Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En maskinvisjonstilnærming til arbeidsflyter for transmisjonselektronmikroskopi, resultatanalyse og datahåndtering

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65446
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Protochips, Inc.

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å bruke maskinsynsprogramvare for å stabilisere dynamiske prosesser under TEM-avbildning, samtidig som vi indekserer flere strømmer av metadata til hvert bilde til en navigerbar tidslinje. Vi demonstrerer hvordan denne plattformen muliggjør automatisert kalibrering og kartlegging av elektrondosen i løpet av et eksperiment.

Abstract

Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) gjør det mulig for brukere å studere materialer på sin grunnleggende, atomære skala. Komplekse eksperimenter genererer rutinemessig tusenvis av bilder med mange parametere som krever tidkrevende og komplisert analyse. AXON-synkronisering er en maskinsynsynkronisering (MVS) programvareløsning designet for å løse smertepunktene som er forbundet med TEM-studier. Når det er installert på mikroskopet, muliggjør det kontinuerlig synkronisering av bilder og metadata generert av mikroskopet, detektoren og in situ-systemer under et eksperiment. Denne tilkoblingen muliggjør bruk av maskinsynalgoritmer som bruker en kombinasjon av romlige, stråle- og digitale korrigeringer for å sentrere og spore et interesseområde innenfor synsfeltet og gi umiddelbar bildestabilisering. I tillegg til den betydelige forbedringen i oppløsning som en slik stabilisering gir, muliggjør metadatasynkronisering bruk av beregnings- og bildeanalysealgoritmer som beregner variabler mellom bilder. Disse beregnede metadataene kan brukes til å analysere trender eller identifisere viktige interesseområder i et datasett, noe som fører til ny innsikt og utvikling av mer sofistikerte maskinsynsfunksjoner i fremtiden. En slik modul som bygger på disse beregnede metadataene er dosekalibrering og administrasjon. Dosemodulen gir toppmoderne kalibrering, sporing og styring av både elektronfluens (e-/Å 2·s-1) og kumulativ dose (e-/Å2) som leveres til bestemte områder av prøven på piksel-for-piksel-basis. Dette muliggjør en omfattende oversikt over samspillet mellom elektronstrålen og prøven. Eksperimentanalyse strømlinjeformes gjennom en dedikert analyseprogramvare der datasett bestående av bilder og tilhørende metadata enkelt visualiseres, sorteres, filtreres og eksporteres. Kombinert legger disse verktøyene til rette for effektivt samarbeid og eksperimentell analyse, oppmuntrer til datautvinning og forbedrer mikroskopiopplevelsen.

Introduction

Transmisjonselektronmikroskoper (TEM) og deres evner har hatt stor nytte av fremskritt innen kameraer, detektorer, prøveholdere og databehandlingsteknologi. Imidlertid hemmes disse fremskrittene av frakoblede datastrømmer, begrensninger i menneskelig drift og tungvint dataanalyse 1,2. Videre tilpasser in situ- og operando-eksperimenter TEM-er til sanntids nanoskalalaboratorier, slik at prøver kan studeres i gass- eller væskemiljøer samtidig som de bruker en rekke eksterne stimuli 3,4,5. Innføringen av slike komplekse arbeidsflyter har bare forstørret disse begrensningene, og den resulterende økningen av størrelsen og kompleksiteten til disse datastrømmene er et område med økende bekymring. Dermed er det en økende vekt på å utnytte maskinhandlingsevne for å finne, få tilgang til, interoperere og gjenbruke data, en praksis kjent som FAIR-prinsippene6. Publisering av forskningsdata i samsvar med FAIR-prinsippkonseptet har fått gunstig oppmerksomhet fra statlige etater over hele verden7,8, og anvendelse av FAIR-prinsippene ved hjelp av maskinsynsprogramvare er et viktig skritt i adopsjonen.

En programvareplattform for maskinsynsynkronisering (MVS) er utviklet som svar på de spesifikke smertepunktene som er forbundet med å utføre og analysere komplekse, metadatatunge TEM-eksperimenter (spesielt in situ - og operando-eksperimenter)9. Når den er installert på TEM, kobler MVS-programvaren til, integrerer og kommuniserer med mikroskopkolonnen, detektorer og integrerte in situ-systemer . Dette gjør det mulig å kontinuerlig samle bilder og justere disse bildene med deres eksperimentelle metadata, og danne en omfattende søkbar database, en tidslinje for eksperimentet fra start til slutt (figur 1). Denne tilkoblingen gjør at MVS-programvaren kan bruke algoritmer som intelligent sporer og stabiliserer et interesseområde (ROI), selv når prøver gjennomgår morfologiske endringer. Programvaren bruker justeringer på trinn, stråle og digitale korreksjoner etter behov for å stabilisere avkastningen gjennom funksjonene Drift Control og Focus Assist . I tillegg til å berike bildene med rå metadata produsert fra de forskjellige eksperimentelle systemene, kan programvaren produsere nye, beregningsmessige metadata ved hjelp av bildeanalysealgoritmer for å beregne variabler mellom bilder, noe som gjør det mulig å automatisk korrigere for prøvedrift eller endringer i fokus.

TEM-bilder og tilhørende metadata samlet inn gjennom MVS-programvaren, er organisert som en eksperimentell tidslinje som kan åpnes og vises av hvem som helst via den gratis, offline versjonen av analyseprogramvaren, Studio (heretter kalt analyseprogramvaren)10. Under et eksperiment synkroniserer MVS-programvaren og registrerer tre typer bilder fra mikroskopets kamera eller detektor, som vises øverst på tidslinjen under bildeviseren: enkeltopptak (individuelle enkeltinnsamlingsbilder hentet direkte fra TEM-programvaren), rå (bilder fra detektoren/kameraets livestream som ikke har hatt noen digitale driftkorreksjoner; disse bildene kan ha blitt fysisk korrigert via trinnbevegelse eller stråleforskyvning), og driftkorrigert (bilder fra detektoren/kameraets livestream som har vært digitalt drivende). Data som samles inn under et eksperiment eller en økt, kan videreutvikles til mindre deler eller utdrag av data, kjent som samlinger, uten tap av innebygde metadata. Fra analyseprogramvaren kan bilder, bildestakker og metadata eksporteres direkte til en rekke bilder og regnearktyper i åpent format for analyse ved hjelp av andre verktøy og programmer.

Rammeverket for mikroskopkontroll, stabilisering og metadataintegrasjon aktivert av MVS-programvaren tillater også implementering av flere maskinsynsprogrammer eller moduler, designet for å lindre begrensninger i gjeldende TEM-arbeidsflyter. En av de første modulene som er utviklet for å dra nytte av denne synkroniseringsplattformen, er elektrondosekalibrering og romlig sporing av stråleeksponerte områder i prøven. Alle TEM-bilder dannes fra samspillet mellom prøven og elektronstrålen. Imidlertid kan disse interaksjonene også resultere i negative, uunngåelige virkninger på prøven, for eksempel radiolyse og knock-on skade 11,12, og krever en nøye balanse mellom å påføre en høy nok elektrondose for å generere bildet og minimere den resulterende stråleskaden 13,14.

Selv om mange brukere stoler på skjermstrømmålinger for å estimere elektrondosen, har denne metoden vist seg å undervurdere den faktiske strålestrømmen15. Kvalitative doseverdier kan oppnås via skjermstrømmen på samme mikroskop med de samme innstillingene, men gjengivelse av disse dosebetingelsene ved hjelp av forskjellige mikroskoper eller innstillinger er svært subjektiv. I tillegg krever eventuelle justeringer av bildeparametere som gjøres av brukeren under eksperimentet, for eksempel punktstørrelse, blenderåpning, forstørrelse eller intensitet, en separat måling av skjermstrømmen for å beregne den resulterende dosen. Brukere må enten strengt begrense bildeforholdene som brukes under et gitt eksperiment eller omhyggelig måle og registrere hver linsetilstand som brukes, noe som kompliserer og utvider eksperimentet betydelig utover det som er mulig for normal drift av mikroskopet16,17.

Dose, referert til som doseprogramvare for denne protokollen, er en programvaremodul for dosekalibrering som bruker en dedikert kalibreringsholder designet for å muliggjøre automatiserte strømmålinger. En Faraday-kopp, gullstandarden for nøyaktig strålestrømkalibrering15, er integrert i tuppen av kalibreringsholderen. MVS-programvaren utfører en serie strålestrøm og stråleområdekalibreringer for hver objektivtilstand og bygger inn disse verdiene på bildene på pikselnivå.

I denne videoartikkelen presenteres MVS-programvareprotokoller designet for å forbedre alle områder av TEM-arbeidsflyten ved hjelp av representative nanomaterialprøver. En strålefølsom zeolitt nanopartikkelprøve14 brukes til å demonstrere arbeidsflytene for kalibrering og dosestyring. Vi utfører et representativt in situ oppvarmingseksperiment ved hjelp av en Au / FeOx nanokatalysator18,19-prøve som gjennomgår betydelige morfologiske endringer ved oppvarming. Dette in situ-eksperimentet fremhever programvarens stabiliseringsalgoritmer og dens evne til å samle flere strømmer av metadata, noe som er en iboende utfordring for in situ- og operandostudier. Selv om det ikke er beskrevet i protokollen, på grunn av sin unike elektrondosefølsomhet, diskuterer vi representative eksempler på programvarens nytte for væske-EM-studier (protokoller som tidligere er rapportert i litteraturen20,21,22), og hvordan disse teknikkene kan brukes for å forbedre forståelsen av effekten av dose på væske-EM-eksperimenter. Til slutt viser vi hvordan dataanalyse strømlinjeformes ved hjelp av offline analyseprogramvare for å visualisere, filtrere og eksportere en rekke bilde-, video- og datafiler til andre tilgjengelige formater.

Figure 1
Figur 1: Eksempler på brukergrensesnitt for MVS og analyseprogramvare. (A) Synkroniseringsprogramvarens bildevisningsrute og kontrollpanel. En forbindelse mellom TEM og synkroniseringsprogramvaren opprettes ved å aktivere Koble til-knappen, som streamer bildene og metadataene fra mikroskopet til synkroniseringsprogramvaren. Fra bildeviseren kan operatøren utføre en rekke maskinsynsassisterte operasjoner, for eksempel Drift Correct og Focus Assist. Det gir også muligheten til å bruke Tag Images og Review Session uten å forstyrre datainnsamlingen. (B) Skjermbilde av bildeanalyseprogramvaren som uthever plasseringen av bildevisningsporten, tidslinjen og metadata- og analysepanelet. Analyseprogramvaren kan nås når som helst under et eksperiment for å gjennomgå bildene som er oppnådd frem til det tidspunktet, ved hjelp av knappen Gjennomgangsøkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Metode 1: Dosekalibrering av transmisjonselektronmikroskopet for TEM og skanning av TEM (STEM) bildemoduser

  1. Slå på pikoammeteret og la det varmes opp i minst 30 minutter før du starter en dosekalibrering. Legg dosekalibreringsholderen i TEM og koble kalibreringsholderen til picoammeteret ved hjelp av hurtigtilkoblingskabelen.
  2. Med mikroskopet i TEM-modus åpner du kolonneventilene og finner det 35 μm fiducialhullet på doseholderen (figur 2). Start MVS-programvaren og velg Dose (Kalibreringsautomatisering) fra eksperimentalternativene.
    MERK: Fiducialhullets plassering lagres av programvaren etter den første kalibreringen, slik at programvaren automatisk kan finne posisjonen for fremtidige kalibreringer.
  3. Klikk på Koble til-ikonet (figur 1A) og velg mikroskopet for å aktivere forbindelsen mellom TEM og MVS-programvaren. Når du er tilkoblet, vil bildene fra kameraet / detektoren være synlige i bildeviseren til programvaren.
    MERK: Det er ikke nødvendig å optimalisere den eusentriske høyden, og kanten av fiducialhullet kan virke uskarpt på grunn av tykkelsen på spissen. Dette vil ikke påvirke dagens målinger.
  4. Naviger til fanen Dose og deretter til Dosekalibrering. Velg Kalibreringsprosess for doseområde , følg instruksjonene i programvaren og angi de forespurte brukerkonfigurerbare verdiene (for eksempel blenderåpning og monokromatorinnstillinger). Når kalibreringen av doseområdet er fullført, velger du dosegjeldende kalibreringsprosess og følger instruksjonene i programvaren.
  5. Gjenta kalibreringsprosessen (trinn 1.4) for hver punktstørrelse, blenderåpning eller monokromatinnstilling som kan brukes under eksperimentet.
  6. Når kalibreringsprosessen for TEM-modus er ferdig, kalibrerer du elektrondosen for STEM-modus ved å gjenta trinn 1.4.
    MERK: STEM-modus krever ikke kalibrering av doseområdet for å utføres.
  7. Når alle ønskede kalibreringer er ferdige, klikker du på Lukk økt, fjerner dosekalibreringsholderen og går tilbake til startskjermen til MVS-programvaren.

2. Metode 2: Bestemmelse av doseterskel ved bruk av MVS og doseprogramvare

  1. Last inn et standard TEM-rutenett med en prøve (kommersielt tilgjengelige ZSM-5 zeolitt nanopartikler ble brukt i dette eksemplet) i en standard TEM-holder. Sett holderen inn i TEM og finn et område av interesse (krystallinske zeolitt nanopartikler).
  2. Åpne MVS-programmet og velg Annet.
    MERK: Ytterligere informasjon om utvalget (f.eks. eksempelidentifikator og beskrivelse, operatørnavn og eksperimentnotater) kan legges til feltet for eksperimentelle parametere.
  3. Gjenta trinn 1.3 for å koble til MVS-programvaren og naviger til kategorien bildemetadata i MVS-programvaregrensesnittet for å velge følgende metadata som skal overlappes i bildestrømmen som vises i livevisningen: Forstørrelse, Maks dose og Dosehastighet. Andre metadata kan inkluderes hvis brukeren ønsker det. Et skjermbilde av grensesnittet for MVS-programvaren som viser dosehåndteringskontrollene, finnes i tilleggsfil 1.
  4. Åpne kategorien Dose og velg Dosestyring og Aktiver doseovervåking for å aktivere automatisert elektrondosesporing. Velg Vis doselag for å vise dosefargeoverlegget.
  5. Still inn verdiene for høydosenivå og høydoserate og trykk på Lagre (i dette eksemplet ble verdier på henholdsvis 60 000 e-/Å 2 og 500 e-/Å2·s brukt).
  6. Naviger til Innstillinger-fanen, velg Dose, og angi verdiene for Dosenavigasjonskart Opasitet og Dose Image Overlay Opasitet (i dette eksemplet ble verdier på henholdsvis 0,50 og 0,30 brukt).
  7. I Live Image Viewer-vinduet aktiverer du driftkorreksjon ved å klikke på Drift Correct.
  8. Naviger til Datavisning-fanen og tegn metadataverdiene Defokus og Fokuskvotient på Y-aksen.
    MERK: Alle de tilgjengelige metadataverdiene kan tegnes inn i sanntid under eksperimentet fra datavisningstabellen.
  9. Aktiver Fokusassistent, og velg deretter Kalibrer fokus for å kjøre den automatiserte fokusassistentkalibreringen. Når rutinen Kalibrer fokus er fullført, lukker du Datavisning-fanen .
  10. Åpne kategorien Bildeanalyse i MVS-programvaren og aktiver alternativene Live FFT og Quadrants 1 &; 2 .
  11. Bruk mikroskopets programvarekontroller, juster stråleforholdene slik at elektronfluksen er ~ 500 e- / Å2 · s. og flytt til et nytt område i prøven og sentrer prøveavkastningen i livevisningen av MVS-programvaren.
    MERK: Når du gjør store scenebevegelser, deaktiveres driftkontrollen og fokusassistenten automatisk, og må aktiveres på nytt når den nye avkastningen er valgt.
  12. Noter dosebetingelsene i programvaren ved hjelp av Tag-funksjonen . Tag-ikonet og skriv inn ønsket tekst for å betegne en bestemt serie bilder i tidslinjen. Bilder merkes med denne teksten til kodeikonet ikke er valgt.
  13. Oppretthold en konstant doserate mens du kontinuerlig avbilder den samme avkastningen til toppene som tilsvarer atomstrukturen i FFT-plottet har forsvunnet.
  14. Reduser forstørrelsen, åpne fanen Dosestyring , og aktiver Vis doselag for å legge over et fargekodet dosekart.
    MERK: Denne funksjonen gir en visuell referanse til områdene i prøven som har blitt utsatt for elektronstrålen og deres relative doseeksponering. Utheving av disse områdene i individuelle bilder med markøren vil indikere deres respektive doseverdier.
  15. Koble fra og avslutt økten ved å fjerne merket for Koble til, og velg deretter Lukk økt. Lagre en kopi av øktdataene i en ekstern kilde for å hindre at dataene som er lagret i MVS-programvaren, overskrives under påfølgende eksperimenter (tilleggsfil 2).

3. Metode 3: Metadata og trendanalyse og dataeksport ved hjelp av analyseprogrammet

  1. Start analyseprogramvaren (den frakoblede programvaren for visning av de fullt synkroniserte datasettene) og åpne eksperimentøktfilen ved å velge den fra filbiblioteket.
    MERK: Brukere kan også få tilgang til analyseprogramvaren via ikonet for gjennomgangsøkt i MVS-programvaren under et eksperiment.
  2. Vis avdriftkorrigerte bilder ved å aktivere DC-fanen under bildevisningsporten og velg de ønskede dataoverleggene ved å merke av for de respektive overleggsdataboksene i kategorien Bildemetadata (i dette eksemplet ble det brukt mikroskop, dato/klokkeslett, dosehastighet, maks dose og forstørrelse). Andre metadata kan plottes inn slik brukeren ønsker.
  3. Merk av for Tidslinje for Maks dose og Dosehastighet for å legge til et grafisk plott av disse verdiene på tidslinjen. Uthev eller bla gjennom disse grafiske plottene for å oppdatere bildet som vises i visningsporten. Få tilgang til en rekke verktøy via fanene Notater, Bildeanalyse, Verktøykasse og Datavisning .
    1. Gå til FFT for hvert bilde via Image Analysis-fanen og klikk på Live FFT for å oppdatere FFT mens du blar gjennom bilder.
    2. Bruk fading av FFT-toppene for å bestemme tidspunktet hvor zeolittstrukturen mister krystallinitet. Registrer den maksimale doseverdien som er registrert med det bildet.
  4. Bruk Filter-alternativet til å filtrere store datasett enkelt i mindre, delbare datasett uten å miste de tilknyttede metadataene. Åpne filterpanelet og juster glidebryterne slik at bare data med en doserate lik eller over ~500 e-/Å2·s velges, og lagre den nye samlingen ved å bruke navnet Doseterskelstudie.
    MERK: Filtre kan brukes for alle tilknyttede metadatatyper.
  5. Eksporter bildene og metadataene fra økten til andre filtyper beriket med skalalinjer og metadataoverlegg.
    1. Merk samlingen i bibliotekruten, og velg Publiser ved å høyreklikke utvalget. Fra Publiser-vinduet velger du de ønskede alternativene for filtypeeksporten.
    2. Velg kategorien avdriftkorrigerte data og bruk overlegg av ønskede metadata og FFT (plasser FFT-overlegget etter ønske; eksempler på bilder eksportert med FFT er vist i figur 3).
  6. Eksporter bildeserien som en filmfil med det samme publiseringsalternativet. Velg bildene ved å utheve dem på tidslinjen, bruke filteralternativene eller eksportere hele databasefilen. Velg ønsket filmformat, bildefrekvens og filplassering. En film av zeolitt-nedbrytningseksperimentet oppnådd ved hjelp av en 200 kV TEM er gitt i tilleggsfil 3.
  7. Eksporter metadataene separat fra de anskaffede bildene som en CSV-fil ved å velge alternativet Metadata (CSV) under publisering.
    MERK: Rå- og driftkorrigerte bilder eksporteres som separate CSV-filer (tilleggsfil 4 og tilleggsfil 5).

4. Metode 4: In situ oppvarmingsstudie av gull på jernoksid nanopartikler

  1. Dropcast en nanokatalysator (Au / FeOx) suspendert i etanol på en in situ varmeapparat E-chip, en mico-elektrochmechanical (MEM) prøvestøtte, og la den lufttørke. Monter prøven i in situ varmeholderen, sett holderen med prøven inn i TEM, og koble holderen til strømforsyningen ved hjelp av den medfølgende kabelen. Finn en prøveavkastning ved hjelp av TEM-kontrollene.
    MERK: Dette eksperimentet brukte en varmeholder som er fullt integrert med MVS-programvaren, slik at temperaturmetadata kan bygges inn med bildene.
  2. Velg riktig arbeidsflytalternativ fra MVS-programvaren (i dette eksemplet ble Fusion-arbeidsflyten brukt, men andre produsentvarmeholdere kan brukes ved å velge Annet).
  3. Følg instruksjonene i arbeidsflyten for å bekrefte den elektriske forbindelsen mellom holderen og E-brikken for oppvarming ved å laste inn kalibreringsfilen og utføre en enhetskontroll.
  4. Koble mikroskopet til MVS-programvaren, som vist tidligere i trinn 2.3-2.10 (i dette eksemplet ble metadataverdiene for dosehastighet, maks dose, matchkorrelasjon, avdrifthastighet og kanal A-temperatur valgt), og sentrer prøveavkastningen i synsfeltet.
  5. Åpne Fusion AX-fanen og sett opp og bruk en temperatur.
  6. Klikk på Channel A Setup-knappen for å få tilgang til temperaturkontrollinnstillingene. Velg modusene Temperaturfunksjon og Manuell kontroll.
  7. Klikk Eksperiment-knappen for å få tilgang til de eksperimentelle kontrollene. Sett rampehastigheten til 10 °C/s og målet til 600 °C. Klikk på Bruk for å starte eksperimentet.
    MERK: Eksperimentet kan settes på pause eller stoppes når som helst ved hjelp av hurtigtilgangsknappene nederst til høyre i MVS-programvaren, uten å åpne Fusion AX-fanen .
  8. Etter at den innstilte temperaturen på 600 °C er nådd, åpner du Fusion AX-fanen og velger Eksperiment. Endre rampehastigheten til 2 °C og målet til 800 °C. Klikk på Bruk for å starte eksperimentet.
    MERK: Prosedyren for å bruke en varmerampe er avhengig av in situ varmesystemet som brukes. Trinnene som er uthevet ovenfor for å bruke temperaturrampen, gjelder for systemet som brukes i dette eksemplet.
  9. Merk eventuelle hendelser eller interessepunkter under eksperimentet ved hjelp av merkingsfunksjonen, som vist i trinn 2.10. Fortsett å avbilde prøven og juster temperaturprofilen etter ønske. Når du er ferdig, klikker du på Avslutt økt og lagrer datafilen ved hjelp av analyseprogramvaren (en del av databasefilen som er omtalt i de representative resultatene, leveres som tilleggsfil 6).
  10. Åpne analyseprogramvaren for å se gjennom økten. Plott temperaturen, malens morphing factor, dosehastighet og kumulativ dose i tidslinjen. Eksporter bilder og filmer etter ønske ved hjelp av trinnene som er beskrevet i trinn 3.6 og 3.7. Bilder og filmer kan eksporteres med eller uten dosekartoverleggene (figur 4).

Representative Results

Dette arbeidet fremhever nytten av datainnsamling ved hjelp av MVS-programvare for TEM-avbildning og in situ-eksperimenter. Mikroskopjustering og tilstandsoppsett ble utført og valgt gjennom TEM-produsentens standardkontroller. Etter første oppsett ble protokollene som presenteres i denne videoartikkelen utført gjennom MVS-programvaren. En 300 kV TEM ble brukt for alle eksperimenter presentert i videoprotokollen og representative data, bortsett fra sammenligningszeolittdataene som ble samlet inn ved hjelp av en 200 kV kald FEG (figur 3D-F og tabell 1). Alle metadata ble samlet inn og justert til sine respektive bilder automatisk av MVS-programvaren.

Etter at programvaren er startet og valgt riktig arbeidsflyt fra menyen, opprettes en forbindelse til mikroskopet ved å aktivere Koble til-knappen i verktøylinjen helt til venstre i bildeviseren, som vist i figur 1A. Når Koble til-knappen er uthevet, blir bilder og tilhørende metadata fra mikroskopet automatisk streamet til MVS-programvaren og vises i bildevisningsruten. Disse bildene og deres tilknyttede metadata lagres kronologisk i en tidslinje som kan åpnes, gjennomgås og analyseres uten å avbryte registreringen av nye data i tidslinjen (figur 1B). Streaming kan avbrytes av brukeren når som helst ved å deaktivere Koble til-ikonet .

Når tilkoblingen er aktivert, kan du få tilgang til andre arbeidsflyter som er avhengige av MVS-programvarerammeverket. I eksemplene som vises i denne videoprotokollen, må en dosekalibrering utføres før bruk av de andre funksjonene i MVS-programvaren. Dosekalibrering er en automatisert prosess som styres av MVS-programvaren; den bruker en dedikert Faraday kopp dosekalibreringsholder for å måle strålens strøm og areal for kombinasjonen av parametere. Faraday koppkalibreringsholderen, vist i figur 2, kobles til et eksternt picoammeter, som nøyaktig måler strålestrømmen. Når det er satt inn i mikroskopet, er fiducial justeringshullet sentrert og de ønskede stråleforholdene som skal kalibreres (spotstørrelser, blenderåpninger og forstørrelser) legges inn i programvaren. Programvaren utfører en rekke kalibreringstrinn for hver kombinasjon av de valgte forholdene. Under dosekalibrering beveger holderen seg automatisk mellom den integrerte Faraday-strømkollektorkoppen og gjennomgående hullet. Den nåværende målingen for hver kombinasjon av linseforhold måles på Faraday-koppen av picoammeteret. Deretter oversetter programvaren scenen for å sentrere strålen i gjennomgående hull, og stråleområdet bestemmes gjennom maskinsynalgoritmer. Denne serien av målinger bygger en profil av forholdet mellom intensitet / lysstyrke og stråleområdet. Dette gjør det mulig for programvaren å ekstrapolere stråleområdet ettersom innstillingen for intensitet / lysstyrke justeres under et eksperiment uavhengig av synsfeltet. Verdier for kumulativ dose og doserate beregnes ved hjelp av disse strålestrøm- og stråleområdemålingene, og en dosekalibreringsfil genereres. Denne prosessen definerer i hovedsak en dose "fingeravtrykk" for TEM og dens individuelle linseforhold. Når dosen er kalibrert for TEM, kan brukeren operere normalt og fritt justere forstørrelsen og intensiteten uten tap av doseinformasjon eller manuell notering av17. Når kalibreringen er fullført, fjernes dosekalibreringsholderen, slik at prøven kan settes inn som normalt. Kalibreringsprosessen for både TEM- og STEM-modus tar vanligvis mindre enn 10 minutter.

Etter kalibrering av dosebetingelsene ble en kommersielt kjøpt zeolitt nanopartikkel (ZSM-5) prøve avbildet under høydosehastighetsbetingelser for å bestemme terskeldosen (kumulativ) der prøven er for skadet til å gi strukturell informasjon. ZSM-5 nanopartikler ble suspendert i etanol og dropcast på et konvensjonelt kobber TEM-rutenett. De ble avbildet kontinuerlig ved 300 kV i TEM-modus ved hjelp av en punktstørrelse på 3 og en 100 μm kondensatoråpning. Doseraten som ble avlest av MVS-programvaren under høydoserateforhold var 519 e-/Å2·s. Nanopartikler i synsfeltet ble avbildet kontinuerlig til toppene i FFT forsvant, noe som indikerer nedbrytning av den krystallinske strukturen, som vist i figur 3A-C og tilleggsfil 3. Overlegg (som kan legges til under et live eksperiment eller etterpå i analyseprogramvaren) ble brukt på TEM-bildene for å vise dato og klokkeslett, dosehastighet, maksimal (kumulativ) dose og forstørrelse. Dosehastigheten ble holdt konstant under eksperimenter, med kumulativ dose (maksdose) økende som en funksjon av tid. FFT-toppene begynte å forsvinne etter 42 s kontinuerlig avbildning (figur 3B). Ved 1 min og 20 s og en kumulativ dose på ~60 000 e-/Å2 var FFT-toppene helt forsvunnet (figur 3C).

For å vise at denne kalibreringsmetoden genererer kvantitative dosemålinger som kan brukes på andre mikroskoper som opererer under forskjellige innstillinger, ble den samme kalibreringsprosessen og zeolittnedbrytningseksperimentet utført ved hjelp av en 200 kV kaldfeltutslippspistol (FEG) TEM og en punktstørrelse på 1. Dette mikroskopet ble kalibrert ved hjelp av samme prosedyre beskrevet i metode 1, og det samme eksperimentet beskrevet i metode 2 ble utført ved hjelp av de nye punktstørrelses- og blenderåpningsinnstillingene. Stråleinnstillingene ble justert slik at forskjellen i den påførte doseraten mellom de to eksperimentene var ubetydelig (499 e-/Å 2·s vs. 519 e-/Å2·s). Som vist i figur 3D-F og oppsummert i tabell 1, forsvinner FFT-flekkene helt etter 1 min og 50 s kontinuerlig avbildning og en kumulativ dose på 58 230 e-/Å2, som stemmer overens med verdiene oppnådd i det første eksperimentet.

Et eksempel på hvordan MVS-programvaren kan dra nytte av in situ-eksperimenter ble vist ved å utføre et oppvarmingseksperiment. En representativ nanokatalysatorprøve, Au / FeOx (syntetisert etter en publisert prosedyre19), ble valgt som et eksempelsystem fordi det gjennomgår dynamiske morfologiske og strukturelle endringer ved høye temperaturer. Denne temperaturinduserte mobiliteten gjør det utfordrende å holde avkastningen sentrert innenfor synsfeltet på grunn av prøvens egen bevegelse og termiske ekspansjon av prøven under temperaturendringer18. Med funksjonene Drift Correct og Focus Assist aktivert, ble prøven avbildet over en periode på ~30 s ved 800 °C. Ved forhøyede temperaturer migrerte gullnanopartiklene i Au / FeOx langs overflaten av jernoksidstøtten og sintret for å danne større partikler, som vist i figur 4 og som en film i tilleggsfil 7. Figur 5 viser en serie TEM-øyeblikksbilder (figur 5A-F) av et porøst område i en Au / FeOx nanokatalysator, registrert på forskjellige tidspunkter (figur 5G) under et in situ oppvarmingseksperiment. Den koordinerte driftsverdien av avkastningen ble automatisk beregnet av programvaren. De koordinerte drift- og temperaturverdiene til bildene i løpet av serien er vist grafisk i figur 5G. Som forventet øker den koordinerte driften av prøven når temperaturprofilen øker, fra en hastighet på ~ 9 nm / min til ~ 62 nm / min, og begynner å synke mot utflating når temperaturen holdes konstant. Til tross for denne høye avdriften og endringer i prøvens morfologi, oppnås høyoppløselige bilder lett under temperaturramping, og avslører bevegelse i det porøse området, som vist i tilleggsfil 8. Se tilleggsfil 9 for nedlastingsinstruksjoner og datamaskinspesifikasjoner.

Figure 2
Figur 2: Kalibrering og sporing av elektrondoser . (A) Dosen kalibreres ved hjelp av en dedikert prøveholder som inneholder en strømkollektor plassert ved prøveplanet for strålestrømmålinger. (B) Illustrasjon av funksjonene i spissdesignet: Venstre: Faraday cup; Midten: fiducial hull; Høyre: gjennom hull (C). Den påførte elektrondosen kan visualiseres i programvaren ved hjelp av fargekodede kart for å betegne forskjellige doseeksponeringer i et bilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Elektrondoseindusert nedbrytning av zeolitt (ZSM-5) nanopartikler. (A-C) Øyeblikksbilder tatt over en periode på 1 min og 20 s som viser nedbrytningsdata oppnådd med en 300 kV FEG og en målt doserate på 519 e-/Å2·s; zeolitten nedbrytes innen 1 min og 20 s. (D-E) Øyeblikksbilder tatt over en tidsperiode på 1 min og 50 s som viser nedbrytningsdata oppnådd med en 200 kV kald FEG TEM og en elektrondoserate på 499 e-/Å2·s; innfeltene viser at FFT-punktet falmer over tid. Skalastangen er 60 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: AXON-synkronisering bruker maskinsynalgoritmer for å spore og stabilisere prøver som utvikler seg dynamisk. Metadata som genereres under eksperimentet, kan tegnes langs tidslinjen, slik at brukeren raskt kan pare et bilde med tilhørende metadata mens de blar gjennom bildeserien som ble generert under eksperimentet. (A-H) Bilder av en nanokatalysatorprøve (Au / FeOx) ved 800 ° C registrert over en periode på 28 s både med (A-D) og uten (E-H) dosekartoverlegget. Røde områder i overlegget indikerer regioner med høy kumulativ doseeksponering, og gule områder indikerer regioner med lavere eksponering. Utheving av en individuell piksel indikerer den kumulative dosen for pikselen. Hvite piler i paneler E-H indikerer to partikler som fusjonerer under forsøket, og den oransje pilen indikerer banen til en bevegelig gullpartikkel. (I) Eksperimentets tidslinje generert av analyseprogramvaren for bildeserien vist i A-H. De oransje prikkene øverst på tidslinjen angir rå (ikke-digitalt korrigerte) bilder, og de blå prikkene angir drivkorrigerte bilder. De oransje vertikale stolpene indikerer punktene på tidslinjen som tilsvarer bildene som vises panelene A-H. Skalastangen er 40 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: TEM-øyeblikksbilder av en porøs region i en Au / FeOx nanokatalysator på forskjellige tidspunkter. MVS-programvaren stabiliserer og sentrerer prøven selv under høye avdrifthastigheter, som de som oppstår under en temperaturrampe gjennom påføring av trinn, stråleskift og digitale korreksjoner, som indikert av maskinsynalgoritmer. (VG Nett) TEM-øyeblikksbilder av en porøs region i en Au / FeOx nanokatalysator, registrert på forskjellige (G) tidspunkter under et in situ oppvarmingseksperiment. Avkastningshastigheten for avkastningen beregnes automatisk og registreres under et eksperiment av MVS-programvaren. Som plottet i (G), når temperaturprofilen endres (den blå linjen), øker avdriftshastigheten (oransje linje) når temperaturen øker og synker når temperaturen holdes konstant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Mikroskop Type 300 KV FEG TEM 200 kV kald FEG TEM
Spot størrelse/kondensator 2 blenderåpning 3/100 μm 1/100 μm
Dose Rate 519 e-/A2•s1 499 e-/A2•s1
Tap av struktur målt ved FFT
(akkumulert dose)		 60 270 e-/A2 58 230 e-/A2

Tabell 1: Sammendrag sammenligning av zeolittnedbrytningsresultater oppnådd fra forskjellige mikroskoper.

Tilleggsfil 1: Skjermbilde av grensesnittet til MVS-programvaren med fanen dosestyring åpen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: MVS programvare databasefil av stråle-indusert zeolitt nedbrytning eksperiment. Denne visnings- / analyseprogramvaren er tilgjengelig for nedlasting gratis. Se tilleggsfil 9 for nedlastingsinstruksjoner og datamaskinspesifikasjoner. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Film av strålen indusert zeolitt nedbrytning. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: CSV-fil 1 (zeolittnedbrytning: rådata [kun mekanisk korreksjon]) Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 5: CSV-fil (zeolittdegradering: driftkorrigert [mekanisk + digital korreksjon]) Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 6: MVS programvare databasefil nanokatalysator in situ oppvarming eksperiment. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 7: Film av nanokatalysatoren ved 800 °C med doseoverlegg. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 8: Film av nanokatalysatoren under en temperaturrampe med koordinerte driftsverdier. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 9: Instruksjoner for nedlasting av gratis analyseprogramvare. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Tolkningen av TEM eksperimentelle resultater er ofte betinget av mange sammenkoblede eksperimentelle parametere, for eksempel mikroskopinnstillinger, avbildningsbetingelser, og i tilfelle operando eller in situ eksperimenter, endringer i miljøet eller stimuli 1,23. Nøyaktig analyse av store TEM-datasett, over hvilke disse parametrene kan endres kontinuerlig, krever betydelig oppmerksomhet fra operatøren for å registrere nøyaktig hver tilstand og innstilling for hvert bilde i en laboratoriejournal eller annen ekstern dokumentasjonskilde. Etter hvert som TEM-datasett vokser i størrelse og kompleksitet, blir manuell journalføring uhåndterlig, og nøkkelinformasjon kan bli savnet eller unøyaktig registrert. MVS-programvaren beskrevet her konsoliderer metadataene som genereres under et eksperiment fra mikroskopet, detektoren / kameraet og andre systemer (for eksempel in situ prøveholdere) og justerer dem med deres respektive bilder.

I tillegg til metadatakonsolidering bruker programvaren maskinsynalgoritmer for å spore og stabilisere synsfeltet gjennom en kombinasjon av romlige, stråle- og digitale korreksjoner ved hjelp av funksjonene Drift Correct og Focus Assist . Når Drift Correct-funksjonen aktiveres, genereres et krysskorrelasjonsbilde ved hjelp av det første bildet som trekkes inn i MVS-programvaren. Malen sammenlignes deretter med innkommende bilder for å beregne retningen og størrelsen på prøvedriften eller bevegelsen. Med denne informasjonen bruker MVS-programvaren automatisk de nødvendige korrigeringene for å holde bildefunksjonene på samme sted ved å justere minst en av tre parametere: sceneplassering, stråle- eller bildeskift og digital bildekorrigering. Focus Assist-funksjonen bruker en kombinasjon av algoritmer for å tilordne en fokusverdi, kalt fokuspoengsummen til hvert bilde, og disse poengsummene sammenlignes for å bestemme størrelsen og retningen på defokusjusteringen som skal brukes for å holde prøven i fokus. I STEM-bildemodus forsøker MVS-programvaren å maksimere kontrasten gjennom en proprietær versjon av normalisert varians for å tilordne fokuspoengsummen. I TEM-modus beregnes en radial sum av intensitet i FFT og brukes til å beregne fokuspoengsummen. Begrensninger i MVS-programvarens evne til å optimalisere fokus oppstår når den ikke nøyaktig kan beregne riktig fokuspoengsum for et bilde. Dette skjer vanligvis når mikroskopet er feiljustert eller prøven er betydelig ute av fokus under kalibrering, slik at programvaren ikke kan beregne riktig startfokuspoengverdi. MVS-programvaren kan ha problemer med å beregne fokuspoengsummen for prøver med veldefinerte gitterfrynser, da gitterkantene i FFT kan "overvelde" fokusscoringsalgoritmen; Hvis et utvalg beveger seg ut av fokus, kan det derfor hende at fokuspoengsummen ikke gjenspeiler endringen i fokus nøyaktig. Omvendt kan arbeid ved lave forstørrelser eller med en prøve som har et lavt FFT-signal også gjøre det utfordrende å beregne en god fokusscore. For å redusere disse vanskelighetene inneholder MVS-programvaren en rekke tilleggsalgoritmer som kan velges av brukeren for å beregne fokuspoengsummen hvis standardinnstillingene er uegnet for prøven. Disse må testes og brukes fra sak til sak for å bestemme de beste algoritmene for et gitt eksperiment.

Morfologiske endringer i prøvestrukturen over tid er regnskapsført ved hjelp av en malmorffaktor. Dette filteret er justerbart av operatøren, slik at registreringsalgoritmer tar hensyn til morfologiske endringer over tid. I tillegg overvåker programvaren kontinuerlige bilde-, mikroskopinnstillinger og kamera- eller detektorinnstillinger for automatisk å oppdatere malen når den utløses av endringer i prøvestruktur og etter eventuelle operatørinduserte endringer i mikroskop-, kamera- eller detektorparametrene. Som vist i figur 4, figur 5, tilleggsfil 7 og tilleggsfil 8, gir MVS-programvaren effektiv, umiddelbar stabilisering, noe som muliggjør høyoppløselig avbildning av dynamisk bevegelige eller endrede prøver. Selv om programvaren er i stand til å kontrollere svært høye avdrift- eller prøvebevegelser, for eksempel de som oppstår når du bruker en varmerampe under et in situ-eksperiment, er det begrensninger for maksimale trinnkorreksjoner eller stråleskift som programvaren kan kontrollere om prøven beveger seg eller driver veldig raskt. Denne grensen er en funksjon av bildeoppdateringshastigheten, synsfeltstørrelsen og avdrifthastigheten. For et gitt synsfelt og bildeoppdateringshastighet er det en maksimal avdrifthastighet som kan korrigeres, og hvis de fysiske bevegelsene ikke kan holde tritt, kan prosessen avsluttes eller bli ustabil. Fra registreringsmalene som genereres når funksjoner som avvikskorrigering, brukes, kan ytterligere beregnede metadata genereres. For eksempel er Match Correlation en numerisk registrering av omfanget av endring mellom maler i en serie og brukes til å identifisere punkter i en eksperimentell tidslinje der utvalget ble endret. En høy samsvarskorrelasjonsverdi tilsvarer et utvalg som har gjennomgått endringer i morfologien, og en korrelasjonsverdi med lav match tilsvarer et utvalg hvis struktur forblir relativt statisk. Samsvarskorrelasjon er spesielt verdifullt for in situ-studier, da det kan plottes grafisk, slik at brukeren raskt kan finne bilder i serien som tilsvarer signifikant utvalgsendring. Det er imidlertid viktig å forstå at høye samsvarskorrelasjonsverdier også kan korrespondere med endringer i bildeforhold, for eksempel å flytte scenen eller endre forstørrelsen, hvis disse handlingene utføres mens funksjonen Drift Correction forblir aktiv.

Kalibreringsarbeidsflyten som presenteres her, bruker en unik kalibreringsholder og en halvautomatisk kalibreringsrutine for å kalibrere strålen nøyaktig under en rekke objektivforhold med minimal operatørinngrep. Du får tilgang til doseringskalibreringsrutinen via MVS-programvaren som er installert på TEM. MVS-programvaren leser automatisk de relevante mikroskopinnstillingene for å lagre alle målinger som referanse for senere eksperimenter. På noen TEM-er er det ikke mulig å lese blenderåpnings- eller monokromatatorinnstillingene, og disse må legges inn i MVS-programvareinnstillingene av operatøren under kalibreringer og under bruk. Det er innebygd påminnelser i programvaren for å holde disse operatørinngangsinnstillingene oppdatert ved å følge programinstruksjonene. Utviklingen av en holder med innebygd strømkollektor, i stedet for å stole på en integrert andre steder i mikroskopkolonnen, er et bevisst designvalg. Dette gjør at strømkollektoren kan plasseres i samme plan som en prøve, og eliminerer feil i strømmåling forårsaket av stråleavbøyning eller forskjeller i absorpsjon av elektroner ved åpninger ved forskjellige stråleposisjoner. MVS-programvaren følger en automatisert rutine for å måle strålestrømmen og området for enhver kombinasjon av linseforhold. Programvaren kan deretter korrelere disse målte kalibreringene med kameraet eller skjermstrømmen og ekstrapolere eventuelle endringer i forstørrelse etc. til stråleområdet under eksperimentet. Når generert, disse kalibrering filene kan brukes umiddelbart og lagres automatisk for senere bruk hvis programvaren oppdager de samme innstillingene som brukes under en fremtidig økt. Selv om levetiden til kalibreringsfilen varierer fra mikroskop til mikroskop, har forfatterne funnet ut at de er i stand til å bruke de samme kalibreringsfilene i flere måneder uten å observere vesentlige endringer i gjeldende verdier. Det er innebygde rutiner som overvåker utslippsprofilen til våpen for å holde disse kalibreringene relevante, spesielt på kalde FEG-utslippspistoler.

Normalisering av dosemålinger mellom mikroskoper og automatisert sporing av en prøves stråleeksponering er kritiske funksjoner i MVS-programvaren, da de tillater kvantitative sammenligninger av dosebetingelser mellom eksperimenter som skal utføres på forskjellige mikroskopsystemer. Doseindusert nedbrytning av en zeolittprøve (ZSM-5), oppnådd under identiske eksperimenter ved bruk av forskjellige mikroskoper, resulterer i fullstendig forsvinning av FFT-flekkene etter en maksimal kumulativ eller terskelelektrondose (~ 60.000 e-/Å 2 ved påføring av en doserate på ~500 e-/Å2·s) for begge oppsett. Disse komparative resultatene viser at doseprogramvaren muliggjør reproduserbare, kvantitative dosemålinger. Den lille forskjellen i den kumulative dosen der full FFT-punktforsvinning observeres for hvert eksperiment, er sannsynligvis et resultat av de forskjellige akselerasjonsspenningene som brukes av de to mikroskopene, med lavere akselerasjonsspenninger som resulterer i flere strålingsskadeveier, og høyere akselerasjonsspenninger som vanligvis resulterer i mer knock-on skade24. Litteraturresultater for den kritiske dosen av ZSM-5 nanopartikler varierer fra 9,000-14,000 e-/Å2 ved bruk av de første FFT-flekkforsvinningene, i stedet for fullstendig forsvinning av alle FFT-flekkene 25,26. I våre resultater tilsvarer den første FFT-spotforsvinningen en kumulativ dose på rundt 25 000 e-/Å2. Tidligere studier stod på nåværende målinger oppnådd ved hjelp av en fosforskjerm, som er godt dokumentert for å undervurdere strålestrømmålinger sammenlignet med en Faraday-kopp15. Den bestemte kritiske dosen kan variere med en faktor på to eller flere, avhengig av hvilken FFT-topp som brukes til å spore dosen. Dette indikerer at de høyere romlige frekvensene brytes ned først, og kan resultere i forskjellige verdier avhengig av sonetilgangen som brukes under målingene (resultatene våre fokuserte på FFT-flekker fra hele zeolittkrystallen, i stedet for spesifikke strukturelle trekk)25,26. Disse forskjellene i teknikker og nåværende kalibrering forklarer forskjellen i verdier mellom de to eksperimentene som er rapportert i våre resultater og tidligere litteraturstudier.

Selv om elektrondoseinteraksjonene er en signifikant faktor i mange TEM-eksperimenter, er in situ og spesifikt væske-EM-studier spesielt følsomme for effektene. Radiolyse av væsker av elektronstrålen resulterer i en kaskade av kjemisk reaktive arter som kan interagere med prøven, komplisere analysen. Både dosehastigheten eller fluensen som brukes under et væske-EM-eksperiment og den kumulative dosen kan påvirke konsentrasjonen av radikale arter generert på grunn av flytende radiolyse27,28. Dermed tillater innsamling og registrering av både kumulative dose- og dosehastighetsmetadata gjennom et eksperiment direkte korrelasjon mellom bilder og en prøves dosehistorie, og er en mer nøyaktig måte å belyse og kontrollere virkningen av elektronstrålen i disse forsøkene. Selv om det ikke dekkes av denne protokollen, er et eksempel på nytten av dosestyringsfunksjonene for væske-EM vist i figur 6.

Figure 6
Figur 6: Stråleindusert vekst av gull nanopartikler under et in situ væske-EM-eksperiment. (A) Lavforstørrelse STEM-oversikt over den resulterende partikkelveksten med et fargeoverlegg av det kumulative dosekartet over hele regionen. Røde områder i overlegget indikerer regioner med høy kumulativ doseeksponering, og gule områder indikerer områder med lavere eksponering. Hvis du uthever et enkeltbildepunkt med markøren eller tegner en boks over et område ved hjelp av tegneverktøyene som følger med, angis den kumulative dosen for bildepunktet eller området. Skalastangen er 2 μm. (B,C) Høyere forstørrelse STEM-bilder av områdene angitt med de oransje boksene (b,c) i A. Område b, eksponert for en høyere kumulativ dose (10,811 e-/Å 2), inneholder større partikler enn de som finnes i område c, som ble eksponert for en lavere kumulativ dose (0,032 e-/Å2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Den berikede dosehastigheten og kumulative dosemetadata forenkler analysen av doseavhengig nanomaterialvekst og nedbrytningsveier. Figur 6 viser stråleindusert reduksjon av en løsning av gull auraklorid (HAuCl3) ioner i vann under væske-EM-eksperimenter. Fra fargedosekartoverlegget i figur 6A er det lett å visualisere at den kumulative elektrondosen påvirker nanopartiklenes resulterende størrelse og form 29,30,31,32. STEM-oversikten med lav forstørrelse viser regioner som er utsatt for en høy (rød) og lav (gul) kumulativ dose. Partiklene i regionen eksponert for høyere doser er større enn partiklene i regionene eksponert for lavere kumulative doser. Fordi dosemetadataene er direkte innebygd i hvert bilde på pikselnivå, kan de komplekse effektene av elektrondose i væske-EM-eksperimenter nå systematisk analyseres på en måte som aldri før var oppnåelig.

I denne protokollen har vi demonstrert at MVS-programvare gir en omfattende løsning for kalibrering, overvåking og sporing av både elektrondosen og den totale dosen levert til en prøve på piksel-for-piksel-basis. Denne evnen låser opp et nytt paradigme for avbildning av dosefølsomme prøver og forståelse av elektronstråleinteraksjonene. Det er spesielt spennende for væske-EM-eksperimenter, da det vil muliggjøre en mer effektiv undersøkelse av rollen som elektrondosen spiller og forbedre eksperimentell reproduserbarhet. Det er vårt håp at dette nye rammeverket vil tillate nøyaktig innsamling av doserate og akkumulert doseinformasjon, legge til rette for deling av disse dataene med samfunnet for en mer nøyaktig tolkning av TEM-resultater, og fremme vitenskapelig samarbeid og datadeling ved å muliggjøre FAIRs hovedrapportering og analyse.

Disclosures

Alle forfattere er ansatte i Protochips, Inc.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble utført delvis ved Analytical Instrumentation Facility (AIF) ved North Carolina State University, som støttes av staten North Carolina og National Science Foundation (prisnummer ECCS-2025064). AIF er medlem av North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), et område i National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Forfatterne vil gjerne takke Damien Alloyeau, CNRS forskningsdirektør ved Universitetet Paris Cité, for å gi 200 kV CFEG zeolitt doseterskel studieresultater.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARM200F CFEG JEOL Transmission Electron Microscope (200 kV)
AXON DOSE Calibration Holder Protochips, Inc. AXA-FC-TFS Dose calibration and management hardware package for ThermoFisher ScientificTEM
AXON DOSE Software:  Version 10.6.5.3 Protochips, Inc. AX-MOD-DOSE-01-1YR Dose calibration and management software
AXON Studio Software: Version 10.6.5.3 Protochips, Inc. No Part Number.
Available to download at  success.protochips.com		 Offline analysis software for AXON datasets.  A free copy of the AXON Studio software is available for down load at:  success.protochips.com
AXON Synchronicity Core Protochips, Inc. AXON-CORE Hardware component of the synchronization software.
AXON Synchronicity Software:  Version 10.6.5.3 Protochips, Inc. AX-MOD-SYNCPRO-01-1YR Synchronization software
Fusion In-Situ Heating E-chip Protochips, Inc. E-FHDC-VO-10 Sample Support E-chip with carbon film.  Used with in situ heating system
Fusion Select In Situ Heating System Protochips, Inc. FFAD-6200-EXP In-situ MEMs heating system for ThermoFisher Scientific TEM.
Gold(III) chloride (50% gold basis) hydrate 50790 Sigma Aldrich 27988-77-8 Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.  Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998)
Iron (III) Oxide 310050 (Fe2O3) Sigma Aldrich 1309-37-1 Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.  Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998)
Titan ChemiSTEM ThermoFisher Scientific Transmission Electron Microscope (300 kV)
Zeolite ZSM-5 Zeolyst CBV 8014  Nanocatalyst sample:  80 SiO2/Al2O3 Mole Ratio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomas, J. M., Leary, R. K., Eggeman, A. S., Midgley, P. A. The rapidly changing face of electron microscopy. Chemical Physics Letters. 631, 103-113 (2015).
  2. Spurgeon, S. R., et al. Towards data-driven next-generation transmission electron microscopy. Nature Materials. 20 (3), 274-279 (2021).
  3. Gai, P. L., Boyes, E. D. In situ visualisation and analysis of dynamic single atom processes in heterogeneous catalysts. Journal of Materials Chemistry A. 10 (11), 5850-5862 (2022).
  4. Zheng, H., Lu, X., He, K. In situ transmission electron microscopy and artificial intelligence enabled data analytics for energy materials. Journal of Energy Chemistry. 68, 454-493 (2022).
  5. Topsøe, H. Developments in operando studies and in situ characterization of heterogeneous catalysts. Journal of Catalysis. 216 (1), 155-164 (2003).
  6. Wilkinson, M. D., et al. The FAIR Guiding Principles for scientific data management and stewardship. Scientific Data. 3 (1), 160018 (2016).
  7. FAIR Principles. Go Fair. , Available from: https://www.go-fair.org/fair-principles/ (2023).
  8. Draxl, C., Scheffler, M. NOMAD: The FAIR concept for big data-driven materials science. MRS Bulletin. 43 (9), 676-682 (2018).
  9. Kelly, D. F., et al. Liquid-EM goes viral-visualizing structure and dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 75, 102426 (2022).
  10. AXON Studio Software Download. Protochips, Inc. , Available from: https://success.protochips.com/s/?language=en_US (2023).
  11. Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).
  12. Grubb, D. T. Radiation damage and electron microscopy of organic polymers. Journal of Materials Science. 9 (10), 1715-1736 (1974).
  13. Buban, J. P., Ramasse, Q., Gipson, B., Browning, N. D., Stahlberg, H. High-resolution low-dose scanning transmission electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 103-112 (2010).
  14. Chen, Q., et al. Imaging beam-sensitive materials by electron microscopy. Advanced Materials. 32 (16), 1907619 (2020).
  15. Krause, F. F., et al. Precise measurement of the electron beam current in a TEM. Ultramicroscopy. 223, 113221 (2021).
  16. Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
  17. Damiano, J., et al. AXON dose: A solution for measuring and managing electron dose in the TEM. Microscopy Today. 30 (4), 22-25 (2022).
  18. Allard, L. F., Flytzani-Stephanopoulos, M., Overbury, S. H. Behavior of Au species in Au/Fe2O3 catalysts characterized by novel in situ heating techniques and aberration-corrected STEM imaging. Microscopy and Microanalysis. 16 (4), 375-385 (2010).
  19. Sze, C., Gulari, E., Demczyk, B. G. Structure of coprecipitated gold-iron oxide catalyst materials. Materials Letters. 36 (1-4), 11-16 (1998).
  20. DiCecco, L. A., et al. Advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice. Journal of Visualized Experiments. (185), e63856 (2022).
  21. Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
  22. Scheutz, G. M., et al. Probing thermoresponsive polymerization-induced self-assembly with variable-temperature liquid-cell transmission electron microscopy. Matter. 4 (2), 722-736 (2020).
  23. Howe, J. Y., Allard, L. F., Bigelow, W. C., Demers, H., Overbury, S. H. Understanding catalyst behavior during in situ heating through simultaneous secondary and transmitted electron imaging. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 614 (2014).
  24. Egerton, R. F. Mechanisms of radiation damage in beam-sensitive specimens, for TEM accelerating voltages between 10 and 300 kV. Microscopy Research and Technique. 75 (11), 1550-1556 (2012).
  25. Yoshida, K., Sasaki, Y. Optimal accelerating voltage for HRTEM imaging of zeolite. Microscopy. 62 (3), 369-375 (2013).
  26. Yoshida, K., Sasaki, Y., Kurata, H. High-resolution imaging of zeolite with aberration-corrected transmission electron microscopy. AIP Advances. 3 (4), 042113 (2013).
  27. Lee, J., Nicholls, D., Browning, N. D., Mehdi, B. L. Controlling radiolysis chemistry on the nanoscale in liquid cell scanning transmission electron microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 23 (33), 17766-17773 (2021).
  28. Schneider, N. M., et al. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).
  29. Fritsch, B., et al. Radiolysis-driven evolution of gold nanostructures - model verification by scale bridging in situ liquid-phase transmission electron microscopy and x-ray diffraction. Advanced Science. 9 (25), e2202803 (2022).
  30. Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (4), 2574-2581 (2015).
  31. Ahmad, N., Le Bouar, Y., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Growth of dendritic nanostructures by liquid-cell transmission electron microscopy: a reflection of the electron-irradiation history. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 9 (2016).
  32. Zhang, Y., Keller, D., Rossell, M. D., Erni, R. Formation of Au nanoparticles in liquid cell transmission electron microscopy: From a systematic study to engineered nanostructures. Chemistry of Materials. 29 (24), 10518-10525 (2017).

Tags

Biologi utgave 196
En maskinvisjonstilnærming til arbeidsflyter for transmisjonselektronmikroskopi, resultatanalyse og datahåndtering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dukes, M. D., Krans, N. A., Marusak, … More

Dukes, M. D., Krans, N. A., Marusak, K., Walden, S., Eldred, T., Franks, A., Larson, B., Guo, Y., Nackashi, D., Damiano, J. A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management. J. Vis. Exp. (196), e65446, doi:10.3791/65446 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter