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Biology

ई कोलाई से पुनः संयोजक प्रोटीन से भरे पुटिकाओं का अनुकूलित उत्पादन और विश्लेषण

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65442
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Biosciences, University of Kent

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल पुनः संयोजक प्रोटीन के जीवाणु उत्पादन के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है, जिसमें आमतौर पर अघुलनशील या डाइसल्फ़ाइड-बॉन्ड युक्त प्रोटीन शामिल हैं, जो बाह्य झिल्ली-बाध्य पुटिकाओं के अंदर पैक किए जाते हैं। इसमें लागू जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा सहित वैज्ञानिक अनुसंधान के बहुमुखी क्षेत्रों पर लागू होने की क्षमता है।

Abstract

यह अभिनव प्रणाली, एक लघु पेप्टाइड टैग का उपयोग करके, जो ई कोलाई से झिल्ली बद्ध पुटिकाओं में कई पुनः संयोजक प्रोटीन का निर्यात करती है, बैक्टीरिया पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति से जुड़ी समस्याओं की एक श्रृंखला के लिए एक प्रभावी समाधान प्रदान करती है। ये पुनः संयोजक पुटिकाएं एक सूक्ष्म वातावरण के भीतर प्रोटीन को विभाजित करती हैं जो बैक्टीरिया से प्रोटीन युक्त अन्यथा चुनौतीपूर्ण, विषाक्त, अघुलनशील, या डाइसल्फ़ाइड-बॉन्ड के उत्पादन की सुविधा प्रदान करती है। पुटिका-न्यूक्लिटिंग पेप्टाइड टैग की अनुपस्थिति में विशिष्ट जीवाणु अभिव्यक्ति की तुलना में प्रोटीन की उपज में काफी वृद्धि हुई है। पुटिका-पैक किए गए प्रोटीन की रिहाई संस्कृति माध्यम से अलगाव का समर्थन करती है और दीर्घकालिक सक्रिय प्रोटीन भंडारण की अनुमति देती है। यह तकनीक लागू जैव प्रौद्योगिकी से लेकर खोज विज्ञान और चिकित्सा तक अनुप्रयोगों की एक विविध श्रृंखला के लिए सरलीकृत डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए पुटिका-पैक किए गए, कार्यात्मक प्रोटीन की पैदावार में वृद्धि को जन्म देती है। वर्तमान लेख और संबंधित वीडियो में, विधि का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जो पुनः संयोजक प्रोटीन से भरे पुटिका उत्पादन को अधिकतम करने के लिए कार्यप्रणाली में महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डालता है।

Introduction

ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया ई कोलाई औद्योगिक और शैक्षणिक दोनों पैमाने पर पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन के लिए एक आकर्षक प्रणाली है। यह न केवल उच्च घनत्व वाले बैचों में संस्कृति के लिए लागत प्रभावी और सीधा है, बल्कि ई कोलाई1 में कार्यात्मक प्रोटीन की पीढ़ी को बढ़ावा देने के लिए अभिकर्मकों, उपभेदों, उपकरणों और प्रमोटरों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम स्थापित किया गया है। इसके अतिरिक्त, सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीक अब आम तौर पर पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों और जटिल प्रोटीन2 के तह के आवेदन से संबंधित बाधाओं पर काबू पा रही है। संस्कृति मीडिया में पुनः संयोजक प्रोटीन के स्राव को लक्षित करने की क्षमता उपज में सुधार और विनिर्माण लागत को कम करने के लिए आकर्षक है। झिल्ली पुटिकाओं में उपयोगकर्ता-परिभाषित प्रोटीन की नियंत्रित पैकेजिंग लागू जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा उद्योगों के भीतर उत्पादों और प्रौद्योगिकियों के विकास में सहायता करती है। अब तक, ई कोलाई 3 से पुनः संयोजक प्रोटीन को स्रावित करने के लिए व्यापक रूप से लागू तरीकों की कमी रही है।

ईस्टवुड एट अल ने हाल ही में ई कोलाई1 से पुनः संयोजक प्रोटीन युक्त पुटिकाओं के उत्पादन और पृथक करने के लिए एक पेप्टाइड टैगिंग-आधारित विधि विकसित की है। यह पुटिका न्यूक्लिटिंग पेप्टाइड (वीएनपी) बाह्य जीवाणु झिल्ली पुटिकाओं के उत्पादन की अनुमति देता है, जिसमें लक्ष्य प्रोटीन के शुद्धिकरण और भंडारण को सरल बनाने के लिए पसंद के पुनः संयोजक प्रोटीन को लक्षित किया जा सकता है, और सामान्य रूप से फ्लास्क संस्कृतियों को हिलाने से अनुमति देने की तुलना में काफी अधिक पैदावार की अनुमति देता है। फ्लास्क कल्चर के प्रति लीटर पुनः संयोजक प्रोटीन के करीब 3 ग्राम की पैदावार की सूचना दी गई है, जिसमें वीएनपी टैग की कमी वाले समकक्ष प्रोटीन की तुलना में >100 गुना अधिक पैदावार होती है। इन पुनः संयोजक प्रोटीन-समृद्ध पुटिकाओं को संस्कृति मीडिया से तेजी से शुद्ध और केंद्रित किया जा सकता है और भंडारण के लिए एक स्थिर वातावरण प्रदान किया जा सकता है। यह तकनीक ई कोलाई पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन में एक बड़ी सफलता का प्रतिनिधित्व करती है। पुटिकाएं घुलनशील और कार्यात्मक रूप में प्रोटीन युक्त विषाक्त और डाइसल्फ़ाइड-बॉन्ड को विभाजित करती हैं, और दीर्घकालिक भंडारण याप्रत्यक्ष प्रसंस्करण के लिए पुटिका-पैक किए गए, कार्यात्मक प्रोटीन के सरल, कुशल और तेजी से शुद्धिकरण का समर्थन करती हैं।

वर्तमान तकनीकों पर इस तकनीक के प्रमुख लाभ हैं: (1) आकार (1 केडीए से >100 केडीए) और प्रोटीन के प्रकार की एक श्रृंखला के लिए प्रयोज्यता; (2) अंतर-और अंतर-प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड-बॉन्ड गठन को सुविधाजनक बनाना; (3) मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स पर लागू; (4) प्रमोटरों और मानक प्रयोगशाला ई कोलाई उपभेदों की एक श्रृंखला के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है; (5) हिलने वाले फ्लास्क से प्रोटीन की पैदावार की पीढ़ी आमतौर पर केवल किण्वन संस्कृतियों के साथ देखी जाती है; प्रोटीन को झिल्ली बद्ध पुटिकाओं में निर्यात और पैक किया जाता है जो (6) सक्रिय घुलनशील प्रोटीन के भंडारण के लिए एक स्थिर वातावरण प्रदान करते हैं; और (7) डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण और प्रोटीन शुद्धिकरण को सरल बनाता है। यह सरल और लागत प्रभावी पुनः संयोजक प्रोटीन उपकरण जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा उद्योगों के साथ-साथ खोज विज्ञान पर सकारात्मक प्रभाव डालने की संभावना है।

यहां, कई वर्षों में विकसित एक विस्तृत प्रोटोकॉल, वीएनपी तकनीक के साथ बैक्टीरिया से पुनः संयोजक प्रोटीन से भरे पुटिकाओं का उत्पादन करने के लिए इष्टतम स्थितियों का वर्णन करता है। व्यवहार में इस प्रणाली की उदाहरण छवियां दिखाई जाती हैं, जिसमें एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त किया जाता है, जिससे उत्पादन, शुद्धिकरण और एकाग्रता के विभिन्न चरणों के दौरान पुटिकाओं की उपस्थिति की कल्पना की जा सकती है। अंत में, बैक्टीरिया से वीएनपी संलयन युक्त पुटिकाओं के उत्पादन को मान्य करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग करने के तरीके पर मार्गदर्शन प्रदान किया जाता है।

Protocol

किए गए जीवाणु कार्य स्थानीय, राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय जैव सुरक्षा नियंत्रण नियमों का पालन करते हैं जो प्रत्येक तनाव के विशेष जैव सुरक्षा खतरे के स्तर के अनुरूप हैं।

1. विभिन्न वीएनपी का चयन

  1. VNP अनुक्रमों की पहचान करें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, तीन वीएनपी अनुक्रमों की पहचान की गई है1 जिसके परिणामस्वरूप आज तक जांच किए गए प्रोटीन की अधिकतम उपज और वेसिकुलर निर्यात होता है: वीएनपी 2, वीएनपी 6, और वीएनपी 15। यह वर्तमान में स्पष्ट नहीं है कि क्यों कुछ वीएनपी वेरिएंट दूसरों की तुलना में कुछ प्रोटीन के साथ अधिक कुशलता से प्रदर्शन करते हैं; इसलिए, यह अनुशंसा की जाती है कि संलयन प्रत्येक वीएनपी संस्करण (यानी, वीएनपी 2, 6, या 15) के साथ रुचि के एक नए प्रोटीन के बीच उत्पन्न होते हैं।
    VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA
    AGKTKEGVL
    VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVVGAVEKTQGVTA
    AEKTKEGVM
    VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVVGAVE
    प्लास्मिड जो विभिन्न वीएनपी एमिनो टर्मिनल संलयन के साथ रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देते हैं, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कराए गए हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. इन संरचनाओं में से एक में वीएनपी के लिए सीडीएनए एन्कोडिंग के 3 'अंत में रुचि के जीन को सम्मिलित करने के लिए एक क्लोनिंग रणनीति तैयार करें, या रुचि के प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग के पहले एटीजी कोडन के संश्लेषित वीएनपी सीडीएनए को एकीकृत करके मौजूदा प्लास्मिड को अनुकूलित करें। 1 में वर्णित विधियों का उपयोग करें।
  3. विषाक्त प्रोटीन के लिए, एक दमनकारी अभिव्यक्ति प्रमोटर या न्यूनतम अनियंत्रित अभिव्यक्ति शोर के साथ एक प्रोमोटर के साथ एक वेक्टर का उपयोग करें।
  4. संलयन प्रोटीन के अमीनो-टर्मिनल पर वीएनपी अनुक्रम टैग क्लोन करें। सुनिश्चित करें कि आत्मीयता टैग, प्रोटीज दरार अनुक्रम, आदि, और रुचि के प्रोटीन वीएनपी टैग के कार्बोक्सिल पक्ष पर स्थित हैं। वीएनपी को एक लचीले लिंकर क्षेत्र के साथ डाउनस्ट्रीम पेप्टाइड से अलग करने की सिफारिश की जाती है, जैसे कि -जी-जी-एस-जी-पॉलीपेप्टाइड अनुक्रम के दो या तीन दोहराव (चित्रा 1)।
    नोट: एंटीबायोटिक चयन के साथ प्लास्मिड का उपयोग करें जो पेप्टिडोग्लाइकन को लक्षित नहीं करता है, जो कोशिका की सतह को कमजोर करता है और पुटिका उपज को कम करता है। कनामाइसिन और क्लोरैम्फेनिकॉल (सामग्री की तालिका देखें) इस अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले पसंदीदा एंटीबायोटिक्स थे।

2. बैक्टीरियल सेल कल्चर और प्रोटीन इंडक्शन

नोट: इस प्रोटोकॉल में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले जीवाणु उपभेद या तो एस्चेरिचिया कोलाई बीएल 21 (डीई 3) या डब्ल्यू 3110 हैं। ई कोलाई कोशिकाओं को लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) (10 ग्राम / एल ट्रिप्टोन; 10 ग्राम / एल एनएसीएल; 5 ग्राम / एल खमीर अर्क) या भयानक शोरबा (टीबी) (12 ग्राम / एल ट्रिप्टोन; 24 ग्राम / एल खमीर अर्क; 4 एमएल / एल 10% ग्लिसरॉल; 17 एमएम केएच 2 पीओ 4; 72 एमएम के2एचपीओ4, लवण आटोक्लेव अलग से) मीडिया में संवर्धित किया जाता है (सामग्री की तालिका देखें)। प्रोटीन प्रेरण और बाद के अलगाव और शुद्धिकरण प्रक्रिया के प्रत्येक चरण को दिखाने वाले उदाहरण चित्र चित्र 2 में दिखाए गए हैं।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर ताजा जीवाणु परिवर्तनों से संतृप्ति तक 5 एमएल एलबी स्टार्टर्स और 500 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क में 25 मिलीलीटर टीबी को टीका लगाने के लिए उनका उपयोग करें, सभी उचित एंटीबायोटिक चयन के साथ।
  2. सतह क्षेत्र: मात्रा अनुपात इस प्रणाली को अनुकूलित करने में एक महत्वपूर्ण कारक है। जितना संभव हो उतना बड़ा वॉल्यूम फ्लास्क का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, 1 एल कल्चर युक्त 5 एल फ्लास्क; अनुकूलन रन के लिए, 500 एमएल फ्लास्क में 25 एमएल मीडिया का उपयोग करें)।
  3. 200 आरपीएम (≥25 मिमी ऑर्बिटल थ्रो) पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में बड़े हिलाने वाले फ्लास्क कल्चर को इनक्यूबेट करें जब तक कि 0.8-1.0 के 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व मान (ओडी600) तक नहीं पहुंच जाता।
    नोट: वेसिकुलेशन इष्टतम है जब कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता है। हालांकि, कुछ पुनः संयोजक प्रोटीन को कम तापमान में अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। यदि यह रुचि के प्रोटीन के लिए मामला है, तो वीएनपी 6 टैग का उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि यह 25 डिग्री सेल्सियस तक के तापमान पर उच्च उपज पुटिका निर्यात की अनुमति देता है।
  4. टी 7 प्रमोटर से पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, आइसोप्रोपिल β-डी-1-थियोगैलेक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी) को 20 μg / mL (84 μM) तक की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति का प्रेरण पुटिकाओं के उत्पादन के लिए लेट-लॉग चरण (यानी, 0.8-1.0 के विशिष्ट ओडी600 ) में होना चाहिए।
    नोट: प्रेरण अवधि की लंबाई प्रोटीन के बीच भिन्न हो सकती है, कुछ 4 घंटे पर अधिकतम उत्पादन तक पहुंचते हैं और अन्य रात भर (18 घंटे) तक पहुंचते हैं। आज तक, रातोंरात संस्कृतियों में अधिकतम पुटिका निर्यात प्राप्त किया गया है।

3. पुनः संयोजक पुटिका अलगाव

  1. 20 मिनट के लिए 3,000 x g (4 °C) पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें।
  2. लंबे समय तक भंडारण के लिए पुटिका युक्त मीडिया को निष्फल करने के लिए, साफ़ संस्कृति मीडिया को बाँझ और डिटर्जेंट-मुक्त 0.45 μm पॉलीथेरसल्फोन (PES) फ़िल्टर के माध्यम से पारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: पुटिका युक्त छानना से व्यवहार्य कोशिकाओं के बहिष्करण का परीक्षण करने के लिए, एलबी एगर पर प्लेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  3. पुटिकाओं को एक छोटी मात्रा में केंद्रित करने के लिए, बाँझ पुटिका युक्त मीडिया को बाँझ और डिटर्जेंट-मुक्त 0.1 μm मिश्रित सेल्यूलोज एस्टर (MCE) फ़िल्टर के माध्यम से पारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. झिल्ली से पुटिकाओं को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए सेल स्क्रैपर या प्लास्टिक स्प्रेडर का उपयोग करके 0.5-1 एमएल बाँझ पीबीएस के साथ झिल्ली को धीरे से धोएं। एक ताजा माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: शुद्ध पुटिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ मीडिया या फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में संग्रहीत किया जा सकता है। इन पुटिकाओं में 6 महीने तक संग्रहीत पुनः संयोजक प्रोटीन के उदाहरण हैं, इस तरह, एंजाइमेटिक गतिविधि में कोई नुकसान नहीं है।

4. पृथक पुटिकाओं से घुलनशील प्रोटीन रिलीज

  1. एक बार प्रोटीन युक्त पुटिकाओं को बाँझ मीडिया / बफर में अलग कर दिया जाता है, तो वेसिकुलर लिपिड झिल्ली को उपकरण के लिए एक उपयुक्त अनुसूची का उपयोग करके सोनिकेशन के अधीन करें (उदाहरण के लिए, 6x20 s ऑन और ऑफ चक्र) और पुटिका मलबे को हटाने के लिए 20 मिनट के लिए 39,000 x g (4 डिग्री सेल्सियस) पर सेंट्रीफ्यूज।
    नोट: आसमाटिक शॉक या डिटर्जेंट उपचार का उपयोग पुटिकाओं को तोड़ने के विकल्प के रूप में किया जा सकता है, लेकिन प्रोटीन कार्यक्षमता और / या डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग पर प्रभाव पर विचार किया जाना चाहिए।
  2. यदि वीएनपी संलयन साइटोसोलिक रहता है और मीडिया में जारी नहीं होता है, तो मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रोटीन को अलग करें (उदाहरण के लिए, उचित निष्कर्षण बफर (20 एमएम ट्रिस, 500 एमएम एनएसीएल) के 5 एमएल में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें, सोनिकेट करें, और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेल मलबे को हटा दें)।

5. प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण

  1. तीन प्रतियों के जेल डेंसिटोमेट्री विश्लेषण द्वारा प्रोटीन की एकाग्रता निर्धारित करें1. कोमासी-दाग वाले सोडियम डोडेसिल-सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) जैल पर गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) लोडिंग मानकों के साथ चलाएं। उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके जैल को स्कैन और विश्लेषण करें (उदाहरण के लिए, छवि जे; सामग्री की तालिका देखें)।

6. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पुटिका गठन और पृथक पुटिकाओं का विज़ुअलाइज़ेशन

नोट: यदि कोशिकाओं में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले वीएनपी फ्यूजन या झिल्ली मार्कर होते हैं, तो पुटिका गठन का पालन करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट लिपिड रंगों का उपयोग उत्पादन और शुद्धिकरण की पुष्टि करने के लिए पुटिकाओं की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है।

  1. सेल बढ़ रहा है।
    1. कवरस्लिप पर चढ़ने से पहले कई घंटों के लिए वीएनपी संलयन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें।
    2. Agarose pad विधि (चित्रा 3A-C): कोशिकाओं को एक पतली (<1 मिमी), गोलाकार एलबी-अगारोस (2%) पैड पर पिपेट करें जिसे एक साफ ग्लास स्लाइड पर बनाने और सेट करने की अनुमति दी गई है। कोशिकाओं को व्यवस्थित और संतुलित करने की अनुमति दें और पैड और कोशिकाओं पर 50 मिमी x 25 मिमी कवरस्लिप रखें। स्पेसर और चिपकने वाला टेप के साथ कवरस्लिप को रखें।
    3. पॉलीथिलीनइमाइन (पीईआई) विधि (चित्रा 3 डी-एफ): एक पिपेट टिप के साथ कवरस्लिप पर 0.05% पीईआई (डीएच2ओ में) के 20 μL फैलाएं और सूखने की अनुमति दिए बिना कांच से बांधने के लिए 3-5 मिनट के लिए छोड़ दें। सेल कल्चर के 50 μL जोड़ें और यह सुनिश्चित करने के लिए 5-10 मिनट के लिए छोड़ दें कि बैक्टीरिया पीईआई-लेपित सतह4 से जुड़े हैं। स्लाइड पर रखने से पहले कवरस्लिप को 100 μL मीडिया से धो लें और इसे स्पेसर और चिपकने वाले टेप के साथ रखें।
  2. बढ़ते पुटिकाएं
    1. पिपेट ने पुटिकाओं को एक पतली (<1 मिमी), गोलाकार एलबी-अगारोस (2%) पैड पर शुद्ध किया जिसे एक साफ ग्लास स्लाइड पर बनाने और सेट करने की अनुमति दी गई है। एक बार तरल सूख जाने के बाद, पैड और पुटिकाओं पर 50 मिमी x 25 मिमी कवरस्लिप रखें। स्पेसर और चिपकने वाला टेप के साथ कवरस्लिप को रखें।
    2. फ्लोरोसेंट लिपिड डाई एफएम 4-64 झिल्ली5 को दाग ने में सक्षम है, और इसलिए इसका उपयोग पुटिकाओं की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। 2 μM की अंतिम सांद्रता पर शुद्ध पुटिकाओं में FM4-64 ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें (डाइमिथाइल सल्फोक्साइड [DMSO] में घुलने वाले 2 mM स्टॉक से) और 10 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद छवि। यह विशेष रूप से गैर-फ्लोरोसेंटली लेबल कार्गो वालेपुटिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोगी है।
    3. देखे गए कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उसी मीडिया के साथ कवरलिप्स को कुल्ला करें।
      नोट: कुछ जटिल मीडिया (जैसे, टीबी) ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अतिरिक्त पृष्ठभूमि संकेत हो सकता है।
  3. इमेजिंग पुटिकाएं;
    नोट: वीएनपी पुनः संयोजक पुटिकाओं की उदाहरण माइक्रोस्कोपी छवियां चित्रा 4 में देखी जा सकती हैं।
    1. तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके स्लाइड को उल्टे माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) पर माउंट करें और नमूने को व्यवस्थित करने और तापमान को संतुलित करने की अनुमति देने के लिए 2-3 मिनट के लिए छोड़ दें।
      नोट: फोटोटॉक्सिसिटी और एनारोबिक तनाव के प्रभाव को कम करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए सभी लाइव सेल इमेजिंग को कवरलिप्स पर कोशिकाओं को माउंट करने के 30 मिनट के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। इस कारण से, एकल-विमान छवियों को जेड-स्टैक के लिए पसंद किया जाता है।
    2. उपयुक्त प्रकाश स्रोतों (जैसे, प्रकाश उत्सर्जक डायोड [एलईडी] या हलोजन बल्ब; सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करेंऔर फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एस)/डाई (एस) का उपयोग करने के लिए फ़िल्टर संयोजन 6.
    3. माइक्रोबियल कोशिकाओं और पुटिकाओं की इमेजिंग के लिए एक उच्च आवर्धन (यानी, 100x या 150x) और उच्च संख्यात्मक एपर्चर (यानी, NA ≥1.4) लेंस का उपयोग करें।
    4. कोशिकाओं और / या पुटिकाओं से प्रतिदीप्ति संकेतों की कल्पना करने के लिए आवश्यक न्यूनतम प्रकाश तीव्रता निर्धारित करें। इसके लिए एक्सपोजर के कुछ समायोजन और उपयोग में कैमरे के लिए सेटिंग्स हासिल करने की आवश्यकता हो सकती है।
      नोट: वर्तमान पूरक धातु-ऑक्साइड अर्धचालक (सीएमओएस) कैमरों से विशिष्ट एक्सपोजर समय इमेजिंग सिस्टम के आधार पर 50-200 एमएस के बीच भिन्न होता है।
    5. एकल फ्रेम छवियों के लिए, हार्डवेयर-निर्भर यादृच्छिक पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए तीन-छवि औसत का उपयोग करें।
    6. टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए, अलग-अलग फ्रेम के बीच 3-5 मिनट की अनुमति दें।
      नोट: माइक्रोस्कोप सेटअप के आधार पर, फोकस को लंबे समय तक चलने वाले प्रयोगों में रुक-रुक कर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

Representative Results

BL21 DE3 E. coli जिसमें VNP6-mNeongreen अभिव्यक्ति निर्माण होता है, को लेट-लॉग चरण (चित्रा 2A) में विकसित किया गया था। VNp6-mNeongreen अभिव्यक्ति को संस्कृति (20 μg / mL या 84 μM अंतिम एकाग्रता) में IPTG के अतिरिक्त से प्रेरित किया गया था, जिसे बाद में जोरदार झटकों (200 rpm, ≥25 मिमी कक्षीय थ्रो) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने के लिए छोड़ दिया गया था। अगली सुबह, संस्कृति ने एमनियोनग्रीन फ्लोरेसेंस7 (चित्रा 2 बी) प्रदर्शित किया, जो सेंट्रीफ्यूजेशन (चित्रा 2 सी) द्वारा जीवाणु कोशिकाओं को हटाने के बाद मीडिया में दिखाई दिया। संस्कृति और स्पष्ट संस्कृति मीडिया के भीतर वीएनपी-एमनियोनग्रीन की उपस्थिति की पुष्टि एसडीएस-पेज (चित्रा 2 डी) द्वारा की गई थी। एमनियोनग्रीन युक्त पुटिकाओं को 0.1 μm MCE फ़िल्टर (चित्रा 2E) पर अलग किया गया और पीबीएस (चित्रा 2 एफ) में फिर से निलंबित कर दिया गया। शुद्ध पुटिकाओं को बाद में एक अगारोस पैड (चित्रा 3 ए-सी) पर रखा गया और वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4 ए) का उपयोग करके चित्रित किया गया। लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट डाई एफएम 4-64 (चित्रा 4 बी) का उपयोग करके पुटिका झिल्ली की उपस्थिति की पुष्टि की गई थी। ई कोलाई कोशिकाएं आंतरिक झिल्ली प्रोटीन साइडबी को एमनियोनग्रीन (हरा) और वीएनपी 6-एमचेरी 2 (मैजेंटा) 8 से जोड़ती हैं, जो जीवित जीवाणु कोशिकाओं में पुटिका उत्पादन और कार्गो सम्मिलन दिखाती हैं (चित्रा 4 सी)। चित्रा 4 ए, बी को वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया गया था, जबकि चित्रा 4 सी को संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था, जो पहलेवर्णित विधियों का उपयोग करके 9,10 था।

Figure 1
चित्रा 1: क्लोनिंग रणनीति तैयार करने से लेकर बाह्य पुटिकाओं के शुद्धिकरण और भंडारण तक वीएनपी तकनीक का सारांश। (ए) एक विशिष्ट वीएनपी संलयन प्रोटीन का योजनाबद्ध। एनएच 2 टर्मिनस पर वीएनपी, इसके बाद एक लचीला लिंकर और आत्मीयता और फ्लोरेसेंस टैग (टैग 1, टैग 2, प्रोटीज क्लीवेज साइट [जैसे, टीईवी]) और रुचि के प्रोटीन का एक उपयुक्त संयोजन है। (बी) ई कोलाई से पुनः संयोजक प्रोटीन से भरे झिल्ली पुटिकाओं की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के लिए प्रोटोकॉल को सारांशित करने वाला योजनाबद्ध आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वीएनपी 6-एमएनजी पुटिकाओं के उत्पादन और शुद्धिकरण के चरण। ई कोलाई कोशिकाओं की संस्कृतियां जिनमें वीएनपी-एमनियोनग्रीन अभिव्यक्ति होती है, वे नीली रोशनी में संलयन प्रोटीन की आईपीटीजी-प्रेरित अभिव्यक्ति से पहले (ए) या (बी) आईपीटीजी-प्रेरित अभिव्यक्ति के बाद निर्माण करती हैं। (बी) से कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिया गया था, जिससे मीडिया (सी) में वीएनपी-एमनियोनग्रीन से भरे पुटिकाएं रह गईं। (डी) ए, बी और सी के समकक्ष नमूनों का विश्लेषण एसडीएस-पेज और कूमासी स्टेनिंग द्वारा किया गया था। पुटिकाओं को 0.1 μm फ़िल्टर (E) पर अलग किया गया और बाद में बफर (F) की उचित मात्रा में धोया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इमेजिंग पुटिकाओं और पुटिका उत्पादन के लिए सेल माउंटिंग प्रक्रिया। (ए-सी) अगारोस पैड विधि और (डी-एफ) ई कोलाई कोशिकाओं को कवरस्लिप पर माउंट करने के लिए पीईआई विधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: वीएनपी पुनः संयोजक पुटिकाओं की माइक्रोस्कोपी छवियां। एफएम 4-64 के विभिन्न क्षेत्रों से हरे (ए) और लाल (बी) उत्सर्जन चित्र एक अगारोस पैड पर लगाए गए वीएनपी 6-एमनियोनग्रीन युक्त पुटिकाओं को लेबल करते हैं। (सी) इमेजिंग ई कोलाई कोशिकाएं आंतरिक झिल्ली प्रोटीन साइडबी को एमनियोनग्रीन (हरा) और वीएनपी 6-एमचेरी 2 (मैजेंटा) से जोड़कर व्यक्त करती हैं, जो जीवित जीवाणु कोशिकाओं में पुटिका उत्पादन और कार्गो सम्मिलन को दर्शाती हैं। (ए, बी) को वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था, जबकि (सी) को संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था। स्केल सलाखों: (ए, बी) = 10 μm; (C) = 1 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

ऊपर वर्णित पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एमिनो-टर्मिनल पेप्टाइड-टैग की गई विधि एक सरल प्रक्रिया है, जो लगातार बड़ी मात्रा में प्रोटीन का उत्पादन करती है जिसे महीनों तक कुशलतापूर्वक अलग और / या संग्रहीत किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में प्रमुख चरणों को उजागर करना महत्वपूर्ण है जो इस प्रणाली के इष्टतम उपयोग के लिए आवश्यक हैं। सबसे पहले, वीएनपी टैग1 एन-टर्मिनस पर स्थित होना चाहिए, इसके बाद प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट और कोई उपयुक्त टैग। एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करने से बचना भी महत्वपूर्ण है जो पेप्टिडोग्लाइकन परत को लक्षित करते हैं, जैसे कि एम्पीसिलीन।

विकास की स्थिति के संदर्भ में, समृद्ध मीडिया (जैसे, एलबी या टीबी मीडिया) और एक उच्च सतह क्षेत्र: मात्रा अनुपात पुटिका उत्पादन को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है। बाह्य पुटिकाओं के उत्पादन के लिए इष्टतम तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है, लेकिन आमतौर पर रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक स्थितियों पर भी विचार किया जाना चाहिए। कम प्रेरण तापमान के लिए, VNp6 का उपयोग किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, टी 7 प्रमोटर का प्रेरण 20 μg / mL (84 μM) IPTG से अधिक का उपयोग करके प्राप्त नहीं किया जाना चाहिए जब कोशिकाएं 0.8-1.0 के OD600 तक पहुंच जाती हैं। सिस्टम का उपयोग करके व्यक्त प्रोटीन 4 घंटे या रात भर प्रेरण के बाद अधिकतम पुटिका उत्पादन तक पहुंचते हैं।

इस प्रोटोकॉल की सादगी के बावजूद, इसे अनुकूलन की आवश्यकता है। वीएनपी वेरिएंट संलयन, अभिव्यक्ति तापमान और प्रेरण समय अवधि रुचि के प्रोटीन के आधार पर भिन्न हो सकती है। इसके अलावा, मीडिया से बाह्य पुटिकाओं के शुद्धिकरण और बाद की एकाग्रता को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। वर्तमान प्रक्रिया स्केलेबल नहीं है और समय लेने वाली हो सकती है। ये इस पद्धति की सीमाएँ हैं।

वीएनपी तकनीक के पारंपरिक तरीकों पर कई फायदेहैं। यह विविध प्रोटीनों के वेसिकुलर निर्यात की अनुमति देता है, जिसमें आज तक सफलतापूर्वक व्यक्त किया गया अधिकतम आकार आंतरिक रहने वाले पुटिकाओं के लिए 175 केडीए और निर्यात किए जाने वालों के लिए 85 केडीए है। इसके अलावा, यह तकनीक भौतिक गुणों और गतिविधियों की एक श्रृंखला के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन की उपज में काफी वृद्धि कर सकती है। रुचि के प्रोटीन वाले निर्यात किए गए पुटिकाओं को पूर्व-साफ़ मीडिया से सरल निस्पंदन द्वारा अलग किया जा सकता है और बाद में कई महीनों तक बाँझ संस्कृति मीडिया या बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

इस प्रणाली के लिए अनुप्रयोग विविध हैं, खोज विज्ञान से लागू जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा (उदाहरण के लिए, कार्यात्मक चिकित्सीय के उत्पादन के माध्यम से)3। उत्पादन में आसानी, डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण और उच्च उपज इन क्षेत्रों में और विशेष रूप से उद्योग में सभी आकर्षक गुण हैं।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों या हितों के अन्य टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक विभिन्न ट्विटर उपयोगकर्ताओं को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने वीएनपी तकनीक का वर्णन करने वाले पेपर में प्रस्तुत प्रोटोकॉल के बारे में सवाल उठाए। चित्रा 1 ए flaticon.com से आइकन का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। इस काम को केंट विश्वविद्यालय और जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबी / टी 008/768/1 और बीबी / S005544 / 1) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Melford 69-52-3
Chloramphenicol Acros Organics (Thermofisher Scientific) 56-75-7
E. coli BL21 (DE3) Lab Stock N/A
E. coli DH10β Lab Stock N/A
Filters for microscope Chroma
FM4-64 Molecular Probes (Invitrogen) T-3166 Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM
ImageJ Open Source Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html
Inverted microscope Olympus
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Melford 367-93-1
Kanamycin sulphate Gibco (Thermofisher Scientific) 11815-024
LED light source for micrscope Cairn Research Ltd
Lysogeny Broth (LB) / LB agar Lab Stock N/A 10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar)
Metamorph imaging software Molecular Devices
MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE) Merck VCWP04700
Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES) Merck HPWP04700
Phosphate buffered saline (PBS) Lab Stock N/A
Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions  Addgene https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/
Terrific Broth (TB) Lab Stock N/A 12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4

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References

  1. Eastwood, T. A., et al. High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli. Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).
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  3. Peng, C., et al. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).
  4. Lewis, K., Klibanov, A. M. Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials. Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).
  6. Mulvihill, D. P. Live cell imaging in fission yeast. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).
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  10. Qiu, H., et al. Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends. Science. 352 (6286), 697-701 (2016).

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जीव विज्ञान अंक 196
<em>ई कोलाई</em> से पुनः संयोजक प्रोटीन से भरे पुटिकाओं का अनुकूलित उत्पादन और विश्लेषण
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Streather, B. R., Baker, K.,… More

Streather, B. R., Baker, K., Eastwood, T. A., Mulvihill, D. P. Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli. J. Vis. Exp. (196), e65442, doi:10.3791/65442 (2023).

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