Summary
Detta protokoll beskriver en detaljerad metod för bakterieproduktion av rekombinanta proteiner, inklusive typiskt olösliga eller disulfidbindande proteiner, förpackade inuti extracellulära membranbundna vesiklar. Detta har potential att tillämpas på mångsidiga områden av vetenskaplig forskning, inklusive tillämpad bioteknik och medicin.
Abstract
Detta innovativa system, med hjälp av en kort peptidtagg, som exporterar flera rekombinanta proteiner i membranbundna vesiklar från E. coli, ger en effektiv lösning på en rad problem i samband med bakteriellt rekombinant proteinuttryck. Dessa rekombinanta vesiklar delar upp proteiner i en mikromiljö som underlättar produktionen av annars utmanande, giftiga, olösliga eller disulfidbindande proteiner från bakterier. Proteinutbytet ökar avsevärt jämfört med typiskt bakterieuttryck i frånvaro av vesikelkärnbildande peptidtagg. Frisättningen av vesikelförpackade proteiner stöder isolering från odlingsmediet och möjliggör långvarig aktiv proteinlagring. Denna teknik ger upphov till ökade utbyten av vesikelförpackade, funktionella proteiner för förenklad nedströms bearbetning för ett brett spektrum av applikationer från tillämpad bioteknik till upptäcktsvetenskap och medicin. I den här artikeln och tillhörande video tillhandahålls ett detaljerat protokoll för metoden, som belyser viktiga steg i metodiken för att maximera rekombinant proteinfylld vesikelproduktion.
Introduction
Den gramnegativa bakterien E. coli är ett attraktivt system för rekombinant proteinproduktion i både industriell och akademisk skala. Det är inte bara kostnadseffektivt och enkelt att odla i satser till höga densiteter, men ett brett spektrum av reagens, stammar, verktyg och promotorer har etablerats för att främja genereringen av funktionella proteiner i E. coli1. Dessutom övervinner syntetiska biologiska tekniker nu hinder som vanligtvis är relaterade till tillämpningen av posttranslationella modifieringar och vikning av komplexa proteiner2. Förmågan att rikta utsöndringen av rekombinanta proteiner i odlingsmedier är attraktiv för att förbättra avkastningen och minska tillverkningskostnaderna. Kontrollerad förpackning av användardefinierade proteiner i membranvesiklar hjälper utvecklingen av produkter och teknologier inom tillämpad bioteknik och medicinsk industri. Hittills har det saknats allmänt tillämpliga metoder för att utsöndra rekombinanta proteiner från E. coli 3.
Eastwood et al. har nyligen utvecklat en peptidmärkningsbaserad metod för att producera och isolera rekombinanta proteininnehållande vesiklar från E. coli1. Denna vesikelkärnbildande peptid (VNp) möjliggör produktion av extracellulära bakteriella membranvesiklar, i vilka det valda rekombinanta proteinet kan riktas för att förenkla rening och lagring av målproteinet och tillåter betydligt högre utbyten än normalt tillåtet från skakkolvkulturer. Utbyten av nära 3 g rekombinant protein per liter kolvkultur har rapporterats, med >100 gånger högre utbyten än de som erhållits med motsvarande proteiner som saknar VNp-märket. Dessa rekombinanta proteinanrikade vesiklar kan snabbt renas och koncentreras från odlingsmediet och ge en stabil miljö för lagring. Denna teknik representerar ett stort genombrott i E. coli rekombinant proteinproduktion. Vesiklarna delar upp toxiska och disulfidbindande proteiner i löslig och funktionell form och stöder enkel, effektiv och snabb rening av vesikelförpackade, funktionella proteiner för långvarig lagring eller direkt bearbetning1.
De stora fördelarna med denna teknik jämfört med nuvarande tekniker är: (1) tillämpligheten på en rad storlekar (1 kDa till >100 kDa) och typer av protein; (2) underlätta bildning av disulfidbindningar mellan och inom proteiner; (3) tillämplig på multiproteinkomplex; (4) kan användas med en rad promotorer och standard laboratorie E. coli-stammar ; 5. Generering av proteinutbyte från skakkolvar, som normalt endast ses med jäsningskulturer. proteiner exporteras och förpackas i membranbundna vesiklar som (6) ger en stabil miljö för lagring av det aktiva lösliga proteinet; och (7) förenklar nedströms bearbetning och proteinrening. Detta enkla och kostnadseffektiva rekombinanta proteinverktyg kommer sannolikt att ha en positiv inverkan på bioteknik- och medicinsk industri samt upptäcktsvetenskap.
Här beskriver ett detaljerat protokoll, utvecklat under flera år, de optimala förhållandena för att producera rekombinanta proteinfyllda vesiklar från bakterier med VNp-tekniken. Exempel på bilder av detta system i praktiken visas, med ett fluorescerande protein som uttrycks, vilket möjliggör närvaron av vesiklar under olika stadier av produktion, rening och koncentration som ska visualiseras. Slutligen ges vägledning om hur man använder levande cellavbildning för att validera produktionen av VNp-fusionsinnehållande vesiklar från bakterierna.
Protocol
Det bakteriella arbete som utförs följer de lokala, nationella och internationella bestämmelserna om biosäkerhet som passar den särskilda biosäkerhetsrisknivån för varje stam.
1. Val av olika virtuella nätverk
- Identifiera VNp-sekvenserna.
OBS: För den aktuella studien har tre VNp-sekvenser identifierats1 som resulterar i maximalt utbyte och vesikulär export av de proteiner som hittills undersökts: VNp2, VNp6 och VNp15. Det är för närvarande inte klart varför vissa VNp-varianter fungerar mer effektivt med vissa proteiner än andra; därför rekommenderas att fusioner genereras mellan ett nytt protein av intresse med varje VNp-variant (dvs. VNp2, 6 eller 15).
VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA
AGKTKEGVL
VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA
AEKTKEGVM
VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE
Plasmider som tillåter uttryck av proteinet av intresse med olika VNp-aminoterminalfusioner har gjorts kommersiellt tillgängliga (se materialtabell). - Designa en kloningsstrategi för att infoga genen av intresse vid 3'-änden av cDNA-kodningen för VNp i en av dessa konstruktioner, eller anpassa en befintlig plasmid genom att integrera syntetiserat VNp cDNA uppströms det första ATG-kodonet i genen som kodar för proteinet av intresse. Använd metoderna som beskrivs i1.
- För giftiga proteiner, använd en vektor med en repressibel uttryckspromotor eller en promotor med minimalt oinducerat uttrycksbrus.
- Klona VNp-sekvenstaggen vid aminoterminalen i fusionsproteinet. Se till att affinitetstaggarna, proteasklyvningssekvenserna etc. och proteinet av intresse är placerade på karboxylsidan av VNp-taggen. Det rekommenderas att separera VNp från nedströmspeptiden med ett flexibelt länkområde, såsom två eller tre upprepningar av en -G-G-S-G- polypeptidsekvens (figur 1).
OBS: Använd plasmider med ett antibiotiskt urval som inte riktar sig mot peptidoglykan, vilket försvagar cellytan och minskar vesikelutbytet. Kanamycin och kloramfenikol (se materialtabell) var de föredragna antibiotika som användes för denna studie.
2. Bakteriell cellodling och proteininduktion
OBS: Bakteriestammar som vanligtvis används i detta protokoll är antingen Escherichia coli BL21 (DE3) eller W3110. E. coli-celler odlas i lysogenbuljong (LB) (10 g / L trypton; 10 g / L NaCl; 5 g / L jästextrakt) eller fantastisk buljong (TB) (12 g / L trypton; 24 g / L jästextrakt; 4 ml / L 10% glycerol; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, salter autoklaver separat) media (se Materialförteckning). Exempelbilder som visar varje steg i proteininduktionen och efterföljande isolerings- och reningsprocess visas i figur 2.
- Odla 5 ml LB-startmotorer från färska bakterieomvandlingar vid 37 °C till mättnad och använd dem för att inokulera 25 ml TB i en 500 ml konisk kolv, alla med lämpligt antibiotiskt val.
- Förhållandet yta:volym är en viktig faktor för att optimera detta system. Använd en kolv med så stor volym som möjligt (t.ex. 5 L kolv innehållande 1 liter kultur; för optimeringskörningar, använd 25 ml media i en 500 ml kolv).
- Inkubera de större skakkolvkulturerna i en inkubator vid 37 °C med skakning vid 200 rpm (≥25 mm orbitalkast) tills ett optiskt densitetsvärde på 600 nm (OD600) på 0,8–1,0 uppnås.
OBS: Vesikulering är optimal när celler odlas vid 37 °C. Vissa rekombinanta proteiner kräver emellertid uttryck i lägre temperaturer. Om detta är fallet för proteinet av intresse måste VNp6-taggen användas, eftersom detta möjliggör export av vesikeler med hög avkastning vid temperaturer ner till 25 °C. - För att inducera rekombinant proteinuttryck från T7-promotorn, tillsätt isopropyl β-D-1-tiogalaktospyranosid (IPTG) till en slutlig koncentration på upp till 20 μg/ml (84 μM) (se materialtabell). Induktionen av rekombinant proteinuttryck måste ske vid den sena logfasen (dvs. typisk OD600 på 0,8-1,0) för produktion av blåsor.
OBS: Induktionsperiodens längd kan skilja sig åt mellan proteiner, där vissa når maximal produktion vid 4 timmar och andra över natten (18 timmar). Hittills har maximal vesikelexport erhållits i övernattningskulturer.
3. Rekombinant vesikelisolering
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 3 000 x g (4 °C) i 20 minuter.
- För att sterilisera vesikelinnehållande media för långtidsförvaring, passera det rensade odlingsmediet genom ett sterilt och tvättmedelsfritt 0,45 μm polyetersulfonfilter (PES) (se Materialförteckning).
Anmärkning: För att testa uteslutningen av viabla celler från det vesikelinnehållande filtratet, platta på LB-agar och inkubera över natten vid 37 °C. - För att koncentrera vesiklarna till en mindre volym, passera det sterila vesikelinnehållande mediet genom ett sterilt och tvättmedelsfritt 0,1 μm blandat cellulosaestrar (MCE) filter (se materialförteckning).
- Tvätta försiktigt membranet med 0,5-1 ml steril PBS med en cellskrapa eller plastspridare för att försiktigt avlägsna blåsor från membranet. Överför till ett nytt mikrofugerör.
OBS: Renade vesiklar kan förvaras i steril media eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 °C. Det finns exempel på rekombinanta proteiner lagrade i dessa vesiklar i 6 månader, på detta sätt, utan förlust av enzymatisk aktivitet.
4. Löslig proteinfrisättning från isolerade vesiklar
- När proteininnehållande vesiklar har isolerats i sterila medier / buffert, utsätt vesikulära lipidmembran för ultraljudsbehandling med hjälp av ett lämpligt schema för apparaten (t.ex. 6x 20 s på och av cykler) och centrifugera vid 39 000 x g (4 ° C) i 20 minuter för att avlägsna vesikelskräp.
OBS: Osmotisk chock eller tvättmedelsbehandling kan användas som ett alternativ för att bryta upp blåsorna, men hänsyn måste tas till påverkan på proteinfunktionalitet och/eller nedströms applicering. - Om VNp-fusion förblir cytosolisk och inte släpps ut i media, isolera proteinet med standardprotokoll (t.ex. resuspendera cellpelletsna i 5 ml av en lämplig extraktionsbuffert (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonikat och ta bort cellskräpet genom centrifugering).
5. Bestämning av proteinkoncentration
- Bestäm koncentrationen av proteiner genom geldensitometrianalys av triplikatprover1. Kör tillsammans med bovint serumalbumin (BSA) laddningsstandarder på coomassie-färgade natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) geler. Skanna och analysera gelerna med lämplig programvara (t.ex. bild J; se materialförteckning).
6. Visualisering av vesikelbildning och isolerade vesiklar genom fluorescensmikroskopi
OBS: Om cellerna innehåller fluorescerande märkta VNp-fusions- eller membranmarkörer kan levande cellavbildning användas för att följa vesikelbildning. Alternativt kan fluorescerande lipidfärgämnen användas för att visualisera vesiklar för att bekräfta produktion och rening.
- Montering av celler
- Inducera VNp-fusionsuttryck i flera timmar innan du monterar på täckglaset.
- Agarosdyna (figur 3A-C): pipettera cellerna på en tunn (<1 mm), cirkulär LB-agaros (2%) dyna som har fått bildas och satts på en ren glasskiva. Låt cellerna sätta sig och balansera och placera ett 50 mm x 25 mm täckglas på dynan och cellerna. Håll täckglaset på plats med distanser och tejp.
- Polyeteniminmetod (PEI) (figur 3D–F): sprid 20 μl 0,05 % PEI (i dH2O) på ett täckglas med pipettspets och låt stå i 3–5 minuter för att binda till glas utan att låta torka. Tillsätt 50 μL cellodling och låt verka i 5-10 minuter för att säkerställa att bakterier har associerats med den PEI-belagda ytan4. Tvätta täckglaset med 100 μl media innan du placerar det på objektglaset och håll det på plats med distanser och tejp.
- Montering av blåsor
- Pipettera renade vesiklar på en tunn (<1 mm), cirkulär LB-agaros (2%) dyna som har fått formas och satts på en ren glasskiva. När vätskan har torkat, placera ett 50 mm x 25 mm täckglas på dynan och blåsorna. Håll täckglaset på plats med distanser och tejp.
- Det fluorescerande lipidfärgämnet FM4-64 kan färga membran5 och kan därför användas för att visualisera vesiklar. Tillsätt FM4-64 (se materialförteckning) till renade vesiklar vid en slutlig koncentration av 2 μM (från en 2 mM stam upplöst i dimetylsulfoxid [DMSO]) och avbilda efter en 10 minuters inkubation. Detta är särskilt användbart för att identifiera vesiklar som innehåller icke-fluorescerande märkta laster5.
- Skölj täckglasen med samma media som används för att odla de observerade cellerna.
OBS: Vissa komplexa medier (t.ex. TB) kan uppvisa autofluorescens, vilket kan resultera i överskott av bakgrundssignal.
- Avbildning av vesiklar
OBS: Exempel på mikroskopibilder av VNp rekombinanta vesiklar kan ses i figur 4.- Montera glaset på ett inverterat mikroskop (se Materialförteckning) med hjälp av ett oljenedsänkningsmål och låt stå i 2-3 minuter så att provet kan sätta sig och temperaturen balanseras.
OBS: All levande cellavbildning för varje prov måste slutföras inom 30 minuter efter montering av celler på täckglas för att minimera effekterna av fototoxicitet och anaerob stress. Av denna anledning föredras bilder med ett plan framför z-stacks. - Använd lämpliga ljuskällor (t.ex. lysdiod [LED] eller halogenlampa; se Materialförteckning) och filterkombinationer för det eller de fluorescerande proteiner/färgämnen som används6.
- Använd en lins med hög förstoring (dvs. 100x eller 150x) och hög numerisk bländare (dvs. NA ≥1,4) för avbildning av mikrobiella celler och blåsor.
- Bestäm den minimala ljusintensitet som krävs för att visualisera fluorescenssignaler från celler och / eller vesiklar. Detta kan kräva viss justering av exponerings- och förstärkningsinställningarna för kameran som används.
OBS: Typiska exponeringstider från nuvarande komplementära metalloxidhalvledarkameror (CMOS) varierar mellan 50-200 ms beroende på bildsystemet. - För bilder med en ram använder du medelvärdet med tre bilder för att minska maskinvaruberoende slumpmässigt bakgrundsbrus.
- För timelapse-avbildning, tillåt 3-5 minuter mellan enskilda ramar.
OBS: Beroende på mikroskopinställningen kan fokus behöva justeras intermittent under längre tidsfördröjningsexperiment.
- Montera glaset på ett inverterat mikroskop (se Materialförteckning) med hjälp av ett oljenedsänkningsmål och låt stå i 2-3 minuter så att provet kan sätta sig och temperaturen balanseras.
Representative Results
BL21 DE3 E. coli innehållande VNp6-mNeongreen-uttryckskonstruktionen odlades till sen logfas (figur 2A). VNp6-mNeongreen-uttrycket inducerades genom tillsats av IPTG till kulturen (20 μg/ml eller 84 μM slutlig koncentration), som därefter lämnades att växa över natten vid 37 °C med kraftig skakning (200 rpm, ≥25 mm orbitalkast). Följande morgon visade kulturen mneongrön fluorescens7 (figur 2B), som förblev synlig i media efter avlägsnande av bakterieceller genom centrifugering (figur 2C). Förekomsten av VNp-mNeongreen inom kulturen och rensade kulturmedier bekräftades av SDS-PAGE (figur 2D). De mneongröninnehållande vesiklarna isolerades på ett 0,1 μm MCE-filter (figur 2E) och återsuspenderades i PBS (figur 2F). De renade vesiklarna monterades därefter på en agarosdyna (figur 3A-C) och avbildades med hjälp av widefield fluorescensmikroskopi (figur 4A). Förekomsten av vesikelmembran bekräftades med användning av det lipofila fluorescerande färgämnet FM4-64 (figur 4B). E. coli-cellerna som uttrycker det inre membranproteinet CydB smält till mNeongreen (grönt) och VNp6-mCherry2 (magenta)8 visar vesikelproduktion och lastinsättning i levande bakterieceller (figur 4C). Figur 4A,B fångades med hjälp av ett widefield-fluorescensmikroskop, medan figur 4C förvärvades med hjälp av strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), med metoder som beskrivits tidigare 9,10.
Figur 1: Sammanfattning av VNp-tekniken från utformning av en kloningsstrategi till rening och lagring av extracellulära vesiklar . (A) Schematisk bild av ett typiskt VNp-fusionsprotein. VNp vid NH2-terminalen, följt av en flexibel länkare och en lämplig kombination av affinitets- och fluorescenstaggar (Tag1, Tag 2, proteasklyvningsställe [t.ex. TEV]) och protein av intresse. B) Schematiskt diagram som sammanfattar protokollet för uttryck och rening av rekombinanta proteinfyllda membranvesiklar från E. coli. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Produktions- och reningsstadier av VNp6-mNg-vesiklar. Kulturer av E. coli-celler som innehåller VNp-mNeongreen-uttrycket konstrueras i blått ljus antingen före (A) eller efter (B) IPTG-inducerat uttryck av fusionsproteinet. Cellerna från (B) avlägsnades genom centrifugering och lämnade VNp-mNeongreen-fyllda vesiklar i mediet (C). (D) Motsvarande prover från A, B och C analyserades med SDS-PAGE och coomassiefärgning. Vesiklarna isolerades på ett 0,1 μm filter (E) och tvättades därefter av till en lämplig volym buffert (F). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Cellmonteringsförfarande för avbildning av vesiklar och vesikelproduktion. (A-C) agarosdyna-metoden och (D-F) PEI-metoden för montering av E. coli-celler på täckglaset. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Mikroskopibilder av VNp rekombinanta vesiklar. Gröna (A) och röda (B) emissionsbilder från olika fält av FM4-64 märkta VNp6-mNeongreen-innehållande vesiklar monterade på en agarosdyna. (C) Avbildning av E. coli-celler som uttrycker det inre membranproteinet CydB smält till mNeongreen (grönt) och VNp6-mCherry2 (magenta) visar vesikelproduktion och lastinsättning i levande bakterieceller. (A,B) avbildades med hjälp av ett widefield-fluorescensmikroskop, medan (C) förvärvades med hjälp av strukturerad belysningsmikroskopi (SIM). Skalstapeler: (A,B) = 10 μm; (C) = 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Den aminoterminala peptidmärkta metoden för produktion av rekombinanta proteiner som beskrivs ovan är en enkel process som konsekvent ger stora mängder protein som effektivt kan isoleras och/eller lagras i månader.
Det är viktigt att markera de viktigaste stegen i protokollet som krävs för optimal användning av detta system. För det första måste VNp-taggen1 placeras vid N-terminalen, följt av proteinet av intresse och eventuella lämpliga taggar. Det är också viktigt att undvika att använda antibiotika som riktar sig mot peptidoglykanskiktet, såsom ampicillin.
När det gäller tillväxtförhållanden är rich media (t.ex. LB- eller TB-media) och ett högt förhållande mellan yta och volym nödvändigt för att maximera vesikelproduktionen. Den optimala temperaturen för produktion av extracellulära vesiklar är 37 °C, men de förhållanden som vanligtvis krävs för uttryck av proteinet av intresse måste också beaktas. För lägre induktionstemperaturer måste VNp6 användas. Avgörande är att induktion av T7-promotorn måste uppnås med högst 20 μg / ml (84 μM) IPTG när cellerna når en OD600 av 0,8-1,0. Proteiner som uttrycks med hjälp av systemet når maximal vesikelproduktion antingen vid 4 timmar eller efter induktion över natten.
Trots enkelheten i detta protokoll kräver det optimering. VNp-variantfusion, uttryckstemperaturer och induktionstidsperioder kan variera beroende på proteinet av intresse. Vidare finns det ett behov av att optimera reningen och efterföljande koncentration av extracellulära vesiklar från media. Den nuvarande proceduren är inte skalbar och kan vara tidskrävande. Det här är begränsningarna med denna metod.
VNp-tekniken har många fördelar jämfört med traditionella metoder2. Det möjliggör vesikulär export av olika proteiner, med den maximala storleken framgångsrikt uttryckt hittills 175 kDa för vesiklar som förblir interna och 85 kDa för de som exporteras. Dessutom kan denna teknik avsevärt öka utbytet av rekombinanta proteiner med en rad fysikaliska egenskaper och aktiviteter. Exporterade vesiklar som innehåller proteinet i fråga kan isoleras genom enkel filtrering från det preclearerade mediet och kan därefter lagras i sterila odlingssubstrat eller buffertar vid 4 °C i flera månader.
Tillämpningarna för detta system är olika, från upptäcktsvetenskap till tillämpad bioteknik och medicin (t.ex. genom produktion av funktionella terapier)3. Enkel produktion, nedströms bearbetning och hög avkastning är alla attraktiva egenskaper inom dessa områden och särskilt inom industrin.
Disclosures
Författarna redovisar inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar olika Twitter-användare som tog upp frågor om protokollet som presenteras i papperet som beskriver VNp-tekniken. Figur 1A genererades med ikoner från flaticon.com. Detta arbete stöddes av University of Kent och finansiering från Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB / T008 / 768 / 1 och BB / S005544 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Melford | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Acros Organics (Thermofisher Scientific) | 56-75-7 | |
| E. coli BL21 (DE3) | Lab Stock | N/A | |
| E. coli DH10β | Lab Stock | N/A | |
| Filters for microscope | Chroma | ||
| FM4-64 | Molecular Probes (Invitrogen) | T-3166 | Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM |
| ImageJ | Open Source | Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html | |
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Melford | 367-93-1 | |
| Kanamycin sulphate | Gibco (Thermofisher Scientific) | 11815-024 | |
| LED light source for micrscope | Cairn Research Ltd | ||
| Lysogeny Broth (LB) / LB agar | Lab Stock | N/A | 10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar) |
| Metamorph imaging software | Molecular Devices | ||
| MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE) | Merck | VCWP04700 | |
| Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES) | Merck | HPWP04700 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab Stock | N/A | |
| Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions | Addgene | https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/ | |
| Terrific Broth (TB) | Lab Stock | N/A | 12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4 |
References
- Eastwood, T. A., et al. High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli. Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).
- Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).
- Peng, C., et al. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).
- Lewis, K., Klibanov, A. M. Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials. Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B.
- Mulvihill, D. P. Live cell imaging in fission yeast. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Periz, J., et al. A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles. Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).
- Qiu, H., et al. Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends. Science. 352 (6286), 697-701 (2016).
