Optimeret produktion og analyse af rekombinante proteinfyldte vesikler fra E. coli

Summary

Denne protokol beskriver en detaljeret metode til bakteriel produktion af rekombinante proteiner, herunder typisk uopløselige eller disulfidbindende proteiner, pakket inde i ekstracellulære membranbundne vesikler. Dette har potentiale til at blive anvendt på alsidige områder af videnskabelig forskning, herunder anvendt bioteknologi og medicin.

Abstract

Dette innovative system, der bruger et kort peptidmærke, der eksporterer flere rekombinante proteiner i membranbundne vesikler fra E. coli, giver en effektiv løsning på en række problemer forbundet med bakteriel rekombinant proteinekspression. Disse rekombinante vesikler opdeler proteiner i et mikromiljø, der letter produktionen af ellers udfordrende, giftige, uopløselige eller disulfidbindende proteiner fra bakterier. Proteinudbyttet øges betydeligt sammenlignet med typisk bakteriel ekspression i fravær af vesikelkernende peptidmærke. Frigivelsen af vesikelemballerede proteiner understøtter isolering fra dyrkningsmediet og tillader langvarig aktiv proteinopbevaring. Denne teknologi giver anledning til øgede udbytter af vesikelpakkede, funktionelle proteiner til forenklet downstream-behandling til en bred vifte af applikationer fra anvendt bioteknologi til opdagelsesvidenskab og medicin. I denne artikel og den tilhørende video gives en detaljeret protokol over metoden, der fremhæver vigtige trin i metoden til maksimering af rekombinant proteinfyldt vesikelproduktion.

Introduction

De gramnegative bakterier E. coli er et attraktivt system til rekombinant proteinproduktion i både industriel og akademisk skala. Det er ikke kun omkostningseffektivt og ligetil at dyrke i partier til høje densiteter, men der er etableret et bredt spektrum af reagenser, stammer, værktøjer og promotorer for at fremme dannelsen af funktionelle proteiner i E. coli¹. Derudover overvinder syntetiske biologiske teknikker nu forhindringer, der typisk er relateret til anvendelsen af posttranslationelle modifikationer og foldning af komplekse proteiner². Evnen til at målrette udskillelsen af rekombinante proteiner i kulturmedier er attraktiv for at forbedre udbyttet og reducere produktionsomkostningerne. Kontrolleret pakning af brugerdefinerede proteiner i membranvesikler hjælper udviklingen af produkter og teknologier inden for den anvendte bioteknologi og medicinalindustrien. Indtil nu har der manglet bredt anvendelige metoder til udskillelse af rekombinante proteiner fra E. coli ³.

Eastwood et al. har for nylig udviklet en peptidmærkningsbaseret metode til fremstilling og isolering af rekombinante proteinholdige vesikler fra E. coli¹. Dette vesikelnukleerende peptid (VNp) tillader produktion af ekstracellulære bakteriemembranvesikler, hvori det valgte rekombinante protein kan målrettes for at forenkle oprensning og opbevaring af målproteinet og tillader signifikant højere udbytter end normalt tilladt fra rystende kolbekulturer. Udbytter på tæt på 3 g rekombinant protein pr. liter kolbekultur er blevet rapporteret, med >100x højere udbytter end dem, der opnås med tilsvarende proteiner, der mangler VNp-mærket. Disse rekombinante proteinberigede vesikler kan hurtigt renses og koncentreres fra kulturmediet og give et stabilt miljø til opbevaring. Denne teknologi repræsenterer et stort gennembrud i E. coli rekombinant proteinproduktion. Vesiklerne opdeler toksiske og disulfidbindende proteiner i en opløselig og funktionel form og understøtter den enkle, effektive og hurtige oprensning af vesikelpakkede, funktionelle proteiner til langtidsopbevaring eller direkte behandling¹.

De største fordele, som denne teknologi giver i forhold til de nuværende teknikker, er: (1) anvendeligheden til en række størrelser (1 kDa til >100 kDa) og proteintyper; 2) lette dannelsen af inter- og intraproteindisulfidbindinger (3) gælder for multiproteinkomplekser (4) kan anvendes med en række promotorer og E. coli-standardlaboratoriestammer; 5) frembringelse af proteinudbytter fra rystekolber, der normalt kun ses ved gæringskulturer proteiner eksporteres og pakkes i membranbundne vesikler, der (6) giver et stabilt miljø til opbevaring af det aktive opløselige protein; og (7) forenkler downstream-forarbejdning og proteinrensning. Dette enkle og omkostningseffektive rekombinante proteinværktøj vil sandsynligvis have en positiv indvirkning på bioteknologi- og medicinalindustrien samt opdagelsesvidenskaben.

Her beskriver en detaljeret protokol, udviklet over flere år, de optimale betingelser for at producere rekombinante proteinfyldte vesikler fra bakterier med VNp-teknologien. Eksempelbilleder af dette system i praksis vises, hvor et fluorescerende protein udtrykkes, hvilket gør det muligt at visualisere tilstedeværelsen af vesikler i forskellige stadier af produktionen, oprensningen og koncentrationen. Endelig gives vejledning i, hvordan man bruger levende cellebilleddannelse til at validere produktionen af VNp-fusionsholdige vesikler fra bakterierne.

Protocol

Det bakterielle arbejde, der udføres, følger de lokale, nationale og internationale regler for indeslutning af biosikkerhed, der passer til det særlige biosikkerhedsfareniveau for hver stamme.

1. Valg af forskellige VNps

1. Identificer VNp-sekvenserne.
   BEMÆRK: For denne undersøgelse er der identificeret tre VNp-sekvenser¹ , der resulterer i maksimalt udbytte og vesikulær eksport af de proteiner, der er undersøgt til dato: VNp2, VNp6 og VNp15. Det er i øjeblikket ikke klart, hvorfor visse VNp-varianter fungerer mere effektivt med nogle proteiner end andre; derfor anbefales det, at fusioner genereres mellem et nyt protein af interesse med hver VNp-variant (dvs. VNp2, 6 eller 15).
   VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA
   AGKTKEGVL
   VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA
   AEKTKEGVM
   VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE
   Plasmider, der tillader ekspression af proteinet af interesse med forskellige VNp-aminoterminale fusioner, er blevet gjort kommercielt tilgængelige (se materialetabel).
2. Design en kloningsstrategi for at indsætte genet af interesse i 3'-enden af cDNA-kodningen for VNp i en af disse konstruktioner, eller tilpas et eksisterende plasmid ved at integrere syntetiseret VNp cDNA opstrøms for det første ATG-codon af genet, der koder for proteinet af interesse. Anvend metoderne som beskrevet i¹.
3. For giftige proteiner skal du bruge en vektor med en undertrykkelig ekspressionspromotor eller en promotor med minimal uinduceret ekspressionsstøj.
4. Klon VNp-sekvensmærket ved fusionsproteinets aminoterminal. Sørg for, at affinitetsmærkerne, proteasespaltningssekvenserne osv. Og proteinet af interesse er placeret på carboxylsiden af VNp-mærket. Det anbefales at adskille VNp fra downstreampeptidet med en fleksibel linkerregion, såsom to eller tre gentagelser af en -G-G-S-G- polypeptidsekvens (figur 1).
   BEMÆRK: Brug plasmider med et antibiotikumvalg, der ikke er målrettet peptidoglycan, hvilket svækker celleoverfladen og reducerer vesikeludbyttet. Kanamycin og chloramphenicol (se tabel over materialer) var de foretrukne antibiotika, der blev anvendt til denne undersøgelse.

2. Bakteriel cellekultur og proteininduktion

BEMÆRK: Bakteriestammer, der typisk anvendes i denne protokol, er enten Escherichia coli BL21 (DE3) eller W3110. E. coli-celler dyrkes i lysogenisk bouillon (LB) (10 g / L trypton; 10 g / L NaCl; 5 g / L gærekstrakt) eller fantastisk bouillon (TB) (12 g / L trypton; 24 g / L gærekstrakt; 4 ml / L 10% glycerol; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K₂HPO₄, salte autoklaveret separat) medier (se materialetabel). Figur 2 viser eksempler på billeder, der viser hvert trin i proteininduktionen og den efterfølgende isolations- og oprensningsproces.

1. Kultur 5 ml LB startere fra friske bakterielle transformationer ved 37 ° C til mætning og brug dem til at inokulere 25 ml TB i en 500 ml konisk kolbe, alle med passende antibiotikavalg.
2. Forholdet mellem overfladeareal: volumen er en vigtig faktor i optimeringen af dette system. Brug så stor en rumfangskolbe som muligt (f.eks. 5 L kolbe indeholdende 1 liter kultur; til optimeringskørsler skal du bruge 25 ml medier i en 500 ml kolbe).
3. De større rystekolbekulturer inkuberes i en inkubator ved 37 °C under omrystning ved 200 omdr./min. (≥25 mm orbitalkast), indtil en optisk densitetsværdi på 600 nm (OD₆₀₀) på 0,8-1,0 er nået.
   BEMÆRK: Vesikulation er optimal, når cellerne dyrkes ved 37 °C. Nogle rekombinante proteiner kræver imidlertid ekspression ved lavere temperaturer. Hvis dette er tilfældet for det relevante protein, skal VNp6-mærket anvendes, da dette muliggør eksport af vesikel med højt udbytte ved temperaturer ned til 25 °C.
4. For at inducere rekombinant proteinekspression fra T7-promotoren tilsættes isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til en slutkoncentration på op til 20 μg/ml (84 μM) (se materialetabel). Induktionen af rekombinant proteinekspression skal ske i den sene log-fase (dvs. typisk OD₆₀₀ på 0,8-1,0) til fremstilling af vesikler.
   BEMÆRK: Længden af induktionsperioden kan variere mellem proteiner, hvor nogle når maksimal produktion ved 4 timer og andre natten over (18 timer). Til dato er der opnået maksimal vesikeleksport i kulturer natten over.

3. Rekombinant vesikelisolering

1. Pellet cellerne ved centrifugering ved 3.000 x g (4 °C) i 20 min.
2. For at sterilisere vesikelholdige medier til langtidsopbevaring skal de ryddede kulturmedier føres gennem et sterilt og vaskemiddelfrit 0,45 μm polyethersulfon (PES) filter (se materialetabel).
   BEMÆRK: For at teste udelukkelsen af levedygtige celler fra det vesikelholdige filtrat, plades på LB-agar og inkuberes natten over ved 37 °C.
3. For at koncentrere vesikler i et mindre volumen føres det sterile vesikelholdige medie gennem et sterilt og vaskemiddelfrit 0,1 μm blandet celluloseesterfilter (MCE) (se materialetabel).
4. Vask forsigtigt membranen med 0,5-1 ml steril PBS ved hjælp af en celleskraber eller plastspreder for forsigtigt at fjerne vesikler fra membranen. Overfør til et frisk mikrofugerør.
   BEMÆRK: Renset vesikler kan opbevares i sterile medier eller fosfatbufret saltvand (PBS) ved 4 °C. Der er eksempler på rekombinante proteiner opbevaret i disse vesikler i 6 måneder på denne måde uden tab af enzymatisk aktivitet.

4. Opløseligt proteinfrigivelse fra isolerede vesikler

1. Når proteinholdige vesikler er blevet isoleret i det sterile medie / buffer, udsættes vesikulære lipidmembraner for sonikering ved hjælp af en passende tidsplan for apparatet (f.eks. 6x 20 s tænd og sluk-cyklusser) og centrifuger ved 39.000 x g (4 ° C) i 20 minutter for at fjerne vesikelaffald.
   BEMÆRK: Osmotisk chok eller behandling med vaskemiddel kan bruges som et alternativ til at bryde vesiklerne op, men der skal tages hensyn til indvirkningen på proteinfunktionalitet og/eller downstream-anvendelse.
2. Hvis VNp-fusion forbliver cytosolisk og ikke frigives i medierne, skal proteinet isoleres ved hjælp af standardprotokoller (f.eks. Resuspender cellepillerne i 5 ml af en passende ekstraktionsbuffer (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonikere og fjerne celleaffaldet ved centrifugering).

5. Bestemmelse af proteinkoncentration

1. Bestem koncentrationen af proteiner ved geldensitometrianalyse af tredobbelte prøver¹. Kør sammen med bovin serumalbumin (BSA) belastningsstandarder på coomassie-farvede natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) geler. Scan og analyser gelerne ved hjælp af passende software (f.eks. Billede J; se materialetabel).

6. Visualisering af vesikeldannelse og isolerede vesikler ved fluorescensmikroskopi

BEMÆRK: Hvis cellerne indeholder fluorescerende mærkede VNp-fusions- eller membranmarkører, kan levende cellebilleddannelse bruges til at følge vesikeldannelse. Alternativt kan fluorescerende lipidfarvestoffer bruges til at visualisere vesikler for at bekræfte produktion og oprensning.

1. Celle montering
   1. Inducer VNp-fusionsudtryk i flere timer, før du monterer på dæksedlen.
   2. Agarosepudemetode (figur 3A-C): pipetter cellerne på en tynd (<1 mm), cirkulær LB-agarose (2%) pude, der har fået lov til at danne sig og sætte sig på et rent glasglas. Lad cellerne sætte sig og ligevægte, og placer et 50 mm x 25 mm dæksel på puden og cellerne. Hold dækselen på plads med afstandsstykker og tape.
   3. Polyethyleneimin (PEI) metode (figur 3D-F): Spred 20 μL 0,05% PEI (i dH₂O) på en dæksel med en pipettespids og lad den binde til glas i 3-5 minutter uden at lade tørre. Tilsæt 50 μL cellekultur og lad den stå i 5-10 minutter for at sikre, at bakterier har forbundet sig med den PEI-belagte overflade⁴. Vask dækslet med 100 μL medie, før du sætter det på diaset, og hold det på plads med afstandsstykker og tape.
2. Montering af vesikler
   1. Pipette rensede vesikler på en tynd (<1 mm), cirkulær LB-agarose (2%) pude, der har fået lov til at danne sig og sætte sig på et rent glasglas. Når væsken er tørret, anbringes et 50 mm x 25 mm dæksel på puden og vesiklerne. Hold dækselen på plads med afstandsstykker og tape.
   2. Det fluorescerende lipidfarvestof FM4-64 er i stand til at plette membraner⁵ og kan derfor bruges til at visualisere vesikler. Der tilsættes FM4-64 (se materialetabellen) til rensede vesikler i en slutkoncentration på 2 μM (fra en 2 mM stamme opløst i dimethylsulfoxid [DMSO]) og billede efter 10 minutters inkubation. Dette er især nyttigt til identifikation af vesikler, der indeholder ikke-fluorescerende mærkede laster⁵.
   3. Skyl dæksedlerne med det samme medie, der bruges til at dyrke de observerede celler.
      BEMÆRK: Nogle komplekse medier (f.eks. TB) kan udvise autofluorescens, hvilket kan resultere i overskydende baggrundssignal.
3. Billeddannelse af vesikler
   BEMÆRK: Eksempler på mikroskopibilleder af VNp rekombinante vesikler kan ses i figur 4.
   1. Monter objektglasset på et omvendt mikroskop (se materialetabellen) ved hjælp af et olienedsænkningsmål, og lad det stå i 2-3 minutter, så prøven kan bundfælde sig og temperaturen ekvilibreres.
      BEMÆRK: Al levende cellebilleddannelse for hver prøve skal udfyldes inden for 30 minutter efter montering af celler på dæksedler for at minimere virkningen af fototoksicitet og anaerob stress. Af denne grund foretrækkes enkeltplanbilleder frem for z-stakke.
   2. Brug passende lyskilder (f.eks. lysemitterende diode [LED] eller halogenpære; se materialetabel) og filterkombinationer til det eller de fluorescerende proteiner/farvestoffer, der anvendes⁶.
   3. Brug en linse med høj forstørrelse (dvs. 100x eller 150x) og høj numerisk blænde (dvs. NA ≥1.4) til billeddannelse af mikrobielle celler og vesikler.
   4. Bestem den minimale lysintensitet, der kræves for at visualisere fluorescenssignaler fra celler og / eller vesikler. Dette kan kræve en vis justering af eksponerings- og forstærkningsindstillingerne for det anvendte kamera.
      BEMÆRK: Typiske eksponeringstider fra nuværende CMOS-kameraer (complementary metal-oxide semiconductor) varierer mellem 50-200 ms afhængigt af billeddannelsessystemet.
   5. Til enkeltbilleder skal du bruge tre-billedgennemsnit for at reducere hardwareafhængig tilfældig baggrundsstøj.
   6. For time-lapse-billeddannelse skal der gå 3-5 minutter mellem de enkelte billeder.
      BEMÆRK: Afhængigt af mikroskopopsætningen skal fokus muligvis justeres intermitterende gennem længere time-lapse-eksperimenter.

Representative Results

BL21 DE3 E. coli indeholdende VNp6-mNeongreen-ekspressionskonstruktionen blev dyrket til sen logfase (figur 2A). VNp6-mNeongreen-ekspression blev fremkaldt ved tilsætning af IPTG til kulturen (20 μg/ml eller 84 μM slutkoncentration), som efterfølgende fik lov til at vokse natten over ved 37 °C med kraftig omrystning (200 omdr./min., ≥25 mm orbitalkast). Den følgende morgen viste kulturen mNeongreen fluorescens⁷ (figur 2B), som forblev synlig i medierne efter fjernelse af bakterieceller ved centrifugering (figur 2C). Tilstedeværelsen af VNp-mNeongreen inden for kultur- og clearede kulturmedier blev bekræftet af SDS-PAGE (figur 2D). De mNeongreen-holdige vesikler blev isoleret på et 0,1 μm MCE-filter (figur 2E) og resuspenderet i PBS (figur 2F). De rensede vesikler blev efterfølgende monteret på en agarosepude (figur 3A-C) og afbildet ved hjælp af widefield fluorescensmikroskopi (figur 4A). Tilstedeværelsen af vesikelmembraner blev bekræftet ved anvendelse af det lipofile fluorescerende farvestof FM4-64 (figur 4B). E. coli-cellerne, der udtrykker det indre membranprotein CydB fusioneret med mNeongreen (grøn) og VNp6-mCherry2 (magenta)⁸, viser vesikelproduktion og lastindsættelse i levende bakterieceller (figur 4C). Figur 4A,B blev taget ved hjælp af et widefield fluorescensmikroskop, mens figur 4C blev erhvervet ved hjælp af struktureret belysningsmikroskopi (SIM) ved hjælp af metoder beskrevet tidligere ^9,10.

Figur 1: Oversigt over VNp-teknologi fra udformning af en kloningsstrategi til oprensning og opbevaring af ekstracellulære vesikler . (A) Skematisk over et typisk VNp-fusionsprotein. VNp ved NH2-terminalen, efterfulgt af en fleksibel linker og en passende kombination af affinitets- og fluorescensmærker (Tag1, Tag 2, proteasespaltningssted [f.eks. TEV]) og protein af interesse. B) Skematisk diagram, der opsummerer protokollen for ekspression og oprensning af rekombinante proteinfyldte membranvesikler fra E. coli. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Stadier af produktion og rensning af VNp6-mNg vesikler. Kulturer af E. coli-celler , der indeholder VNp-mNeongreen-ekspressionen, konstrueres i blåt lys enten før (A) eller efter (B) IPTG-induceret ekspression af fusionsproteinet. Cellerne fra (B) blev fjernet ved centrifugering, hvilket efterlod VNp-mNeongreen-fyldte vesikler i mediet (C). (D) Ækvivalente prøver fra A, B og C blev analyseret ved SDS-PAGE og coomassie-farvning. Vesiklerne blev isoleret på et 0,1 μm filter (E) og efterfølgende vasket af i et passende volumen buffer (F). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Cellemonteringsprocedure til billeddannelse af vesikler og vesikelproduktion. (A-C) Agarosepudemetoden og (D-F) PEI-metoden til montering af E. coli-celler på dæksedlen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Mikroskopibilleder af VNp rekombinante vesikler. Grønne (A) og røde (B) emissionsbilleder fra forskellige felter af FM4-64 mærket VNp6-mNeongreen-holdige vesikler monteret på en agarosepude. (C) Billeddannelse af E. coli-celler , der udtrykker det indre membranprotein CydB fusioneret med mNeongreen (grøn) og VNp6-mCherry2 (magenta), viser vesikelproduktion og lastindsættelse i levende bakterieceller. (A,B) blev afbildet ved hjælp af et widefield fluorescensmikroskop, mens (C) blev erhvervet ved hjælp af struktureret belysningsmikroskopi (SIM). Skalastænger: (A,B) = 10 μm; (C) = 1 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den aminoterminale peptidmærkede metode til produktion af rekombinante proteiner, der er beskrevet ovenfor, er en simpel proces, der konsekvent giver store mængder protein, der effektivt kan isoleres og/eller opbevares i flere måneder.

Det er vigtigt at fremhæve de vigtigste trin i protokollen, der kræves for optimal brug af dette system. For det første skal VNp-tag¹ være placeret ved N-terminalen, efterfulgt af proteinet af interesse og eventuelle passende tags. Det er også vigtigt at undgå at bruge antibiotika, der er målrettet peptidoglycanlaget, såsom ampicillin.

Med hensyn til vækstbetingelser er rich media (f.eks. LB- eller TB-medier) og et højt overfladeareal:volumenforhold nødvendigt for at maksimere vesikelproduktionen. Den optimale temperatur til produktion af ekstracellulære vesikler er 37 °C, men de betingelser, der typisk kræves for ekspression af det pågældende protein, skal også overvejes. For lavere induktionstemperaturer skal VNp6 anvendes. Det er afgørende, at induktion af T7-promotoren ikke opnås ved hjælp af mere end 20 μg/ml (84 μM) IPTG, når cellerne når en OD₆₀₀ på 0,8-1,0. Proteiner udtrykt ved hjælp af systemet når maksimal vesikelproduktion enten 4 timer eller efter induktion natten over.

På trods af enkelheden i denne protokol kræver den optimering. VNp-variantfusion, ekspressionstemperaturer og induktionstidsperioder kan variere afhængigt af det interessante protein. Desuden er der behov for at optimere oprensningen og den efterfølgende koncentration af ekstracellulære vesikler fra medierne. Den nuværende procedure er ikke skalerbar og kan være tidskrævende. Dette er begrænsningerne ved denne metode.

VNp-teknologien har mange fordele i forhold til traditionelle metoder². Det tillader vesikulær eksport af forskellige proteiner, hvor den maksimale størrelse, der med succes er udtrykt til dato, er 175 kDa for vesikler, der forbliver interne, og 85 kDa for dem, der eksporteres. Desuden kan denne teknologi øge udbyttet af rekombinante proteiner betydeligt med en række fysiske egenskaber og aktiviteter. Eksporterede vesikler, der indeholder det pågældende protein, kan isoleres ved simpel filtrering fra det forrensede medie og kan efterfølgende opbevares i sterile dyrkningsmedier eller buffere ved 4 °C i flere måneder.

Anvendelsesmulighederne for dette system er forskellige, fra opdagelsesvidenskab til anvendt bioteknologi og medicin (f.eks. gennem produktion af funktionel terapi)³. Den lette produktion, downstream-forarbejdning og det høje udbytte er alle attraktive kvaliteter i disse områder og især i industrien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Melford	69-52-3
Chloramphenicol	Acros Organics (Thermofisher Scientific)	56-75-7
E. coli BL21 (DE3)	Lab Stock	N/A
E. coli DH10β	Lab Stock	N/A
Filters for microscope	Chroma
FM4-64	Molecular Probes (Invitrogen)	T-3166	Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM
ImageJ	Open Source		Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html
Inverted microscope	Olympus
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Melford	367-93-1
Kanamycin sulphate	Gibco (Thermofisher Scientific)	11815-024
LED light source for micrscope	Cairn Research Ltd
Lysogeny Broth (LB) / LB agar	Lab Stock	N/A	10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar)
Metamorph imaging software	Molecular Devices
MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE)	Merck	VCWP04700
Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES)	Merck	HPWP04700
Phosphate buffered saline (PBS)	Lab Stock	N/A
Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions	Addgene		https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/
Terrific Broth (TB)	Lab Stock	N/A	12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4