Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ייצור וניתוח אופטימליים של בועיות מלאות חלבון רקומביננטי מאי-קולי

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65442
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Biosciences, University of Kent

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מפורטת לייצור חיידקים של חלבונים רקומביננטיים, כולל חלבונים המכילים בדרך כלל קשרים בלתי מסיסים או דיסולפידים, ארוזים בתוך שלפוחיות חוץ-תאיות הקשורות לקרום. יש לכך פוטנציאל להיות מיושם בתחומים מגוונים של מחקר מדעי, כולל ביוטכנולוגיה יישומית ורפואה.

Abstract

מערכת חדשנית זו, המשתמשת בתג פפטיד קצר, המייצא חלבונים רקומביננטיים מרובים בשלפוחיות הקשורות לממברנה מ- E. coli, מספקת פתרון יעיל למגוון בעיות הקשורות לביטוי חלבון רקומביננטי חיידקי. שלפוחיות רקומביננטיות אלה ממדירות חלבונים בתוך מיקרו-סביבה המאפשרת ייצור של חלבונים מאתגרים, רעילים, בלתי מסיסים או דיסולפידים המכילים חלבונים מחיידקים. תפוקת החלבון גדלה במידה ניכרת בהשוואה לביטוי חיידקי טיפוסי בהיעדר תג הפפטיד נוקלציית השלפוחית. שחרור חלבונים ארוזים בשלפוחית תומך בבידוד מתווך התרבית ומאפשר אחסון חלבון פעיל לטווח ארוך. טכנולוגיה זו מולידה תפוקות מוגברות של חלבונים פונקציונליים ארוזים בשלפוחית לעיבוד פשוט במורד הזרם עבור מגוון רחב של יישומים, החל מביוטכנולוגיה יישומית ועד מדע גילוי ורפואה. במאמר הנוכחי ובסרטון הנלווה אליו, מובא פרוטוקול מפורט של השיטה, המדגיש שלבים מרכזיים במתודולוגיה למקסום ייצור שלפוחית מלאה בחלבון רקומביננטי.

Introduction

חיידק הגראם-שלילי E. coli הוא מערכת אטרקטיבית לייצור חלבונים רקומביננטיים בקנה מידה תעשייתי ואקדמי כאחד. זה לא רק חסכוני ופשוט לתרבית בקבוצות לצפיפויות גבוהות, אלא הוקם ספקטרום רחב של ריאגנטים, זנים, כלים ומקדמים כדי לקדם את ייצור החלבונים הפונקציונליים ב- E. coli1. בנוסף, טכניקות ביולוגיה סינתטית מתגברות כיום על מכשולים הקשורים בדרך כלל ליישום שינויים לאחר תרגום וקיפול חלבונים מורכבים2. היכולת למקד את הפרשת החלבונים הרקומביננטיים לתרבית אטרקטיבית לשיפור היבול ולהוזלת עלויות הייצור. אריזה מבוקרת של חלבונים המוגדרים על-ידי המשתמש לתוך בועיות הממברנה מסייעת בפיתוח מוצרים וטכנולוגיות בתעשיות הביוטכנולוגיה היישומית והרפואה. עד כה, חסרו שיטות ישימות להפרשת חלבונים רקומביננטיים מ- E. coli 3.

איסטווד ועמיתיו פיתחו לאחרונה שיטה מבוססת תיוג פפטידי לייצור ובידוד שלפוחיות המכילות חלבון רקומביננטי מ- E. coli1. פפטיד נוקלטינג שלפוחית זה (VNp) מאפשר ייצור שלפוחיות קרום חיידקים חוץ-תאיות, שלתוכן ניתן לכוון את החלבון הרקומביננטי המועדף כדי לפשט את הטיהור והאחסון של חלבון המטרה, ומאפשר יבולים גבוהים משמעותית מהמותר בדרך כלל מרעידות תרביות בקבוקים. דווח על תפוקות של קרוב ל-3 גרם חלבון רקומביננטי לליטר תרבית בקבוקים, עם תפוקות גבוהות פי >פי 100 מאלה שהתקבלו עם חלבונים מקבילים חסרי תג VNp. שלפוחיות רקומביננטיות מועשרות בחלבון אלה ניתנות לטיהור וריכוז מהיר ממצע התרבית ומספקות סביבה יציבה לאחסון. טכנולוגיה זו מהווה פריצת דרך משמעותית בייצור חלבון רקומביננטי E. coli. השלפוחיות ממדירות חלבונים רעילים ובעלי קשר דיסולפיד בצורה מסיסים ופונקציונליים, ותומכות בטיהור פשוט, יעיל ומהיר של חלבונים פונקציונליים ארוזים בשלפוחית לאחסון לטווח ארוך או עיבוד ישיר1.

היתרונות העיקריים שטכנולוגיה זו מציגה על פני הטכניקות הנוכחיות הם: (1) הישימות למגוון גדלים (1 kDa עד >100 kDa) וסוגי חלבונים; (2) הקלה על היווצרות קשר דיסולפיד בין-חלבוני ותוך-חלבוני; (3) חל על קומפלקסים רב-חלבוניים; (4) ניתן לשימוש עם מגוון מקדמים וזני E. coli מעבדה סטנדרטיים; (5) הפקת יבולים של חלבונים מרעידות צלוחיות שבדרך כלל רואים רק בתרביות תסיסה; חלבונים מיוצאים ונארזים לבועיות הקשורות לממברנה אשר (6) מספקות סביבה יציבה לאחסון החלבון המסיס הפעיל; ו-(7) מפשט את העיבוד במורד הזרם ואת טיהור החלבונים. כלי חלבון רקומביננטי פשוט וחסכוני זה עשוי להשפיע לטובה על תעשיות הביוטכנולוגיה והרפואה, כמו גם על מדע הגילוי.

כאן, פרוטוקול מפורט, שפותח במשך מספר שנים, מתאר את התנאים האופטימליים לייצור שלפוחיות מלאות חלבון רקומביננטי מחיידקים עם טכנולוגיית VNp. תמונות לדוגמה של מערכת זו בפועל מוצגות, עם חלבון פלואורסצנטי מבוטא, המאפשר נוכחות של שלפוחיות בשלבים שונים של הייצור, טיהור וריכוז כדי להמחיש. לבסוף, ניתנת הדרכה כיצד להשתמש בהדמיה של תאים חיים כדי לאמת את הייצור של בועיות המכילות איחוי VNp מהחיידקים.

Protocol

עבודת החיידקים המבוצעת עוקבת אחר תקנות הכלת הבטיחות הביולוגית המקומיות, הלאומיות והבינלאומיות המתאימות לרמת הסיכון הבטיחותית הביולוגית הספציפית של כל זן.

1. בחירה של VNps שונים

  1. זהה את רצפי VNp.
    הערה: במחקר הנוכחי זוהו שלושה רצפי VNp1 המביאים לתפוקה מקסימלית ולייצוא שלפוחית של החלבונים שנבדקו עד כה: VNp2, VNp6 ו-VNp15. כיום לא ברור מדוע גרסאות VNp מסוימות מתפקדות ביעילות רבה יותר עם חלבונים מסוימים מאשר עם אחרים; לכן, מומלץ ליצור איחוי בין חלבון חדש מעניין עם כל וריאנט VNp (כלומר, VNp2, 6 או 15).
    VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA
    AGKTKEGVL
    VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA
    AEKTKEGVM
    VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE
    פלסמידים המאפשרים ביטוי של החלבון המעניין עם איחוי מסוף אמינו VNp שונים הפכו לזמינים באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים).
  2. תכנן אסטרטגיית שיבוט כדי להחדיר את הגן המעניין בקצה 3' של קידוד cDNA עבור VNp באחד מהמבנים האלה, או להתאים פלסמיד קיים על ידי שילוב VNp cDNA מסונתז במעלה הזרם של קודון ATG הראשון של הגן המקודד לחלבון המעניין. השתמש בשיטות כמתואר ב- 1.
  3. עבור חלבונים רעילים, השתמש בווקטור עם מקדם ביטוי ניתן לדיכוי או פרומוטור עם רעש ביטוי מינימלי בלתי מושרה.
  4. שכפל את תג הרצף VNp במסוף האמינו-טרמינלי של חלבון ההיתוך. ודא כי תגי הזיקה, רצפי מחשוף פרוטאז וכו ', ואת החלבון של עניין ממוקמים בצד carboxyl של תג VNp. מומלץ להפריד את VNp מהפפטיד במורד הזרם עם אזור מקשר גמיש, כגון שתיים או שלוש חזרות של רצף פוליפפטיד -G-G-S-G (איור 1).
    הערה: השתמש פלסמידים עם בחירה אנטיביוטית שאינה מכוונת לפפטידוגליקן, אשר מחליש את פני התא ומפחית את תפוקת השלפוחית. קנמיצין וכלוראמפניקול (ראו טבלת חומרים) היו האנטיביוטיקות המועדפות ששימשו במחקר זה.

2. תרבית תאים חיידקית והשראת חלבונים

הערה: זני חיידקים המשמשים בדרך כלל בפרוטוקול זה הם Escherichia coli BL21 (DE3) או W3110. תאי E. coli מגודלים בתרבית במרק ליזוגני (LB) (10 גרם/ליטר טריפטון; 10 גרם/ליטר NaCl; 5 גרם/ליטר תמצית שמרים) או בציר נהדר (שחפת) (12 גרם/ליטר טריפטון; 24 גרם/ליטר תמצית שמרים; 4 מ"ל/ליטר 10% גליצרול; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, מלחים אוטומטיים בנפרד) מדיה (ראה טבלת חומרים). תמונות לדוגמה המציגות כל שלב בהשראת החלבונים ולאחר מכן תהליך הבידוד והטיהור מוצגות באיור 2.

  1. תרבית 5 מ"ל LB מתחילים מטרנספורמציות חיידקים טריים ב 37 ° C לרוויה ולהשתמש בהם כדי לחסן 25 מ"ל של שחפת בבקבוק חרוטי 500 מ"ל, כל זאת עם בחירה אנטיביוטית מתאימה.
  2. יחס שטח הפנים:נפח הוא גורם חשוב במיטוב מערכת זו. השתמש בבקבוק נפח גדול ככל האפשר (למשל, בקבוק 5 ליטר המכיל 1 ליטר תרבית; לריצות אופטימיזציה, השתמש ב -25 מ"ל של מדיה בבקבוק של 500 מ"ל).
  3. יש לדגור על תרביות הבקבוקים הגדולים יותר באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם טלטול ב-200 סל"ד (≥25 מ"מ זריקת מסלול) עד לקבלת ערך צפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD600) של 0.8-1.0.
    הערה: שלפוחית היא אופטימלית כאשר תאים גדלים ב 37 ° C. עם זאת, חלק מהחלבונים הרקומביננטיים דורשים ביטוי בטמפרטורות נמוכות יותר. אם זה המקרה עבור חלבון של עניין, תג VNp6 חייב לשמש, כמו זה מאפשר ייצוא שלפוחית תפוקה גבוהה בטמפרטורות עד 25 ° C.
  4. כדי לגרום לביטוי חלבון רקומביננטי ממקדם T7, הוסף איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של עד 20 מיקרוגרם/מ"ל (84 מיקרומטר) (ראה טבלת חומרים). השראת ביטוי חלבון רקומביננטי חייבת להתרחש בשלב הרישום המאוחר (כלומר, OD600 טיפוסי של 0.8-1.0) לייצור שלפוחיות.
    הערה: משך תקופת האינדוקציה עשוי להשתנות בין חלבונים, כאשר חלקם מגיעים לייצור מקסימלי לאחר 4 שעות ואחרים במהלך הלילה (18 שעות). עד כה, יצוא שלפוחית מקסימלית הושג בתרבויות לילה.

3. בידוד שלפוחית רקומביננטית

  1. משחררים את התאים באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 x גרם (4°C) למשך 20 דקות.
  2. כדי לעקר מדיה המכילה שלפוחית לאחסון לטווח ארוך, העבר את מדיית התרבית המפונה דרך מסנן פוליאתרסולפון (PES) סטרילי ונטול חומרי ניקוי 0.45 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).
    הערה: כדי לבדוק את ההרחקה של תאים קיימא מן התסנין המכיל שלפוחית, צלחת על אגר LB לדגור לילה ב 37 ° C.
  3. כדי לרכז את השלפוחיות לנפח קטן יותר, העבירו את המצע הסטרילי המכיל שלפוחית דרך מסנן סטרילי ונטול חומרי ניקוי של אסטרי תאית מעורבת (MCE) בגודל 0.1 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).
  4. לשטוף בעדינות את הממברנה עם 0.5-1 מ"ל של PBS סטרילי באמצעות מגרד תאים או מפזר פלסטיק כדי להסיר בזהירות שלפוחיות מן הממברנה. מעבירים לצינור מיקרופוגה טרי.
    הערה: ניתן לאחסן בועיות מטוהרות במדיה סטרילית או במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ב-4°C. ישנן דוגמאות לחלבונים רקומביננטיים המאוחסנים בשלפוחיות אלה במשך 6 חודשים, בדרך זו, ללא אובדן בפעילות אנזימטית.

4. שחרור חלבון מסיס משלפוחיות מבודדות

  1. לאחר שבודדו שלפוחיות המכילות חלבון לתוך המדיה/חיץ הסטרילי, יש להעביר את קרומי השומנים השלפוחיתיים לסוניקציה באמצעות לוח זמנים מתאים למכשיר (למשל, 6x 20 שניות במחזורי הפעלה וכיבוי) וצנטריפוגה ב-39,000 x גרם (4°C) למשך 20 דקות כדי להסיר פסולת שלפוחית.
    הערה: ניתן להשתמש בהלם אוסמוטי או בטיפול בחומרי ניקוי כחלופה לפתיחת השלפוחיות, אך יש לקחת בחשבון את ההשפעה על פונקציונליות החלבון ו / או יישום במורד הזרם.
  2. אם היתוך VNp נשאר ציטוסולי ואינו משתחרר למדיה, בודד את החלבון באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים (למשל, השהה מחדש את כדורי התא ב- 5 מ"ל של חיץ מיצוי מתאים (20 mM tris, 500 mM NaCl), סוניקציה והסר את פסולת התא באמצעות צנטריפוגה).

5. קביעת ריכוז החלבונים

  1. לקבוע את ריכוז החלבונים על ידי ניתוח צפיפות ג'ל של דגימות טריפליקט1. יש לפעול לצד תקני העמסת אלבומין בסרום בקר (BSA) על ג'ל אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) המוכתם בקומסי. סרוק ונתח את הג'לים באמצעות תוכנה מתאימה (לדוגמה, תמונה J; ראה טבלת חומרים).

6. הדמיה של היווצרות שלפוחית ובועיות מבודדות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

הערה: אם התאים מכילים סמני איחוי VNp או ממברנה המסומנים באופן פלואורסצנטי, ניתן להשתמש בהדמיית תאים חיים כדי לעקוב אחר היווצרות השלפוחית. לחלופין, ניתן להשתמש בצבעי שומנים פלואורסצנטיים כדי לדמיין שלפוחיות כדי לאשר ייצור וטיהור.

  1. הרכבה על תאים
    1. השראת ביטוי היתוך VNp למשך מספר שעות לפני הרכבה על הכיסוי.
    2. שיטת פד אגרוז (איור 3A-C): מפיפטים את התאים על פד LB-agarose עגול דק (<1 מ"מ) שהותר לו להיווצר ולקבע על מגלשת זכוכית נקייה. אפשרו לתאים להתיישב ולהתאזן והניחו מכסה בגודל 50 מ"מ x 25 מ"מ על הפד והתאים. החזיקו את הכיסוי במקומו בעזרת ספייסרים וסרט הדבקה.
    3. שיטת פוליאתילניאמין (PEI) (איור 3D-F): מרחו 20 מיקרוליטר של 0.05% PEI (ב-dH2O) על כיסוי עם קצה פיפטה והשאירו למשך 3-5 דקות להיקשר לזכוכית מבלי לאפשר לה להתייבש. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תרבית תאים והשאירו למשך 5-10 דקות כדי לוודא שהחיידקים התחברו למשטח המצופה ב-PEI4. שטפו את הכיסוי עם 100 מיקרוליטר של מדיה לפני הנחתו על המגלשה והחזיקו אותו במקומו עם ספייסרים וסרט הדבקה.
  2. הרכבה שלפוחיות
    1. פיפטה מטהרת שלפוחיות על פד LB-agarose עגול דק (<1 מ"מ) שהותר לו להיווצר ולקבע על מגלשת זכוכית נקייה. לאחר שהנוזל התייבש, הניחו כיסוי בגודל 50 מ"מ x 25 מ"מ על הפד והשלפוחיות. החזיקו את הכיסוי במקומו בעזרת ספייסרים וסרט הדבקה.
    2. צבע השומנים הפלואורסצנטי FM4-64 מסוגל להכתים קרומים5, ולכן ניתן להשתמש בו כדי לדמיין שלפוחיות. הוסף FM4-64 (ראה טבלת חומרים) לבועיות מטוהרות בריכוז סופי של 2 מיקרומטר (מציר של 2 מילימטר מומס בדימתיל סולפוקסיד [DMSO]) ותמונה לאחר דגירה של 10 דקות. זה שימושי במיוחד לזיהוי שלפוחיות המכילות מטענים שאינם מסומנים פלואורסצנטית5.
    3. שטפו את הכיסויים באותה מדיה המשמשת לתרבית התאים הנצפים.
      הערה: מדיה מורכבת מסוימת (לדוגמה, שחפת) יכולה להציג אוטופלואורסצנטיות, מה שעלול לגרום לאות רקע עודף.
  3. בועיות הדמיה
    הערה: תמונות מיקרוסקופיות לדוגמה של שלפוחיות רקומביננטיות VNp ניתן לראות באיור 4.
    1. הרכיבו את המגלשה על מיקרוסקופ הפוך (ראו טבלת חומרים) באמצעות מטרת טבילת שמן והשאירו למשך 2-3 דקות כדי לאפשר לדגימה לשקוע ולטמפרטורה להתאזן.
      הערה: יש להשלים את כל הדמיית התאים החיים עבור כל דגימה תוך 30 דקות מהרכבת התאים על כיסויים כדי למזער את ההשפעה של פוטוטוקסיות ולחץ אנאירובי. מסיבה זו, תמונות מישור יחיד עדיפות על ערימות z.
    2. השתמש במקורות אור מתאימים (לדוגמה, דיודה פולטת אור [LED] או נורת הלוגן; ראה טבלת חומרים) ושילובי מסננים עבור החלבונים/הצבעים הפלואורסצנטיים הנמצאים בשימוש6.
    3. השתמש בעדשה בהגדלה גבוהה (כלומר, 100x או 150x) ובצמצם מספרי גבוה (כלומר, NA ≥1.4) להדמיית התאים המיקרוביאליים והשלפוחיות.
    4. לקבוע את עוצמת האור המינימלית הנדרשת כדי לדמיין אותות פלואורסצנטיים מתאים ו / או שלפוחיות. פעולה זו עשויה לדרוש התאמה מסוימת של הגדרות החשיפה והרווח עבור המצלמה שבשימוש.
      הערה: זמני חשיפה אופייניים ממצלמות מוליכים למחצה משלימים של תחמוצת מתכת (CMOS) משתנים בין 50-200 אלפיות השנייה, בהתאם למערכת ההדמיה.
    5. לתמונות במסגרת בודדת, השתמשו בממוצע של שלוש תמונות כדי להפחית רעשי רקע אקראיים תלויי חומרה.
    6. להדמיה בהילוך מהיר, המתן 3-5 דקות בין מסגרות בודדות.
      הערה: בהתאם להגדרת המיקרוסקופ, ייתכן שיהיה צורך לכוונן את המיקוד לסירוגין במהלך ניסויים ארוכים יותר בהילוך מהיר.

Representative Results

BL21 DE3 E. coli המכיל את מבנה הביטוי VNp6-mNeongreen גודלו לשלב רישום מאוחר (איור 2A). ביטוי VNp6-mNeongreen נגרם על ידי תוספת של IPTG לתרבית (20 מיקרוגרם / מ"ל או ריכוז סופי של 84 מיקרומטר), אשר לאחר מכן נשאר לגדול בן לילה ב 37 ° C עם רעידות נמרצות (200 סל"ד, ≥ 25 מ"מ זריקה מסלולית). למחרת בבוקר, התרבית הראתה פלואורסצנטיות mNeongreen7 (איור 2B), שנשארה גלויה בתקשורת לאחר הסרת תאי חיידקים באמצעות צנטריפוגה (איור 2C). הנוכחות של VNp-mNeongreen בתוך מדיה תרבותית ותרבותית מנוקה אושרה על-ידי SDS-PAGE (איור 2D). השלפוחיות המכילות mNeongreen בודדו לתוך מסנן MCE של 0.1 מיקרומטר (איור 2E) והושעו מחדש ב-PBS (איור 2F). השלפוחיות המטוהרות הורכבו לאחר מכן על משטח אגרוז (איור 3A-C) וצולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה (איור 4A). נוכחותם של קרומי שלפוחית אושרה באמצעות הצבע הפלואורסצנטי הליפופילי FM4-64 (איור 4B). תאי E. coli המבטאים את חלבון הממברנה הפנימית CydB התמזגו עם mNeongreen (ירוק) ו-VNp6-mCherry2 (מגנטה)8 מראים ייצור שלפוחית והחדרת מטען בתאי חיידקים חיים (איור 4C). איור 4A,B נלכד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה, ואילו איור 4C נרכש באמצעות מיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM), בשיטות שתוארו קודם לכן 9,10.

Figure 1
איור 1: סיכום טכנולוגיית VNp מתכנון אסטרטגיית שיבוט ועד לטיהור ואחסון של שלפוחיות חוץ-תאיות . (A) סכמה של חלבון היתוך VNp טיפוסי. VNp במסוף NH2, ואחריו מקשר גמיש ושילוב מתאים של תגי זיקה ופלואורסצנטיות (Tag1, Tag 2, אתר מחשוף פרוטאז [למשל, TEV]) וחלבון מעניין. (B) תרשים סכמטי המסכם את פרוטוקול הביטוי והטיהור של שלפוחיות קרום מלאות חלבון רקומביננטי מ- E. coli. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שלבי ייצור וטיהור של שלפוחיות VNp6-mNg. תרביות של תאי E. coli המכילים את הביטוי VNp-mNeongreen נבנות באור כחול לפני (A) או אחרי (B) ביטוי המושרה על ידי IPTG של חלבון ההיתוך. התאים מ-(B) הוסרו באמצעות צנטריפוגה, והותירו שלפוחיות מלאות VNp-mNeongreen במדיה (C). (D) דגימות שוות ערך מ-A, B ו-C נותחו על ידי SDS-PAGE וצביעת קומאסי. השלפוחיות בודדו למסנן של 0.1 מיקרומטר (E) ולאחר מכן נשטפו לנפח חיץ מתאים (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הליך הרכבת תאים להדמיית בועיות וייצור שלפוחיות. (A-C) שיטת כרית אגרוז (D-F) שיטת PEI להרכבת תאי E. coli על הכיסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תמונות מיקרוסקופיה של שלפוחיות רקומביננטיות VNp. תמונות פליטה ירוקות (A) ואדומות (B) משדות שונים של FM4-64 המסומנות בשלפוחיות המכילות VNp6-mNeongreen המותקנות על פד אגרוז. (C) הדמיה של תאי E. coli המבטאים את חלבון הממברנה הפנימית CydB המאוחה ל-mNeongreen (ירוק) ו-VNp6-mCherry2 (מגנטה) מראה ייצור שלפוחית והחדרת מטען לתאי חיידקים חיים. (A,B) צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה, ואילו (C) נרכש באמצעות מיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM). פסי קנה מידה: (A,B) = 10 מיקרומטר; (C) = 1 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

השיטה המתוייגת בפפטיד אמינו-טרמינלי לייצור חלבונים רקומביננטיים שתוארה לעיל היא תהליך פשוט, אשר מניב באופן עקבי כמויות גדולות של חלבון שניתן לבודד ביעילות ו / או לאחסן במשך חודשים.

חשוב להדגיש את השלבים המרכזיים בפרוטוקול הנדרשים לשימוש מיטבי במערכת זו. ראשית, תג VNp1 חייב להיות ממוקם במסוף N, ואחריו החלבון של עניין וכל תגים מתאימים. חשוב גם להימנע משימוש באנטיביוטיקה המכוונת לשכבת הפפטידוגליקן, כגון אמפיצילין.

במונחים של תנאי גידול, מדיה עשירה (למשל, מדיה LB או TB) ויחס שטח פנים:נפח גבוה נחוצים כדי למקסם את ייצור השלפוחית. הטמפרטורה האופטימלית לייצור שלפוחיות חוץ-תאיות היא 37 מעלות צלזיוס, אך יש לקחת בחשבון גם את התנאים הדרושים בדרך כלל לביטוי החלבון המעניין. לטמפרטורות אינדוקציה נמוכות יותר, יש להשתמש ב-VNp6. באופן מכריע, אינדוקציה של מקדם T7 חייבת להיות מושגת באמצעות לא יותר מ 20 מיקרוגרם / מ"ל (84 מיקרומטר) IPTG ברגע שהתאים מגיעים OD600 של 0.8-1.0. חלבונים המבוטאים באמצעות המערכת מגיעים לייצור שלפוחית מקסימלי תוך 4 שעות או לאחר אינדוקציה של לילה.

למרות הפשטות של פרוטוקול זה, הוא דורש אופטימיזציה. היתוך גרסאות VNp, טמפרטורות ביטוי ופרקי זמן אינדוקציה עשויים להשתנות בהתאם לחלבון המעניין. יתר על כן, יש צורך לייעל את הטיהור ואת הריכוז הבא של שלפוחיות חוץ תאיות מן התקשורת. ההליך הנוכחי אינו ניתן להרחבה ויכול לגזול זמן. אלה המגבלות של מתודולוגיה זו.

לטכנולוגיית VNp יתרונות רבים על פני שיטות מסורתיות2. הוא מאפשר ייצוא שלפוחית של חלבונים מגוונים, כאשר הגודל המקסימלי שבא לידי ביטוי בהצלחה עד כה הוא 175 kDa עבור שלפוחיות שנותרו פנימיות ו 85 kDa עבור אלה המיוצאים. יתר על כן, טכנולוגיה זו יכולה להגדיל באופן משמעותי את התשואה של חלבונים רקומביננטיים עם מגוון תכונות ופעילויות פיזיקליות. ניתן לבודד בועיות מיוצאות המכילות את החלבון המעניין על ידי סינון פשוט מהמדיה שסולקה מראש ולאחר מכן ניתן לאחסן אותן, בתרבית סטרילית או בחיץ, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.

היישומים עבור מערכת זו מגוונים, החל ממדע גילוי ועד ביוטכנולוגיה יישומית ורפואה (למשל, באמצעות ייצור של טיפולים פונקציונליים)3. קלות הייצור, העיבוד במורד הזרם והתשואה הגבוהה הן כולן תכונות אטרקטיביות בתחומים אלה ובמיוחד בתעשייה.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים למשתמשי טוויטר מגוונים שהעלו שאלות לגבי הפרוטוקול המוצג במאמר המתאר את טכנולוגיית VNp. איור 1A נוצר באמצעות סמלים מ-flaticon.com. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קנט ובמימון מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BB/T008/768/1 ו- BB/S005544/1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Melford 69-52-3
Chloramphenicol Acros Organics (Thermofisher Scientific) 56-75-7
E. coli BL21 (DE3) Lab Stock N/A
E. coli DH10β Lab Stock N/A
Filters for microscope Chroma
FM4-64 Molecular Probes (Invitrogen) T-3166 Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM
ImageJ Open Source Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html
Inverted microscope Olympus
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Melford 367-93-1
Kanamycin sulphate Gibco (Thermofisher Scientific) 11815-024
LED light source for micrscope Cairn Research Ltd
Lysogeny Broth (LB) / LB agar Lab Stock N/A 10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar)
Metamorph imaging software Molecular Devices
MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE) Merck VCWP04700
Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES) Merck HPWP04700
Phosphate buffered saline (PBS) Lab Stock N/A
Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions  Addgene https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/
Terrific Broth (TB) Lab Stock N/A 12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eastwood, T. A., et al. High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli. Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).
  2. Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).
  3. Peng, C., et al. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).
  4. Lewis, K., Klibanov, A. M. Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials. Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).
  6. Mulvihill, D. P. Live cell imaging in fission yeast. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).
  7. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  8. Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).
  9. Periz, J., et al. A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles. Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).
  10. Qiu, H., et al. Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends. Science. 352 (6286), 697-701 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 196
ייצור וניתוח אופטימליים של בועיות מלאות חלבון רקומביננטי <em>מאי-קולי</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Streather, B. R., Baker, K.,… More

Streather, B. R., Baker, K., Eastwood, T. A., Mulvihill, D. P. Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli. J. Vis. Exp. (196), e65442, doi:10.3791/65442 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter