İletim elektron mikroskobu iş akışlarına, sonuç analizine ve veri yönetimine bir makine görüşü yaklaşımı

Summary

Burada, TEM görüntüleme sırasında dinamik süreçleri stabilize etmek için yapay görme yazılımını kullanmak için bir protokol sunarken, aynı anda her görüntüye birden fazla meta veri akışını gezilebilir bir zaman çizelgesine dizine ekliyoruz. Bu platformun bir deney boyunca elektron dozunun otomatik kalibrasyonunu ve haritalanmasını nasıl sağladığını gösteriyoruz.

Abstract

İletim elektron mikroskobu (TEM), kullanıcıların malzemeleri temel, atomik ölçekte incelemelerini sağlar. Karmaşık deneyler rutin olarak zaman alıcı ve karmaşık analiz gerektiren çok sayıda parametreye sahip binlerce görüntü oluşturur. AXON eşzamanlılığı, TEM çalışmalarının doğasında bulunan sorunlu noktaları ele almak için tasarlanmış bir makine görüşü senkronizasyonu (MVS) yazılım çözümüdür. Mikroskopa kurulduktan sonra, bir deney sırasında mikroskop, dedektör ve yerinde sistemler tarafından üretilen görüntülerin ve meta verilerin sürekli senkronizasyonunu sağlar. Bu bağlantı, görüş alanındaki ilgi çekici bir bölgeyi merkezlemek ve izlemek için mekansal, ışın ve dijital düzeltmelerin bir kombinasyonunu uygulayan ve anında görüntü sabitleme sağlayan makine görüşü algoritmalarının uygulanmasını sağlar. Bu tür bir stabilizasyonun sağladığı çözünürlükteki önemli iyileşmeye ek olarak, meta veri senkronizasyonu, görüntüler arasındaki değişkenleri hesaplayan hesaplama ve görüntü analizi algoritmalarının uygulanmasını sağlar. Bu hesaplanan meta veriler, eğilimleri analiz etmek veya bir veri kümesindeki temel ilgi alanlarını belirlemek için kullanılabilir, bu da gelecekte yeni içgörülere ve daha gelişmiş yapay görme yeteneklerinin geliştirilmesine yol açar. Bu hesaplanan meta verilere dayanan böyle bir modül, doz kalibrasyonu ve yönetimidir. Doz modülü, numunenin belirli alanlarına piksel piksel bazda verilen elektron akıcılığının (e-/ş2·^s-1) ve kümülatif dozun (e^-/Ų) son teknoloji kalibrasyonunu, takibini ve yönetimini sağlar. Bu, elektron ışını ve numune arasındaki etkileşime kapsamlı bir genel bakış sağlar. Deneme analizi, görüntülerden ve ilgili meta verilerden oluşan veri kümelerinin kolayca görselleştirildiği, sıralandığı, filtrelendiği ve dışa aktarıldığı özel bir analiz yazılımı aracılığıyla kolaylaştırılmıştır. Bir araya geldiğinde, bu araçlar verimli işbirliklerini ve deneysel analizleri kolaylaştırır, veri madenciliğini teşvik eder ve mikroskopi deneyimini geliştirir.

Introduction

İletim elektron mikroskopları (TEM'ler) ve yetenekleri, kameralar, dedektörler, numune tutucular ve bilgi işlem teknolojilerindeki gelişmelerden büyük ölçüde yararlanmıştır. Bununla birlikte, bu ilerlemeler bağlantısı kesilmiş veri akışları, insan operasyonunun sınırlamaları ve hantal veri analizi ^1,2 nedeniyle engellenmektedir. Ayrıca, yerinde ve operando deneyleri, TEM'leri gerçek zamanlı nano ölçekli laboratuvarlara uyarlayarak, numunelerin gaz veya sıvı ortamlarda incelenmesini sağlarken, aynı anda bir dizi dış uyaran ^3,4,5 uygular. Bu tür karmaşık iş akışlarının benimsenmesi yalnızca bu sınırlamaları büyütmüştür ve bunun sonucunda bu veri akışlarının boyutunun ve karmaşıklığının artması giderek artan bir endişe alanıdır. Bu nedenle, FAIR ilkeleri⁶ olarak bilinen bir uygulama olan verileri bulmak, erişmek, birlikte çalıştırmak ve yeniden kullanmak için makine eyleme geçirilebilirliğinin kullanılmasına giderek daha fazla vurgu yapılmaktadır. Araştırma verilerinin FAIR ilkeleri kavramına uygun olarak yayınlanması, dünyanın dört bir yanındaki devlet kurumlarından olumlu ilgi görmüştür ^7,8 ve FAIR ilkelerinin makine görüşü yazılımı kullanılarak uygulanması, benimsenmelerinde önemli bir adımdır.

Karmaşık, meta veri ağırlıklı TEM deneylerinin (özellikle in situ ve operando deneyleri) gerçekleştirilmesi ve analiz edilmesinin doğasında bulunan belirli sorunlu noktalara yanıt olarak bir makine görüşü senkronizasyonu (MVS) yazılım platformu ^{geliştirilmiştir9}. TEM'e kurulduktan sonra, MVS yazılımı mikroskop sütununa, dedektörlere ve entegre yerinde sistemlere bağlanır, entegre olur ve iletişim kurar. Bu, görüntüleri sürekli olarak toplamasına ve bu görüntüleri deneysel meta verileriyle hizalamasına olanak tanıyarak kapsamlı bir aranabilir veritabanı, denemenin baştan sona bir zaman çizelgesi oluşturur (Şekil 1). Bu bağlantı, MVS yazılımının, numuneler morfolojik değişikliklere uğrarken bile, bir ilgi alanını (ROI) akıllıca izleyen ve stabilize eden algoritmalar uygulamasına olanak tanır. Yazılım, Drift Kontrolü ve Odak Yardımı işlevleri aracılığıyla yatırım getirisini dengelemek için gerektiğinde sahne, ışın ve dijital düzeltmelere ayarlamalar uygular. Görüntüleri farklı deneysel sistemlerden üretilen ham meta verilerle zenginleştirmenin yanı sıra, yazılım, görüntüler arasındaki değişkenleri hesaplamak için görüntü analiz algoritmalarını kullanarak yeni, hesaplamalı meta veriler üretebilir, bu da örnek sürüklenmesi veya odaktaki değişiklikler için otomatik olarak düzeltilmesini sağlar.

TEM görüntüleri ve MVS yazılımı aracılığıyla toplanan ilişkili meta veriler, analiz yazılımının ücretsiz, çevrimdışı sürümü Studio (bundan böyle analiz yazılımı olarak anılacaktır) aracılığıyla herkes tarafından açılabilen ve görüntülenebilen deneysel bir zaman çizelgesi olarak ^{düzenlenmiştir10}. Bir deney sırasında, MVS yazılımı, mikroskopun kamerasından veya dedektöründen, görüntü görüntüleyicinin altındaki zaman çizelgesinin en üstünde görüntülenen üç tür görüntüyü senkronize eder ve kaydeder: tek edinme (doğrudan TEM yazılımından elde edilen bireysel tek edinme görüntüleri), ham (dedektör / kamera canlı akışından herhangi bir dijital sürüklenme düzeltmesi uygulanmamış görüntüler; bu görüntüler fiziksel olarak düzeltilmiş olabilir. sahne alanı hareketi veya ışın kayması) ve sürüklenme düzeltildi (dedektör/kamera canlı akışından dijital olarak sürüklenen görüntüler). Bir deneme veya oturum sırasında toplanan veriler, gömülü meta veri kaybı olmadan koleksiyonlar olarak bilinen daha küçük bölümler veya veri parçacıkları halinde daha da hassaslaştırılabilir. Analiz yazılımından, görüntüler, görüntü yığınları ve meta veriler, diğer araçlar ve programlar kullanılarak analiz için doğrudan çeşitli açık biçimli görüntülere ve elektronik tablo türlerine aktarılabilir.

MVS yazılımı tarafından sağlanan mikroskop kontrolü, stabilizasyon ve meta veri entegrasyonu çerçevesi, mevcut TEM iş akışlarındaki sınırlamaları hafifletmek için tasarlanmış ek yapay görme programlarının veya modüllerinin uygulanmasına da izin verir. Bu senkronizasyon platformundan yararlanmak için geliştirilen ilk modüllerden biri, elektron dozu kalibrasyonu ve numune içindeki ışına maruz kalan alanların mekansal takibidir. Tüm TEM görüntüleri, numune ile elektron ışını arasındaki etkileşimden oluşur. Bununla birlikte, bu etkileşimler aynı zamanda radyoliz ve zincirleme hasar 11,12 gibi numune üzerinde olumsuz, kaçınılmaz etkilere neden olabilir ve görüntüyü oluşturmak için yeterince yüksek bir elektron dozu uygulamak ile ortaya çıkan ışın hasarını en aza indirmek arasında dikkatli bir denge gerektirir ^13,14.

Birçok kullanıcı elektron dozunu tahmin etmek için ekran akımı ölçümlerine güvense de, bu yöntemin gerçek ışın akımı^15'i büyük ölçüde hafife aldığı gösterilmiştir. Kalitatif doz değerleri, aynı mikroskopta aynı ayarlara sahip ekran akımı ile elde edilebilir, ancak bu doz koşullarının farklı mikroskoplar veya ayarlar kullanılarak çoğaltılması oldukça özneldir. Ek olarak, deney sırasında kullanıcı tarafından yapılan spot boyutu, diyafram açıklığı, büyütme veya yoğunluk gibi herhangi bir görüntüleme parametresi ayarlaması, elde edilen dozu hesaplamak için ekran akımının ayrı bir ölçümünü gerektirir. Kullanıcılar ya belirli bir deney sırasında kullanılan görüntüleme koşullarını titizlikle sınırlamalı ya da kullanılan her lens durumunu titizlikle ölçmeli ve kaydetmeli, bu da deneyi mikroskopun normal çalışması için mümkün olanın ötesinde önemli ölçüde karmaşıklaştırmalı ve genişletmelidir^16,17.

Bu protokol için doz yazılımı olarak adlandırılan doz, otomatik akım ölçümlerini etkinleştirmek için tasarlanmış özel bir kalibrasyon tutucu kullanan bir doz kalibrasyon yazılımı modülüdür. Doğru ışın akımı kalibrasyonu¹⁵ için altın standart olan Faraday kabı, kalibrasyon tutucusunun ucuna entegre edilmiştir. MVS yazılımı, her lens durumu için bir dizi ışın akımı ve ışın alanı kalibrasyonu gerçekleştirir ve bu değerleri görüntülere piksel düzeyinde gömer.

Bu video makalesinde, TEM iş akışının tüm alanlarını geliştirmek için tasarlanmış MVS yazılım protokolleri, temsili nanomalzeme örnekleri kullanılarak sunulmuştur. Kalibrasyon ve doz yönetimi iş akışlarını göstermek için ışına duyarlı bir zeolit nanopartikül numunesi¹⁴ kullanılır. Isıtıldığında önemli morfolojik değişikliklere uğrayan bir Au / FeO_x nanokatalizör^18,19 numunesi kullanarak temsili bir yerinde ısıtma deneyi gerçekleştiriyoruz. Bu yerinde deney, yazılımın stabilizasyon algoritmalarını ve in situ ve operando çalışmaları için doğal bir zorluk olan çoklu meta veri akışlarını harmanlama yeteneğini vurgulamaktadır. Protokolde tanımlanmamış olmasına rağmen, benzersiz elektron doz duyarlılığı nedeniyle, yazılımın sıvı-EM çalışmaları için faydasının temsili örneklerini (protokoller daha önce literatürde^20,21,22 bildirilmiştir) ve dozun sıvı-EM deneyleri üzerindeki etkisinin anlaşılmasını geliştirmek için bu tekniklerin nasıl uygulanabileceğini tartışıyoruz. Son olarak, çeşitli görüntü, video ve veri dosyalarını görselleştirmek, filtrelemek ve diğer erişilebilir biçimlerde dışa aktarmak için çevrimdışı analiz yazılımı kullanılarak veri analizinin nasıl kolaylaştırıldığını gösteriyoruz.

Şekil 1: MVS ve analiz yazılımı için kullanıcı arabirimi örnekleri . (A) Senkronizasyon yazılımı görüntü görüntüleme bölmesi ve kontrol paneli. TEM ve senkronizasyon yazılımı arasındaki bağlantı, görüntüleri ve meta verileri mikroskoptan senkronizasyon yazılımına aktaran Connect düğmesi etkinleştirilerek kurulur. Görüntü görüntüleyiciden operatör, Drift Düzeltme ve Odaklama Yardımı gibi çeşitli yapay görme destekli işlemleri gerçekleştirebilir. Ayrıca, veri toplamayı kesintiye uğratmadan Etiket Görüntüleri ve İnceleme Oturumu'nu uygulama olanağı sağlar. (B) Görüntü Görüntüleme Bağlantı Noktasının, Zaman Çizelgesinin ve Meta Veri ve Analiz panelinin konumunu vurgulayan görüntü analiz yazılımının ekran görüntüsü. Analiz yazılımına, Oturumu Gözden Geçir düğmesi kullanılarak o zamana kadar elde edilen görüntüleri incelemek için bir deneme sırasında herhangi bir noktada erişilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

1. Yöntem 1: TEM ve tarama TEM (STEM) görüntüleme modları için transmisyon elektron mikroskobunun doz kalibrasyonu

1. Pikoammetreyi açın ve bir doz kalibrasyonuna başlamadan önce en az 30 dakika ısınmasına izin verin. Doz kalibrasyon tutucusunu TEM'e yükleyin ve hızlı bağlantı kablosunu kullanarak kalibrasyon tutucuyu pikoammetreye bağlayın.
2. Mikroskop TEM modundayken, kolon valflerini açın ve doz tutucu üzerindeki 35 μm referans deliğini bulun (Şekil 2). MVS yazılım uygulamasını başlatın ve deneme seçeneklerinden Doz (Kalibrasyon Otomasyonu) öğesini seçin.
   NOT: Referans delik konumu, ilk kalibrasyondan sonra yazılım tarafından kaydedilir ve yazılımın gelecekteki kalibrasyonlar için konumunu otomatik olarak bulmasını sağlar.
3. Bağlan simgesine tıklayın (Şekil 1A) ve TEM ile MVS yazılımı arasındaki bağlantıyı etkinleştirmek için mikroskobu seçin. Bağlandıktan sonra, kameradan/dedektörden gelen görüntüler yazılımın resim görüntüleyicisinde görünür olacaktır.
   NOT: Ösentrik yüksekliği optimize etmek gerekli değildir ve ucun kalınlığı nedeniyle referans deliğinin kenarı bulanık görünebilir. Bu, mevcut ölçümleri etkilemeyecektir.
4. Doz sekmesine ve ardından Doz Kalibrasyonu'na gidin. Doz Alanı Kalibrasyon işlemi'ni seçin, yazılım istemlerini izleyin ve istenen kullanıcı tarafından yapılandırılabilir değerleri (diyafram açıklığı ve monokromatör ayarları gibi) girin. Doz Alanı Kalibrasyonu tamamlandıktan sonra, Doz Akımı Kalibrasyon işlemini seçin ve yazılım istemlerini izleyin.
5. Deney sırasında kullanılabilecek her nokta boyutu, diyafram açıklığı veya tek renkli ayar için kalibrasyon işlemini (adım 1.4) tekrarlayın.
6. TEM modu için kalibrasyon işlemi tamamlandığında, adım 1.4'ü tekrarlayarak STEM modu için elektron dozunu kalibre edin.
   NOT: STEM modu, Doz Alanı Kalibrasyonunun yapılmasını gerektirmez.
7. İstenen tüm kalibrasyonlar bittiğinde, Oturumu Kapat'a tıklayın, doz kalibrasyon tutucusunu çıkarın ve MVS yazılımının başlangıç ekranına dönün.

2. Yöntem 2: MVS ve doz yazılımı kullanılarak doz eşiğinin belirlenmesi

1. Standart bir TEM ızgarasını bir numune ile (bu örnekte ticari olarak temin edilebilen ZSM-5 zeolit nanopartikülleri kullanılmıştır) standart bir TEM tutucusuna yükleyin. Tutucuyu TEM'e yerleştirin ve ilgilenilen bir bölgeyi (kristalin zeolit nanopartikülleri) bulun.
2. MVS yazılım uygulamasını açın ve Diğer'i seçin.
   NOT: Numune hakkında ek bilgiler (ör. numune tanımlayıcısı ve açıklaması, operatör adı ve deney notları) deneysel parametreler alanına eklenebilir.
3. MVS yazılımına bağlanmak için adım 1.3'ü tekrarlayın ve canlı ekranda gösterilen görüntü akışına bindirmek üzere aşağıdaki meta verileri seçmek için MVS yazılım arabirimindeki görüntü meta verileri sekmesine gidin: Büyütme, Maksimum Doz ve Doz Hızı. Kullanıcı isterse diğer meta veriler dahil edilebilir. Doz yönetimi kontrollerini gösteren MVS yazılım arayüzünün ekran görüntüsü Ek Dosya 1'de verilmiştir.
4. Doz sekmesini açın ve otomatik elektron dozu izlemeyi etkinleştirmek için Doz Yönetimi ve Doz İzlemeyi Etkinleştir'i seçin. Doz rengi kaplamasını görüntülemek için Doz Katmanını Göster'i seçin.
5. Yüksek doz seviyesi ve yüksek doz oranı değerlerini ayarlayın ve Kaydet'e basın (bu örnekte, sırasıyla 60.000 e-/Ų ve 500 e^-/Ų·s değerleri kullanılmıştır).
6. Ayarlar sekmesine gidin, Doz'u seçin ve Doz Navigasyon Haritası Opaklığı ve Doz Görüntüsü Bindirmesi Opaklık değerlerini ayarlayın (bu örnekte sırasıyla 0,50 ve 0,30 değerleri kullanılmıştır).
7. Canlı Görüntü Görüntüleyici penceresinde, Sürüklenme Düzeltme'ye tıklayarak sürüklenme düzeltmeyi etkinleştirin.
8. Veri Görünümü sekmesine gidin ve Y eksenindeki Bulanıklaştırma ve Odak Bölümü meta veri değerlerini çizin.
   NOT: Kullanılabilir meta veri değerlerinden herhangi biri, deneme sırasında veri görünümü tablosundan gerçek zamanlı olarak çizilebilir.
9. Odaklama Yardımı'nı etkinleştirin ve ardından otomatik netleme yardımı kalibrasyonunu çalıştırmak için Netlemeyi Kalibre Et'i seçin. Odağı Kalibre Et rutini tamamlandıktan sonra Veri Görünümü sekmesini kapatın.
10. MVS yazılımında Görüntü Analizi sekmesini açın ve Canlı FFT ve Kadranlar 1 ve 2 seçeneklerini etkinleştirin.
11. Mikroskopun yazılım kontrollerini kullanarak, ışın koşullarını elektron akısı ~ 500 e^-/Ų · s olacak şekilde ayarlayın ve numunede yeni bir bölgeye gidin ve MVS yazılımının canlı görüntüsünde örnek YG'yi ortalayın.
    NOT: Büyük sahne hareketleri yaparken, sürüklenme kontrolü ve odak yardımı otomatik olarak devre dışı bırakılır ve yeni ROI seçildikten sonra yeniden devreye sokulmalıdır.
12. Tag işlevini kullanarak yazılımdaki doz koşullarını not edin. Etiket simgesini vurgulayın ve zaman çizelgesindeki belirli bir görüntü serisini belirtmek için istediğiniz metni girin. Resimler, Etiket simgesinin seçimi kaldırılana kadar bu metinle etiketlenir.
13. FFT grafiğindeki atomik yapıya karşılık gelen zirveler kaybolana kadar aynı ROI'yi sürekli olarak görüntülerken sabit bir doz oranını koruyun.
14. Büyütmeyi azaltın, Doz Yönetimi sekmesini açın ve renk kodlu bir doz haritasını kaplamak için Doz Katmanını Göster'i etkinleştirin.
    NOT: Bu özellik, numunenin elektron ışınına maruz kalan alanlarının ve bunların göreceli doz maruziyetinin görsel bir referansını sağlar. Bu alanların imleçle tek tek görüntülerde vurgulanması, ilgili doz değerlerini gösterecektir.
15. Bağlan'ın seçimini kaldırarak oturumun bağlantısını kesin ve sonlandırın, ardından Oturumu Kapat'ı seçin. MVS yazılımında kaydedilen verilerin sonraki deneyler sırasında üzerine yazılmasını önlemek için oturum verilerinin bir kopyasını harici bir kaynağa kaydedin (Ek Dosya 2).

3. Yöntem 3: Meta veri ve trend analizi ve analiz yazılımı kullanılarak veri dışa aktarma

1. Analiz yazılımını (tam olarak eşitlenmiş veri kümelerini görüntülemek için çevrimdışı yazılım) başlatın ve deneme oturumu dosyasını dosya kitaplığından seçerek açın.
   NOT: Kullanıcılar, bir deneme sırasında MVS yazılımındaki Gözden Geçirme Oturumu simgesi aracılığıyla analiz yazılımına da erişebilir.
2. Image View Port'un altındaki DC sekmesini etkinleştirerek sapma düzeltilmiş görüntüleri görüntüleyin ve Image Metadata sekmesindeki ilgili Bindirme Verileri kutularını işaretleyerek istediğiniz veri bindirmelerini seçin (bu örnekte Mikroskop, Tarih/Saat, Doz Hızı, Maksimum Doz ve Büyütme kullanılmıştır). Diğer meta veriler kullanıcının istediği gibi çizilebilir.
3. Bu değerlerin grafiksel bir grafiğini zaman çizelgesine eklemek için Maksimum Doz ve Doz Oranı için Zaman Çizelgesi kutusunu işaretleyin. Görüntü penceresinde görüntülenen görüntüyü güncellemek için bu grafik çizimleri vurgulayın veya grafikler arasında kaydırın. Notlar, Görüntü Analizi, Araç Kutusu ve Veri Görünümü sekmeleri aracılığıyla çeşitli araçlara erişin.
   1. Görüntü Analizi sekmesinden her görüntünün FFT'sine erişin ve görüntüler arasında gezinirken FFT'yi güncellemek için Canlı FFT'ye tıklayın.
   2. Zeolit yapısının kristalliğini kaybettiği zaman noktasını belirlemek için FFT zirvelerinin solmasını kullanın. Bu görüntüyle kaydedilen maksimum doz değerini kaydedin.
4. İlişkili meta verilerini kaybetmeden büyük veri kümelerini kolayca daha küçük, paylaşılabilir veri kümelerine filtrelemek için Filtre seçeneğini kullanın. Filtre panelini açın ve kaydırıcıları yalnızca doz hızı ~500 e^-/Ų·s veya daha yüksek olan veriler seçilecek şekilde ayarlayın ve Doz Eşiği Etüdü adını kullanarak yeni koleksiyonu kaydedin.
   NOT: İlişkili meta veri türlerinden herhangi biri için filtreler uygulanabilir.
5. Oturumdaki görüntüleri ve meta verileri, ölçek çubukları ve meta veri kaplamalarıyla zenginleştirilmiş diğer dosya türlerine dışa aktarın.
   1. Kitaplık bölmesinde koleksiyonu vurgulayın ve seçimi sağ tıklatarak Yayımla'yı seçin. Yayınla penceresinden, dosya türü dışa aktarma için istediğiniz seçenekleri belirleyin.
   2. Sapma düzeltilmiş veri sekmesini seçin ve istenen meta verilerin ve FFT'nin bindirmelerini uygulayın (FFT bindirmesini istediğiniz gibi konumlandırın; FFT ile dışa aktarılan görüntülerin örnekleri Şekil 3'te gösterilmiştir).
6. Aynı Yayınla seçeneğini kullanarak görüntü serisini film dosyası olarak dışa aktarın. Görüntüleri zaman çizelgesinde vurgulayarak, filtre seçeneklerini kullanarak veya tam veritabanı dosyasını dışa aktararak seçin. İstediğiniz film formatını, kare hızını ve dosya konumunu seçin. 200 kV TEM kullanılarak elde edilen zeolit bozunma deneyinin bir filmi Ek Dosya 3'te verilmiştir.
7. Yayınlarken Meta Veri (CSV) seçeneğini belirleyerek meta verileri edinilen görüntülerden ayrı olarak CSV dosyası olarak dışa aktarın.
   NOT: Ham ve sapma düzeltilmiş görüntüler ayrı CSV (Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5) olarak dışa aktarılır.

4. Yöntem 4: Demir oksit nanopartikülleri üzerinde altının yerinde ısıtma çalışması

1. Etanol içinde asılı bir nanokatalizörü (Au/FeO_x) bir in situ ısıtıcı E-çipe, bir miko-elektrokmekanik (MEM) numune desteğine bırakın ve havayla kurumasını sağlayın. Numuneyi yerinde ısıtma tutucusuna monte edin, tutucuyu numuneyle birlikte TEM'e takın ve birlikte verilen kabloyu kullanarak tutucuyu güç kaynağına bağlayın. TEM kontrollerini kullanarak örnek bir yatırım getirisi bulun.
   NOT: Bu deneyde, MVS yazılımıyla tamamen entegre olan ve sıcaklık meta verilerinin görüntülere gömülmesini sağlayan bir ısıtma tutucusu kullanılmıştır.
2. MVS yazılımından uygun iş akışı seçeneğini belirleyin (bu örnekte, Fusion İş Akışı kullanılmıştır, ancak Diğer seçilerek diğer üretici ısıtma tutucuları kullanılabilir).
3. Kalibrasyon dosyasını yükleyerek ve bir cihaz kontrolü gerçekleştirerek tutucu ile ısıtma E-çipi arasındaki elektrik bağlantısını onaylamak için iş akışı istemlerini izleyin.
4. Mikroskopu, daha önce 2.3-2.10 adımlarında gösterildiği gibi MVS yazılımına bağlayın (bu örnekte, doz hızı, maksimum doz, eşleşme korelasyonu, sürüklenme hızı ve kanal A sıcaklığı için meta veri değerleri seçilmiştir) ve örnek YG'yi görüş alanında ortalayın.
5. Fusion AX sekmesini açın ve bir sıcaklık ayarlayıp uygulayın.
6. Sıcaklık kontrolü ayarlarına erişmek için Kanal A Kurulumu düğmesini tıklatın. Sıcaklık fonksiyonunu ve Manuel kontrol modunu seçin.
7. Deneme amaçlı kontrollere erişmek için Deneme düğmesini tıklayın. Rampa Hızını 10 °C/s ve Hedefi 600 °C'ye ayarlayın. Denemeyi başlatmak için Uygula'yı tıklayın.
   NOT: Deneme, MVS yazılımının sağ alt köşesindeki hızlı erişim düğmeleri kullanılarak Fusion AX sekmesi açılmadan herhangi bir zamanda duraklatılabilir veya durdurulabilir.
8. 600 °C ayarlanan sıcaklığa ulaşıldıktan sonra Fusion AX sekmesini açın ve Deney'i seçin. Rampa hızını 2 ° C ve hedefi 800 ° C olarak değiştirin. Denemeyi başlatmak için Uygula'yı tıklayın.
   NOT: Bir ısıtma rampasının uygulanması prosedürü, kullanılan yerinde ısıtma sistemine bağlıdır. Sıcaklık rampasını uygulamak için yukarıda vurgulanan adımlar, bu örnekte kullanılan sistem için geçerlidir.
9. 2.10 adımında gösterildiği gibi, etiketleme özelliğini kullanarak deneme sırasında tüm olayları veya ilgi çekici noktaları vurgulayın. Numuneyi görüntülemeye devam edin ve sıcaklık profilini istediğiniz gibi ayarlayın. İşiniz bittiğinde, Oturumu Sonlandır'a tıklayın ve analiz yazılımını kullanarak veri dosyasını kaydedin (temsili sonuçlarda tartışılan veritabanı dosyasının bir kısmı Ek Dosya 6 olarak sağlanır).
10. Oturumu gözden geçirmek için analiz yazılımını açın. Zaman çizelgesinde sıcaklığı, şablon dönüştürme faktörünü, doz oranını ve kümülatif dozu grafiklendirin. Adım 3.6 ve 3.7'de özetlenen adımları kullanarak görüntüleri ve filmleri istediğiniz gibi dışa aktarın. Görüntüler ve filmler, doz haritası kaplamalarıyla birlikte veya bunlar olmadan dışa aktarılabilir (Şekil 4).

Representative Results

Bu çalışma, TEM görüntüleme ve yerinde deneyler için MVS yazılımını kullanarak veri toplamanın faydasını vurgulamaktadır. Mikroskop hizalaması ve koşul kurulumu, TEM üreticisinin varsayılan kontrolleri aracılığıyla gerçekleştirildi ve seçildi. İlk kurulumdan sonra, bu video makalesinde sunulan protokoller MVS yazılımı aracılığıyla gerçekleştirildi. 200 kV soğuk FEG kullanılarak elde edilen karşılaştırma zeolit verileri hariç, video protokolünde ve temsili verilerde sunulan tüm deneyler için 300 kV TEM kullanılmıştır (Şekil 3D-F ve Tablo 1). Tüm meta veriler, MVS yazılımı tarafından otomatik olarak toplandı ve ilgili görüntülerine hizalandı.

Yazılımı başlattıktan ve menüden uygun iş akışını seçtikten sonra, Şekil 1A'da gösterildiği gibi, resim görüntüleyicinin en solundaki araç çubuğundaki Bağlan düğmesi etkinleştirilerek mikroskopla bağlantı kurulur. Bağlan düğmesi vurgulandığında, mikroskoptan gelen görüntüler ve ilişkili meta veriler otomatik olarak MVS yazılımına aktarılır ve görüntü görünümü bölmesinde görünür. Bu görüntüler ve bunlarla ilişkili meta veriler, yeni verilerin zaman çizelgesine kaydedilmesini kesintiye uğratmadan açılabilen, incelenebilen ve analiz edilebilen bir zaman çizelgesine kronolojik olarak kaydedilir (Şekil 1B). Akış, Bağlan simgesini devre dışı bırakarak kullanıcı tarafından herhangi bir zamanda kesintiye uğratılabilir.

Bağlantı etkinleştirildikten sonra, MVS yazılım çerçevesine bağımlı olan diğer iş akışlarına erişilebilir. Bu video protokolünde gösterilen örneklerde, MVS yazılımının diğer işlevlerini kullanmadan önce bir doz kalibrasyonu yapılmalıdır. Doz kalibrasyonu, MVS yazılımı tarafından kontrol edilen otomatik bir prosestir; parametrelerin kombinasyonu için ışının akımını ve alanını ölçmek için özel bir Faraday fincan doz kalibrasyon tutucusu kullanır. Şekil 2'de gösterilen Faraday kabı kalibrasyon tutucusu, ışın akımını hassas bir şekilde ölçen harici bir pikoammetreye bağlanır. Mikroskopa yerleştirildikten sonra, referans hizalama deliği ortalanır ve kalibre edilmesi istenen ışın koşulları (spot boyutları, açıklıklar ve büyütmeler) yazılıma girilir. Yazılım, seçilen koşulların her kombinasyonu için bir dizi kalibrasyon adımı gerçekleştirir. Doz kalibrasyonu sırasında, tutucu entegre Faraday akım toplayıcı kabı ile geçiş deliği arasında otomatik olarak hareket eder. Lens koşullarının her kombinasyonu için mevcut ölçüm, Faraday kabında pikoammetre ile ölçülür. Daha sonra, yazılım sahneyi delikteki kirişi ortalamak için çevirir ve ışın alanı makine görüşü algoritmaları aracılığıyla belirlenir. Bu ölçüm serisi, yoğunluk/parlaklık ve ışın alanı arasındaki ilişkinin bir profilini oluşturur. Bu, görüş alanından bağımsız olarak bir deney sırasında yoğunluk/parlaklık ayarı ayarlandığı için yazılımın ışın alanını tahmin etmesini sağlar. Kümülatif doz ve doz oranı değerleri, bu ışın akımı ve ışın alanı ölçümleri kullanılarak hesaplanır ve bir doz kalibrasyon dosyası oluşturulur. Bu işlem esas olarak TEM ve bireysel lens koşulları için bir doz "parmak izi" tanımlar. Doz TEM için kalibre edildikten sonra, kullanıcı normal şekilde çalışabilir ve doz bilgisi kaybı veya manuel not alma¹⁷ olmadan büyütme ve yoğunluğu serbestçe ayarlayabilir. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, doz kalibrasyon tutucusu çıkarılır ve numunenin normal şekilde yerleştirilmesine izin verilir. Hem TEM hem de STEM modları için kalibrasyon işlemi normalde 10 dakikadan az sürer.

Doz koşullarını kalibre ettikten sonra, ticari olarak satın alınan bir zeolit nanopartikül (ZSM-5) numunesi, numunenin yapısal bilgi sağlamak için çok hasar gördüğü eşik (kümülatif) dozu belirlemek için yüksek doz hızı koşulları altında görüntülendi. ZSM-5 nanopartikülleri etanol içinde askıya alındı ve geleneksel bir bakır TEM ızgarasında damlatıldı. TEM modunda 300 kV'da 3 spot boyutu ve 100 μm kondenser açıklığı kullanılarak sürekli olarak görüntülendiler. MVS yazılımı tarafından yüksek doz hızı koşulları altında okunan doz hızı 519 e^-/Ų·s idi. Görüş alanındaki nanopartiküller, FFT'deki zirveler kaybolana kadar sürekli olarak görüntülendi, bu da Şekil 3A-C ve Ek Dosya 3'te gösterildiği gibi kristalin yapının bozulduğunu gösteriyor. Tarih ve saati, doz oranını, maksimum (kümülatif) dozu ve büyütmeyi göstermek için BINDIRMELER (canlı bir deney sırasında veya analiz yazılımında daha sonra eklenebilir) TEM görüntülerine uygulanmıştır. Doz oranı deneyler sırasında sabit tutuldu, kümülatif doz (maksimum doz) zamanın bir fonksiyonu olarak arttı. FFT pikleri 42 sn sürekli görüntülemeden sonra kaybolmaya başladı (Şekil 3B). 1 dakika ve 20 sn ve ~ 60.000 e^-/Ų kümülatif dozda, FFT pikleri tamamen kaybolmuştu (Şekil 3C).

Bu kalibrasyon yönteminin, farklı ortamlarda çalışan diğer mikroskoplara uygulanabilecek nicel doz ölçümleri ürettiğini göstermek için, aynı kalibrasyon işlemi ve zeolit bozunma deneyi, 200 kV soğuk alan emisyon tabancası (FEG) TEM ve 1 spot büyüklüğü kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu mikroskop, Yöntem 1'de açıklanan aynı prosedür kullanılarak kalibre edildi ve Yöntem 2'de açıklanan aynı deney, yeni nokta boyutu ve diyafram ayarları kullanılarak gerçekleştirildi. Işın ayarları, iki deney arasındaki uygulanan doz oranındaki fark ihmal edilebilir olacak şekilde ayarlandı (499 e-/ş2·s ve 519 e^-/Ų·s). Şekil 3 D-F'de gösterildiği ve Tablo 1'de özetlendiği gibi, FFT lekeleri 1 dakika ve 50 s sürekli görüntüleme ve ilk deneyde elde edilen değerlerle uyumlu olan 58.230 e^-/Å2'lik kümülatif bir dozdan sonra tamamen kaybolur.

MVS yazılımının yerinde deneylerden nasıl yararlanabileceğine dair bir örnek, bir ısıtma deneyi yapılarak gösterilmiştir. Temsili bir nanokatalizör örneği olan Au / FeO_x (yayınlanmış bir prosedür^19'u takiben sentezlenir), yüksek sıcaklıklarda dinamik morfolojik ve yapısal değişikliklere uğradığı için örnek bir sistem olarak seçildi. Sıcaklığa bağlı bu hareketlilik, numunenin kendi hareketi ve sıcaklık değişimleri sırasında numunenin kendisini destekleyen termal genleşmesi nedeniyle YG'yi görüş alanı içinde merkezde tutmayı zorlaştırır¹⁸. Sapma Düzeltme ve Odaklama Yardımı özellikleri etkinleştirildiğinde, numune 800 ° C'de ~ 30 sn'lik bir süre boyunca görüntülendi. Yüksek sıcaklıklarda, Au / FeO_x içindeki altın nanopartiküller, demir oksit desteğinin yüzeyi boyunca göç etti ve Şekil 4'te ve Ek Dosya 7'de bir film olarak gösterildiği gibi daha büyük parçacıklar oluşturmak için sinterlendi. Şekil 5, bir in situ ısıtma deneyi sırasında çeşitli zaman noktalarında (Şekil 5G) kaydedilen bir Au / FeO_x nanokatalizörü içindeki gözenekli bir bölgenin bir dizi TEM anlık görüntüsünü (Şekil 5A-F) göstermektedir. ROI'nin koordineli sürüklenme değeri yazılım tarafından otomatik olarak hesaplandı. Seri boyunca görüntülerin koordineli sürüklenme ve sıcaklık değerleri Şekil 5G'de grafiksel olarak gösterilmiştir. Beklendiği gibi, numunenin koordineli sürüklenmesi, sıcaklık profili arttıkça, ~ 9 nm / dak'dan ~ 62 nm / dak'ya kadar artar ve sıcaklık sabit tutuldukça seviyelendirmeye doğru azalmaya başlar. Bu yüksek sürüklenme oranına ve numunenin morfolojisindeki değişikliklere rağmen, Ek Dosya 8'de gösterildiği gibi, sıcaklık artışı sırasında yüksek çözünürlüklü görüntüler kolayca elde edilir ve gözenekli bölge içindeki hareketi ortaya çıkarır. İndirme talimatları ve bilgisayar özellikleri için Ek Dosya 9'a bakın.

Şekil 2: Elektron dozu kalibrasyonu ve takibi . (A) Doz, ışın akımı ölçümleri için numune düzlemine yerleştirilmiş bir akım toplayıcı içeren özel bir numune tutucu kullanılarak kalibre edilir. (B) Uç tasarımının özelliklerinin gösterimi: Sol: Faraday fincanı; Orta: referans deliği; Sağda: delikten (C). Uygulanan elektron dozu, bir görüntüdeki farklı doz maruziyetlerini belirtmek için renk kodlu haritalar kullanılarak yazılımda görselleştirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Zeolit (ZSM-5) nanopartiküllerinin elektron dozuna bağlı bozunması. (A-C) 300 kV FEG ve 519 e-/Ų· ölçülen doz oranı ile elde edilen bozunma verilerini gösteren 1 dakika ve 20 sn periyotta alınan anlık görüntülers; zeolit 1 dakika ve 20 sn içinde bozunur. (D-E) 200 kV soğuk FEG TEM ve 499 e-/Ų· elektron doz hızı ile elde edilen bozunma verilerini gösteren 1 dakika ve 50 sn zaman diliminde alınan anlık görüntülers; iç kısımlar FFT noktasının zamanla solduğunu gösterir. Ölçek çubuğu 60 nm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: AXON eşzamanlılığı, dinamik olarak gelişen numuneleri izlemek ve stabilize etmek için yapay görme algoritmaları uygular. Deneme sırasında oluşturulan meta veriler zaman çizelgesi boyunca çizilebilir ve kullanıcının deneme sırasında oluşturulan görüntü serilerinde gezinirken bir görüntüyü ilişkili meta verileriyle hızlı bir şekilde eşleştirmesine olanak tanır. (A-H) 800 ° C'de bir nanokatalizör örneğinin (Au / FeO_x) görüntüleri, hem (A-D) hem de (E-H) doz haritası kaplaması olmadan 28 saniyelik bir süre boyunca kaydedildi. Bindirmedeki kırmızı alanlar yüksek kümülatif doz maruziyeti bölgelerini, sarı alanlar ise daha düşük maruz kalma bölgelerini gösterir. Tek bir pikseli vurgulamak, o pikselin kümülatif dozunu gösterir. E-H panellerindeki beyaz oklar, deney sırasında birleşen iki parçacığı gösterir ve turuncu ok, hareketli bir altın parçacığın yörüngesini gösterir. (I) A-H olarak gösterilen görüntü serileri için analiz yazılımı tarafından oluşturulan deney zaman çizelgesi. Zaman çizelgesinin üst kısmındaki turuncu noktalar ham (dijital olarak düzeltilmemiş) görüntüleri, mavi noktalar ise sürüklenme düzeltilmiş görüntüleri gösterir. Turuncu dikey çubuklar, zaman çizelgesinde A'dan H'ye panellerde gösterilen görüntülere karşılık gelen noktaları gösterir. Ölçek çubuğu 40 nm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Çeşitli zaman noktalarında bir Au/FeOx nanokatalizörü içindeki gözenekli bir bölgenin TEM anlık görüntüleri. MVS yazılımı, makine görüşü algoritmaları tarafından belirtildiği gibi, aşama, ışın kaydırma ve dijital düzeltmelerin uygulanması yoluyla bir sıcaklık rampası sırasında meydana gelenler gibi yüksek sürüklenme hızları sırasında bile numuneyi stabilize eder ve ortalar. (A-F) Bir Au/FeOx nanokatalizörü içindeki gözenekli bir bölgenin TEM anlık görüntüleri, in situ ısıtma deneyi sırasında çeşitli (G) zaman noktalarında kaydedildi. YG'nin sürüklenme oranı, MVS yazılımı tarafından yapılan bir deney sırasında otomatik olarak hesaplanır ve kaydedilir. (G)'de çizildiği gibi, sıcaklık profili değiştikçe (mavi çizgi), sıcaklık arttıkça sürüklenme oranı (turuncu çizgi) artar ve sıcaklık sabit tutuldukça azalır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Mikroskop Tipi	300 kV FEG TEM	200 kV Soğuk FEG TEM
Spot Boyutu/Kondenser 2 Diyafram Açıklığı	3/100 μm	1/100 μm
Doz Oranı	519 e-/A2•s1	499 e-/A2•s1
FFT ile ölçülen yapı kaybı (Birikmiş Doz)	60.270 e-/A2	58.230 e-/A2

Tablo 1: Farklı mikroskoplardan elde edilen zeolit bozunma sonuçlarının özet karşılaştırması.

Ek Dosya 1: Doz yönetimi sekmesi açıkken MVS yazılım arayüzünün ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Işın kaynaklı zeolit bozunma deneyinin MVS yazılım veritabanı dosyası. Bu görüntüleme/analiz yazılımı ücretsiz olarak indirilebilir. İndirme talimatları ve bilgisayar özellikleri için lütfen Ek Dosya 9'a bakın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Kirişin filminin zeolit bozulmasına neden olması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: CSV dosyası 1 (zeolit bozunması: ham veriler [yalnızca mekanik düzeltme]) Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 5: CSV dosyası (zeolit bozulması: sürüklenme düzeltildi [mekanik + dijital düzeltme]) Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 6: MVS yazılım veritabanı dosyası nanokatalizör in situ ısıtma deneyi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 7: Nanokatalizörün 800 ° C'de doz kaplamaları ile filmi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 8: Koordineli sürüklenme değerlerine sahip bir sıcaklık rampası sırasında nanokatalizörün filmi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 9: Ücretsiz analiz yazılımını indirme talimatları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

TEM deneysel sonuçlarının yorumlanması genellikle mikroskop ayarları, görüntüleme koşulları ve operando veya in situ deneyler durumunda, ortamdaki değişiklikler^{veya uyaranlar 1,23} gibi birbirine bağlı birçok deneysel parametreye bağlıdır. Bu parametrelerin sürekli olarak değiştirilebileceği büyük TEM veri kümelerinin doğru analizi, operatörün her bir koşulu ve her görüntü için ayarı bir laboratuvar günlüğüne veya başka bir harici dokümantasyon kaynağına doğru bir şekilde kaydetmesi için büyük dikkat gerektirir. TEM veri kümelerinin boyutu ve karmaşıklığı arttıkça, manuel kayıt tutma yönetilemez hale gelir ve önemli bilgiler gözden kaçabilir veya yanlış kaydedilebilir. Burada açıklanan MVS yazılımı, bir deney sırasında mikroskoptan, dedektörden/kameradan ve diğer sistemlerden (yerinde numune tutucular gibi) üretilen meta verileri birleştirir ve bunları ilgili görüntüleriyle hizalar.

Meta veri konsolidasyonuna ek olarak, yazılım, Drift Düzeltme ve Odak Yardımı işlevlerini kullanarak uzamsal, ışın ve dijital düzeltmelerin bir kombinasyonu aracılığıyla görüş alanını izlemek ve stabilize etmek için makine görüşü algoritmaları uygular. Sapma Doğru işlevi devreye girdiğinde, MVS yazılımına çekilen ilk görüntü kullanılarak çapraz korelasyon 'şablon' görüntüsü oluşturulur. Şablon daha sonra örnek sürüklenme veya hareketin yönünü ve büyüklüğünü hesaplamak için gelen görüntülerle karşılaştırılır. Bu bilgilerle MVS yazılımı, üç parametreden en az birini ayarlayarak görüntü özelliklerini aynı yerde tutmak için gerekli düzeltmeleri otomatik olarak uygular: sahne alanı konumu, ışın veya görüntü kaydırma ve dijital görüntü düzeltme. Netleme Yardımı işlevi, her görüntüye netleme puanı adı verilen bir netleme değeri atamak için algoritmaların bir kombinasyonunu kullanır ve bu puanlar, örneği odakta tutmak için uygulanacak bulanıklaştırma ayarının büyüklüğünü ve yönünü belirlemek için karşılaştırılır. STEM görüntüleme modunda, MVS yazılımı, odak puanını atamak için normalleştirilmiş varyansın tescilli bir sürümü aracılığıyla kontrastı en üst düzeye çıkarmaya çalışır. TEM modunda, FFT'de radyal bir yoğunluk toplamı hesaplanır ve odak puanını hesaplamak için kullanılır. MVS yazılımının odağı optimize etme yeteneğindeki sınırlamalar, bir görüntü için doğru odak puanını doğru bir şekilde hesaplayamadığında ortaya çıkar. Bu genellikle mikroskop yanlış hizalandığında veya numune kalibrasyon sırasında önemli ölçüde odak dışı kaldığında meydana gelir ve yazılımın doğru başlangıç odak puanı değerini doğru bir şekilde hesaplamasını engeller. MVS yazılımı, FFT'deki kafes saçakları odak puanlama algoritmasını 'bunaltabileceğinden', iyi tanımlanmış kafes saçaklarına sahip örnekler için odak puanını hesaplamakta zorluk çekebilir; Bu nedenle, bir örnek odak dışına çıkarsa, odak puanı odaktaki değişikliği doğru bir şekilde yansıtmayabilir. Tersine, düşük büyütmelerde veya düşük FFT sinyaline sahip bir numuneyle çalışmak da iyi bir odak puanı hesaplamayı zorlaştırabilir. Bu zorlukları azaltmak için MVS yazılımı, varsayılan ayarlar örnek için uygun değilse, odak puanını hesaplamak için kullanıcı tarafından seçilebilecek bir dizi ek algoritma içerir. Bunlar, belirli bir deney için en iyi algoritmaları belirlemek üzere duruma göre test edilmeli ve uygulanmalıdır.

Zaman içinde numune yapısındaki morfolojik değişiklikler, bir şablon dönüştürme faktörü kullanılarak hesaba katılır. Bu filtre operatör tarafından ayarlanabilir, böylece kayıt algoritmaları zaman içindeki morfolojik değişiklikleri hesaba katar. Ek olarak, yazılım sürekli görüntüyü, mikroskop ayarlarını ve kamera veya dedektör ayarlarını izleyerek örnek yapısındaki değişikliklerle tetiklendiğinde ve mikroskop, kamera veya dedektör parametrelerinde operatör kaynaklı değişikliklerden sonra şablonu otomatik olarak günceller. Şekil 4, Şekil 5, Ek Dosya 7 ve Ek Dosya 8'de gösterildiği gibi, MVS yazılımı dinamik olarak hareket eden veya değişen numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayan etkili, anında stabilizasyon sağlar. Yazılım, yerinde bir deney sırasında bir ısıtma rampası uygularken meydana gelenler gibi çok yüksek sapma veya numune hareketi oranlarını kontrol edebilse de, yazılımın numunenin çok hızlı hareket edip etmediğini veya sürüklenip sürüklenmediğini kontrol edebileceği maksimum aşama düzeltmeleri veya ışın kaymaları için sınırlamalar vardır. Bu sınır, görüntü güncelleme hızının, görüş alanı boyutunun ve sürüklenme hızının bir işlevidir. Belirli bir görüş alanı ve görüntü güncelleme hızı için, düzeltilebilecek maksimum bir sürüklenme oranı vardır ve fiziksel hareketler ayak uyduramazsa, işlem sona erebilir veya kararsız hale gelebilir. Sapma Düzeltme gibi özellikler uygulandığında oluşturulan kayıt şablonlarından, hesaplanan ek meta veriler oluşturulabilir. Örneğin, Eşleştirme Korelasyonu, bir serideki şablonlar arasındaki değişimin kapsamının sayısal bir kaydıdır ve örneğin değiştiği deneysel bir zaman çizelgesindeki noktaları tanımlamak için kullanılır. Yüksek eşleşme korelasyon değeri, morfolojisinde değişiklikler geçiren bir örneğe karşılık gelir ve düşük eşleşmeli bir korelasyon değeri, yapısı nispeten statik kalan bir örneğe karşılık gelir. Eşleşme korelasyonu, grafiksel olarak çizilebildiği için yerinde çalışmalar için özellikle değerlidir ve kullanıcının önemli örneklem değişikliğine karşılık gelen serideki görüntüleri hızlı bir şekilde belirlemesini sağlar. Bununla birlikte, yüksek eşleşme korelasyon değerlerinin, Sürüklenme Düzeltme işlevi etkin kalırken bu eylemler gerçekleştirilirse, sahneyi hareket ettirme veya büyütmeyi değiştirme gibi görüntüleme koşullarındaki değişikliklere de karşılık gelebileceğini anlamak önemlidir.

Burada sunulan kalibrasyon iş akışı, minimum operatör müdahalesiyle çeşitli lens koşullarında ışını doğru bir şekilde kalibre etmek için benzersiz bir kalibrasyon tutucu ve yarı otomatik bir kalibrasyon rutini kullanır. Doz kalibrasyon rutinine TEM'de yüklü MVS yazılımı aracılığıyla erişilir. MVS yazılımı, tüm ölçümleri daha sonraki deneyler için referans olarak kaydetmek üzere ilgili mikroskop ayarlarını otomatik olarak okur. Bazı TEM'lerde, diyafram açıklığı veya monokromatör ayarlarını okumak mümkün değildir ve bunların kalibrasyonlar sırasında ve kullanım sırasında operatör tarafından MVS yazılım ayarlarına girilmesi gerekir. Program istemlerini izleyerek bu operatör giriş ayarlarının güncel tutulmasına yardımcı olmak için yazılımda yerleşik hatırlatıcılar vardır. Mikroskop sütununda başka bir yere entegre edilmiş olana güvenmek yerine, yerleşik bir akım toplayıcıya sahip bir tutucunun geliştirilmesi, kasıtlı bir tasarım seçimidir. Bu, akım toplayıcısının bir numune ile aynı düzlemde konumlandırılmasını sağlayarak, ışın sapmasından kaynaklanan akım ölçümündeki hataları veya elektronların farklı ışın konumlarındaki açıklıklar tarafından emilimindeki farklılıkları ortadan kaldırır. MVS yazılımı, lens koşullarının herhangi bir kombinasyonu için ışın akımını ve alanını ölçmek için otomatik bir rutin izler. Yazılım daha sonra bu ölçülen kalibrasyonları kamera veya ekran akımı ile ilişkilendirebilir ve büyütme vb. değişiklikleri deney sırasında ışın alanına tahmin edebilir. Oluşturulduktan sonra, bu kalibrasyon dosyaları hemen kullanılabilir ve yazılım gelecekteki bir oturumda aynı ayarların kullanıldığını algılarsa daha sonra kullanılmak üzere otomatik olarak kaydedilir. Kalibrasyon dosyasının ömrü mikroskoptan mikroskopa değişmekle birlikte, yazarlar mevcut değerlerde önemli değişiklikler gözlemlemeden aynı kalibrasyon dosyalarını birkaç ay boyunca kullanabildiklerini bulmuşlardır. Özellikle soğuk FEG emisyon tabancalarında bu kalibrasyonların alakalı kalmasına yardımcı olmak için tabancaların emisyon profilini izleyen yerleşik rutinler vardır.

Mikroskoplar arasındaki doz ölçümlerinin normalleştirilmesi ve bir numunenin ışına maruz kalmasının otomatik olarak izlenmesi, MVS yazılımının kritik işlevleridir, çünkü farklı mikroskop sistemlerinde gerçekleştirilecek deneyler arasındaki doz koşullarının nicel karşılaştırmalarına izin verirler. Farklı mikroskoplar kullanılarak yapılan aynı deneyler sırasında elde edilen bir zeolit örneğinin (ZSM-5) doza bağlı bozulması, her iki kurulum için de maksimum kümülatif veya eşik elektron dozundan (~ 500 e-/ş2 ·^{s doz oranı} uygulanırken ~ 60.000 e^-/Ų · s) sonra FFT lekelerinin tamamen kaybolmasına neden olur. Bu karşılaştırmalı sonuçlar, doz yazılımının tekrarlanabilir, nicel doz ölçümlerini kolaylaştırdığını göstermektedir. Her deney için tam FFT noktasının kaybolduğu kümülatif dozdaki küçük fark, muhtemelen iki mikroskop tarafından kullanılan farklı hızlanma voltajlarının bir sonucudur; daha düşük hızlanma voltajları daha fazla radyasyon hasarı yolu ile sonuçlanır ve daha yüksek hızlanma voltajları tipik olarak daha fazla zincirleme hasarla sonuçlanır²⁴. ZSM-5 nanopartiküllerinin kritik dozu için literatür sonuçları, tüm FFT noktalarının tamamen kaybolması yerine, ilk FFT noktası kayboluşlarını kullanarak 9.000-14.000 e^-/ Ų arasında değişmektedir ^25,26. Sonuçlarımızda, ilk FFT lekesinin kaybolması, yaklaşık 25.000 e^-/Å^2'lik kümülatif bir doza karşılık gelmektedir. Önceki çalışmalar, bir Faraday fincan¹⁵ ile karşılaştırıldığında ışın akımı ölçümlerini hafife almak için iyi belgelenmiş bir fosfor ekranı kullanılarak elde edilen akım ölçümlerine dayanıyordu. Belirlenen kritik doz, dozu izlemek için hangi FFT zirvesinin kullanıldığına bağlı olarak iki veya daha fazla faktöre göre değişebilir. Bu, daha yüksek uzamsal frekansların ilk önce bozunduğunu ve ölçümler sırasında kullanılan bölge erişimine bağlı olarak farklı değerlerle sonuçlanabileceğini gösterir (sonuçlarımız, belirli yapısal özelliklerden ziyade tüm zeolit kristalinden FFT noktalarına odaklanmıştır)^25,26. Tekniklerdeki ve mevcut kalibrasyondaki bu farklılıklar, sonuçlarımızda ve önceki literatür çalışmalarında bildirilen iki deney arasındaki değer farkını açıklamaktadır.

Elektron doz etkileşimleri birçok TEM deneyinde önemli bir faktör olmasına rağmen, in situ ve özellikle sıvı-EM çalışmaları etkilerine karşı özellikle hassastır. Sıvıların elektron ışını tarafından radyolizi, numune ile etkileşime girebilen ve analizi zorlaştıran kimyasal olarak reaktif türlerin bir kaskadı ile sonuçlanır. Bir sıvı-EM deneyi sırasında kullanılan hem doz hızı hem de akıcılık ve kümülatif doz, sıvı radyoliz nedeniyle üretilen radikal türlerin konsantrasyonu üzerinde bir etkiye sahip olabilir^27,28. Bu nedenle, bir deney boyunca hem kümülatif doz hem de doz oranı meta verilerinin toplanması ve kaydedilmesi, görüntüler ile bir numunenin doz geçmişi arasında doğrudan korelasyona izin verir ve bu deneylerde elektron ışınının etkisini aydınlatmak ve kontrol etmek için daha doğru bir yoldur. Bu protokolde ele alınmamasına rağmen, sıvı-EM için doz yönetimi özelliklerinin faydasının bir örneği Şekil 6'da gösterilmiştir.

Şekil 6: Bir in situ sıvı-EM deneyi sırasında altın nanopartiküllerin ışın kaynaklı büyümesi. (A) Bölgedeki kümülatif doz haritasının renk kaplaması ile ortaya çıkan parçacık büyümesine düşük büyütmeli STEM genel bakışı. Bindirmedeki kırmızı alanlar yüksek kümülatif doz maruziyeti bölgelerini, sarı alanlar ise daha düşük maruz kalma bölgelerini gösterir. İmleçle tek bir pikseli vurgulamak veya birlikte verilen çizim araçlarını kullanarak bir alanın üzerine bir kutu çizmek, o piksel veya alan için kümülatif dozu gösterir. Ölçek çubuğu 2 μm'dir. (B,C) A'daki turuncu kutularla (b,c) gösterilen alanların daha yüksek büyütmeli STEM görüntüleri. Daha yüksek bir kümülatif doza (10.811 e^-/Ų) maruz kalan b alanı, daha düşük bir kümülatif doza (0.032 e^-/Ų) maruz kalan c alanında bulunanlardan daha büyük parçacıklar içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Zenginleştirilmiş doz oranı ve kümülatif doz meta verileri, doza bağımlı nanomateryal büyümesi ve bozunma yollarının analizini basitleştirir. Şekil 6, sıvı-EM deneyleri sırasında sudaki altın aurik klorür (HAuCl₃) iyonlarının bir çözeltisinin ışın kaynaklı indirgenmesini göstermektedir. Şekil 6A'daki renk dozu haritası bindirmesinden, kümülatif elektron dozunun 29,30,31,32 nanopartiküllerin ortaya çıkan boyutunu ve şeklini etkilediğini görselleştirmek kolaydır. Düşük büyütmeli STEM'e genel bakış, yüksek (kırmızı) ve düşük (sarı) kümülatif doza maruz kalan bölgeleri gösterir. Daha yüksek dozlara maruz kalan bölgedeki partiküller, daha düşük kümülatif dozlara maruz kalan bölgelerdekilerden daha büyüktür. Doz meta verileri doğrudan piksel düzeyinde her görüntüye gömülü olduğundan, sıvı-EM deneylerinde elektron dozunun karmaşık etkileri artık daha önce hiç elde edilemeyen bir şekilde sistematik olarak analiz edilebilir.

Bu protokolde, MVS yazılımının hem elektron dozunu hem de bir numuneye verilen toplam dozu piksel piksel kalibre etmek, izlemek ve izlemek için kapsamlı bir çözüm sunduğunu gösterdik. Bu yetenek, doza duyarlı numuneleri görüntülemek ve elektron ışını etkileşimlerini anlamak için yeni bir paradigmanın kilidini açar. Sıvı-EM deneyleri için özellikle heyecan vericidir, çünkü elektron dozunun oynadığı role daha etkili bir sorgulama yapılmasına izin verecek ve deneysel tekrarlanabilirliği artıracaktır. Bu yeni çerçevenin, doz hızının ve birikmiş doz bilgilerinin doğru bir şekilde toplanmasına izin vereceğini, TEM sonuçlarının daha doğru bir şekilde yorumlanması için bu verilerin toplulukla paylaşılmasını kolaylaştıracağını ve FAIR ana raporlama ve analizini mümkün kılarak bilimsel işbirliğini ve veri paylaşımını ilerleteceğini umuyoruz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARM200F CFEG	JEOL		Transmission Electron Microscope (200 kV)
AXON DOSE Calibration Holder	Protochips, Inc.	AXA-FC-TFS	Dose calibration and management hardware package for ThermoFisher ScientificTEM
AXON DOSE Software:  Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-DOSE-01-1YR	Dose calibration and management software
AXON Studio Software: Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	No Part Number. Available to download at  success.protochips.com	Offline analysis software for AXON datasets.  A free copy of the AXON Studio software is available for down load at:  success.protochips.com
AXON Synchronicity Core	Protochips, Inc.	AXON-CORE	Hardware component of the synchronization software.
AXON Synchronicity Software:  Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-SYNCPRO-01-1YR	Synchronization software
Fusion In-Situ Heating E-chip	Protochips, Inc.	E-FHDC-VO-10	Sample Support E-chip with carbon film.  Used with in situ heating system
Fusion Select In Situ Heating System	Protochips, Inc.	FFAD-6200-EXP	In-situ MEMs heating system for ThermoFisher Scientific TEM.
Gold(III) chloride (50% gold basis) hydrate 50790	Sigma Aldrich	27988-77-8	Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.  Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998)
Iron (III) Oxide 310050 (Fe2O3)	Sigma Aldrich	1309-37-1	Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.  Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998)
Titan ChemiSTEM	ThermoFisher Scientific		Transmission Electron Microscope (300 kV)
Zeolite ZSM-5	Zeolyst	CBV 8014	Nanocatalyst sample:  80 SiO2/Al2O3 Mole Ratio