AB02025-00500
TrypLE Express Enzyme Gibco/Thermo Fisher 12604013
Y27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nature Reviews. Molecular Cell BiologyI. 22 (1), 39-53 (2021).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Yin, Y. -B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. -L. Enteroids for nutritional studies. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (16), 1801143 (2019).
  4. Cai, T., et al. Effects of six common dietary nutrients on murine intestinal organoid growth. PLoS One. 13 (2), e0191517 (2018).
  5. Davoudi, Z., et al. Gut Organoid as a new platform to study alginate and chitosan mediated PLGA nanoparticles for drug delivery. Marine Drugs. 19 (5), 282 (2021).
  6. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  7. Yin, Y. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. L. Mini-gut: a promising model for drug development. Drug Discovery Today. 24 (9), 1784-1794 (2019).
  8. Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).
  9. Gunther, C., Winner, B., Neurath, M. F., Stappenbeck, T. S. Organoids in gastrointestinal diseases: from experimental models to clinical translation. Gut. 71 (9), 1892-1908 (2022).
  10. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
  11. Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
  12. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  13. Fagerholm, U., Johansson, M., Lennernas, H. Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum. Pharmaceutical Research. 13 (9), 1336-1342 (1996).
  14. Dubbelboer, I. R., Dahlgren, D., Sjogren, E., Lennernas, H. Rat intestinal drug permeability: A status report and summary of repeated determinations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 364-376 (2019).
  15. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  16. Zhang, Z., Carriero, N., Gerstein, M. Comparative analysis of processed pseudogenes in the mouse and human genomes. Trends in Genetics. 20 (2), 62-67 (2004).
  17. Lambracht-Washington, D., Fischer Lindahl, K. Active MHC class Ib genes in rat are pseudogenes in the mouse. Immunogenetics. 56 (2), 118-121 (2004).
  18. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
  19. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  20. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  21. Olivier, A. K., Gibson-Corley, K. N., Meyerholz, D. K. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of cystic fibrosis: gastrointestinal, pancreatic, and hepatobiliary disease and pathophysiology. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (6), G459-G471 (2015).
  22. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  23. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  24. Hedrich, W. D., et al. Development and characterization of rat duodenal organoids for ADME and toxicology applications. Toxicology. 446, 152614 (2020).
  25. How to Cryopreserve Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html (2023).
  26. How to Thaw Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html (2023).
  27. Sancak, Y., et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).
  28. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
  29. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
  30. Regent, F., et al. Nicotinamide promotes formation of retinal organoids from human pluripotent stem cells via enhanced neural cell fate commitment. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 878351 (2022).
  31. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  32. Breau, K. A., et al. Efficient transgenesis and homology-directed gene targeting in monolayers of primary human small intestinal and colonic epithelial stem cells. Stem Cell Reports. 17 (6), 1493-1506 (2022).
  33. Berkers, G., et al. Rectal organoids enable personalized treatment of cystic fibrosis. Cell Reports. 26 (7), 1701-1708 (2019).
  34. deWinter-de Groot, K. M., et al. Forskolin-induced swelling of intestinal organoids correlates with disease severity in adults with cystic fibrosis and homozygous F508del mutations. Journal of Cystic Fibrosis. 19 (4), 614-619 (2020).
  35. Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
  36. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  37. van Mourik, P., Beekman, J. M., vander Ent, C. K. Intestinal organoids to model cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 54 (1), 1802379 (2019).
  38. Tong, T., et al. Transport of artificial virus-like nanocarriers through intestinal monolayers via microfold cells. Nanoscale. 12 (30), 16339-16347 (2020).
  39. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  40. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  41. Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
  42. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9 (9), e107814 (2014).
  43. Sachs, N., Tsukamoto, Y., Kujala, P., Peters, P. J., Clevers, H. Intestinal epithelial organoids fuse to form self-organizing tubes in floating collagen gels. Development. 144 (6), 1107-1112 (2017).
  44. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).

Tags

Biologi nummer 196
Generering och manipulation av tarmorganoider hos råttor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zagoren, E., Santos, A. K., Ameen,… More

Zagoren, E., Santos, A. K., Ameen, N. A., Sumigray, K. Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (196), e65343, doi:10.3791/65343 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter