Optimalisert produksjon og analyse av rekombinante proteinfylte vesikler fra E. coli

Summary

Denne protokollen beskriver en detaljert metode for bakteriell produksjon av rekombinante proteiner, inkludert typisk uoppløselige eller disulfidbindende proteiner, pakket inn i ekstracellulære membranbundne vesikler. Dette har potensial til å bli brukt på allsidige områder av vitenskapelig forskning, inkludert anvendt bioteknologi og medisin.

Abstract

Dette innovative systemet, ved hjelp av en kort peptidkode, som eksporterer flere rekombinante proteiner i membranbundne vesikler fra E. coli, gir en effektiv løsning på en rekke problemer forbundet med bakteriell rekombinant proteinuttrykk. Disse rekombinante vesiklene fordeler proteiner i et mikromiljø som letter produksjonen av ellers utfordrende, giftige, uoppløselige eller disulfidbindingsholdige proteiner fra bakterier. Proteinutbyttet økes betydelig sammenlignet med typisk bakterieuttrykk i fravær av vesikkelnukleerende peptidmerke. Frigivelsen av vesikkelpakkede proteiner støtter isolering fra kulturmediet og tillater langsiktig aktiv proteinlagring. Denne teknologien gir opphav til økt utbytte av vesikkelpakkede, funksjonelle proteiner for forenklet nedstrømsbehandling for et mangfoldig utvalg av applikasjoner fra anvendt bioteknologi til oppdagelsesvitenskap og medisin. I denne artikkelen og tilhørende video er det gitt en detaljert protokoll for metoden, som fremhever viktige trinn i metodikken for å maksimere rekombinant proteinfylt vesikelproduksjon.

Introduction

Den gramnegative bakterien E. coli er et attraktivt system for rekombinant proteinproduksjon på både industriell og akademisk skala. Det er ikke bare kostnadseffektivt og greit å dyrke i partier til høye tettheter, men et bredt spekter av reagenser, stammer, verktøy og promotorer er etablert for å fremme genereringen av funksjonelle proteiner i E. coli¹. I tillegg overvinner syntetiske biologiske teknikker nå hindringer som vanligvis er relatert til anvendelse av posttranslasjonelle modifikasjoner og folding av komplekse proteiner². Evnen til å målrette sekresjonen av rekombinante proteiner i kulturmedier er attraktiv for å forbedre utbyttet og redusere produksjonskostnadene. Kontrollert pakking av brukerdefinerte proteiner i membranvesikler hjelper utviklingen av produkter og teknologier innen anvendt bioteknologi og medisinsk industri. Hittil har det vært mangel på allment anvendelige metoder for å utskille rekombinante proteiner fra E. coli ³.

Eastwood et al. har nylig utviklet en peptidmerkingsbasert metode for å produsere og isolere rekombinante proteinholdige vesikler fra E. coli¹. Dette vesikkelkjernende peptidet (VNp) tillater produksjon av ekstracellulære bakterielle membranvesikler, i hvilke det valgte rekombinante proteinet kan målrettes for å forenkle rensing og lagring av målproteinet, og tillater betydelig høyere utbytter enn normalt tillatt fra ristende kolbekulturer. Utbytter på nær 3 g rekombinant protein per liter kolbekultur er rapportert, med >100x høyere utbytter enn de som oppnås med ekvivalente proteiner som mangler VNp-taggen. Disse rekombinante proteinberikede vesiklene kan raskt renses og konsentreres fra kulturmediene og gir et stabilt miljø for lagring. Denne teknologien representerer et stort gjennombrudd i E. coli rekombinant proteinproduksjon. Vesiklene deler giftige og disulfidbindingsholdige proteiner i en løselig og funksjonell form, og støtter enkel, effektiv og rask rensing av vesikkelpakkede, funksjonelle proteiner for langtidslagring eller direkte behandling¹.

De største fordelene denne teknologien presenterer i forhold til dagens teknikker er: (1) anvendeligheten til en rekke størrelser (1 kDa til >100 kDa) og typer protein; (2) legge til rette for dannelse av inter- og intraproteindisulfidbindinger; (3) gjelder multiproteinkomplekser; (4) kan brukes med en rekke promotorer og standard laboratorie E. coli-stammer ; (5) generering av utbytter av proteiner fra ristende kolber som normalt bare ses med gjæringskulturer; Proteiner eksporteres og pakkes i membranbundne vesikler som (6) gir et stabilt miljø for lagring av det aktive løselige proteinet; og (7) forenkler nedstrømsbehandling og proteinrensing. Dette enkle og kostnadseffektive rekombinante proteinverktøyet vil sannsynligvis ha en positiv innvirkning på bioteknologi og medisinsk industri, samt oppdagelsesvitenskap.

Her beskriver en detaljert protokoll, utviklet over flere år, de optimale forholdene for å produsere rekombinante proteinfylte vesikler fra bakterier med VNp-teknologien. Eksempler på bilder av dette systemet i praksis vises, med et fluorescerende protein som uttrykkes, slik at tilstedeværelsen av vesikler i forskjellige stadier av produksjon, rensing og konsentrasjon kan visualiseres. Til slutt gis veiledning om hvordan man bruker levende celleavbildning for å validere produksjonen av VNp-fusjonsholdige vesikler fra bakteriene.

Protocol

Bakteriearbeidet som utføres følger de lokale, nasjonale og internasjonale biosikkerhetsbegrensningsforskriftene som passer til det spesielle biosikkerhetsfarenivået for hver stamme.

1. Valg av forskjellige VNps

1. Identifiser VNp-sekvensene.
   MERK: For denne studien har tre VNp-sekvenser blitt identifisert¹ som resulterer i maksimalt utbytte og vesikulær eksport av proteinene som er undersøkt til dags dato: VNp2, VNp6 og VNp15. Det er foreløpig ikke klart hvorfor visse VNp-varianter utfører mer effektivt med noen proteiner enn andre; Derfor anbefales det at fusjoner genereres mellom et nytt protein av interesse med hver VNp-variant (dvs. VNp2, 6 eller 15).
   VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA
   AGKTKEGVL
   VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA
   AEKTKEGVM
   VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE
   Plasmider som tillater ekspresjon av proteinet av interesse med forskjellige VNp aminoterminalfusjoner har blitt gjort tilgjengelig kommersielt (se materialtabell).
2. Design en kloningsstrategi for å sette inn genet av interesse ved 3'-enden av cDNA-kodingen for VNp i en av disse konstruksjonene, eller tilpasse et eksisterende plasmid ved å integrere syntetisert VNp cDNA oppstrøms for det første ATG-kodonet til genet som koder for proteinet av interesse. Bruk metodene som beskrevet i¹.
3. For giftige proteiner, bruk en vektor med en repressibel ekspresjonspromotor eller en promotor med minimal uindusert uttrykksstøy.
4. Klon VNp-sekvenskoden ved aminoterminalen til fusjonsproteinet. Forsikre deg om at affinitetsmerkene, proteasespaltningssekvensene, etc., og proteinet av interesse er plassert på karboksylsiden av VNp-taggen. Det anbefales å skille VNp fra nedstrøms peptid med en fleksibel linkerregion, slik som to eller tre repetisjoner av en -G-G-S-G- polypeptidsekvens (figur 1).
   MERK: Bruk plasmider med et antibiotisk utvalg som ikke retter seg mot peptidoglykan, noe som svekker celleoverflaten og reduserer vesikkelutbyttet. Kanamycin og kloramfenikol (se materialtabell) var de foretrukne antibiotika som ble brukt i denne studien.

2. Bakteriell cellekultur og proteininduksjon

MERK: Bakteriestammer som vanligvis brukes i denne protokollen er enten Escherichia coli BL21 (DE3) eller W3110. E. coli-celler dyrkes i lysogen buljong (LB) (10 g / L trypton, 10 g / L NaCl, 5 g / L gjærekstrakt) eller fantastisk buljong (TB) (12 g / L trypton, 24 g / L gjærekstrakt, 4 ml / l 10% glyserol, 17 mM KH 2 PO 4, 72 mM K₂HPO₄, salter autoklavert separat) (se materialtabellen). Eksempelbilder som viser hvert trinn i proteininduksjonen og påfølgende isolasjons- og renseprosess er vist i figur 2.

1. Dyrkning av 5 ml LB starter fra friske bakterietransformasjoner ved 37 °C til metning og bruker dem til å inokulere 25 ml TB i en 500 ml konisk kolbe, alle med passende antibiotikavalg.
2. Overflaten: volumforhold er en viktig faktor for å optimalisere dette systemet. Bruk en så stor volumkolbe som mulig (f.eks. 5 l kolbe inneholdende 1 liter kultur; for optimaliseringskjøringer, bruk 25 ml media i en 500 ml kolbe).
3. Inkuber de større ristende kolbekulturene i en inkubator ved 37 °C med risting ved 200 rpm (≥25 mm orbitalkast) til en optisk tetthetsverdi på 600 nm (OD₆₀₀) på 0,8-1,0 er nådd.
   MERK: Vesikulasjon er optimal når cellene dyrkes ved 37 °C. Imidlertid krever noen rekombinante proteiner uttrykk i lavere temperaturer. Hvis dette er tilfelle for proteinet av interesse, må VNp6-taggen brukes, da dette tillater eksport av vesikkel med høy avkastning ved temperaturer ned til 25 ° C.
4. For å indusere rekombinant proteinuttrykk fra T7-promotoren, tilsett isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) til en endelig konsentrasjon på opptil 20 μg / ml (84 μM) (se materialtabellen). Induksjonen av rekombinant proteinekspresjon må skje i senloggfasen (dvs. typisk OD₆₀₀ på 0,8-1,0) for produksjon av vesikler.
   MERK: Lengden på induksjonsperioden kan variere mellom proteiner, med noen som når maksimal produksjon ved 4 timer og andre over natten (18 timer). Hittil har maksimal vesikeleksport blitt oppnådd i overnattkulturer.

3. Rekombinant vesikkelisolasjon

1. Pellet cellene ved sentrifugering ved 3000 x g (4 °C) i 20 minutter.
2. For å sterilisere vesikkelholdige medier for langtidsoppbevaring, pass det ryddede kulturmediet gjennom et sterilt og vaskemiddelfritt 0,45 μm polyetersulfon (PES) filter (se materialfortegnelse).
   MERK: For å teste utelukkelsen av levedyktige celler fra det vesikkelholdige filtratet, plate på LB-agar og inkuber over natten ved 37 °C.
3. For å konsentrere vesiklene til et mindre volum, pass det sterile vesikkelholdige mediet gjennom et sterilt og vaskemiddelfritt 0,1 μm blandede celluloseestere (MCE) filter (se materialfortegnelse).
4. Vask membranen forsiktig med 0,5-1 ml steril PBS ved hjelp av en celleskrape eller plastspreder for å fjerne vesikler forsiktig fra membranen. Overfør til et nytt mikrofugerør.
   MERK: Rensede vesikler kan oppbevares i sterile medier eller fosfatbufret saltvann (PBS) ved 4 °C. Det er eksempler på rekombinante proteiner lagret i disse vesiklene i 6 måneder, på denne måten, uten tap av enzymatisk aktivitet.

4. Løselig proteinfrigjøring fra isolerte vesikler

1. Når proteinholdige vesikler er isolert i sterilt medium / buffer, underkastes vesikulære lipidmembraner til sonikering ved hjelp av en passende tidsplan for apparatet (f.eks. 6x 20 s på og av sykluser) og sentrifuge ved 39.000 x g (4 ° C) i 20 minutter for å fjerne vesikkelavfall.
   MERK: Osmotisk sjokk eller vaskemiddelbehandling kan brukes som et alternativ til å bryte opp vesiklene, men det må tas hensyn til virkningen på proteinfunksjonalitet og / eller nedstrøms applikasjon.
2. Hvis VNp-fusjon forblir cytosolisk og ikke slippes ut i mediet, isoler proteinet ved hjelp av standardprotokoller (f.eks. Resuspender cellepellets i 5 ml av en passende ekstraksjonsbuffer (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonicate og fjern celleavfallet ved sentrifugering).

5. Bestemmelse av proteinkonsentrasjon

1. Bestem konsentrasjonen av proteiner ved geldensitometrianalyse av triplikatprøver¹. Kjør sammen med bovint serumalbumin (BSA) lastestandarder på coomassie-farget natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) geler. Skann og analyser gelene ved hjelp av passende programvare (f.eks. bilde J; se materialfortegnelse).

6. Visualisering av vesikkeldannelse og isolerte vesikler ved fluorescensmikroskopi

MERK: Hvis cellene inneholder fluorescerende merket VNp-fusjon eller membranmarkører, kan levende celleavbildning brukes til å følge vesikkeldannelse. Alternativt kan fluorescerende lipidfargestoffer brukes til å visualisere vesikler for å bekrefte produksjon og rensing.

1. Montering av celler
   1. Indusere VNp-fusjonsuttrykk i flere timer før det monteres på dekselet.
   2. Agaroseputemetode (figur 3A-C): pipetter cellene på en tynn (<1 mm), sirkulær LB-agarose (2%) pute som har fått lov til å danne og satt på et rent glassglass. La cellene sette seg og balansere og plasser en 50 mm x 25 mm deksel på puten og cellene. Hold dekselet på plass med avstandsstykker og tape.
   3. Polyetylenimin (PEI) metode (figur 3D-F): spre 20 μL av 0,05% PEI (i dH₂O) på en deksel med en pipettespiss og la den stå i 3-5 min for å binde til glass uten å la tørke. Tilsett 50 μL cellekultur og la stå i 5-10 minutter for å sikre at bakterier har assosiert med den PEI-belagte overflaten⁴. Vask dekselet med 100 μL media før du legger det på lysbildet og hold det på plass med avstandsstykker og tape.
2. Montering av vesikler
   1. Pipette renset vesikler på en tynn (<1 mm), sirkulær LB-agarose (2%) pute som har fått lov til å danne og satt på en ren glassglass. Når væsken har tørket, plasser en 50 mm x 25 mm dekselslip på puten og vesiklene. Hold dekselet på plass med avstandsstykker og tape.
   2. Det fluorescerende lipidfargestoffet FM4-64 er i stand til å flekke membraner⁵, og kan derfor brukes til å visualisere vesikler. Tilsett FM4-64 (se materialfortegnelse) til rensede vesikler ved en endelig konsentrasjon på 2 μM (fra en 2 mM bestand oppløst i dimetylsulfoksid [DMSO]) og bilde etter en 10 minutters inkubasjon. Dette er spesielt nyttig for å identifisere vesikler som inneholder ikke-fluorescerende merkede laster⁵.
   3. Skyll dekslene med samme medium som brukes til å dyrke de observerte cellene.
      MERK: Noen komplekse medier (f.eks. TB) kan utvise autofluorescens, noe som kan føre til overflødig bakgrunnssignal.
3. Imaging vesikler
   MERK: Eksempel på mikroskopibilder av VNp rekombinante vesikler kan ses i figur 4.
   1. Monter lysbildet på et omvendt mikroskop (se materialfortegnelse) ved hjelp av et oljenedsenkningsmål og la det stå i 2-3 minutter for å la prøven sette seg og temperaturen likevektes.
      MERK: All levende celleavbildning for hver prøve må fullføres innen 30 minutter etter montering av celler på dekksedler for å minimere virkningen av fototoksisitet og anaerob stress. Av denne grunn foretrekkes enkeltplanbilder fremfor z-stabler.
   2. Bruk egnede lyskilder (f.eks. lysemitterende diode [LED] eller halogenpære, se materialfortegnelse) og filterkombinasjoner for fluorescerende protein(er)/fargestoff(er) som brukes⁶.
   3. Bruk en linse med høy forstørrelse (dvs. 100x eller 150x) og høy numerisk blenderåpning (dvs. NA ≥1.4) for avbildning av mikrobielle celler og vesikler.
   4. Bestem den minimale lysintensiteten som kreves for å visualisere fluorescenssignaler fra celler og / eller vesikler. Dette kan kreve en viss justering av eksponerings- og forsterkningsinnstillingene for kameraet som brukes.
      MERK: Typiske eksponeringstider fra nåværende CMOS-kameraer (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) varierer mellom 50–200 ms, avhengig av bildesystemet.
   5. For enkeltbilder kan du bruke gjennomsnitt av tre bilder for å redusere maskinvareavhengig tilfeldig bakgrunnsstøy.
   6. For time-lapse-avbildning, la det gå 3-5 minutter mellom individuelle rammer.
      MERK: Avhengig av mikroskopoppsettet, kan det hende at fokuset må justeres periodisk gjennom lengre tidsforløpseksperimenter.

Representative Results

BL21 DE3 E. coli som inneholder uttrykkskonstruksjonen VNp6-mNeongreen ble dyrket til senloggfase (figur 2A). VNp6-mNeongreen-uttrykk ble indusert ved tilsetning av IPTG til kulturen (20 μg / ml eller 84 μM endelig konsentrasjon), som deretter ble igjen for å vokse over natten ved 37 ° C med kraftig risting (200 rpm, ≥25 mm orbitalkast). Neste morgen viste dyrkningen mNeongreen fluorescens⁷ (figur 2B), som forble synlig i media etter fjerning av bakterieceller ved sentrifugering (figur 2C). Tilstedeværelsen av VNp-mNeongreen i kultur- og ryddekulturmediene ble bekreftet av SDS-PAGE (figur 2D). De mNeongreen-holdige vesiklene ble isolert på et 0,1 μm MCE-filter (figur 2E) og resuspendert i PBS (figur 2F). De rensede vesiklene ble deretter montert på en agarosepute (figur 3A-C) og avbildet med bredfeltfluorescensmikroskopi (figur 4A). Tilstedeværelsen av vesikkelmembraner ble bekreftet ved bruk av det lipofile fluorescerende fargestoffet FM4-64 (figur 4B). E. coli-cellene som uttrykker det indre membranproteinet CydB fusjonert til mNeongreen (grønn) og VNp6-mCherry2 (magenta)⁸ viser vesikkelproduksjon og lastinnsetting i levende bakterieceller (figur 4C). Figur 4A,B ble fanget med et bredfeltfluorescensmikroskop, mens figur 4C ble tatt ved hjelp av strukturert belysningsmikroskopi (SIM), ved hjelp av metoder beskrevet tidligere ^9,10.

Figur 1: Sammendrag av VNp-teknologi fra utforming av en kloningsstrategi til rensing og lagring av ekstracellulære vesikler . (A) Skjematisk fremstilling av et typisk VNp-fusjonsprotein. VNp ved NH2-terminalen, etterfulgt av en fleksibel linker og en passende kombinasjon av affinitets- og fluorescenskoder (Tag1, Tag 2, proteasespaltningssted [f.eks. TEV]) og protein av interesse. (B) Skjematisk diagram som oppsummerer protokollen for ekspresjon og rensing av rekombinante proteinfylte membranvesikler fra E. coli. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Produksjonsstadier og rensing av VNp6-mNg-vesikler. Kulturer av E. coli-celler som inneholder VNp-mNeongreen-ekspresjonen konstruerer i blått lys enten før (A) eller etter (B) IPTG-indusert ekspresjon av fusjonsproteinet. Cellene fra (B) ble fjernet ved sentrifugering, og etterlot VNp-mNeongreen-fylte vesikler i mediet (C). (D) Ekvivalente prøver fra A, B og C ble analysert ved SDS-PAGE og coomassiefarging. Vesiklene ble isolert på et 0,1 μm filter (E) og deretter vasket ut til et passende volum buffer (F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Cellemonteringsprosedyre for avbildning av vesikler og vesikelproduksjon. (A-C) Agaroseputemetoden og (D-F) PEI-metoden for montering av E. coli-celler på dekselet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Mikroskopibilder av VNp rekombinante vesikler. Grønne (A) og røde (B) emisjonsbilder fra forskjellige felt av FM4-64 merket VNp6-mNeongreen-holdige vesikler montert på en agarosepute. (C) Imaging E. coli-celler som uttrykker det indre membranproteinet CydB fusjonert til mNeongreen (grønn) og VNp6-mCherry2 (magenta) viser vesikkelproduksjon og lastinnsetting i levende bakterieceller. (A,B) ble avbildet ved hjelp av et bredfeltfluorescensmikroskop, mens (C) ble anskaffet ved hjelp av strukturert belysningsmikroskopi (SIM). Skala barer: (A,B) = 10 μm; (C) = 1 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Den aminoterminale peptidmerkede metoden for produksjon av rekombinante proteiner beskrevet ovenfor er en enkel prosess, som konsekvent gir store mengder protein som effektivt kan isoleres og / eller lagres i flere måneder.

Det er viktig å fremheve de viktigste trinnene i protokollen som kreves for optimal bruk av dette systemet. For det første må VNp-tag¹ være plassert ved N-terminalen, etterfulgt av proteinet av interesse og eventuelle passende koder. Det er også viktig å unngå å bruke antibiotika som retter seg mot peptidoglykanlaget, for eksempel ampicillin.

Når det gjelder vekstforhold, er rike medier (f.eks. LB- eller TB-medier) og et høyt overflateareal: volumforhold nødvendig for å maksimere vesikelproduksjonen. Den optimale temperaturen for produksjon av ekstracellulære vesikler er 37 °C, men betingelsene som vanligvis kreves for ekspresjon av proteinet av interesse må også vurderes. For lavere induksjonstemperaturer må VNp6 brukes. Avgjørende er at induksjon av T7-promotoren må oppnås ved bruk av ikke større enn 20 μg / ml (84 μM) IPTG når cellene når en OD₆₀₀ på 0,8-1,0. Proteiner uttrykt ved hjelp av systemet når maksimal vesikkelproduksjon enten ved 4 timer eller etter induksjon over natten.

Til tross for enkelheten i denne protokollen, krever den optimalisering. VNp-variantfusjon, ekspresjonstemperaturer og induksjonstidsperioder kan variere avhengig av proteinet av interesse. Videre er det behov for å optimalisere rensingen og påfølgende konsentrasjon av ekstracellulære vesikler fra mediet. Den nåværende prosedyren er ikke skalerbar og kan være tidkrevende. Dette er begrensningene i denne metodikken.

VNp-teknologien har mange fordeler i forhold til tradisjonelle metoder². Det tillater vesikulær eksport av forskjellige proteiner, med maksimal størrelse vellykket uttrykt til dags dato 175 kDa for vesikler som forblir interne og 85 kDa for de som eksporteres. Videre kan denne teknologien øke utbyttet av rekombinante proteiner betydelig med en rekke fysiske egenskaper og aktiviteter. Eksporterte vesikler som inneholder proteinet av interesse kan isoleres ved enkel filtrering fra det forhåndsgodkjente mediet og kan deretter lagres i sterile kulturmedier eller buffer ved 4 °C i flere måneder.

Bruksområdene for dette systemet er forskjellige, fra oppdagelsesvitenskap til anvendt bioteknologi og medisin (f.eks. gjennom produksjon av funksjonelle terapier)³. Enkel produksjon, nedstrøms prosessering og høyt utbytte er alle attraktive kvaliteter i disse områdene og spesielt i industrien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Melford	69-52-3
Chloramphenicol	Acros Organics (Thermofisher Scientific)	56-75-7
E. coli BL21 (DE3)	Lab Stock	N/A
E. coli DH10β	Lab Stock	N/A
Filters for microscope	Chroma
FM4-64	Molecular Probes (Invitrogen)	T-3166	Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM
ImageJ	Open Source		Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html
Inverted microscope	Olympus
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Melford	367-93-1
Kanamycin sulphate	Gibco (Thermofisher Scientific)	11815-024
LED light source for micrscope	Cairn Research Ltd
Lysogeny Broth (LB) / LB agar	Lab Stock	N/A	10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar)
Metamorph imaging software	Molecular Devices
MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE)	Merck	VCWP04700
Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES)	Merck	HPWP04700
Phosphate buffered saline (PBS)	Lab Stock	N/A
Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions	Addgene		https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/
Terrific Broth (TB)	Lab Stock	N/A	12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4