Denne protokollen beskriver en detaljert metode for bakteriell produksjon av rekombinante proteiner, inkludert typisk uoppløselige eller disulfidbindende proteiner, pakket inn i ekstracellulære membranbundne vesikler. Dette har potensial til å bli brukt på allsidige områder av vitenskapelig forskning, inkludert anvendt bioteknologi og medisin.
Dette innovative systemet, ved hjelp av en kort peptidkode, som eksporterer flere rekombinante proteiner i membranbundne vesikler fra E. coli, gir en effektiv løsning på en rekke problemer forbundet med bakteriell rekombinant proteinuttrykk. Disse rekombinante vesiklene fordeler proteiner i et mikromiljø som letter produksjonen av ellers utfordrende, giftige, uoppløselige eller disulfidbindingsholdige proteiner fra bakterier. Proteinutbyttet økes betydelig sammenlignet med typisk bakterieuttrykk i fravær av vesikkelnukleerende peptidmerke. Frigivelsen av vesikkelpakkede proteiner støtter isolering fra kulturmediet og tillater langsiktig aktiv proteinlagring. Denne teknologien gir opphav til økt utbytte av vesikkelpakkede, funksjonelle proteiner for forenklet nedstrømsbehandling for et mangfoldig utvalg av applikasjoner fra anvendt bioteknologi til oppdagelsesvitenskap og medisin. I denne artikkelen og tilhørende video er det gitt en detaljert protokoll for metoden, som fremhever viktige trinn i metodikken for å maksimere rekombinant proteinfylt vesikelproduksjon.
Den gramnegative bakterien E. coli er et attraktivt system for rekombinant proteinproduksjon på både industriell og akademisk skala. Det er ikke bare kostnadseffektivt og greit å dyrke i partier til høye tettheter, men et bredt spekter av reagenser, stammer, verktøy og promotorer er etablert for å fremme genereringen av funksjonelle proteiner i E. coli1. I tillegg overvinner syntetiske biologiske teknikker nå hindringer som vanligvis er relatert til anvendelse av posttranslasjonelle modifikasjoner og folding av komplekse proteiner2. Evnen til å målrette sekresjonen av rekombinante proteiner i kulturmedier er attraktiv for å forbedre utbyttet og redusere produksjonskostnadene. Kontrollert pakking av brukerdefinerte proteiner i membranvesikler hjelper utviklingen av produkter og teknologier innen anvendt bioteknologi og medisinsk industri. Hittil har det vært mangel på allment anvendelige metoder for å utskille rekombinante proteiner fra E. coli 3.
Eastwood et al. har nylig utviklet en peptidmerkingsbasert metode for å produsere og isolere rekombinante proteinholdige vesikler fra E. coli1. Dette vesikkelkjernende peptidet (VNp) tillater produksjon av ekstracellulære bakterielle membranvesikler, i hvilke det valgte rekombinante proteinet kan målrettes for å forenkle rensing og lagring av målproteinet, og tillater betydelig høyere utbytter enn normalt tillatt fra ristende kolbekulturer. Utbytter på nær 3 g rekombinant protein per liter kolbekultur er rapportert, med >100x høyere utbytter enn de som oppnås med ekvivalente proteiner som mangler VNp-taggen. Disse rekombinante proteinberikede vesiklene kan raskt renses og konsentreres fra kulturmediene og gir et stabilt miljø for lagring. Denne teknologien representerer et stort gjennombrudd i E. coli rekombinant proteinproduksjon. Vesiklene deler giftige og disulfidbindingsholdige proteiner i en løselig og funksjonell form, og støtter enkel, effektiv og rask rensing av vesikkelpakkede, funksjonelle proteiner for langtidslagring eller direkte behandling1.
De største fordelene denne teknologien presenterer i forhold til dagens teknikker er: (1) anvendeligheten til en rekke størrelser (1 kDa til >100 kDa) og typer protein; (2) legge til rette for dannelse av inter- og intraproteindisulfidbindinger; (3) gjelder multiproteinkomplekser; (4) kan brukes med en rekke promotorer og standard laboratorie E. coli-stammer ; (5) generering av utbytter av proteiner fra ristende kolber som normalt bare ses med gjæringskulturer; Proteiner eksporteres og pakkes i membranbundne vesikler som (6) gir et stabilt miljø for lagring av det aktive løselige proteinet; og (7) forenkler nedstrømsbehandling og proteinrensing. Dette enkle og kostnadseffektive rekombinante proteinverktøyet vil sannsynligvis ha en positiv innvirkning på bioteknologi og medisinsk industri, samt oppdagelsesvitenskap.
Her beskriver en detaljert protokoll, utviklet over flere år, de optimale forholdene for å produsere rekombinante proteinfylte vesikler fra bakterier med VNp-teknologien. Eksempler på bilder av dette systemet i praksis vises, med et fluorescerende protein som uttrykkes, slik at tilstedeværelsen av vesikler i forskjellige stadier av produksjon, rensing og konsentrasjon kan visualiseres. Til slutt gis veiledning om hvordan man bruker levende celleavbildning for å validere produksjonen av VNp-fusjonsholdige vesikler fra bakteriene.
Den aminoterminale peptidmerkede metoden for produksjon av rekombinante proteiner beskrevet ovenfor er en enkel prosess, som konsekvent gir store mengder protein som effektivt kan isoleres og / eller lagres i flere måneder.
Det er viktig å fremheve de viktigste trinnene i protokollen som kreves for optimal bruk av dette systemet. For det første må VNp-tag1 være plassert ved N-terminalen, etterfulgt av proteinet av interesse og eventuelle passende koder. Det er også viktig å unngå å bruke antibiotika som retter seg mot peptidoglykanlaget, for eksempel ampicillin.
Når det gjelder vekstforhold, er rike medier (f.eks. LB- eller TB-medier) og et høyt overflateareal: volumforhold nødvendig for å maksimere vesikelproduksjonen. Den optimale temperaturen for produksjon av ekstracellulære vesikler er 37 °C, men betingelsene som vanligvis kreves for ekspresjon av proteinet av interesse må også vurderes. For lavere induksjonstemperaturer må VNp6 brukes. Avgjørende er at induksjon av T7-promotoren må oppnås ved bruk av ikke større enn 20 μg / ml (84 μM) IPTG når cellene når en OD600 på 0,8-1,0. Proteiner uttrykt ved hjelp av systemet når maksimal vesikkelproduksjon enten ved 4 timer eller etter induksjon over natten.
Til tross for enkelheten i denne protokollen, krever den optimalisering. VNp-variantfusjon, ekspresjonstemperaturer og induksjonstidsperioder kan variere avhengig av proteinet av interesse. Videre er det behov for å optimalisere rensingen og påfølgende konsentrasjon av ekstracellulære vesikler fra mediet. Den nåværende prosedyren er ikke skalerbar og kan være tidkrevende. Dette er begrensningene i denne metodikken.
VNp-teknologien har mange fordeler i forhold til tradisjonelle metoder2. Det tillater vesikulær eksport av forskjellige proteiner, med maksimal størrelse vellykket uttrykt til dags dato 175 kDa for vesikler som forblir interne og 85 kDa for de som eksporteres. Videre kan denne teknologien øke utbyttet av rekombinante proteiner betydelig med en rekke fysiske egenskaper og aktiviteter. Eksporterte vesikler som inneholder proteinet av interesse kan isoleres ved enkel filtrering fra det forhåndsgodkjente mediet og kan deretter lagres i sterile kulturmedier eller buffer ved 4 °C i flere måneder.
Bruksområdene for dette systemet er forskjellige, fra oppdagelsesvitenskap til anvendt bioteknologi og medisin (f.eks. gjennom produksjon av funksjonelle terapier)3. Enkel produksjon, nedstrøms prosessering og høyt utbytte er alle attraktive kvaliteter i disse områdene og spesielt i industrien.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker ulike Twitter-brukere som reiste spørsmål om protokollen som presenteres i papiret som beskriver VNp-teknologien. Figur 1A ble generert ved hjelp av ikoner fra flaticon.com. Dette arbeidet ble støttet av University of Kent og finansiering fra Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB / T008 / 768 / 1 og BB / S005544 / 1).
Ampicillin | Melford | 69-52-3 | |
Chloramphenicol | Acros Organics (Thermofisher Scientific) | 56-75-7 | |
E. coli BL21 (DE3) | Lab Stock | N/A | |
E. coli DH10β | Lab Stock | N/A | |
Filters for microscope | Chroma | ||
FM4-64 | Molecular Probes (Invitrogen) | T-3166 | Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM |
ImageJ | Open Source | Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html | |
Inverted microscope | Olympus | ||
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Melford | 367-93-1 | |
Kanamycin sulphate | Gibco (Thermofisher Scientific) | 11815-024 | |
LED light source for micrscope | Cairn Research Ltd | ||
Lysogeny Broth (LB) / LB agar | Lab Stock | N/A | 10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar) |
Metamorph imaging software | Molecular Devices | ||
MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE) | Merck | VCWP04700 | |
Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES) | Merck | HPWP04700 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab Stock | N/A | |
Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions | Addgene | https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/ | |
Terrific Broth (TB) | Lab Stock | N/A | 12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4 |