En maskinvisionstilgang til transmissionselektronmikroskopi-arbejdsgange, resultatanalyse og datastyring

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at bruge maskinsynssoftware til at stabilisere dynamiske processer under TEM-billeddannelse, samtidig med at vi indekserer flere strømme af metadata til hvert billede i en navigerbar tidslinje. Vi demonstrerer, hvordan denne platform muliggør automatiseret kalibrering og kortlægning af elektrondosis i løbet af et eksperiment.

Abstract

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) giver brugerne mulighed for at studere materialer på deres grundlæggende, atomare skala. Komplekse eksperimenter genererer rutinemæssigt tusindvis af billeder med adskillige parametre, der kræver tidskrævende og kompliceret analyse. AXON synchronicity er en maskinsynssynkronisering (MVS) softwareløsning designet til at løse de smertepunkter, der er forbundet med TEM-undersøgelser. Når det er installeret på mikroskopet, muliggør det kontinuerlig synkronisering af billeder og metadata genereret af mikroskopet, detektoren og in situ-systemer under et eksperiment. Denne forbindelse muliggør anvendelse af maskinsynsalgoritmer, der anvender en kombination af rumlige, stråle- og digitale korrektioner til at centrere og spore et interesseområde inden for synsfeltet og give øjeblikkelig billedstabilisering. Ud over den betydelige forbedring i opløsning, som en sådan stabilisering giver, muliggør metadatasynkronisering anvendelse af beregnings- og billedanalysealgoritmer, der beregner variabler mellem billeder. Disse beregnede metadata kan bruges til at analysere tendenser eller identificere vigtige interesseområder inden for et datasæt, hvilket fører til ny indsigt og udvikling af mere sofistikerede maskinsynsfunktioner i fremtiden. Et sådant modul, der bygger på disse beregnede metadata, er dosiskalibrering og -styring. Dosismodulet giver state-of-the-art kalibrering, sporing og styring af både elektronfluensen (e-/Å 2·^s-1) og kumulativ dosis (e^-/Ų), der leveres til bestemte områder af prøven pixel for pixel. Dette muliggør et omfattende overblik over samspillet mellem elektronstrålen og prøven. Eksperimentanalyse strømlines gennem en dedikeret analysesoftware, hvor datasæt bestående af billeder og tilsvarende metadata let visualiseres, sorteres, filtreres og eksporteres. Kombineret letter disse værktøjer effektivt samarbejde og eksperimentel analyse, tilskynder til datamining og forbedrer mikroskopioplevelsen.

Introduction

Transmissionselektronmikroskoper (TEM'er) og deres evner har haft stor gavn af fremskridt inden for kameraer, detektorer, prøveholdere og computerteknologier. Disse fremskridt hæmmes imidlertid af frakoblede datastrømme, begrænsninger i menneskelig drift og besværlig dataanalyse ^1,2. Desuden tilpasser in situ- og operando-eksperimenter TEM'er til nanoskalalaboratorier i realtid, hvilket gør det muligt at studere prøver i gas- eller væskemiljøer, samtidig med at der anvendes en række eksterne stimuli ^3,4,5. Indførelsen af sådanne komplekse arbejdsgange har kun forstørret disse begrænsninger, og den deraf følgende stigning i størrelsen og kompleksiteten af disse datastrømme giver anledning til stigende bekymring. Der lægges således stigende vægt på at udnytte maskinhandlingsevne til at finde, få adgang til, interoperere og genbruge data, en praksis kendt som FAIR-principperne⁶. Offentliggørelse af forskningsdata i overensstemmelse med FAIR-principperne har fået positiv opmærksomhed fra statslige organer rundt om i verden^7,8, og anvendelse af FAIR-principperne ved hjælp af maskinsynssoftware er et vigtigt skridt i deres vedtagelse.

En maskinsynssynkroniseringssoftwareplatform (MVS) er blevet udviklet som reaktion på de specifikke smertepunkter, der er forbundet med at udføre og analysere komplekse, metadatatunge TEM-eksperimenter (især in situ - og operando-eksperimenter)⁹. Når MVS-softwaren er installeret på TEM, forbinder, integrerer og kommunikerer den med mikroskopsøjlen, detektorer og integrerede in situ-systemer . Dette gør det muligt løbende at indsamle billeder og justere disse billeder med deres eksperimentelle metadata og danne en omfattende søgbar database, en tidslinje for eksperimentet fra start til slut (figur 1). Denne forbindelse gør det muligt for MVS-softwaren at anvende algoritmer, der intelligent sporer og stabiliserer et interesseområde (ROI), selv når prøver gennemgår morfologiske ændringer. Softwaren anvender justeringer af scene-, stråle- og digitale korrektioner efter behov for at stabilisere ROI gennem sine Drift Control og Focus Assist-funktioner . Ud over at berige billederne med de rå metadata, der produceres fra de forskellige eksperimentelle systemer, kan softwaren producere nye, beregningsmæssige metadata ved hjælp af billedanalysealgoritmer til at beregne variabler mellem billeder, som gør det muligt automatisk at korrigere for prøvedrift eller ændringer i fokus.

TEM-billeder og deres tilknyttede metadata indsamlet via MVS-softwaren er organiseret som en eksperimentel tidslinje, der kan åbnes og ses af alle via den gratis, offline version af analysesoftwaren, Studio (i det følgende benævnt analysesoftwaren)¹⁰. Under et eksperiment synkroniserer og optager MVS-softwaren tre typer billeder fra mikroskopets kamera eller detektor, som vises øverst på tidslinjen under billedfremviseren: enkelt erhvervelse (individuelle enkeltoptagelsesbilleder erhvervet direkte fra TEM-softwaren), rå (billeder fra detektoren / kameraets livestream, der ikke har haft nogen digitale driftkorrektioner anvendt; disse billeder kan være blevet fysisk korrigeret via scenebevægelse eller stråleskift) og drift korrigeret (billeder fra detektoren/kameraets livestream, der er blevet digitalt afdrift). Data, der indsamles under et eksperiment eller en session, kan raffineres yderligere til mindre sektioner eller uddrag af data, kendt som samlinger, uden tab af indlejrede metadata. Fra analysesoftwaren kan billeder, billedstakke og metadata eksporteres direkte til en række billeder i åbent format og regnearkstyper til analyse ved hjælp af andre værktøjer og programmer.

Rammen for mikroskopstyring, stabilisering og metadataintegration, der er aktiveret af MVS-softwaren, tillader også implementering af yderligere maskinsynsprogrammer eller moduler, der er designet til at afhjælpe begrænsninger i nuværende TEM-arbejdsgange. Et af de første moduler, der er udviklet til at drage fordel af denne synkroniseringsplatform, er elektrondosiskalibrering og rumlig sporing af stråleeksponerede områder i prøven. Alle TEM-billeder dannes ud fra interaktionen mellem prøven og elektronstrålen. Disse interaktioner kan imidlertid også resultere i negative, uundgåelige virkninger på prøven, såsom radiolyse og knock-on skader 11,12, og kræver en omhyggelig balance mellem at anvende en høj nok elektrondosis til at generere billedet og minimere den resulterende stråleskade ^13,14.

Selvom mange brugere er afhængige af skærmstrømmålinger for at estimere elektrondosis, har denne metode vist sig at undervurdere den faktiske strålestrøm¹⁵. Kvalitative dosisværdier kan opnås via skærmstrømmen på det samme mikroskop med de samme indstillinger, men gengivelse af disse dosisbetingelser ved hjælp af forskellige mikroskoper eller indstillinger er meget subjektiv. Derudover kræver eventuelle justeringer af billedparametre, der foretages af brugeren under eksperimentet, såsom spotstørrelse, blænde, forstørrelse eller intensitet, en separat måling af skærmstrømmen for at beregne den resulterende dosis. Brugere skal enten strengt begrænse de billeddannelsesbetingelser, der anvendes under et givet eksperiment, eller omhyggeligt måle og registrere hver anvendt linsetilstand, hvilket betydeligt komplicerer og udvider eksperimentet ud over, hvad der er muligt for normal drift af mikroskopet^16,17.

Dosis, kaldet dosissoftware til denne protokol, er et dosiskalibreringssoftwaremodul, der bruger en dedikeret kalibreringsholder designet til at muliggøre automatiserede strømmålinger. En Faraday-kop, guldstandarden for nøjagtig strålestrømskalibrering¹⁵, er integreret i spidsen af kalibreringsholderen. MVS-softwaren udfører en række strålestrøms- og stråleområdekalibreringer for hver linsetilstand og integrerer disse værdier på billederne på pixelniveau.

I denne videoartikel præsenteres MVS-softwareprotokoller, der er designet til at forbedre alle områder af TEM-arbejdsgangen, ved hjælp af repræsentative nanomaterialeprøver. En strålefølsom zeolit nanopartikelprøve¹⁴ bruges til at demonstrere kalibrerings- og dosisstyringsarbejdsgangene. Vi udfører et repræsentativt in situ opvarmningseksperiment ved hjælp af en Au/FeO_x nanokatalysator^18,19 prøve^, der gennemgår betydelige morfologiske ændringer ved opvarmning. Dette in situ-eksperiment fremhæver softwarens stabiliseringsalgoritmer og dens evne til at samle flere strømme af metadata, hvilket er en iboende udfordring for in situ- og operando-undersøgelser. Selvom det ikke er beskrevet i protokollen, diskuterer vi på grund af dets unikke elektrondosisfølsomhed repræsentative eksempler på softwarens anvendelighed til væske-EM-undersøgelser (protokoller, som tidligere er rapporteret i litteraturen^20,21,22), og hvordan disse teknikker kan anvendes til at forbedre forståelsen af dosiseffekten på væske-EM-eksperimenter. Endelig viser vi, hvordan dataanalyse strømlines ved hjælp af offlineanalysesoftwaren til at visualisere, filtrere og eksportere en række billed-, video- og datafiler til andre tilgængelige formater.

Figur 1: Eksempler på brugergrænseflade til MVS og analysesoftware. (A) Synkroniseringssoftwarens billedvisningsrude og kontrolpanel. En forbindelse mellem TEM og synkroniseringssoftwaren etableres ved at aktivere knappen Connect, som streamer billederne og metadataene fra mikroskopet til synkroniseringssoftwaren. Fra billedfremviseren kan operatøren udføre en række maskinsynsassisterede handlinger, såsom Drift Correct og Focus Assist. Det giver også mulighed for at anvende tagbilleder og gennemgangssession uden at forstyrre dataindsamlingen. (B) Skærmbillede af billedanalysesoftwaren, der fremhæver placeringen af billedvisningsporten, tidslinjen og panelet Metadata og analyse. Analysesoftwaren kan tilgås når som helst under et eksperiment for at gennemgå de billeder, der er erhvervet op til dette tidspunkt, ved hjælp af knappen Gennemgå session. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Metode 1: Dosiskalibrering af transmissionselektronmikroskopet til TEM- og scannings-TEM-billeddannelsestilstande (STEM)

1. Tænd picoammeteret, og lad det varme op i mindst 30 minutter, før du starter en dosiskalibrering. Læg dosiskalibreringsholderen i TEM, og tilslut kalibreringsholderen til picoammeteret ved hjælp af hurtigtilslutningskablet.
2. Når mikroskopet er i TEM-tilstand , åbnes søjleventilerne, og det 35 μm fiduciale hul på dosisholderen lokaliseres (figur 2). Start MVS-softwareprogrammet, og vælg Dosis (kalibreringsautomatisering) fra eksperimentindstillingerne.
   BEMÆRK: Placeringen af det fiduciale hul gemmes af softwaren efter den indledende kalibrering, hvilket gør det muligt for softwaren automatisk at lokalisere sin position til fremtidige kalibreringer.
3. Klik på ikonet Connect (Figur 1A), og vælg mikroskopet for at aktivere forbindelsen mellem TEM og MVS-softwaren. Når de er tilsluttet, vil billederne fra kameraet / detektoren være synlige i billedfremviseren af softwaren.
   BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at optimere den eucentriske højde, og kanten af fiducialhullet kan virke sløret på grund af spidsens tykkelse. Dette vil ikke påvirke de nuværende målinger.
4. Gå til fanen Dosis og derefter til Dosiskalibrering. Vælg Dosisområdekalibreringsproces , følg softwarevejledningen, og indtast de ønskede brugerkonfigurerbare værdier (såsom blænde- og monokromatorindstillinger). Når dosisområdekalibreringen er fuldført, skal du vælge processen Dosisaktuel kalibrering og følge softwarevejledningen.
5. Gentag kalibreringsprocessen (trin 1.4) for hver spotstørrelse, blænde eller monokromatorindstilling, der kan anvendes under eksperimentet.
6. Når kalibreringsprocessen for TEM-tilstand er afsluttet, kalibreres elektrondosis til STEM-tilstand ved at gentage trin 1.4.
   BEMÆRK: STEM-tilstand kræver ikke, at dosisområdekalibrering udføres.
7. Når alle ønskede kalibreringer er færdige, skal du klikke på Luk session, fjerne dosiskalibreringsholderen og vende tilbage til startskærmen for MVS-softwaren.

2. Metode 2: Bestemmelse af dosistærskel ved hjælp af MVS og dosissoftware

1. Indlæs et standard TEM-gitter med en prøve (kommercielt tilgængelige ZSM-5 zeolit nanopartikler blev brugt i dette eksempel) i en standard TEM-holder. Indsæt holderen i TEM og find et område af interesse (krystallinske zeolit nanopartikler).
2. Åbn MVS-softwareprogrammet, og vælg Andet.
   BEMÆRK: Yderligere oplysninger om prøven (f.eks. prøve-id og beskrivelse, operatørnavn og eksperimentnoter) kan føjes til feltet eksperimentelle parametre.
3. Gentag trin 1.3 for at oprette forbindelse til MVS-softwaren, og naviger til fanen billedmetadata i MVS-softwaregrænsefladen for at vælge følgende metadata, der skal overlejres på den billedstream, der vises på livedisplayet: Forstørrelse, Maks. dosis og Dosishastighed. Andre metadata kan inkluderes, hvis brugeren ønsker det. Et skærmbillede af MVS-softwaregrænsefladen, der viser dosisstyringskontrollerne, findes i supplerende fil 1.
4. Åbn fanen Dosis , og vælg Dosisstyring og Aktivér dosisovervågning for at aktivere automatisk sporing af elektrondoser. Vælg Vis dosislag for at få vist dosisfarveoverlejringen.
5. Indstil værdierne for det høje dosisniveau og den høje dosishastighed, og tryk på Gem (i dette eksempel blev der brugt værdier på henholdsvis 60.000 e-/Å 2 og 500 e^-/Ų·s).
6. Gå til fanen Indstillinger , vælg Dosis, og indstil værdierne Opacitet af dosisnavigationskort og Opacitet af dosisbilledoverlejring (i dette eksempel blev der brugt værdier på henholdsvis 0,50 og 0,30).
7. I Live Image Viewer-vinduet skal du aktivere driftskorrektion ved at klikke på Drift Correct.
8. Gå til fanen Datavisning , og afbild metadataværdierne Defokusering og Fokuskvotient på Y-aksen.
   BEMÆRK: Alle tilgængelige metadataværdier kan afbildes i realtid under eksperimentet fra datavisningstabellen.
9. Aktivér Focus Assist, og vælg derefter Kalibrer fokus for at køre kalibreringen af den automatiske fokusassistent. Når rutinen Kalibrer fokus er fuldført, skal du lukke fanen Datavisning .
10. Åbn fanen Billedanalyse i MVS-softwaren, og aktiver indstillingerne Live FFT og kvadranterne 1 &; 2 .
11. Brug mikroskopets softwarekontroller til at justere stråleforholdene, så elektronfluxen er ~ 500 e-/Ų·s. og flyt til et nyt område i prøven og centrer ^prøve-ROI i live view af MVS-softwaren.
    BEMÆRK: Når du foretager store scenebevægelser, deaktiveres driftskontrol og fokusassistent automatisk og skal aktiveres igen, når det nye ROI er valgt.
12. Noter dosisbetingelserne i softwaren ved hjælp af funktionen Tag . Fremhæv tagikonet , og indtast den ønskede tekst for at angive en bestemt serie billeder inden for tidslinjen. Billeder mærkes med denne tekst, indtil ikonet Tag fravælges.
13. Oprethold en konstant dosishastighed, mens du kontinuerligt afbilder det samme investeringsafkast, indtil toppene svarende til atomstrukturen i FFT-plottet er forsvundet.
14. Reducer forstørrelsen, åbn fanen Dosisstyring , og aktiver Vis dosislag for at overlejre et farvekodet dosiskort.
    BEMÆRK: Denne funktion giver en visuel reference til de områder af prøven, der har været udsat for elektronstrålen og deres relative dosiseksponering. Fremhævning af disse områder i individuelle billeder med markøren angiver deres respektive dosisværdier.
15. Afbryd og afslut sessionen ved at fravælge Opret forbindelse, og vælg derefter Luk session. Gem en kopi af sessionsdataene i en ekstern kilde for at forhindre, at de data, der er gemt i MVS-softwaren, overskrives under efterfølgende eksperimenter (supplerende fil 2).

3. Metode 3: Metadata og trendanalyse og dataeksport ved hjælp af analysesoftwaren

1. Start analysesoftwaren (offlinesoftwaren til visning af de fuldt synkroniserede datasæt), og åbn eksperimentsessionsfilen ved at vælge den fra filbiblioteket.
   BEMÆRK: Brugere kan også få adgang til analysesoftwaren via ikonet Gennemgangssession i MVS-softwaren under et eksperiment.
2. Vis de afvigelseskorrigerede billeder ved at aktivere fanen DC under billedvisningsporten , og vælg de ønskede dataoverlejringer ved at markere deres respektive overlejringsdatafelter under fanen Billedmetadata (i dette eksempel blev mikroskop, dato/klokkeslæt, dosishastighed, maks. dosis og forstørrelse brugt). Andre metadata kan plottes som brugeren ønsker.
3. Markér afkrydsningsfeltet Tidslinje for Maks. dosis og dosishastighed for at føje et grafisk plot af disse værdier til tidslinjen. Fremhæv eller rul gennem disse grafiske afbildninger for at opdatere det billede, der vises i vinduet. Få adgang til en række værktøjer via fanerne Noter, Billedanalyse, Værktøjskasse og Datavisning .
   1. Få adgang til FFT for hvert billede via fanen Billedanalyse , og klik på Live FFT for at opdatere FFT, mens du ruller gennem billeder.
   2. Brug fading af FFT-toppe til at bestemme det tidspunkt, hvor zeolitstrukturen mister krystallinitet. Registrer den maksimale dosisværdi, der er registreret med dette billede.
4. Brug indstillingen Filter til nemt at filtrere store datasæt i mindre, delbare datasæt uden at miste deres tilknyttede metadata. Åbn filterpanelet, og juster skyderne, så kun data med en dosishastighed lig med eller over ~500 e^-/Ų·s vælges, og gem den nye samling under navnet Dose Threshold Study.
   BEMÆRK: Der kan anvendes filtre for enhver af de tilknyttede metadatatyper.
5. Eksportér billederne og metadataene fra sessionen til andre filtyper, der er beriget med skalabjælker og metadataoverlejringer.
   1. Fremhæv samlingen i biblioteksruden, og vælg Udgiv ved at højreklikke på markeringen. Vælg de ønskede indstillinger for eksport af filtypen i vinduet Udgiv .
   2. Vælg fanen Afvigelseskorrigerede data, og anvend overlejringer af de ønskede metadata og FFT'en (placer FFT-overlejringen som ønsket; eksempler på billeder, der eksporteres med FFT, er vist i figur 3).
6. Eksporter billedserien som en filmfil ved hjælp af den samme udgivelsesindstilling . Vælg billederne ved at fremhæve dem på tidslinjen, bruge filterindstillingerne eller eksportere hele databasefilen. Vælg det ønskede filmformat, billedhastighed og filplacering. En film af zeolitnedbrydningseksperimentet opnået ved hjælp af en 200 kV TEM findes i supplerende fil 3.
7. Eksporter metadataene separat fra de hentede billeder som en CSV-fil ved at vælge indstillingen Metadata (CSV) under udgivelsen.
   BEMÆRK: Raw- og driftkorrigerede billeder eksporteres som separate CSV-filer (supplerende fil 4 og supplerende fil 5).

4. Metode 4: In situ-opvarmningsundersøgelse af guld på jernoxidnanopartikler

1. Dropcast en nanokatalysator (Au/FeO_x) suspenderet i ethanol på en in situ varmelegeme E-chip, en mico-elektrochmechanical (MEM) prøvestøtte, og lad den lufttørre. Monter prøven i in situ-varmeholderen, sæt holderen med prøven i TEM'en, og tilslut holderen til strømforsyningen ved hjælp af det medfølgende kabel. Find et eksempel på et investeringsafkast ved hjælp af TEM-kontrolelementerne.
   BEMÆRK: Dette eksperiment brugte en varmeholder, der er fuldt integreret med MVS-softwaren, hvilket gør det muligt at integrere temperaturmetadata med billederne.
2. Vælg den relevante arbejdsgangsindstilling fra MVS-softwaren (i dette eksempel blev Fusion Workflow brugt, men andre producenters varmeholdere kan bruges ved at vælge Andet).
3. Følg arbejdsgangsvejledningen for at bekræfte den elektriske forbindelse mellem holderen og opvarmnings-E-chippen ved at indlæse kalibreringsfilen og udføre en enhedskontrol.
4. Tilslut mikroskopet til MVS-softwaren, som vist tidligere i trin 2.3-2.10 (i dette eksempel blev metadataværdierne for dosishastighed, maks. dosis, matchkorrelation, driftshastighed og kanal A-temperatur valgt), og centrer prøve-ROI i synsfeltet.
5. Åbn fanen Fusion AX , og konfigurer og anvend en temperatur.
6. Klik på knappen Kanal A Opsætning for at få adgang til temperaturkontrolindstillingerne. Vælg funktionen Temperatur og Manuel kontroltilstand.
7. Klik på knappen Eksperiment for at få adgang til eksperimentelle kontrolelementer. Indstil rampehastigheden til 10 °C/s og målet til 600 °C. Klik på Anvend for at starte eksperimentet.
   BEMÆRK: Eksperimentet kan til enhver tid sættes på pause eller stoppes ved hjælp af hurtigadgangsknapperne i nederste højre hjørne af MVS-softwaren uden at åbne fanen Fusion AX .
8. Når den indstillede temperatur på 600 °C er nået, skal du åbne fanen Fusion AX og vælge Eksperiment. Skift rampehastigheden til 2 °C og målet til 800 °C. Klik på Anvend for at starte eksperimentet.
   BEMÆRK: Proceduren for anvendelse af en varmerampe afhænger af det anvendte in situ-varmesystem . De trin, der er fremhævet ovenfor for at anvende temperaturrampen, gælder for det system, der bruges i dette eksempel.
9. Fremhæv eventuelle hændelser eller interessepunkter under eksperimentet ved hjælp af taggingfunktionen som vist i trin 2.10. Fortsæt med at tage billeder af prøven, og juster temperaturprofilen efter behov. Når du er færdig, skal du klikke på Afslut session og gemme datafilen ved hjælp af analysesoftwaren (en del af databasefilen, der diskuteres i de repræsentative resultater, leveres som supplerende fil 6).
10. Åbn analysesoftwaren for at gennemgå sessionen. Plot temperaturen, skabelon morphing faktor, dosishastighed og kumulativ dosis i tidslinjen. Eksporter billeder og film efter behov ved hjælp af de trin, der er beskrevet i trin 3.6 og 3.7. Billeder og film kan eksporteres med eller uden dosiskortoverlejringer (figur 4).

Representative Results

Dette arbejde fremhæver nytten af dataindsamling ved hjælp af MVS-software til TEM-billeddannelse og in situ-eksperimenter. Mikroskopjustering og tilstandsopsætning blev udført og valgt gennem TEM-producentens standardkontroller. Efter den første opsætning blev protokollerne præsenteret i denne videoartikel udført gennem MVS-softwaren. En 300 kV TEM blev brugt til alle eksperimenter præsenteret i videoprotokollen og repræsentative data, bortset fra sammenligningszeolitdataene, der blev erhvervet ved hjælp af en 200 kV kold FEG (figur 3D-F og tabel 1). Alle metadata blev indsamlet og justeret til de respektive billeder automatisk af MVS-softwaren.

Når du har startet softwaren og valgt den relevante arbejdsgang i menuen, oprettes en forbindelse til mikroskopet ved at aktivere knappen Tilslut i værktøjslinjen yderst til venstre i billedfremviseren, som vist i figur 1A. Når knappen Tilslut er fremhævet, streames billeder og tilknyttede metadata fra mikroskopet automatisk til MVS-softwaren og vises i billedvisningsruden. Disse billeder og deres tilknyttede metadata gemmes kronologisk på en tidslinje, der kan åbnes, gennemgås og analyseres uden at afbryde registreringen af nye data på tidslinjen (figur 1B). Streaming kan til enhver tid afbrydes af brugeren ved at deaktivere ikonet Opret forbindelse .

Når forbindelsen er aktiveret, kan du få adgang til andre arbejdsgange, der er afhængige af MVS-softwarerammen. I eksemplerne vist i denne videoprotokol skal der udføres en dosiskalibrering, før de andre funktioner i MVS-softwaren udnyttes. Dosiskalibrering er en automatiseret proces, der styres af MVS-softwaren; den bruger en dedikeret Faraday kopdosiskalibreringsholder til at måle strålens strøm og areal for kombinationen af parametre. Faraday-kopkalibreringsholderen, vist i figur 2, tilsluttes et eksternt picoammeter, som nøjagtigt måler strålestrømmen. Når det er indsat i mikroskopet, centreres det fiduciale justeringshul, og de ønskede stråleforhold, der skal kalibreres (spotstørrelser, åbninger og forstørrelser), indtastes i softwaren. Softwaren udfører en række kalibreringstrin for hver kombination af de valgte forhold. Under dosiskalibrering bevæger holderen sig automatisk mellem den integrerede Faraday strømopsamlerkop og det gennemgående hul. Den aktuelle måling for hver kombination af linseforhold måles på Faraday-koppen af picoammeteret. Derefter oversætter softwaren scenen til at centrere strålen i det gennemgående hul, og stråleområdet bestemmes gennem maskinsynsalgoritmer. Denne serie af målinger bygger en profil af forholdet mellem intensitet/lysstyrke og strålearealet. Dette gør det muligt for softwaren at ekstrapolere stråleområdet, da intensitets-/lysstyrkeindstillingen justeres under et eksperiment uanset synsfeltet. Værdier for kumulativ dosis og dosishastighed beregnes ved hjælp af disse målinger af strålestrøm og stråleareal, og der genereres en dosiskalibreringsfil. Denne proces definerer i det væsentlige et dosis "fingeraftryk" for TEM og dets individuelle linseforhold. Når dosis er kalibreret til TEM, kan brugeren arbejde normalt og frit justere forstørrelse og intensitet uden tab af dosisinformation eller manuel notetagning¹⁷. Når kalibreringen er afsluttet, fjernes dosiskalibreringsholderen, så prøven kan indsættes som normalt. Kalibreringsprocessen for både TEM- og STEM-tilstande tager normalt mindre end 10 minutter.

Efter kalibrering af dosisbetingelserne blev en kommercielt købt zeolit nanopartikel (ZSM-5) prøve afbildet under høje dosishastighedsbetingelser for at bestemme tærsklen (kumulativ) dosis, hvor prøven er for beskadiget til at give strukturelle oplysninger. ZSM-5 nanopartiklerne blev suspenderet i ethanol og dropcast på et konventionelt kobber TEM-gitter. De blev afbildet kontinuerligt ved 300 kV i TEM-tilstand ved hjælp af en spotstørrelse på 3 og en 100 μm kondensatorblænde. Den dosishastighed, der blev aflæst af ^{MVS-softwaren} under betingelser med høj dosishastighed, var 519 e-/Ų·s. Nanopartikler i synsfeltet blev afbildet kontinuerligt, indtil toppene i FFT forsvandt, hvilket indikerer nedbrydning af den krystallinske struktur, som vist i figur 3A-C og supplerende fil 3. Overlejringer (som kan tilføjes under et live eksperiment eller bagefter i analysesoftwaren) blev anvendt på TEM-billederne for at vise dato og klokkeslæt, dosishastighed, maksimal (kumulativ) dosis og forstørrelse. Dosishastigheden blev holdt konstant under forsøgene, hvor den kumulative dosis (maks. dosis) steg som funktion af tiden. FFT-toppene begyndte at forsvinde efter 42 s kontinuerlig billeddannelse (figur 3B). Efter 1 min og 20 sek. og en kumulativ dosis på ~60.000 e-/Ų var ^FFT-toppene helt forsvundet (figur 3C).

For at vise, at denne kalibreringsmetode genererer kvantitative dosismålinger, der kan anvendes på andre mikroskoper, der opererer under forskellige indstillinger, blev den samme kalibreringsproces og zeolitnedbrydningseksperiment udført under anvendelse af en 200 kV koldfeltemissionspistol (FEG) TEM og en spotstørrelse på 1. Dette mikroskop blev kalibreret ved hjælp af den samme procedure beskrevet i metode 1, og det samme eksperiment beskrevet i metode 2 blev udført ved hjælp af de nye indstillinger for spotstørrelse og blænde. Stråleindstillingerne blev justeret, så forskellen i den anvendte dosishastighed mellem de to eksperimenter var ubetydelig (499 e-/Å 2·s vs. 519 e^-/Ų·s). Som vist i figur 3D-F og opsummeret i tabel 1 forsvinder FFT-pletterne fuldstændigt efter 1 min og 50 s kontinuerlig billeddannelse og en kumulativ dosis på 58.230 e-/Ų, hvilket stemmer overens med værdierne opnået i det første eksperiment.

Et eksempel på, hvordan MVS-softwaren kan gavne in situ-eksperimenter, blev vist ved at udføre et opvarmningseksperiment. En repræsentativ nanokatalysatorprøve, Au/FeO_x (syntetiseret efter en offentliggjort procedure¹⁹), blev valgt som eksempelsystem, fordi den gennemgår dynamiske morfologiske og strukturelle ændringer ved høje temperaturer. Denne temperaturinducerede mobilitet gør det udfordrende at holde ROI centreret inden for synsfeltet på grund af prøvens egen bevægelse og termiske udvidelse af prøven under temperaturændringer¹⁸. Med funktionerne Drift Correct og Focus Assist aktiveret blev prøven afbildet over en periode på ~30 s ved 800 °C. Ved forhøjede temperaturer vandrede guldnanopartiklerne i Au/FeO_x langs overfladen af jernoxidstøtten og sintrede til dannelse af større partikler, som vist i figur 4 og som en film i supplerende fil 7. Figur 5 viser en række TEM-snapshots (figur 5A-F) af et porøst område i en Au/FeO_x nanokatalysator, registreret på forskellige tidspunkter (figur 5G) under et in situ-opvarmningseksperiment. Den koordinerede driftsværdi af ROI blev automatisk beregnet af softwaren. De koordinerede drifts- og temperaturværdier for billederne i løbet af serien er vist grafisk i figur 5G. Som forventet øges den koordinerede drift af prøven, når temperaturprofilen stiger, fra en hastighed på ~ 9 nm / min til ~ 62 nm / min og begynder at falde mod udjævning, når temperaturen holdes konstant. På trods af denne høje afdrift og ændringer i prøvens morfologi opnås billeder i høj opløsning let under temperaturramping, hvilket afslører bevægelse inden for det porøse område, som vist i supplerende fil 8. Se Supplementary File 9 for downloadinstruktioner og computerspecifikationer.

Figur 2: Kalibrering og sporing af elektrondosis . (A) Dosis kalibreres ved hjælp af en dedikeret prøveholder, der indeholder en strømopsamler, der er placeret på prøveplanet til strålestrømsmålinger. (B) Illustration af spidsens design: Venstre: Faraday-kop; Midten: fiducial hul; Til højre: gennemgående hul (C). Den anvendte elektrondosis kan visualiseres i softwaren ved hjælp af farvekodede kort til at angive forskellige dosiseksponeringer i et billede. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Elektrondosisinduceret nedbrydning af zeolit (ZSM-5) nanopartikler. (A-C) Snapshots taget over en periode på 1 min og 20 sek., der viser nedbrydningsdata opnået med en 300 kV FEG og en målt dosishastighed på 519 e-/Ų·s; zeolitten nedbrydes inden for 1 min og 20 s. (D-E) Snapshots taget over en tidsperiode på 1 min og 50 s, der viser nedbrydningsdata opnået med en 200 kV kold FEG TEM og en elektrondosishastighed på 499 e-/Ų·s; indsatserne viser, at FFT-pletten falmer over tid. Skalabjælken er 60 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: AXON-synkronicitet anvender maskinsynsalgoritmer til at spore og stabilisere dynamisk udviklende prøver. Metadata, der genereres under eksperimentet, kan plottes langs tidslinjen, så brugeren hurtigt kan parre et billede med dets tilknyttede metadata, når de ruller gennem billedserien, der genereres under eksperimentet. (A-H) Billeder af en nanokatalysatorprøve (Au/FeO_x) ved 800 °C optaget over en periode på 28 s både med (A-D) og uden (E-H) dosiskortlægningen. Røde områder i overlejringen angiver områder med høj kumulativ dosiseksponering, og gule områder angiver områder med lavere eksponering. Fremhævning af en individuel pixel angiver den kumulative dosis for den pågældende pixel. Hvide pile i paneler E-H angiver to partikler, der fusionerer under eksperimentet, og den orange pil angiver banen for en bevægelig guldpartikel. (I) Eksperimentets tidslinje genereret af analysesoftwaren for billedserien vist i A-H. De orange prikker øverst på tidslinjen angiver rå (ikke-digitalt korrigerede) billeder, og de blå prikker angiver afdriftkorrigerede billeder. De orange lodrette bjælker angiver de punkter på tidslinjen, der svarer til de viste billeder paneler A-H. Skalabjælken er 40 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: TEM-snapshots af et porøst område i en Au/FeOx nanokatalysator på forskellige tidspunkter. MVS-softwaren stabiliserer og centrerer prøven selv under høje driftshastigheder, såsom dem, der opstår under en temperaturrampe gennem anvendelse af trin, stråleskift og digitale korrektioner, som angivet af maskinsynsalgoritmer. (A-F) TEM-snapshots af et porøst område i en Au/FeOx nanokatalysator, optaget på forskellige (G) tidspunkter under et in situ opvarmningseksperiment. Driftshastigheden for ROI beregnes automatisk og registreres under et eksperiment af MVS-softwaren. Som afbildet i (G), når temperaturprofilen ændres (den blå linje), øges drivhastigheden (orange linje), når temperaturen stiger og falder, når temperaturen holdes konstant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Mikroskop Type	300 KV FEG TEM	200 kV kold FEG TEM
Spotstørrelse/kondensator 2 blænde	3/100 μm	1/100 μm
Dosishastighed	519 e-/A2•s1	499 e-/A2•s1
Tab af struktur målt ved FFT (akkumuleret dosis)	60.270 e-/A2	58.230 e-/A2

Tabel 1: Sammenfattende sammenligning af zeolitnedbrydningsresultater opnået fra forskellige mikroskoper.

Supplerende fil 1: Skærmbillede af MVS-softwaregrænsefladen med fanen Dosisstyring åben. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: MVS-softwaredatabasefil af det stråleinducerede zeolitnedbrydningseksperiment. Denne visnings- / analysesoftware kan downloades gratis. Se venligst Supplementary File 9 for downloadinstruktioner og computerspecifikationer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Film af stråleinduceret zeolitnedbrydning. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: CSV-fil 1 (zeolitnedbrydning: rådata [kun mekanisk korrektion]) Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: CSV-fil (zeolitnedbrydning: drift korrigeret [mekanisk + digital korrektion]) Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 6: MVS software database fil nanokatalysator in situ opvarmning eksperiment. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 7: Film af nanokatalysatoren ved 800 °C med dosisoverlejringer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 8: Film af nanokatalysatoren under en temperaturrampe med koordinerede driftværdier. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 9: Instruktioner til download af den gratis analysesoftware. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Fortolkningen af TEM-eksperimentelle resultater er ofte betinget af mange indbyrdes forbundne eksperimentelle parametre, såsom mikroskopindstillinger, billeddannelsesbetingelser og, i tilfælde af operando- eller in situ-eksperimenter, ændringer i miljøet eller stimuli ^1,23. Nøjagtig analyse af store TEM-datasæt, over hvilke disse parametre løbende kan ændres, kræver betydelig opmærksomhed fra operatøren for nøjagtigt at registrere hver tilstand og indstilling for hvert billede i en laboratoriejournal eller anden ekstern dokumentationskilde. Efterhånden som TEM-datasæt vokser i størrelse og kompleksitet, bliver manuel registrering uhåndterlig, og nøgleoplysninger kan blive overset eller registreret unøjagtigt. MVS-softwaren, der beskrives her, konsoliderer de metadata, der genereres under et eksperiment fra mikroskopet, detektoren/kameraet og andre systemer (såsom in situ-prøveholdere) og justerer dem med deres respektive billeder.

Ud over metadatakonsolidering anvender softwaren maskinsynsalgoritmer til at spore og stabilisere synsfeltet gennem en kombination af rumlige, stråle- og digitale korrektioner ved hjælp af funktionerne Drift Correct og Focus Assist . Når funktionen Drift Correct er aktiveret, genereres et krydskorrelations-'skabelonbillede' ved hjælp af det første billede, der trækkes ind i MVS-softwaren. Skabelonen sammenlignes derefter med indgående billeder for at beregne retningen og størrelsen af prøvens drift eller bevægelse. Med disse oplysninger anvender MVS-softwaren automatisk de nødvendige korrektioner for at holde billedfunktionerne på samme sted ved at justere mindst en af tre parametre: sceneplacering, stråle eller billedskift og digital billedkorrektion. Fokusassistentfunktionen bruger en kombination af algoritmer til at tildele en fokusværdi, kaldet fokusscoren til hvert billede, og disse scorer sammenlignes for at bestemme størrelsen og retningen af defokuseringsjustering, der skal anvendes for at holde prøven i fokus. I STEM-billedtilstand forsøger MVS-softwaren at maksimere kontrasten gennem en proprietær version af normaliseret varians for at tildele fokusscoren. I TEM-tilstand beregnes en radial sum af intensitet i FFT og bruges til at beregne fokusscoren. Begrænsninger i MVS-softwarens evne til at optimere fokus opstår, når den ikke nøjagtigt kan beregne den korrekte fokusscore for et billede. Dette sker typisk, når mikroskopet er forkert justeret, eller prøven er signifikant ude af fokus under kalibrering, hvilket forhindrer softwaren i korrekt at beregne den korrekte startfokusscoreværdi. MVS-softwaren kan have svært ved at beregne fokusscoren for prøver med veldefinerede gitterfrynser, da gitterkanterne i FFT kan 'overvælde' fokusscoringsalgoritmen; Hvis en prøve således bevæger sig ud af fokus, afspejler fokusscoren muligvis ikke nøjagtigt ændringen i fokus. Omvendt kan arbejde ved lave forstørrelser eller med en prøve, der har et lavt FFT-signal, også gøre det udfordrende at beregne en god fokusscore. For at afbøde disse vanskeligheder indeholder MVS-softwaren en række yderligere algoritmer, der kan vælges af brugeren til beregning af fokusscoren, hvis standardindstillingerne er uegnede til prøven. Disse skal testes og anvendes fra sag til sag for at bestemme de bedste algoritmer til et givet eksperiment.

Morfologiske ændringer i prøvestrukturen over tid redegøres for ved hjælp af en skabelonmorferingsfaktor. Dette filter kan justeres af operatøren, så registreringsalgoritmer tager højde for morfologiske ændringer over tid. Derudover overvåger softwaren det kontinuerlige billede, mikroskopindstillinger og kamera- eller detektorindstillinger for automatisk at opdatere skabelonen, når den udløses af ændringer i prøvestruktur og efter eventuelle operatørinducerede ændringer i mikroskop-, kamera- eller detektorparametrene. Som vist i figur 4, figur 5, supplerende fil 7 og supplerende fil 8 giver MVS-softwaren effektiv, øjeblikkelig stabilisering, hvilket muliggør billeddannelse i høj opløsning af dynamisk bevægelige eller skiftende prøver. Selvom softwaren er i stand til at kontrollere meget høje drifts- eller prøvebevægelser, såsom dem, der opstår, når der anvendes en opvarmningsrampe under et in situ-eksperiment, er der begrænsninger for de maksimale trinkorrektioner eller stråleskift, som softwaren kan kontrollere, hvis prøven bevæger sig eller driver meget hurtigt. Denne grænse er en funktion af billedopdateringshastigheden, synsfeltets størrelse og drifthastigheden. For et givet synsfelt og billedopdateringshastighed er der en maksimal drifthastighed, der kan korrigeres, og hvis de fysiske bevægelser ikke kan følge med, kan processen ende eller blive ustabil. Fra de registreringsskabeloner, der genereres, når funktioner som Drift Correct anvendes, kan der genereres yderligere beregnede metadata. For eksempel er matchkorrelation en numerisk registrering af omfanget af ændring mellem skabeloner i en serie og bruges til at identificere punkter på en eksperimentel tidslinje, hvor prøven blev ændret. En korrelationsværdi med høj match svarer til en prøve, der har gennemgået ændringer i sin morfologi, og en korrelationsværdi med lav match svarer til en prøve, hvis struktur forbliver relativt statisk. Matchkorrelation er især værdifuld til in situ-undersøgelser, da den kan plottes grafisk, så brugeren hurtigt kan lokalisere billeder i serien, der svarer til signifikant prøveændring. Det er dog vigtigt at forstå, at korrelationsværdier med høj match også kan svare til ændringer i billeddannelsesforhold, såsom at flytte scenen eller ændre forstørrelsen, hvis disse handlinger udføres, mens funktionen Drift Correction forbliver aktiv.

Kalibreringsarbejdsgangen, der præsenteres her, bruger en unik kalibreringsholder og en halvautomatisk kalibreringsrutine til nøjagtigt at kalibrere strålen under forskellige linseforhold med minimal operatørindgriben. Der er adgang til dosiskalibreringsrutinen via MVS-softwaren, der er installeret på TEM. MVS-softwaren læser automatisk de relevante mikroskopindstillinger for at gemme alle målinger som reference til senere eksperimenter. På nogle TEM'er er det ikke muligt at læse blænde- eller monokromatorindstillingerne, og disse skal indtastes i MVS-softwareindstillingerne af operatøren under kalibreringer og under brug. Der er påmindelser indbygget i softwaren for at hjælpe med at holde disse operatørinputindstillinger opdateret ved at følge programvejledningen. Udviklingen af en holder med en indbygget strømopsamler, snarere end at stole på en integreret andetsteds i mikroskopsøjlen, er et bevidst designvalg. Dette gør det muligt at placere strømkollektoren på samme plan som en prøve, hvilket eliminerer fejl i strømmålingen forårsaget af stråleafbøjning eller forskelle i absorptionen af elektroner ved åbninger ved forskellige strålepositioner. MVS-softwaren følger en automatiseret rutine for at måle strålestrøm og areal for enhver kombination af linseforhold. Softwaren kan derefter korrelere disse målte kalibreringer med kameraets eller skærmens strøm og ekstrapolere eventuelle ændringer i forstørrelse osv. til stråleområdet under eksperimentet. Når de er genereret, kan disse kalibreringsfiler bruges med det samme og gemmes automatisk til senere brug, hvis softwaren registrerer de samme indstillinger, der bruges under en fremtidig session. Selvom kalibreringsfilens levetid varierer fra mikroskop til mikroskop, har forfatterne fundet ud af, at de er i stand til at bruge de samme kalibreringsfiler i flere måneder uden at observere væsentlige ændringer i de aktuelle værdier. Der er indbyggede rutiner, der overvåger emissionsprofilen for våben for at hjælpe med at holde disse kalibreringer relevante, især på kolde FEG-emissionspistoler.

Normalisering af dosismålinger mellem mikroskoper og automatiseret sporing af en prøves stråleeksponering er kritiske funktioner i MVS-softwaren, da de gør det muligt at udføre kvantitative sammenligninger af dosisbetingelser mellem eksperimenter på forskellige mikroskopsystemer. Dosisinduceret nedbrydning af en zeolitprøve (ZSM-5), opnået under identiske eksperimenter med forskellige mikroskoper, resulterer i fuldstændig forsvinden af ^{FFT-pletterne} efter en maksimal kumulativ eller tærskelelektrondosis (~ 60.000 e-/Å 2 ved anvendelse af en dosishastighed på ~ 500 e^-/Å ² · s) for begge opsætninger. Disse sammenlignende resultater viser, at dosissoftwaren muliggør reproducerbare, kvantitative dosismålinger. Den lille forskel i den kumulative dosis, hvor fuld FFT-pletforsvinden observeres for hvert eksperiment, er sandsynligvis et resultat af de forskellige accelerationsspændinger, der anvendes af de to mikroskoper, med lavere accelerationsspændinger, der resulterer i flere strålingsskadeveje, og højere accelerationsspændinger, der typisk resulterer i mere knock-on-skade²⁴. Litteraturresultater for den kritiske dosis ZSM-5 nanopartikler spænder fra 9.000-14.000 e-/Ų ved hjælp af de første FFT-pletforsvindinger, snarere end den fuldstændige forsvinden af alle ^{FFT-pletterne 25,26}. I vores resultater svarer den første FFT-pletforsvinden til en kumulativ dosis på omkring 25.000 e^-/Ų. Tidligere undersøgelser var afhængige af aktuelle målinger opnået ved hjælp af en fosforskærm, som er veldokumenteret for at undervurdere strålestrømsmålinger sammenlignet med en Faraday kop¹⁵. Den bestemte kritiske dosis kan variere med en faktor på to eller flere, afhængigt af hvilken FFT-top der bruges til at spore dosis. Dette indikerer, at de højere rumlige frekvenser nedbrydes først og kan resultere i forskellige værdier afhængigt af den zoneadgang, der blev brugt under målingerne (vores resultater fokuserede på FFT-pletter fra hele zeolitkrystallen snarere end specifikke strukturelle træk)^25,26. Disse forskelle i teknikker og nuværende kalibrering forklarer forskellen i værdier mellem de to eksperimenter, der er rapporteret i vores resultater og tidligere litteraturstudier.

Selvom elektrondosisinteraktionerne er en væsentlig faktor i mange TEM-eksperimenter, er in situ- og specifikt væske-EM-undersøgelser særligt følsomme over for dens virkninger. Elektronstrålens radiolyse af væsker resulterer i en kaskade af kemisk reaktive arter, som kan interagere med prøven, hvilket komplicerer analysen. Både den dosishastighed eller fluens, der anvendes under et væske-EM-eksperiment, og den kumulative dosis kan have indflydelse på koncentrationen af radikale arter, der genereres på grund af flydende radiolyse^27,28. Således tillader indsamling og registrering af både kumulative dosis- og dosishastighedsmetadata gennem et eksperiment direkte korrelation mellem billeder og en prøves dosishistorie og er en mere præcis måde at belyse og kontrollere virkningen af elektronstrålen i disse eksperimenter. Selvom det ikke er dækket af denne protokol, er et eksempel på nytten af dosisstyringsfunktionerne for væske-EM vist i figur 6.

Figur 6: Stråleinduceret vækst af guldnanopartikler under et in situ væske-EM-eksperiment. (A) STEM-oversigt med lav forstørrelse af den resulterende partikelvækst med en farveoverlejring af det kumulative dosiskort over hele regionen. Røde områder i overlejringen angiver områder med høj kumulativ dosiseksponering, og gule områder angiver områder med lavere eksponering. Hvis du fremhæver en enkelt pixel med markøren eller tegner en boks over et område ved hjælp af de medfølgende tegneværktøjer, angives den kumulative dosis for den pågældende pixel eller det pågældende område. Skalabjælken er 2 μm. (B,C) STEM-billeder med højere forstørrelse af de områder, der er angivet med de orange bokse (b,c) i A. Område b, der udsættes for en højere kumulativ dosis (10,811 e-/Å 2) indeholder større partikler end dem, der findes i område c, som blev udsat for en lavere kumulativ dosis (0,032 e^-/Ų). Klik her for at se en større version af denne figur.

Den berigede dosishastighed og metadata for kumulative doser forenkler analysen af dosisafhængige nanomaterialers vækst- og nedbrydningsveje. Figur 6 viser den stråleinducerede reduktion af en opløsning af guldaurinchloridioner (HAuCl3) i vand under væske-EM-eksperimenter. Fra farvedosiskortoverlejringen i figur 6A er det let at visualisere, at den kumulative elektrondosis påvirker den resulterende størrelse og form af nanopartiklerne 29,30,31,32. STEM-oversigten med lav forstørrelse viser regioner, der udsættes for en høj (rød) og lav (gul) kumulativ dosis. Partiklerne i den region, der udsættes for højere doser, er større end partiklerne i de regioner, der udsættes for lavere kumulative doser. Fordi dosismetadataene er direkte indlejret i hvert billede på pixelniveau, kan de komplekse virkninger af elektrondosis i væske-EM-eksperimenter nu systematisk analyseres på en måde, der aldrig før var opnåelig.

I denne protokol har vi demonstreret, at MVS-software giver en omfattende løsning til kalibrering, overvågning og sporing af både elektrondosis og den samlede dosis, der leveres til en prøve på pixel-for-pixel-basis. Denne evne låser op for et nyt paradigme til billeddannelse af dosisfølsomme prøver og forståelse af elektronstråleinteraktionerne. Det er især spændende for væske-EM-eksperimenter, da det vil give mulighed for en mere effektiv undersøgelse af den rolle, elektrondosis spiller og forbedre eksperimentel reproducerbarhed. Det er vores håb, at denne nye ramme vil muliggøre nøjagtig indsamling af oplysninger om dosishastighed og akkumulerede doser, lette deling af disse data med samfundet for en mere nøjagtig fortolkning af TEM-resultater og fremme videnskabeligt samarbejde og datadeling ved at muliggøre FAIR-hovedrapportering og analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARM200F CFEG	JEOL		Transmission Electron Microscope (200 kV)
AXON DOSE Calibration Holder	Protochips, Inc.	AXA-FC-TFS	Dose calibration and management hardware package for ThermoFisher ScientificTEM
AXON DOSE Software:  Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-DOSE-01-1YR	Dose calibration and management software
AXON Studio Software: Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	No Part Number. Available to download at  success.protochips.com	Offline analysis software for AXON datasets.  A free copy of the AXON Studio software is available for down load at:  success.protochips.com
AXON Synchronicity Core	Protochips, Inc.	AXON-CORE	Hardware component of the synchronization software.
AXON Synchronicity Software:  Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-SYNCPRO-01-1YR	Synchronization software
Fusion In-Situ Heating E-chip	Protochips, Inc.	E-FHDC-VO-10	Sample Support E-chip with carbon film.  Used with in situ heating system
Fusion Select In Situ Heating System	Protochips, Inc.	FFAD-6200-EXP	In-situ MEMs heating system for ThermoFisher Scientific TEM.
Gold(III) chloride (50% gold basis) hydrate 50790	Sigma Aldrich	27988-77-8	Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.  Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998)
Iron (III) Oxide 310050 (Fe2O3)	Sigma Aldrich	1309-37-1	Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.  Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998)
Titan ChemiSTEM	ThermoFisher Scientific		Transmission Electron Microscope (300 kV)
Zeolite ZSM-5	Zeolyst	CBV 8014	Nanocatalyst sample:  80 SiO2/Al2O3 Mole Ratio